PRODUKSI KITOSAN DARI BAHAN BAKU CANGKANGUDANG MENGGUNAKAN METODE KIMIA DAN ENZIMATIS

DENGAN ENZIM KITIN DEASETILASE

Winda Rahmawati1, Dian Herasari

1, Husniati

2

Jurusan Kimia Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Lampung

1

Baristand Industri Bandar Lampung2

email: ewindathestorm@gmail.com

Abstrak

Telah dilakukan penelitian mengenai produksi kitosan dari cangkang udangdengan dua metode. Uji metode kimia meliputi deproteinasi, demineralisasi,deasetilasi dan metode enzimatis dengan deasetilasi kimia sebagian diikutidengan penambahan enzim kitin deasetilase. Karakterisasi kitosan yangdihasilkan meliputi kadar air, kadar abu, kadar nitrogen dan derajatdeasetilasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kitosan yang dihasilkandari metode kimia memiliki kadar air, kadar abu, kadar nitrogen dan derajatdeasetilasi berturut– turut 7,39%; 2,10%; 7,59% dan 71%. Sedangkan padadeasetilasi enzimatis, hasil analisis derajat deasetilasi kimia sebagianmenggunakan spektrofotometer fourier transform infrared (FTIR)menghasilkan kitosan dengan derajat deasetilasi 46,68 %, diikuti denganpenambahan enzim CDA (Kitin Deasetilase) menghasilkan kitosan denganderajat deasetilasi 75,91%.

Kata Kunci: derajat deasetilasi, kitosan, kitin deasetilase.

1. PendahuluanIndonesia merupakan negara maritim

yang kaya akan potensi perikananseperti udang. Pemanfaatan udanguntuk keperluan konsumsimenghasilkan limbah dalam jumlahbesar yang belum dimanfaatkan secarakomersial.

Sekitar 35% dari cangkang keringudang mengandung kitin. Dari kitinudang dapat dihasilkan sekitar 80%kitosan (No dan Meyer, 1997). Kitin

adalah salah satu polisakarida yangmelimpah di bumi selain selulosa danpati, kitin merupakan polimer dari N-asetilglukosamin yang terikat melaluiikatan β-(1,4) (Tsigos dan Bouriotis,1995). Turunan kitin yang memilikitingkat N-terasetilasi lebih rendahdisebut kitosan. Kitosan yang disebutjuga dengan β-1,4-2-amino-2-dioksi-D-glukosa diperoleh dari kitin melaluiproses deasetilasi menggunakan basakuat berkonsentrasi tinggi (No and

Meyer, 1997). Kitosan tidak larut dalamair dan H2SO4, sedikit larut dalam HCl,dan HNO3. Kitosan juga mudahmengalami degradasi dan bersifatpolielektrolit (Hirano, 1986). Deasetilasikitin menjadi kitosan dapat dilakukandengan dua metode, yaitu metode kimiadan enzimatis. Metode kimia lebihmudah dan cepat. Sedangkan padametode enzimatik digunakan enzimspesifik (misal: enzim kitin deasetilase ).Dalam sebuah penelitian pendahuluandilakukan isolasi enzim kitin deasetilasedari mikroba Aspergillus Aculeatus.Enzim ini bekerja spesifik memotonggugus asetil dari kitin menjadi kitosan,melalui pemutusan ikatan N-asetamidopada kitin dan merubahnya menjadikitosan (Kafetzopoulos et al., 1993).

Berdasarkan uraian diatas, makadalam penelitian ini akan dilakukanpembuatan kitin dengan metode kimiayang meliputi tahap deproteinasi,demineralisasi dan deasetilasi kitinuntuk menghasilkan kitosan. Sedangkandeasetilasi secara enzimatismenggunakan enzim kitin deasetilase,proses deasetilasi enzimatis bersifatselektif dan tidak merusak struktur rantaikitosan, sehingga menghasilkan kitosandengan karakteristik yang lebih seragam(Tokoyasu et al., 1997) Kitosan yangdiperoleh kemudian dikarakterisasimenggunakan Fourier TransformInfrared (FTIR) untuk menganalisisgugus fungsinya.

