Upload
dangtram
View
236
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE ISOLATBacillus sp.UJ-132 SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK DARI HUTAN
MANGROVE DESA MARGASARI LAMPUNG TIMUR
(Skripsi)
Oleh
MILSA SOLVA DIANA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG2018
ABSTRAK
Produksi dan Karakterisasi Enzim Protease Isolat Bacillus sp. UJ-132sebagai Kandidat Probiotik dari Hutan Mangrove Desa Margasari Lampung
Timur
Oleh
Milsa Solva Diana
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui produksi dan karakterisasi enzimprotease dari isolat Bacillus sp. UJ132 yang diisolasi dari kawasan hutanmangrove Desa Marga Sari Lampung Timur. Uji aktivitas enzim dilakukansecara kualitatif dan kuantitatif. Tujuan penelitian ini adalah menentukan produksioptimum enzim dan mengamati karakterisasi enzim meliputi penentuan suhu danpH optimum, pengaruh beberapa ion logam serta penentuan Km dan Vmaks. Darihasil percobaan diketahui bahwa enzim protease dihasilkan pada waktu produksioptimum 18 jam yang menghasilkan aktivitas protease sebanyak 0,09 U/ml. Suhuoptimum enzim ini yaitu pada suhu 50 oC yang menghasilkan aktivitas sebesar0,08 U/ml. Enzim protease ini mempuyai kondisi optimum pada pH 5 dengannilai aktivitas 0,09 U/ml. Semua ion logam (Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+) berfungsisebagai inhibitor kecuali ion Fe2+ yang berfungsi sebagai aktivator padakonsentrasi 1 µM dan 5 µM. EDTA dengan konsentrasi 1 µM dan 5 µMberfungsi sebagai inhibitor pada enzim protease isolat UJ132. Nilai Vmaks enzimprotease 0,33 U/ml sedangkan Km senilai 4,59 mg/ml substrat, enzim inimempunyai afinitas yang tinggi terhadap substrat.
Kata Kunci: Bacillus sp; Bakteri Proteolitik; Hutan Mangrove; Probiotik;Protease.
PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE ISOLAT
Bacillus sp.UJ-132 SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK DARI HUTAN
MANGROVE DESA MARGASARI LAMPUNG TIMUR
Oleh
MILSA SOLVA DIANA
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar
SARJANA SAINS
pada
Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG
2018
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di OKU Timur, Sumatera Selatan
pada tanggal 26 Agustus 1996 sebagai anak pertama
dari empat bersaudara, dari pasangan bapak Muhtar dan
ibu Parisyam.
Penulis mulai menempuh pendidikan dini Taman
Kanak-kanak Raudhatul Athfal Nurul Huda, kemudian
melanjutkan pendidikan Sekolah Dasar Negeri 01 Sukaraja Luar dan
menyelesaikannya pada tahun 2008, selanjutnya penulis menempuh pendidikan
Sekolah Menengah Pertama hingga tahun 2011 di SMP Negeri 01 Buay Madang.
Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 3 Martapura, Sumatera
Selatan dan menyelesaikannya tahun 2014. Pada tahun yang sama, penulis
diterima sebagai mahasiswi Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung melalui
jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN).
Selama menempuh pendidikan di kampus Penulis pernah menjadi asisten
praktikum mata kuliah Mikrobiologi Umum dan Mikrobiologi Pangan dan
Industri. Selain itu penulis juga aktif di dunia organisasi kampus yaitu Himpunan
Mahasiswa Biologi (HIMBIO).
vi
Aktivitas organisasi penulis dimulai sejak menjadi Anggota Muda Biologi
(Amuba) tahun 2014–2015. Selanjutnya penulis aktif dalamHimpunan Mahasiswa
Biologi (Himbio) FMIPA Unila sebagai anggota biro Keskretariatan dan Logistik
(Kalog) tahun 2015 dan menjadi anggota divisi Komunikasi dan Informasi
(Kominfo) tahun 2016.
Penulis melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di desa Subing Karya,
Kabupaten Lampung Tengah dari bulan Januari-Februari 2017. Pada bulan Juli –
Agustus 2017, penulis melaksanakan Kerja Praktik di Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor dengan judul penelitian “Isolasi dan
Karakterisasi Bakteri Susu Sapi Perah yang Terinfeksi Mastitis”. Penulis
melaksanakan penelitian di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas
MIPA, Universitas Lampung pada bulan Januari 2018 hingga Maret 2018.
PERSEMBAHAN
حیم حمن الر بســــــــــــــــــم هللا الر
Segala puji bagi Allah SWT yang selalu menunjukkan jalan kebaikan dan melimpahkan
nikmat sehat, sehingga atas Ridho-Nya karya ini dapat terselesaikan dengan baik.
Kupersembahkan karya ini dengan setulus hati kepada:
Yang teristimewa orangtuaku tercinta,Ayahanda Muhtar dan Ibunda Parisyam yang selalu menyebut namaku dalam doa, serta yang
selalu memberikan segalanya untuk pendidikanku, yang menjadi sumber kekuatanku untuktetap bertahan dalam mewujudkan cita-cita.
Ketiga adikku dan segenap keluarga,Adik-adikku tersayang Rana Okta Viani, Chelsea Olivia dan Galang Ahmad Givaris yangselalu mendoakan,smemberikan canda tawa, motivasi tiada henti dan menjadi teman cerita
baik suka maupun duka.
Teruntuk yang kuhormati,Bapak Dr.Sumardi, M,Si., Bapak Ir. Salman Farisi, M.Si.
Dan Ibu Dra. C.N. Ekowati, M.Si.
Para Guru dan Dosen,Atas dedikasi yang telah mengajarkan ilmu pengetahuan dan nilai-nilai moral serta yang
membuat diri ini memahami sebagian akan kebesaran Allah SWT.
Sahabat-sahabat tersayang,
Yang telah memberikan pengalaman, nasihat-nasihat, canda dan tawa selama masa studi.
Serta,Almamater tercinta
Universitas Lampung
MOTTO
Allah akan meninggikan orang-orang yang beriman di antaramu dan orang-orangyang diberi ilmu pengetahuan beberapa derajat
(Q.s. al-Mujadalah : 11)
“Kita semua harus menerima kenyataan, tapi menerima kenyataan saja adalahpekerjaan manusia yang tak mampu lagi berkembang. Karena manusia juga bisa
membikin kenyataan-kenyataan baru. Kalau tak ada orang mau membikin kenyataan-kenyataan baru, maka “kemajuan” sebagai kata dan makna sepatutnya dihapuskan dari
kamus umat manusia.”(Pramoedya Ananta Toer, House of Glass)
“Orang kaya memiliki TV kecil dan perpustakaan besar, sementara orang miskinmemiliki perpustakaan kecil dan TV besar.” – Zig Ziglar
“sedangkan sebetulnya cara mendapatkan hasil itulah yang lebih penting daripadahasil sendiri”(Tan Malaka)
“Apa gunanya ilmu kalau tidak memperluas jiwa seseorang sehingga ia berlaku sepertisamudera yang menampung sampah-sampah?”
(Emha Ainun Nadjib)
Apa gunanya ilmu kalau hanya untuk mengibuli? Apa guna banyak baca buku, kalaumulut kau bungkam melulu?
(Wiji Thukul)
Jangan gunakan kefasihan berbicaramu (mendebat) dihadapan Ibumu yang dahulumengajarimu berbicara
(Ali bin Abi Thalib)
SANWACANA
Alhamdulillahirobbilalamiin,
Puji syukur kehadirat Allah SWT. yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-
Nya sehingga Penulis mampu menyelesaikan skripsi yang berjudul “Produksi
dan Karakterisasi Enzim Protease Isolat Bacillus sp.UJ-132 Sebagai
Kandidat Probiotik dari Hutan Mangrove Desa Margasari Lampung Timur”
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains di Universitas
Lampung. Penelitian ini merupakan bagian dari proyek penelitian Bapak
Dr. Sumardi, M.Si. tahun 2018.
Penulis mengucapkan terimakasih dengan tulus kepada semua pihak yang telah
memberikan bantuan, bimbingan, nasihat, semangat dan dukungan dalam proses
penyusunan skripsi ini maupun selama masa studi. Secara tulus, Penulis
mengucapkan terimakasih kepada:
1. Ibunda Parisyam dan Ayahanda Muhtar tercinta, yang selalu menjadi
kekuatan terbesar untuk melakukan yang terbaik dalam hidup. Terima kasih
atas segala doa yang terus dipanjatkan, support, dan kasih sayang yang tak
pernah putus.
x
2. Adikku tercinta (Rana Okta Viani, Chelsea Olivia dan Galang Ahmad
Givaris) terima kasih atas segala keriangan yang selalu kalian berikan.
Semoga kita selalu membuat ayah dan ibu tersenyum.
3. Bapak Dr. Sumardi, M.Si. selaku Dosen PembimbingUtama yang senantiasa
membimbing, memberikan ilmu, motivasi, saran dan kritik baik selama
perkuliahan maupun dalam proses penyelesaian skripsi ini.
4. Bapak Ir. Salman Farisi, M.Si. selaku Dosen Pembimbing Kedua yang
senantiasa membimbing, memberikan ilmu, memberikan waktu, motivasi dan
semangat selama proses penyusunan skripsi maupun selama masa
perkuliahan.
5. Ibu Dra. C.N. Ekowati, M.Si.selaku Dosen Penguji yang senantiasa
membimbing, memberikan ilmu, motivasi, kritik dan saran baik dalam proses
penyelesaian skripsi maupun selama masa perkuliahan.
6. Ibu Endang Linirin Widiastuti, Ph.D. selaku Pembimbing Akademik yang
telah memberikan arahan dan motivasi selama perkuliahan maupun dalam
penyusunan skripsi.
7. Bapak Prof. Dr. Ir. Hasriadi Mat Akin, M.P., selaku Rektor Universitas
Lampung.
8. Bapak Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
9. Ibu Dr. Nuning Nurcahyani, M.Sc. selaku Ketua Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
10. Seluruh dosen dan karyawan Jurusan Biologi atas semua bimbingan
pengajaran, pelayanan dan bantuan yang telah diberikan.
xi
11. Tim CKPTWB dan MIKROPEDIA (Suminta Frida Hairisah, Komang Rima,
Nandia Putri Aulia, Rismayanti, Rizka Oktavia, Agung Setia Ningsih, Benny
Hartanto, Rosmaida La. Sinurat, Diana Ismawati, Ketut Mahendri) terima
kasih atas kerjasama, kebersamaan, kesabaran, dan canda tawa yang
diberikan. Semoga kita dapat meraih kesuksesan dan kebahagiaan.
12. Sahabat terbaikku, Rumpies (Adelea Tasya Putri, Puput Dian Anggraini,
Rachma Aulia, Sesti Edina Merisca, Suminta Frida Hairisah dan Triana
Gusmaryana) yang telah menemani di waktu luang, senggang, susah, dan
senang.
13. UNO Group, Fanisha Restu Dikjayati, Lasmi Putri Kinasih, Nana Nurhasanah dan
Nurisfa’ni, yang selalu menyelaraskan pengetahuan dan keimanan serta senantiasa
mengajak untuk bermuhasabah diri.
14. Sahabat LDR ku, Ev dan Nyett nun jauh disana yang selalu mendengarkan
keluhan dan lawakan basi serta menjadi teman bernostalgia, terima kasih
untuk keabsurdan kalian.
15. Sobat Puware ku, yuk Riska Sri Haryanti, Fitri Satriawati, Lesi Mareta,
Liyana Mardova dan Nunik Indah Wayyah yang selalu menjadi kawan
melancong dikala pulkam di Sukaraja tercinta dan senantiasa menjadi kawan
dalam merancang masa depan yang masih kelabu.
16. Microholic 2013, kak Yovita Selvie Pasaribu yang selalu memberikan
pengarahan, motivasi dan senantiasa mendengarkan dan memberi solusi atas
segala kebingungan dan ketidakpahaman selama penelitian.
17. Teman-teman terdekatku (Annisa Gena Saras Agustia, Nurjulia Jashinda
Akas, Indria Ratna. Eka Ratna Susmala Dewi dan Pratami Dwi Rahmawati)
terima kasih untuk semangat, canda tawa dan kebersamaannya.
xii
18. Microholic 2014 terimakasih atas pengetahuan, kerjasama, dukungan, canda
dan tawa selama ini yang telah kalian berikan.
19. Teman-teman KKN desa Subing Karya, Bagus Prasojo, Eva Narulita Kurnia
Perdana, Ibnu Alwan, M. Ikhwan Alrasyid, Revilarita Arlanda dan Yula Fadilah,
terimakasih untuk kebersamaan yang telah dilalui selama 40 hari dan berkesan
hingga kini.
20. Teman-teman seperjuangan Biologi Angkatan 2014, terima kasih atas
semangat serta kekeluargaannya yang telah terjalin selama ini. Seluruh
kakak-kakak dan adik-adik tingkat Jurusan Biologi FMIPA Unila yang tidak
dapat disebutkan satu persatu atas kebersamaan, dukungan dan semangatnya.
21. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu yang telah
membantu, mempermudah serta mendoakan dalam penelitian hingga
penyelesaian skripsi ini.
22. Serta almamater tercinta, Universitas Lampung.
Akhir kata, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan,
akan tetapi besar harapan semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan
bermanfaat bagi kita semua. Semoga Allah SWT senantiasa membalas semua
kebaikan yang telah diberikan kepada penulis.
Bandar Lampung, 3 Agustus 2018
Penulis,
Milsa Solva Diana
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK .......................................................................................... i
HALAMAN SAMPUL DALAM....................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN .......................................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN............................................................ iv
RIWAYAT HIDUP ............................................................................ v
PERSEMBAHAN............................................................................... vii
MOTTO .............................................................................................. viii
SANWACANA ................................................................................... ix
DAFTAR ISI....................................................................................... xiii
DAFTAR TABEL .............................................................................. xvi
DAFTAR GAMBAR.......................................................................... xvii
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang .......................................................................... 1B. Tujuan Penelitian....................................................................... 4C. Manfaat Penelitian..................................................................... 4D. Kerangka Pikiran....................................................................... 4E. Hipotesis .................................................................................... 5
xiv
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Enzim ....................................................................................... 61. Pengertian Enzim .............................................................. 62. Produksi Enzim ........ 73. Sifat Enzim......................................................................... 104. Mekanisme Kerja Enzim.................................................... 105. Jenis Enzim ........................................................................ 126. Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim.................... 147. Kinetika Enzim................................................................... 178. Isolasi Enzim...................................................................... 18
B. Enzim Protease ........................................................................ 21C. Bacillus sp. .............................................................................. 23D. Bakteri Probiotik ...................................................................... 24E. Hutan Mangrove....................................................................... 27
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu ................................................................... 30B. Alat dan Bahan ......................................................................... 30C. Metode Penelitian..................................................................... 31D. Analisis Data ........................................................................... 31E. Prosedur Kerja.......................................................................... 31
1. Peremajaan Isolat Bakteri .................................................... 31a. Uji Aktivitas Protease secara Kualitatif.......................... 32b. Uji Aktivitas Enzim Protease secara Kuantitatif ............ 32
1. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Proteolitik.............. 322. Produksi Enzim Protease............................................ 333. Uji Aktivitas Enzim Protease .................................... 334. Karakterisasi Enzim Protease..................................... 35
a. Penentuan Suhu Optimum..................................... 35b. Penentuan Ph Optimum......................................... 35c. Pengujian Daya Hambat Inhibitor dan Berbagai
Ion Logam terhadap Aktivitas Enzim Protease ..... 35d. Penentuan Km dan Vmaks .................................... 36
IV.HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Uji Kualitatif ............................................................................ 38B. Produksi Enzim Protease.......................................................... 39
xv
C. Karakterisasi Enzim Protease1. Suhu Optimum..................................................................... 402. Ph Optimum......................................................................... 413. Pengaruh Ion Logam dan Inhibitor EDTA pada Aktivitas
Enzim Protease .................................................................... 434. Penentuan Km dan Vmaks .................................................. 44
V.KESIMPULAN DAN SARAN
A.Kesimpulan................................................................................. 47B. Saran .......................................................................................... 47
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………. 48
LAMPIRAN………………………………………………………… 55
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1. Jenis-jenis Enzim ...................................................................................14
Tabel 2. Mekanisme Uji Kuantitatif Protease ......................................................34
Tabel 3. Ulangan 1 Optimasi Waktu Produksi.........................................................62
Tabel 4. Ulangan 2 Optimasi Waktu Produksi.........................................................62
Tabel 5. Ulangan 3 Optimasi Waktu Produksi.........................................................62
Tabel 6. Ulangan 1 Pengaruh Suhu................................................................................. 63
Tabel 7. Ulangan 2 Pengaruh Suhu................................................................................. 63
Tabel 8. Ulangan 3 Pengaruh Suhu................................................................................. 63
Tabel 9. Ulangan 1 Pengaruh Ph..................................................................................... 64
Tabel 10. Ulangan 2 Pengaruh pH.................................................................................. 64
Tabel 11. Ulangan 3 Pengaruh pH.................................................................................. 64
Tabel 12. Ulangan 1 (5 µm) Pengaruh Ion logam.......................................................... 65
Tabel 13. Uji Ion Logam (1 µm) ................................................................................. 65
Tabel 14. Data Pengaruh Substrat…………………………………………........65
Tabel 15. Nilai Kinetika Enzim………………………………………………...65
DAFTAR GAMBAR
HalamanGambar 1. Struktur Kuartener Protease ................................................................. 6
Gambar 2. Mekanisme Lock Key .........................................................................11
Gambar 3. Mekanisme Induce-fit.........................................................................12
Gambar 4. Pengaruh Suhu....................................................................................15
Gambar 5. Pengaruh pH.......................................................................................16
Gambar 6. Pengaruh Inhibitor..............................................................................17
Gambar 7. Struktur Sekunder beta-sheet dan alpha-helix Protein.......................23
Gambar 8. Bacillus sp. ........................................................................................24
Gambar 9. Ekosistem Hutan Magrove ................................................................27
Gambar 10. Isolat UJ-132 Menghasilkan Zona Bening........................................38
Gambar 11. Optimasi Waktu Produksi .................................................................39
Gambar 12. Pengaruh Suhu...................................................................................40
Gambar 13. Aktivitas Enzim Protease pada Beberapa Variasi pH .......................42
Gambar 14. Pengaruh Beberapa Ion Logam dan Inhibitor EDTA terhadapAktivitas Enzim Protease .................................................................43
Gambar 15. Kurva Lineweaver-Burk Enzim Protease..........................................45
Gambar 16. Uji Kuantitatif Enzim.................................................................................. 68
Gambar 17. Natan dan Supernatan Protease………………………………………….. 68
Gambar 18. Media Produksi Protease………………………………............................. 68
Gambar 19. Hasil Sentrifuge Uji ………………………………..…………………… 68
xviii
Gambar 20. Uji Enzim Protease………………………………………...……………….69
Gambar 21. Media Produksi Protease……………………………………...…….……...69
Gambar 22. Ekstrak Seluler…………………………….......………………………...…69
Gambar 23. Media Produksi yang Dishaker di Orbitasl Shaker…………………...... ..69
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Munculnya beberapa penyakit pada hasil perikanan laut seperti penyakit
vibriosis pada udang maupun ikan laut lainnya, memurunkan hasil produksi
perikanan. Tingginya tingkat mortalitas udang budidaya diduga disebabkan
oleh infeksi virus maupun bakteri patogen (Ali, 2009).