2. Metode Penelitian2.1 Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakanadalah cangkang udang dari PT.Indokom Samudra Persada, kitinkomersial dari PT. Biotech Sukofindo,crude enzim kitin deasetilase daripenelitian pendahuluan mengenai(Isolasi Enzim Kitin Deasetilase DariIsolat Tanah Humus AspergillusAculeatus Dan Identifikasi EnzimTersebut Dalam Produksi Kitosan,Husniati., dkk), asam klorida pekat(HCl), natrium hidroksida (NaOH), asamasetat (CH3COOH), indikator universal,akuades,

Alat-alat yang digunakan adalahalat gelas, orbital shaker (Memmert),

hot plate dan magnetic stirrer (FisherScientific), pH meter (HACH),mikropipet (BIOHTIP Oyj), incubator(Memmert), laminar air flow (ESCO),tabung sentrifuga (eppendorf),autoclave (Sturdy), oven (Memmert),kertas saring, statif, penangas air(Stuart Scientific), batang pengaduk,pipet ukur, pipet volum, tanur, corong, ,desikator, bola hisap, neraca analitik,penangas minyak, cawan pengabuan,spektrofotometer fourier transforminframerah (FTIR) merk varian 2000Scimitar Series , dan spektrofotometetrfourier transform inframerah ShimadzuFTIR -8010PC).

2.2 Preosedur Penelitian2.2.1 Pembuatan Kitosan DenganMetode Kimia

Proses pembuatan kitosan terdiriatas tiga tahap yaitu deproteinasimerupakan tahap pemisahan protein,demineralisasi yaitu tahap pemisahanmineral. Dan deasetilasi kitin untukmemperoleh kitosan.

2.2.2 DeproteinasiSebanyak 40 gram cangkang

udang ditempatkan dalam bejanatahan asam basa yang dilengkapidengan pengaduk, penangas air dantermometer. Kemudian ditambahkanNaOH 3 M sebanyak 400 ml denganperbandingan 1:10 (b/v) dandipanaskan selama 60 menit padasuhu 90 0C sambil di aduk konstan..Endapan yang diperoleh dicuci denganmenggunakan akuades sampai pHnetral. Endapan dikeringkan dalamoven dengan suhu 60 0C selama 24jam. Kitin kasar yang diperolehberwarna kuning kemerahan.

2.2.3 Demineralisasi

Kitin hasil deproteinasi dimasukkandalam bejana tahan asam dan basayang dilengkapi dengan pengaduk,termometer, dan diletakkan dalampenangas air. Kemudian sampelditambahkan HCl 2M denganperbandingan 1:7 (b/v) selama 120menit pada suhu 25-30 0C. Setelah itu,dilakukan penyaringan sehingga

diperoleh filtrat dan endapan.Endapan yang diperoleh dicuci denganmenggunakan akuades sampai pHnetral, dan endapan dikeringkan dalamoven dengan suhu 60 0C selama 24jam, sehingga diperoleh kitin berwarnakuning kemerahan.

2.2.4 Deasetilasi KitinKemudian kitin dimasukkan dalam

larutan NaOH 20 %, lalu dipanaskanpada suhu 90-100 0C sambil diadukkonstan selama 60 menit. Setelah itudidinginkan selama 3 jam pada suhuruang dan dilakukan penyaringanuntuk memisahkan padatan dancairannya. Padatannya dicuci denganakuades sampai pH netral.Selanjutnya padatan dikeringkandalam oven dengan suhu 60 0Cselama 24 jam. Hasil yang diperolehdisebut kitosan. Kitosan yangdiperoleh di ukur menggunakanspektrofotometer IR.

2.3 Pembuatan Kitosan DenganMetode Enzimatis

2.3.1 Deasetilasi Kimia sebagianSebanyak 20 gram tepung kitin

komersial direndam dalam larutanNaOH 60% selama 24 jam, kemudiandipanaskan pada suhu 60 0C selama 2jam. Kemudian kitin yang diperolehdicuci dengan akuades hingga pHnetral, dan dikeringkan dalam ovendengan suhu 60 0C selama 24 jam.

2.3.2 Deasetilasi EnzimatisKitosan hasil deasetilasi kimia

sebagian dilarutkan dalam asam asetat0,1 M. Kemudian dicampurkan enzimCDA sebanyak100 μL dalam 10 mllarutan kitosan 1% kemudian di inkubasipada suhu 55 0C selama 24 jam.

2.4 Karakterisasi Kitosan

2.4.1 Pengukuran Spektroskopi IR

Kitosan yang diperoleh dibacadengan spektrofotometer IR. Kitosandibuat pelet dengan KBr, kemudiandilakukan scanning pada daerahfrekuensi antara 4000 cm-1 sampai

dengan 400 cm-1. Spektrum hasilpengukuran yang diperolehdibandingkan dengan spektrumkitosan standar.