Badan Pusat Statistik (BPS) melaporkan bahwa produksi budidaya perairan
laut di provinsi Lampung pada tahun 2011 sebanyak 1.151 ton, tahun 2012
meningkat menjadi 1.193 ton, pada tahun 2013 meningkat kembali menjadi
2.978 ton, kemudian pada tahun 2014 menurun menjadi 2.816 ton, kemudian
terjadi peningkatan dua kali lipat pada tahun 2015 menjadi 4.105 ton. Produksi
pada tahun 2016 mengalami penurunan yang drastis hingga mencapai angka
1.159 ton saja. Hal ini menimbulkan kerugian ekonomi yang sangat
signifikan. Salah satu penyebab munculnya kerugian ini adalah terjadinya
infeksi mikrorgoranisme patogen pada produk perikanan. Laporan dari
berbagai wilayah di dunia menyatakan bahwa kerugian ekonomi akibat
mikroorganisme patogen ini di seluruh dunia mencapai US$ 3 miliar per tahun
(Subasinghe et al., 2001; Hill, 2005).
2
Berbagai upaya telah dilakukan untuk mengendalikan penyakit dan kualitas air,
salah satunya menggunakan probiotik. Probiotik didefinisikan sebagai
mikroba hidup yang ditambahkan dalam jumlah tertentu dan mampu bertahan
hidup dalam ekosistem saluran pencernaan. Mikroba probiotik memiliki peran
positif pada inang. Peran mikroba tersebut berpengaruh terhadap kesehatan
dan nutrisi inang (Gismondo et al.,1999).
Probiotik memiliki keunggulan dibandingkan cara-cara pengendalian yang
lainnya, di antaranya adalah : (1) menekan pertumbuhan bakteri pathogen
termasuk diantaranya bakteri vibrio dan (2) mampu memperbaiki kualitas air
(Moriarty,1998). Beberapa pegiat ilmiah telah melakukan penelitian untuk
mencari manfaat dari penggunaan probiotik diantaranya pemanfaatan probiotik
di sektor budiya perikanan (Fadilah et al.2012), bioremediasi kualitas air
(Muliani et al., 2008), efisiensi pada pakan (Murdianto, 2015). Penelitian
mengenai probiotik sebagian besar dimanfaatkan untuk pembenihan atau
efisiensi pakan baik dalam budidaaya perairan.
Kelompok bakteri yang termasuk probiotik antara lain Bacillus sp..,
Photobacterium sp., dan Lactobacillus sp. (Irianto, 2003). Bakteri dalam
saluran pencernaan terutama hewan akuatik telah diketahui memiliki peran
baik diantaranya bakteri pada genus Bacillus, Bifidobacteri, Pseudomonas,
Lactobacillus, dan Micrococcus telah terbukti sebagai bakteri yang
menguntungkan dan dapat hidup berasosiasi sebagai flora normal pada
organisme baik di dalam maupun di luar tubuh (Feliatra et al., 2004).
3
Sumber bakteri probiotik yang telah diteliti di antaranya adalah air dan
sedimen laut, karang, dan daun mangrove (Tjahjadi et al., 1994; Rosa et al.,
1997; Hala, 1999; Haryanti et al., 2000; Muliani et al., 2004).
Proses penguraian bahan organik di mangrove melibatkan multi spesies bakteri
(Suastika-Jaya et al, 1996). Bakteri-bakteri tersebut tersusun dari berbagai
jenis bakteri, seperti bakteri proteolitik, selulolitik, amilolitik, nitrifikasi dan
denitrifikasi. Limbah organik yang mempunyai kandungan protein tinggi akan
terdekomposisi menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh bakteri proteolitik.
Beberapa bakteri proteolitik telah ditemukan yaitu Bacillus, Pseudomonas dan
Vibrio (Tsao, 1984). Secara alamiah, bakteri proteolitik sudah terdapat dalam
perairan mengrove meskipun dengan kuantitas dan kualitas yang terbatas
(Browdy et al., 2001).
Beberapa peneliti telah menemukan bakteri penghasil protease di hutan
mangrove. Yahya (2014) melaporkan bahwa golongan Bacillus sp. antara lain
B. megatrium dan B. pumilus ditemukan dalam perairan mangrove. Bakteri
menguraikan serasah secara enzimatik melalui peran aktif dari enzim
proteolitik, selulolitik dan kitinoklastik. Bakteri Bacillus sp., Pseudomonas
sp., Nitrococcus sp., Micrococcus sp. dan Vibrio sp. merupakan bakteri
chemoheterof yang tergantung pada nutrien dalam ekosistem mangrov e
(Rajab, 2010). Beberapa genus bakteri yang diketahui mampu menghasilkan
protease di antaranya Bacillus (Rao et al., 1998; Said dan Likadja, 2012).
Sejauh ini potensi dari isolat bakteri Bacillus sp. yang berasal dari hutan
mangrove di Lampung belum banyak digali, oleh karena itu perlu dilakukan
4
kajian ilmiah mengenai enzim proteolitik dari isolat Bacillus sp. sebagai
kandidat probiotik yang bersumber dari hutan mangrove di desa Marga Sari
Lampung Timur.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui karakteristik enzim
protease yang dihasilkan isolat Bacillus sp. sebagai kandidat probiotik dari
hutan mangrove wilayah Lampung Tengah.
C. Manfaat Penelitian
Hasil dari penelitian ini adalah menambah koleksi bakteri proteolitik penghasil
enzim protease dan diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah untuk
peneliti dan masyrakat mengenai karakteristik enzim protease.
D. Kerangka Pikiran
Bakteri yang dikenal menghasilkan protease ekstrasel diantaranya Bacillus sp.
Protease ekstraseluler merupakan enzim konstitutif yaitu enzim yang
dibentuk terus-menerus oleh sel.Protease merupakan enzim yang dapat
menghidrolisis senyawa protein menjadi asam amino.
Bakteri proteolitik dapat ditemukan pada habitat alami diantaranya di
kawasan hutan mangrove. Manggrove sebagai habitat bakteri mengandung
banyak protein sebagai subtrat, yang terkandung dalam berbagai komponen
penyusun lantai mangrove. Dari lingkungan mangrove di desa Margasari
ditemukan lima Isolat Bacillus sp. diantaranya isolat Bacillus sp. UJ-132.
5
Salah satu isolat yang terpilih diantaranya Bacillus sp. UJ-132. Kemampuan
isolat Bacillus sp. UJ-132 dalam menghidrolisis protein tergantung pada
jumlah protease yang dihasilkan.
Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan. Kondisi
lingkungan yang mempengaruhi karakter enzim antara lain: suhu, pH, ion-ion
logam. Mengetahui sifat dan karakter suatu enzim sangat penting untuk
mengetahui kondisi optimum aktivitas enzim. Lingkungan mangrove di
daerah hutan mangrove Margasari memiliki kondisi suhu 23 oC. Pada kondisi
yang optimum, enzim akan bekerja maksimal. Kondisi lingkungan habitat asal
bakteri proteolitik sangat berpengaruh terhadap karakter enzim protease yang
dihasilkan .
E. Hipotesis
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah diperoleh waktu produksi,
pH dan suhu optimum, inhibitor dan aktivator spesifik, serta Km dan Vmaks
yang dapat memberikan aktivitas optimum protease dari Bacillus sp. Isolat UJ-
132.
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Enzim
1. Pengertian Enzim
Enzim merupakan katalisator pilihan yang diharapkan dapat mengurangi
dampak pencemaran lingkungan dan pemborosan energi karena reaksinya
tidak membutuhkan energi, bersifat spesifik dan tidak beracun. Enzim telah
dimanfaatkan secara luas pada berbagai industri produk pertanian, kimia
dan industri obat-obatan. Tiap sifat utama dari biokatalisator adalah
menaikkan kecepatan reaksi, mempunyai kekhususan dalam reaksi dan
produk serta kontrol kinetik (Akhdiya, 2003).
Gambar 1. Struktur Kuartener Protease
7
Berdasarkan biosintesisnya, enzim dibedakan menjadi enzim konstitutif dan
enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di
dalam sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan, sedangkan enzim
induktif adalah enzim yang ada dalam jumlah sel yang tidak tetap,
tergantung pada adanya induser. Enzim induktif ini jumlahnya akan
bertambah sampai beberapa ribu kali bahkan lebih apabila dalam medium
mengandung substrat yang menginduksi, terutama bila substrat penginduksi
merupakan satu-satunya sumber karbon (Rahayu, 2010).
2. Produksi Enzim
Komponen utama enzim adalah protein sehingga sintesis enzim sangat
terkait dengan proses ekspresi genetik. Oleh sebab itu, pengaturan sintesis
enzim pada dasarnya adalah pengaturan ekspresi genetik.
Mekanisme pengaturan sintesis enzim telah banyak dipelajari pada bakteri
dengan menggunakan model operon (dikemukakan oleh Francois Jacob dan
Jackues Monod, 1961). Operon terdiri atas serangkaian gen struktural yang
mengkode protein yang terlibat dalam suatu proses metabolisme tertentu.
Situs operator ialah sekuen DNA yang mengatur transkripsi gen struktural
dan gen regulator yang mengkode protein yang mengenali daerah operator.
Pada banyak bakteri, gen-gen struktural yang menentukan sintesis enzim
dalam suatu lintasan metabolik tertentu ditempatkan menurut urutan sesuai
dengan rangkaian reaksi pada lintasan tersebut. Hal ini menunjukkan
bahwa urutan reaksi pada lintasan metabolik dikendalikan oleh kromosom
(Murray et al., 2002).
8
Sintesis Enzim merupakan proses terbentuknya enzim sebagai protein yang
terdiri dari 2 tahap yaitu tahap transkripsi dan tahap translasi. Tahap
transkripsi adalah tahap dimana pada saat pembentukan mRNA di dalam
nukleus dari DNA template dengan dibantu oleh enzim polimerase. Tahap
translasi adalah tahap dimana mRNA keluar dari inti sel dan bertemu
dengan tRNA lalu dibantu oleh Ribosom yang terdiri dari sub unit besar
dan sub unit kecil (Marzuki, 2014)
1. Transkripsi
Transkripsi adalah proses pembentukan molekul RNA dari DNA.
Proses transkripsi memerlukan kerja sekelompok enzim yang disebut
dengan RNA polimerase. Untuk memulai proses ini, dibutuhkan adanya
sinyal atau tanda yang berupa gen tertentu. Gen yang menjadi tanda itu
adalah kodon AUG. Tempat mulainya transkripsi ini disebut hulu, atau
dikodekan dengan bentuk 5`. Proses dimulainya transkripsi dikenal
dengan istilah inisiasi. Pada pengakhiran proses transkripsi, ada daerah
yang disebut hilir yang sering ditandai dengan bentuk 3`. Proses
diakhirinya transkripsi dikenal dengan istilah terminasi. Proses
transkripsi selalu berjalan dari hulu ke hilir, artinya selalu berjalan
menurut arah 5` ke 3`.
Proses antara inisiasi dan terminasi adalah proses pemanjangan atau
dikenal dengan proses elongasi. Pita mRNA dengan pita DNA memiliki
panjang yang berbeda. Untaian RNA lebih pedek dari pada untaian
9
DNA. Di dalam satu untai DNA double helix bisa terjadi beberapa
proses transkripsi yang menghasilkan beberapa untai mRNA.
Informasi yang diterjemahkan dari DNA ke RNA adalah basa
nitrogennya. Jika pada untai DNA sens terdapat basa nitrogen adenin
(A), maka pada rantai mRNA akan diterjemahkan sebagai basa nitrogen
urasil (U). Jika pada untai DNA sens terdapat basa nitrogen guanin
(G), maka pada untai mRNA akan diartikan sebagai basa nitrogen
sitosin (S). Hal ini berlaku sebaliknya. Untai inisiasi pada DNA-pun
akan diterjemahkan menjadi untai terminasi pada mRNA, dan
sebaliknya.mRNA yang telah selesai dicetak (dalam arti telah selesai
menerima informasi genetik dari DNA) akan meninggalkan DNA,
keluar dari inti sel melalui pori-pori membran inti sel menuju
sitoplasma untuk melanjutkan proses translasi.
2. Translasi
Proses translasi dibantu dengan bantuan molekul-molekul perantara lain
yang terdapat di dalam sitoplasma, yaitu tRNA atau
RNA pemindah. tRNA berfungsi untuk mengikat asam amino pada satu
ujungnya, sedangkan ujung yang lain mampu untuk mengenal
kodon mRNA untuk tempat melekatnya asam amino yang dia ikat.
Asam amino yang terdapat di dalam sitoplasma akan diikat oleh tRNA.
Pengikatan ini dibantu dengan menggunakan energi yang berupa
ATP (adenin tripospat). ATP berfungsi untuk mengaktifkan asam
10
amino agar siap untuk diangkut ke subunit ribosom.Translasi meliputi
tiga tahapan, yaitu inisiasi, elongasi, dan terminasi.
3. Sifat Enzim
Enzim bersifat spesifik dalam mengkatalis suatu reaksi. Setiap enzim
memiliki suhu dan pH optimum yang berbeda-beda (spesifik untuk masing-
masing enzim). Reaksi enzimatik secara umum bekerja denga cara
menurunkan energi aktivasi. Hal inilah yang menyebabkan reaksi yang
dikatalisis secara enzimatik menjadi lebih efisien dibandingkan dengan
reaksi yang dikatalisis oleh katalis kimia (August, 2000).
Enzim mempunyai kekhususan aktivitas, yaitu berperan sebagai katalis
hanya terhadap satu jenis reaksi saja (Winarno, 1986). Sifat spesifik
(spesifisitas enzim) didefinisikan sebagai kemampuan suatu enzim untuk
mendiskriminasikan substratnya berdasarkan perbedaan afinitas substrat-
substrat untuk mencapai sisi aktif enzim (August, 2000). Sifat spesifinitas
ini dapat dimanfaatkan untuk tujuan reaksi atau jenis produk yang
diharapkan. Sifat ini sangat menguntungkan karena tidak akan dijumpai
reaksi-reaksi samping, sehingga lebih ramah lingkungan.
4. Mekanisme Kerja Enzim
Terikatnya substrat pada sisi aktif enzim menyebabkan berubahnya
keadaan substrat sehingga berada dalam keadaan transisi dan akibatnya
molekul substrat mengalami perubahan konformasi transisi yang
diperlukan agar dapat diubah menjadi produk. Beberapa ion logam yang
11
merupakan kofaktor juga membantu terjadinya ikatan sustrat dengan enzim
(Wheeler, 1994). Jika enzim telah melakukan pembentukan ikatan antara
enzim dengan substrat dengan membentuk molekul kompleks enzim
substrat, pembentukan molekul ini sangat dipengaruhi oleh bentuk sisi aktif
enzim dan kespesifikan substrat.
Menurut Saono (1976) ada dua teori pembentukan kompleks enzim substrat
yaitu:
a) Teori lock and key (Kunci Gembok)
Diilustrasikan dimana substrat yang spesifik akan terikat pada daerah
spesifik di molekul enzim yang disebut sisi aktif. Substrat mempunyai
daerah polar dan non polar pada sisi aktif yang baik bentuk
maupun muatannya merupakan pasangan substrat.