2.4.2 Kadar Air (AOAC 1999)Dilakukan penimbangan terhadap

cawan yang hendak dipakai, kemudiandimasukkan sampel cangkang udangsebanyak 1 gram. Sampel laludimasukkan dalam oven pada suhu1050C selama 3 jam sampai diperolehberat yang tetap, didinginkan dalamdesikator lalu ditimbang. Kadar airdihitung dengan persamaan sebagaiberikut:Perhitungan :Kadar Air = b- a x 100%

ba = berat sampel sesudah dikeringkanb = berat awal sampel

2.4.2 Kadar Abu (AOAC 1999)Krus porselin untuk pengabuan

ditimbang, lalu dibakar dalam tanurpada suhu 6000C selama 3 jam,didinginkan dalam desikator laluditimbang. Dimasukkan sampelcangkang udang sebanyak 1 gram,lalu dibakar dalam tanur selama 6 jampada suhu 6000C sampai diperolehabu berwarna putih.Perhitungan:Kadar abu = berat abu(g) x 100%

berat sampel (g)

2.4.3 Derajat DeasetilasiDerajat deasetilasi ditentukan dari

spektrum serapan spektrofotometer IRdengan metode garis dasar. Puncaktertinggi dicatat dan diukur dari garisdasar yang dipilih. Nilai absorbansidihitung dengan rumus :

A = log P0/PKeterangan;P0= % transmitansi pada garis dasarP=% transmitansi pada puncak

minimum

Perbandingan antara absorbansi padaѴ= 1655 cm-1 (serapan pita amina)dengan absorbansi Ѵ= 3450 cm-1(serapan pita hidroksi) dihitung untuk

N-deasetilasi kitin yang sempurna(100%) diperoleh A1655= 1,33.Penggunaan nilai absorbansi puncakyangѴ terkait derajat deasetilasi dapatdihitung dengan cara : N-deasetilasi =1- (A1655/A3450 x 1/1,33) x 100%(Bastaman, 1989, dalam Haryanto,1955).

3. Hasil dan Pembahasan3.1 Pembuatan Kitin

Penelitian utama dilakukan untukmengekstraksi kitin dari cangkangudang melalui proses deproteinasimenggunakan NaOH denganpemanasan tinggi. Deproteinasibertujuan untuk memutuskan ikatanantara protein dan kitin, dengan caramenambahkan NaOH. Selamaperendaman, protein terekstrak dalambentuk Na-asam lemak ( Na-proteinat)akibat reaksi saponifikasi antara lemakyang terkandung dalam cangkangudang dengan larutan NaOH panas,dimana ion Na+ akan mengikat ujungrantai protein yang bermuatan negatifdan mengendap (Suhartono,2000).Deproteinasi dalam penelitian inidilakukan dengan menggunakan NaOH3 M dalam waktu 60 menit dan suhu ±900C.

Setelah dilakukan tahapdeproteinasi, endapan yang diperolehdicuci dengan akuades sampai pHnetral, sebagai indikator digunakan pHuniversal. Pencucian ini dimaksudkanuntuk mencegah terjadinya degradasiproduk selama proses pengeringan.

Pada tahap demineralisasi, senyawakalsium akan bereaksi dengan asamklorida yang larut dalam air (Bastaman,1989) Protein, lemak, fosfor,magnesium, dan besi turut terbuangdalam proses ini. Dalam penelitian ini,demineralisasi dilakukan padatemperatur 25-300C dengan larutanasam klorida 2 M dengan perbandingan(1:7).

Kitosan dihasilkan melalui tahapdeasetilasi. Deasetilasi bertujuan untukmemutuskan gugus asetil (−COCH3)yang terdapat pada kitin. Padapenelitian ini, deasetilasi kitin dilakukandengan merendam kitin selama 60menit pada suhu 900C menggunakan

larutan NaOH 20%. Menurut Muzzarelli(1986) kitin mempunyai struktur kristalinyang panjang dengan ikatan kuat antaraatom nitrogen dan gugus karboksil.Oleh karena itu pada proses deasetilasidigunakan larutan NaOH dengankonsentrasi tinggi (40-60%) untukmendapatkan kitosan dari kitin.