Gambar 2. Mekanisme Lock Key
b) Teori induced-fit (ketetapan induksi)
Teori ini menerangkan bahwa enzim bersifat fleksibel. Dimana
sebelumnya bentuk sisi aktif tidak sesuai dengan bentuk substrat,
12
tetapi setelah substrat menempel pada sisi aktif, maka enzim akan
terinduksi dan menyesuaikan dengan bentuk substrat.
Gambar 3. Mekanisme Induced-fit
5. Jenis Enzim
Berdasarkan biosintesisnya, enzim dibedakan menjadi enzim konstitutif
dan enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di
dalam sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan, sedangkan enzim
induktif adalah enzim yang ada dalam jumlah sel yang tidak tetap,
tergantung pada adanya induser. Enzim induktif ini jumlahnya akan
bertambah sampai beberapa ribu kali bahkan lebih apabila dalam medium
mengandung substrat yang menginduksi, terutama bila substrat penginduksi
merupakan satu-satunya sumber karbon (Lidya dan Djenar, 2000).
Berdasarkan tempat bekerjanya, enzim dapat dibedakan dalam 2 golongan,
yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim disebut juga enzim
intraseluler, dihasilkan di dalam sel yaitu pada bagian membran sitoplasma
dan melakukan metabolisme di dalam sel. Eksoenzim (enzim ekstraseluler)
merupakan enzim yang dihasilkan sel kemudian dikeluarkan melalui
dinding sel sehingga terdapat bebas dalam media yang mengelilingi sel dan
13
bereaksi memecah bahan organik tanpa tergantung pada sel yang
melepaskannya (Soedigdo, 1988).
Menurut Poedjadi (2005), enzim yang dibagi kedalam enam golongan
tersebut digolongkan berdasarkan pada jenis reaksi yang dikatalisis,
keenam golongan enzim tersebut yait:
a. Oksido-reduktase Enzim yang berperan dalam reaksi oksidasi-reduksi.
Enzim yang termasuk dalam golongan ini ada dua yaitu dehidrogenase
dan oksidase. Contoh enzim dehidrogenase yaitu : alkohol
dehidrogenase dan glutamat dehidrogenase. Contoh enzim oksidase
yaitu : glukosa oksidase dan glisin oksidase
b. Transferase Enzim yang berperan dalam reaksi pemindahan gugus
tertentu. Contoh enzim yang termasuk golongan ini adalah
metiltransferase, hidroksimetiltransferase dan aminotransferase.
c. Hidrolase Enzim yang berperan dalam reaksi hidrolisis. Ada tiga jenis
enzim hidrolase, yaitu jenis yang memecah ikatan ester, memecah
glikosida, dan yang memecah ikatan peptida. Contoh enzim hidrolase
yaitu esterase, lipase, amilase, aminopeptidase, karboksipeptidase,
pepsin, tripsin, dan kimotripsin.
d. Liase Enzim yang termasuk golongan ini mempunyai peranan penting
didalam reaksi pemisahan suatu gugus dari suatu substrat (bukan cara
hidrolisis) 9 atau sebaliknya. Contoh enzim golongan ini yaitu:
dekarboksilase, aldolase, dan hidratase.
e. Isomerase Enzim yang termasuk dalam golongan ini bekerja pada
reaksi perubahan intramolekular misalnya reaksi perubahan glukosa
14
menjadi fruktosa. Contoh : ribulosafosfat epimerase, dan glukosafosfat
isomerase.
f. Ligase Enzim yang berperan pada reaksi penggabungan dua molekul,
oleh karenanya enzim-enzim tersebut juga dinamakan sintetase. Ikatan
yang terbentuk adalah ikatan C-O, C-S, C-N, atau C-C. Contoh:
glutamin dan piruvat karboksilase.
Tabel 1. Jenis-jenis Enzim
6. Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim
a. Temperatur
Suhu inkubasi sangat mempengaruhi kerja dari enzim, suhu inkubasi
yang lebih tinggi dari suhu optimum kerja enzim dapat menyebabkan
terjadinya perubahan konformasi sisi aktif enzim yang disebabkan
adanya denaturasi protein enzim (Aehle, 2004). Sebagian besar enzim
terdenaturasi pada suhu diatas 50 OC (Wolfe, 1993). Dalam batas-batas
15
suhu tertentu, kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim akan naik bila
suhunya naik.
Temperatur mempengaruhi aktivitas enzim. Pada temperatur rendah,
reaksi enzimatis berlangsung lambat, kenaikan temperatur akan
mempercepat reaksi, hingga suhu optimum tercapai dan reaksi
enzimatis mencapai maksimum. Kenaikan temperatur melewati
temperatur optimum akan menyebabkan enzim terdenaturasi dan
menurunkan kecepatan reaksi enzimatis (Armstrong,1983).
Gambar 4. Pengaruh Suhu
b. pH (Derajat Keasaman)
Eenzim pada umumnya bersifat amfolitik, yang berarti enzim
mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus
basanya, terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus
terminal amino. Perubahan kereaktifan enzim diperkirakan merupakan
akibat dari perubahan pH lingkungan (Winarno, 1989). Perubahan pH
dapat mempengaruhi asam amino kunci pada sisi aktif, sehingga
menghalangi sisi aktif enzim membentuk kompleks dengan substratnya
(Page, 1989).
16
Gambar 5. Pengaruh pH
c. Konsentarasi Enzim
Kecepatan laju reaksi enzimatik berhubungan langsung antara
konsentrasi enzim dengan substrat (Orten and Neuhaus, 1970).
Konsentrasi enzim secara langsung mempengaruhi kecepatan laju
reaksi enzimatik, laju reaksi meningkat dengan bertambahnya
konsentrasi enzim (Poedjiadi, 2005).
d. Konsentrasi substrat
Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada konsentrasi
substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat
meningkat. Peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil
hingga tercapai suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan
konsentrasi substrat hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan reaksi
(Lehninger, 1990).
e. Aktivator dan inhibitor
17
Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya.
Aktivator adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan kecepatan
reaksi 11 enzimatis. Komponen kimia yang membentuk enzim disebut
juga kofaktor. Kofaktor tersebut dapat berupa ion-ion anorganik seperti
Zn, Fe, Ca, Mn, Cu, Mg atau dapat pula sebagai molekul organik
kompleks yang disebut koenzim (Martoharsono dan Soeharsono, 1997).
Menurut Wirahadikusumah (2001) inhibitor merupakan suatu zat kimia
tertentu yang dapat menghambat aktivitas enzim.
Gambar 6. Pengaruh Inhibitor
7. Kinetika Enzim
Parameter dalam kinetika reaksi enzim adalah konstanta Michaelis-
Menten (Km) dan laju reaksi maksimum (Vmaks). Mekanisme reaksi
enzimatik untuk sebuah subtrat tunggal. Enzim (E) mengikat substrat
(S) dan menghasilkan produk (P). Kinetika enzim menginvestigasi
bagaimana enzim mengikat substrat dengan mengubahnya menjadi
produk. (Soedigdo, 1988).
18
Konsentrasi substrat mempengaruhi kecepatan reaksi yang dikatalisis
oleh enzim. Pada konsentrasi substrat yang amat rendah, kecepatan
reaksipun amat rendah, tetapi, kecepatan ini akan akan meningkat
dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Pada batas kecepatan
maksimum (Vmaks), enzim menjadi jenuh oleh substratnya, dan tidak
dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger, 1990).
Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan, yang dinyatakan
sebagai Km yang bermanfaat dalam menyatakan hubungan yang tepat
di antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik. Nilai Km
didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim
mencapai kecepatan setengah kecepatan maksimum. Nilai Km
merupakan unsur kunci di dalam persamaan Michaelis-Menten dan
bersifat khas bagi setiap enzim dengan menggunakan substrat tertentu
yang spesifik pada kondisi pH dan temperatur tertentu (Rajab, 2010).
8. Isolasi Enzim
Tahapan isolasi enzim meliputi:
a. Sentrifugasi
Sentrifugasi merupakan tahap awal pemurnian enzim. Metode ini
digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel.
Sentrifugasi akan menghasilkan supernatan yang jernih dan endapan
yang terikat kuat pada 13 dasar tabung, yang kermudian dipisahkan
secara normal. Sel-sel mikroba biasanya mengalami sedimentasi pada
19
kecepatan 5000 selama 15 menit (Scopes, 1982; Walsh and Headon,
1994).
Menurut Cooper (1994), prinsip sentrifugasi berdasarkan pada
kenyataan bahwa setiap partikel yang berputar pada laju sudut yang
konstan akan memperoleh gaya keluar (F). Besar gaya ini bergantung
pada laju sudut ω (radian/detik) dan radius pertukarannya (sentimeter)
(Sariningsih, 2000).
b. Fraksinasi dengan ammonium sulfat
Presipitasi adalah proses penambahan senyawa yang dapat
menggumpalkan dan memisahkan protein dari bahan lain sehingga
didapatkan protein yang lebih murni (Suhartono et al., 1992). Menurut
Chaplin dan Bucke (1990), presipitasi protein merupakan metode yang
berguna untuk pemekatan protein dan sering dilakukan pada tahap awal
dari pemurnian enzim. Presipitasi protein dapat dilakukan dengan
beberapa cara antara lain perubahan pH, penambahan pelarut organik
dan penambahan garam.
Pemekatan protein dengan penambahan garam ke dalam larutan enzim
merupakan cara yang banyak dilakukan. Garam yang dapat digunakan
berupa natrium klorida, natrium sulfat, atau ammonium sulfat.
Ammonium sulfat lebih sering digunakan karena memiliki beberapa
kelebihan dibandingkan garam-garam yang lain, yaitu mempunyai
kelarutan yang tinggi, tidak mempengaruhi aktivitas enzim, mempunyai
20
daya pengendapan yang efektif, mempunyai efek penstabil terhadap
kebanyakan enzim, dapat digunakan pada berbagai pH dan harganya
murah (Scopes, 1982).
Penambahan garam pada konsentrasi tinggi akan menurunkan kelarutan
protein. Hal ini dikarenakan adanya peningkatan muatan listrik di
sekitar protein yang akan menarik molekul-molekul air dari protein.
Interaksi hidrofobik sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi
akan menyebabkan pengendapan protein, yang disebut salting out.
Protein yang hidrofobisitasnya tinggi akan mengendap lebih dahulu,
sedangkan protein yang memiliki sedikit residu non polar akan tetap
larut meskipun pada konsentrasi garam yang paling tinggi (Scopes,
1982 ; Walsh and Headon, 1994).
Dialisis Salah satu metode yang digunakan untuk meningkatkan
kemurnian enzim adalah dialisis. Prinsip dialisis yaitu memisahkan
molekul-molekul besar dari molekul-molekul kecil dengan bantuan
membran semipermeable. Dialisis berfungsi untuk memisahkan garam-
garam anorganik agar tidak mengganggu tahap pemurnian enzim
selanjutnya. Dialisis dapat dilakukan dengan menggunakan kantong
selofan, kantong ini memiliki ukuran pori-pori yang lebih kecil dari
ukuran protein sehingga protein tidak dapat keluar dari kantong selofan.
Penggunaan kantong selofan memiliki beberapa keuntungan yaitu
mudah digunakan, memiliki harga yang relatif murah dan mudah
didapatkan (Kristanti, 2001).
21
B. Enzim Protease
Enzim protease adalah enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi asam
amino. Masing-masing protease mempunyai pengikat peptida yang spesifik.
Enzim ini diperoleh dari tumbuhan dan mikroorganisme. Sifat proteolitik
didasarkan pada kemampuan untuk memutus ikatan peptida protein.
(Suhartono, 1989). Menurut Surwanto (1994) berdasarkan pH optimum untuk
aktifnya enzim protease dibedakan atas 3 kelompok yaitu protese alkali,
protease netral dan protease asam.
Protease disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzim golongan
hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yang lebih sederhana,
seperti menjadi oligopeptida pendek atau asam amino, dengan reaksi hidrolisis
pada ikatan peptide. Enzim ini diperlukan oleh semua mahkluk hidup karena
bersifat esensial dalam metabolism protein. Protein ini memiliki banyak
struktur sekunder beta-sheet dan alpha-helix yang sangat pendek (Poliana,
2007).
Berdasarkan cara kerjanya Palmerr (1981) membagi protease menjadi dua,
yaitu:
1. Proteolisis terbatas,yang memcah hanya satu atau beberapa ikatan peptida
tertentu dari sebuah protein target. Contohnya adalah perubahan
prohormon menjadi hormon.
2. Proteolitis tak terbatas, yaitu mendgradasi protein menjadi asam amino
penyusunnya.
22
Hartley (1960) membagi protease menjadi 4 golongan :
1. Protease Serin,
a. Memiliki residu serin dalam lokasi aktifnya.
b. Bersifat endopeptidase
c. Yang termasuk enzim ini: tripsin, kimotripsin, elastase dan subtilin
2. Protease sulfhidril
a. Memiliki residu sulfhidril pada lokasi aktif
b. Kerja enzim ini dapat dihambat oleh senyawa oksidator, alkilator dan logam
berat
c. Yang termasuk enzimini : protease dari tanaman dan mikroba seperti
papain, fisin dan bromelin
3. Protease metal
a. Keaktifannya tergantung pada adanya metal dengan hubungan stoikiometrik
1 mol metal/1 molenzim
b. Dapat dihambat oleh EDTA (Ethlene Diamine Tetra Acetic Acid) dimana
dapat mengkelat metal sehingga keaktifan enzim hilang/berkurang.
c. Yang termasuk enzim ini : karboksipeptidase untuk beberapa amino
peptidase
4. Protease asam
a. Enzim yang pada lokasi aktifnya terdapat dua gugus karboksil
b. Aktif pada pH rendah,optimum 2,0-5,0
c. Keaktifannya dapat dihambat oleh p-bromo fenasilbromida.
d. Yang termasuk enzim ini : pepsin, renin dan protease kapang.
7
23
Gambar 7. Struktur Sekunder beta-sheet dan alpHa-helixProtein
C. Bacillus sp.
Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang, tergolong bakteri gram
positif, motil, menghasilkan spora yang biasanya resisten pada panas, bersifat
aerob (beberapa spesies bersifat anaerob fakultatif), katalase positif, dan
oksidasi bervariasi. Tiap spesies berbeda dalam penggunaan gula, sebagian
melakukan fermentasi dan sebagian tidak (Barrow, 1993).
Ditambahkan Claus & Barkeley (1986) genus Bacillus mempunyai sifat
fisiologis yang menarik karena tiap-tiap jenis mempunyai kemampuan yang
berbeda-beda, diantaranya : (1) mampu mengdegradasi senyawa organik
seperti protein, pati, selulosa, hidrokarbon dan agar, (2) mampu menghasilkan
antibiotik; (3) berperan dalam nitrifikasi dan dentrifikasi; (4) pengikat nitrogen;
(7) bersifat khemolitotrof, aerob atau fakutatif anaerob, asidofilik, psikoprifilik,
atau thermofilik. Menurut Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8
th editions dalam Hadioetomo (1985) kalsifikasi Bacillus sp.p. adalah sebagai
berikut:
Kerajaan : Procaryotae
Divisi : Bacteria
24
Kelas : Schizomycetes
Bangsa : Eubacteriales
Suku : Bacillaceae
Marga : Bacillus
Jenis : Bacillus spp.
Menurut Yuniati (2015) Mikroorganisme merupakan sumber enzim yang
paling potensial dibandingkan tanaman dan hewan. Penggunanan
mikroorganisme lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, dapat
tumbuh pada substrat yang murah, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui
pengaturan kondisi pertumbuhan dan rekayasa genetik.
Gambar 8. Bacillus sp.
D. Bakteri Probiotik
Probiotik adalah sediaan sel mikroba hidup yang memiliki pengaruh
menguntungkan terhadap kesehatan dan kehidupan inangnya (Salminen et
al., 1999). probiotik didefinisikan sebagai segala bentuk pakan tambahan
erupa sel mikroba utuh (tidak harus hidup) yang mengutugkan bagi hewan
inangnya melalui cara menyeimbangkan kondisi mikrobiologis inang,
memodifikasi bentuk asosiasi dengan inang atau komunitas mikroba
25
lingkunga hidupnya, meningkatkan pemanfaatan nutrisi pakan atau
memperbaiki kualitas lingkungan (Gatesoupe,1999; Verschure et al.,2000;
Irianto, 2003; Prima, 2004; Guarto dan Hendrajat, 2008).
Beberapa probiotik diketahui dapat menghasilkan enzim pencernaan seperti
amilase, protease dan lipase yang dapat meningkatkan konsentrasi enzim
pencernaan pada saluran pencernaan inang sehingga dapat meningkatkan
perombakan nutrien. Terdapat beberapa mekanisme respon probiotik yaitu
meliputi produksi bahan penghambat secara langsung, penurunan pH luminal
melalui produksi asam lemak terbang rantai pendek, kompetisi terhadap
nutrien dan tempat pelekatan pada dinding usus, interaksi bakterial (CE),
resistensi kolonisasi contohnya Lactobacilli vs bakteri patogen, merubah
respon imun, dan mengatur ekspresi gen colonocyte (Fooks dan Gibson,
2002; Steer et al., 2000; Mack et al., 1999).