Berdasarkan hal di atas, deasetilasikitin menggunakan metode kimiadengan perlakuan suhu 90-100 0Cselama 60 menit diperoleh derajatdeasetilasi sebesar 71%.

3.2 Penafsiran Spektrum IR kitosanGambar 1 menunjukkan hasil

identifikasi kitosan menggunakanmetode kimia murni denganpengukuran spektrofotometer FTIRVarian 2000. Hasil identifikasi gugusfungsi terlihat adanya serapan padabilangan gelombang 3452, 49 cm-1yang merupakan serapan dari gugus-OH. Gugus –OH digunakan sebagaistandar internal dalam kitosan (Marioet., al 2008) sedangkan serapan khaskitosan terlihat pada bilangangelombang 1666, 50 cm-1 yangmerupakan geseran tekuk N-H yangmenunjukkan keberadaan aminaprimer (NH

2). Berikut adalah spektrum

IR dari kitosan menggunakan metodekimia murni.

Gambar 1. Spektra FTIR kitosan hasildeasetilasi metode kimia hasil

pengukuran FTIR Varian 2000

3.3 Deasetilasi EnzimatisProses deasetilasi enzimatis dapat

meningkatkan derajat deasetilasi 5-30%, tergantung pada derajatdeasetilasi awal. Semakin tinggiderajat deasetilasi awal, semakin kecilpeningkatan derajat deasetilasi yangterjadi. Sebelumnya kitin dalam bentuktepung direndam dalam NaOH 60%selama 24 jam, kemudian di panaskanpada suhu 600C selama 2 jam.Penepungan dilakukan agar prosesdeasetilasi dapat berlangsung lebihcepat dan sempurna, karena semakinluasnya permukaan yang dapatdiakses oleh larutan alkali (No danMeyers, 1997). Hasil pengukuranderajat deasetilasi kitosan kimiawidengan spektrofotometer IR disajikanpada gambar 2.

Gambar 2. Spektra IR kitosan hasildeasetilasi kimia sebagianhasil pengukuranspektrofotometer FTIR

(-8010PC)

Derajat deasetilasi awal yangrendah menunjukkan banyaknyajumlah residu asetil yang belumterpotong. Lebih banyak residu asetilmenunjukkan lebih banyak substratyang tersedia untuk reaksi enzim.Sesuai dengan kinetika enzim,semakin banyak substrat yangtersedia, laju reaksi akan semakincepat dan akan menurun jika jumlahsubstrat berkurang (Suhartono 1989).

Kitin hasil deasetilasi sebagiandilarutkan dalam asam asetat 0,1 M.

Kemudian dicampurkan enzim CDA(Kitin Deasetilase) 100 μL dalam 10ml larutan kitosan 1% lalu di inkubasipada suhu 55 0C selama 24 jam. Hasilpengukuran derajat deasetilasi kitosanenzimatis dengan spektrofotometer IRdisajikan pada gambar 3.

Gambar 3. Spektra IR kitosan hasildeasetilasi enzimatis hasilPengukuran

spektrofotometer FTIR(-8010PC)

3.4 Kadar AirBerdasarkan hasil penelitian telah

diketahui bahwa kadar air kitosansebesar 7,59%. Hal ini menunjukkanbahwa kitosan yang dihasilkanmemenuhi standar mutu kadar abuyang ditetapkan Spesifikasi KitosanNiaga (Anonim, 1987) yakni sebesar <10%. Kadar air tidak dipengaruhi olehkonsentrasi NaOH serta suhudeasetilasi yang digunakan. Hal inidisebabkan kadar air yang terkandungpada kitosan dipengaruhi oleh prosespengeringan, lama pengeringan yangdilakukan, jumlah kitosan yangdikeringkan dan luas permukaantempat kitosan dikeringkan (Saleh etal., 1994).

3.5 Kadar AbuHal ini menunjukkan bahwa kadar

abu kitosan belum memenuhi standaryang ditetapkan Spesifikasi KitosanNiaga (Anonim, 1987) yakni < 2%.sebagian besar cangkang udangmengandung mineral kalsium karbonatdan kalsium fosfat. Penghilanganmineral dipengaruhi oleh prosespengadukan selama demineralisasi,

sehingga panas yang dihasilkanmenjadi homogen. Prosespengadukan yang konstan akanmenyebabkan panas merata sehinggapelarut asam klorida (HCl) dapatmengikat mineral secara sempurna.Jika pengadukan yang dilakukan tidakkonstan maka panas yang dihasilkantidak merata, sehingga reaksipengikatan mineral oleh pelarut jugaakan tidam sempurna (Hartati FK etal., 2002). Selain itu proses pencucianyang baik hingga diperoleh pH netraljuga berpengaruh terhadap kadar abu.Mineral yang terlepas dari sampelakan berikatan dengan pelarut dapatterbuang dan larut bersama air (Angkadan Suhartono, 2000).

4. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapatdisimpulkan bahwa karakteristikkitosan yang meliputi kadar air, kadarabu, dan derajat deasetilasi masing-masing adalah 7,39%, 2,10%, danderajat deasetilasi kimia murni sebesar71%. Berdasarkan pengamatanspektrofotometer IR menunjukkanadanya kitosan hasil deasetilasisebagian yang terdeteksi pada daerahserapan amina primer denganbilangan gelombang 1645,77 cm-1,dan setelah penambahan enzim CDAmenghasilkan kitosan yang terdeteksipada daerah serapan 1636,50 cm-1.

5. Ucapan Terima Kasih

Penulis mengucapkan terima kasihatas dukungan dana penelitian dariProgram Kegiatan Insentif PKPP 2011Kementrian Riset dan Teknologimelalui penelitian pembuatan kitosandan nano partikel kitosan dengantripoli fosfat dari limbah cangkangudang (crustaceae) dan aplikasinyasebagai bahan memperpanjang shelf-life produk buah segar dan buahkaleng dengan No. Kontrak12/SPK/RISTEK/BPKIMI/03/2011tanggal 3 Maret 2011.

6. Daftar Pustaka

Angka, S.L. dan M.T. Suhartono, 2000.Pemanfaatan Limbah Hasil Laut.IPB.Bogor

AOAC. 1999. Official Methods ofAnalysis of AOAC International.5th Revision. Volume 2. CunnifP(Editor). Maryland : AOACInternational.

Bastaman S. 1989. Studies OnDegradation and Extraction ofChitin and Chitosan FromPrawn Shells. Belfast: TheDepartement Of MechanicalManufacturing , Aeronauticaland Chemical Engineering. TheQueen's University

Hartati FK, Susanto.T, Rakhmadiono S,Adi Loekito S. 2002. Faktor-faktor yang berpengaruhterhadap tahap deproteinasiMenggunakan Enzim Proteasedalam Pembuatan Kitin danKitosan dari cangkang Rajungan(Portunus Pelagius). JurnalBiosain. Vol 2:1

Hirano, S. 1986. Chitin and Chitosan.Ulmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry. Republickaof Germany. 5th . ed. A 6: 231 –232.

Kafetzhopoulos D, Martinou A, BouriotisV. 1993. Bioconversion of chitinto chitosan: purification andcharacterization of chitindeacetylase from Mucor Rouxii.Proc Natl Acad Scii USA90:2564-2568.

Mario, F. D., P. Rapan’a, U. Tomati, E.Galli.2008. Chitin and Chitosanfrom Basidomycetes. Intern.Journal of BiologicalMacromolecules, 4:8-12

Muzzarelly.1986. Studies on TheSuitable of ChitinocisticMicroorganism for Shrimp

Waste Fermentation.Dissertation. University ofWashington. New York.

No, H.K., S.P. Meyers, K.S. Lee, 1989.Isolation abd Characterization ofchitin frow Crawfish ShellWaste, J. Agri. Food Chem.,37:575-579

Saleh MR, Abdillah, Suerman E, BasmalJ, Indriati N.1994. PengaruhSuhu, waktu dan konsentrasipelarut pada Ekstraksi Kitosandari Limbah Pengolahan UdangBeku Terhadap BeberapaParameter Mutu Kitosan. JurnalPasca Panen Perikanan 81:30-43

Tsigos I, Bouriotis V. 1995. Purificationand Characterization of ChitinDeacetylase from ColletotrichumLindemuthianum. The JournalOf Biological Chemistry 270:26286-26291.

Tsigos, I., A. Martinou, Kafetzopoulosand V. Bouriotis. 2000. Chitindeacetylases: New versatiletools in biotechnology. TIBTECHRev, 18: 305-312.

Tokuyasu K, Ono H, Kameyama MO,Hayashi K, Moil Y. 1997.Deacetylation of ChitinOligosaccharides of dp 2-4 byChitin Deascetylase fromColletotrichum Lindemuthianum.Carbohydrate Research303:353-358.