Berbagai jenis mikroorganisme yang digunakan sebagai probiotik diisolasi
dari isi usus pencernaan, mulut, dan kotoran ternak atau manusia. Pada saat
ini, mikroorganisme yang banyak digunakan sebagai probiotik yaitu strain
Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus sp. , Streptococcus, yeast dan
Saccharomyces cereviceae. Mikroorganisme tersebut harus non-patogen,
Gram positif, strain yang spesifik, anti E. coli, tahan terhadap cairan empedu,
hidup, melekat pada mukosa usus, dan minimal mengandung 30 x 109 cfu/g
(Mack et al., 1999).
Target utama dari penggunaan probiotik dan prebiotik yaitu: (i) peningkatan
ketahanan inang terhadap patogen eksogenus pencernaan; (ii) mengontrol
26
penyakit dimana komponen mikroflora pencernaan telah diimplikasi dalam
aeteologi; (iii) menurunkan keracunan metabolisme mikrobial dalam
pencernaan; dan (iv) mengatur sistim imunitas inang. Secara keseluruhan,
tujuan dari strategi ini yaitu meningkatkan pertumbuhan bakteri yang dapat
bersaing dengan, atau antagonis terhadap bakteri patogen. Saat ini telah
banyak dilakukan penelitian penggunaan probiotik dan prebiotik terhadap
ternak non ruminansia maupun ruminansia. Pengaturan bakteri pencernaan
agar menjadi satu komunitas yang sehat melalui pemberian probiotik atau
prebiotik khususnya karbohidrat meningkatkan bakteri yang menguntungkan
saat ini banyak diteliti (Faggia, 2010).
Beberapa probiotik yang telah terbukti menekan populasi bakteri vibrio adalah
Bacillus sp. (Dalmin et al., 2001), Bacillus subtilis BT23 (Vaseeharan dan
Ramasamy, 2003), Bacillus subtilis UTM 126 (Balcázar dan Rojas-Luna,
2007).
Terdapat beberapa keuntungan dalam penggunaan probiotik atau biokontrol
untuk penanggulangan penyakit antara lain; (1) organisme yang dipakai telah
dipertimbangkan lebih aman daripada berbagai bahan kimia yang digunakan;
(2) tidak terakumulasi dalam rantai makanan; (3) adanya proses reproduksi
yang dapat mengurangi pemakaian yang berulang; (4) organisme sasaran
jarang yang menjadi resisten terhadap agen probiotik/biokontrol dibandingkan
dengan resistensinya terhadap bahan kimia atau antibiotik; (5) dapat dipakai
untuk pengendalian secara bersama-sama dengan cara-cara proteksi yang telah
ada sampai saat ini (Suwanto, 1994).
27
E. Hutan Mangrove
1. Pengertian Hutan Mangrove
Mangrove merupakan salah satu tumbuhan yang dikenal sebagai pelindung
fisik pantai untuk mencegah adanya abrasi. Mangrove tumbuh dan hidup
pada daerah berlumpur, basah, dan perairan pasang surut daerah tropis
(Purnobasuki, 2005).
Gambar 9. Ekosistem Hutan Mangrove
Serasah dan batang lapuk mangrove merupakan bahan organik yang telah
mengalami beberapa tahap dekomposisi oleh mikroorganisme dan telah
tercampur ke dalam tanah untuk menghasilkan zat organik dan mineral
bagi kesuburan tanah serta sumber bagi kehidupan fitoplankton. (Arief,
2007). Berbagai zat organik hasil dekomposisi serasah dan batang lapuk
oleh mikroorganisme umumnya adalah selulosa, hemiselulosa, dan pektin.
Diantara komponen organik tersebut, pektin merupakan substansi terbesar
pada tanaman yaitu berkisar antara 0,5-4,0 % dari berat basah tumbuhan
28
(Sakai et al., 1993; Whitaker, 1990; Kashyap et al., 2001; Jayani et al.,
2005).
2. Bakteri pada Mangrove
Kelembaban tanah hutan mangrove sangat basah dan sebagian titik lokasi
tanahnya berlumpur. Kondisi tanah yang lembab dan basah ini adalah
salah satu ciri dari habitat t anaman mangrove. Tanah mangrove yang
berlumpur ini menimbun serasah, sehingga serasah akan mengalami
dekomposisi oleh berbagai jasad renik (Lidya, 2000).
Spesies bakteri pektinolitik telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari
tanah Akola India yaitu Bacillus firmus, Bacillus coagulans, Bacillus
endophyticus, dan Bacillus vietnamensis (Aaisha dan Barata, 2016). Selain
itu, ditemukan pula bakteri pektinolitik di tanah perkebunan mangga
Andhra Pradesh yaitu Paenibacillus jamilae (Sridevi et al., 2016).
Penelitian serupa juga ditemukan bakteri pektinolitik dalam sedimen tanah
limbah pertanian di daerah El-Farafra Oasis, New Valley governorate,
Egypt yakni Bacillus subtilis (El-Sayed, 2015).
Mangrove juga mengandung protein yang dapat didegradasi oleh bakteri
proteolitik. Mann (1986) mengemukakan bahwa berat kering daun
mangrove mengandung 61 % protein. Bakteri akan menguraikan serasah
secara enzimatik melalui peran aktif dari enzim proteolitik Pada area
mangrove juga banyak ditemukan bangkai hewan-hewan air yang
mengandung protein pula; selanjutnya protein tersebut dapat didegradasi
29
oleh bakteri proteolitik yang hidup dalam tanah mangrove. Apabila
protein, baik yang berasal dari sisa-sisa mangrove maupun yang berasal
dari bangkai hewan-hewan air telah tergradasi oleh bakteri-bakteri
proteolitik, maka akan menambah nutrisi dalam tanah mangrove, sehingga
dapat menyuburkan area mangrove.
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan November – Januari 2018 di Laboratorium
Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu laminar air flow
cabinet, autoclave, oven, hot plate magnetic stirrer, neraca analitik, pH
meter, ultrasonic cleaner, inkubator, erlenmeyer, beaker glass, tabung
reaksi, mikro tip, cawan petri, kapas, kain kassa, keranjang, tabung reaksi,
kertas label, pipet volumetri dan pump, bunsen, gelas ukur, sentrifugasi
dingin, inkubator, orbital shaker, spektrrofotometer, kertas bening, pena,
stopwatch, ose bulat, ice bucket, ice gel, low incubator, sentri fugased dan
waterbath
2. Bahan
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi isolat bakteri Bacillus
sp. yang diperoleh dari kawasan Hutan Mangrove desa Margasari,
31
aquadest, media Sea Water Complete (SWC (bacto pepton, yeast
extract,gliserol,air laut, aquadest)), Skim Milk, substrat kasein, TCA
(thrichloroacetic acid) 0,1 M, Na2CO3 0,4 M, pereaksi Follin Ciocalteu,
Tyrosin standart,larutan Ion logam (Mn2+, Fe2+, Ca2+, Cu2+, Mg2+), Inhibitor
spesifik (EDTA), buffer Tris-HCL, buffer Sitrat (pH 5 dan 6), buffer fosfat
(pH 7 dan 8), dan buffer glisin NaOH (pH 9 dan 10) 0,5 M.
C. Metode Penelitian
Uji proteolitik dari isolat bakteri dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Uji
ini menggunakan 1 jenis isolat. Uji kualitatif ditentukan dengan melihat
adanya zona bening di sekitar koloni. Uji kuantitatif aktivitas protease
ditentukan dengan menggunakan metode Bergmeyer dan Grassl (1983) yang
diukur berdasarkan jumlah tirosin yang terbentuk. Banyaknya tirosin diukur
dengan spektrofotometer berdasarkan absorbansinya pada panjang gelombang
578 nm. Karakteristik enzim yang diaamti meliputi waktu produksi, suhu dan
pH optimum, pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik, serta penentuan Km
dan Vmaks.
D. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif.
E. Prosedur kerja
Prosedur kerja yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Peremajaan Isolat Bakteri
Isolat yang digunakan adalah Bacillus sp. dengan kode isolat UJI32 yang
32
diisolasi dari udang Pasir di kawasan hutan mangrove dil akukan uji
proteolitik dan selanjutnya diremajakan untuk diproduksi dan karakkterisai
enzim.
a. Uji Aktivitas Protease Secara Kualitatif
Uji kualitatif dilakukan dengan menggunakan media SWC agar yang
ditambah Skim Milk 1 %.Suspensi bakteri Bacillus sp. isolat UJ-132
proteolitikyang telah diremajakan diambil sebanyak 1 ose dan di
inokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi media SWC dan skim
Milk lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 OC. Jika terbentuk
zona bening disekitar koloni, hal tersebut menunjukkan adanya
aktivitas proteolitik ditunjukan dengan terlihatnya zona bening yang
muncul di sekitar koloni yang terbentuk (Putri, 2012).
b. Uji Aktivitas Enzim Protease Secara Kuantitatif
1. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Proteolitik
Isolat bakteri proteolitik yang yang berumur 48 jam pada media
SWC diambil 3 ose dan diinokulasikan ke dalam erlenmeyer ukuran
250 ml yang berisi 50 ml media SWC, kemudian diinkubasi selama
24 jam di atas orbital shaker pada suhu ruang dengan kecepatan 120
rpm.
33
2. Produksi Enzim Protease
Starter bakteri proteolitik sebanyak 5 ml diinokulasikan ke dalam 45
ml media SWC yang telah ditambah Skim Milk 0,25 %, kemudian
diinkubasi selama 0, 6, 12, 18, 24, 30, dan 36 jam di atas orbital
shaker dengan kecepatan 120 rpm dalam suhu ruang. Selanjutnya,
kultur dimasukkan ke dalam tabung dan enzim diisolasi dengan cara
disentrifugasi pada suhu 4 OC pada kecepatan 10000 rpm selama 10
menit. Supernatan yang diperoleh digunakan untuk uji aktivitas
protease.
3. Uji Aktivitas Enzim Protease
Aktivitas protease diukur dengan metode Bergmeyer dan Grassl
(1983), dengan menggunakan substrat kasein Hammerstein (b/v).
Prosedur pengujian aktivitas protease adalah mereaksikan 0,1 ml
enzim dengan 0,5 ml bufer Fosfat yang mengandung 2 % kasein.
Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 37 OC selama 10 menit, lalu
ditambahkan 0,1 M TCA (Trichloroacetic Acid). Larutan
diinkubasi kembali pada suhu 37 OC selama 10 menit, dilanjutkan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm 10 menit dengan
suhu 4 OC. Dari campuran hasil sentrifugasi diambil 0,375 ml
supernatan dan ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1,25
ml Na2CO3 0,4 M, kemudian ditambahkan 0,25 ml pereaksi Folin
Ciocalteau (1:2) dan diinkubasi pada suhu 37 OC selama 20 menit.
34
Hasil inkubasi diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 578 nm (Bergmeyer dan Grassl, 1983).
Tabel 2. Mekanisme Uji Kuantitatif Protease
Blanko(ml)
Standar(ml)
Sampel(ml)
Substrat kasien dalam BufferFosfat (0,1 M, pH 7)
0,5 0,5 0,5
Enzim - - 0,1Tirosin standar - 0,1 -Aquadest 0,1 - -Inkubasi pada optimum selama 10 menit
TCA (0,1 M) 0,5 0,5 0,5Enzim 0,1 0,1 -Aquadest - - 0,1Inkubasi pada 37 oC selama 10 menitSentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oCFiltrat 0,375 0,375 0,375Na2CO3 (0,4 M) 1,25 1,25 1,25Pereaksi Follin (1:2) 0,25 0,25 0,25Diamkan selama 20 menit pada suhu optimumBaca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm
Aktivitas ptotease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) per ml
ekstrak enzim (Djajasukma, 1993).
Keterangan :
PU : Unit Aktivitas Protease (Unit/ml)Asb : Nilai Absorbansi SampelAst : Nilai Absorbansi StandardAbl : Nilai Absorbansi BlankoT : Waktu
35
4. Karakterisasi Enzim Protease
a. Penentuan Suhu Optimum
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara
mereaksikan larutan ekstrak kasar enzim dan 0,25 % substrat
kasein. Dengan variasi suhu uji 20, 30, 40, 50, 60 dan 70 OC.
Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim mengikuti
metode Bergmeyer dan Grassl. Suhu optimum akan
menghasilkan hasil produksi yang maksimum
b. Penentuan pH Optimum
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara
mereaksikan larutan ekstrak kasar enzim dan 0,25 % substrat
kasein dinkubasi pada suhu 37 OC dalam satu seri bufer 0,05 M
yang berbeda, yakni: pH 4 dan 5 (buffer sitrat), pH 6 dan 7
(buffer fosfat), pH 8 dan 9 (buffer trisHCl), pH 10, 11 dan 12
(buffer glisin-NaOH). Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas
enzim mengikuti metode Bergmeyer dan Grassl (Soeka dan
Sulistiani, 2014).
c. Pengujian Daya Hambat Inhibitor dan Berbagai Ion LogamTerhadap Aktivatas Enzim Protease
Pengaruh ion logam Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+, Fe2+ sebagai aktivator
yang digunakan dalam bentuk garam masing-masing secara
berurutan adalah sebagai berikut: CaCl2, MnCl2, CuCl2, MgCl2, dan
36
FeCl3. Senyawa inhibitor untuk aktivitas protease yang digunakan
adalah senyawa pengkelat ion logam yang, asam etilen
diamintetraasetat (EDTA) dan satu tabung sebagai kontrol (tanpa
ion logam). Substrat enzim yang digunakan kasein 0,25 % yang
direaksikan dengan 1 µM dan 5 µM ion logam aktivator dan
senyawa inhibitor di atas. Enzim yang telah direaksikan dengan
ion logam dan inhibitor diinkubasi selama 10 menit pada suhu dan
pH optimum, kemudian dilakukan uji aktivitas enzim dengan
metode Bergmeyer dan Grassl (1983) yang dimodifikasi. Hasil uji
aktivitas protease kemudian dibandingkan dengan uji aktivitas
protease pada sampel yang tidak mendapat penambahan logam
(Baehaki, 2012 ; Wahyuntari dan Hendrawati, 2012).
d. Penentuan Km dan Vmaks
Penentuan kinetika enzim ini menggunakan hasil uji aktivitas
enzim mengikuti metode Bergmeyer dan Grassl (1983 ) yang
dimodifikasi pada suhu dan pH optimumnya dengan menggunakan
variasi konsentrasi substrat kasein sebagai berikut: 0 %, 1 %,
1,5 %, 2 % , dan 2,5 %. Nilai aktivitas protease yang diperoleh
kemudian digunakan untuk membuat kurva hubungan antara
konsentrasi kasein dan aktivitas spesifik enzim. Kemudian
hasilnya dimasukkan dalam persamaan linear Lineweaver-Burk.
Nilai Km dan Vmaks diperoleh dengan rumus (Wahyuntari dan
Hendrawati, 2012):
37
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Karakter enzim protease dari isolat Bacillus sp. UJ-132 adalah waktu
produksi optimum selama 18 jam. Enzim protease ini mempuyai pH
optimum 5. Suhu optimum enzim ini tergolong termostabil yaitu pada
suhu 50 oC. Semua ion logam (Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+) berperan sebagai
inhibitor kecuali ion Fe2+ yang membantu sebagai aktivator pada
konsentrasi 5 µM. Nilai Vmaks enzim protease 0,33 U/ml sedangkan Km
senilai 4,59 mg/ml substrat, enzim ini mempunyai afinitas yang tinggi
terhadap substrat.
B. Saran
Untuk mendapatkan hasil kerja enzim yang lebih baik, maka diperlukan
pemurnian serta karakterisasi dengan menggunakan elektroforesis dan
perlu dilakukan pengujian lebih lanjut dengan mengaplikasikan enzim
protease isolat Bacillus sp. UJ-132 pada pakan untuk budidaya perairan.
DAFTAR PUSTAKA
Aaisha, G.A., dan D.L. Barate. 2016. Isolation and Identification of PectinolyticBacteria from Soil Samples of Akola Region, India. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci. 5(1): 514-521.
Ali, Ridlo dan R. Pramesti. 2009. Aplikasi Ekstrak Rumput LautSebagai Agen Imunostimulan Sistem Pertahanan Non Spesifik PadaUdang (Litopennaeus vannamei). J. Ilmu Kelautan. Vol 14 (3):133-137.
Adinarayana, K., P. Ellaiah, dan D.S. Prasad. 2003. Purification and PartialCharacterization of Thermostable Serine Alkaline Protease from a NewlyIsolated Bacillus subtilis PE 11, AAPS Pharm Sci Tech, 4 (4), 1-9.
Aehle, W. 2004. Enzyme in Industry. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA,Weinheim. Germany. 175, 219, 232.
Akhdiya, A. 2003. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin Termostabil.Buletin Plasma Nutfah 9 (2).
Arief, M., Mufidah, dan Kusriningrum. 2007. Pengaruh Penambahan Probiotikpada Pakan buatan Terhadap Pertumbuhan dan Rasio Konversi Pakan IkanNila Gift (Oreochromis niloticus). Berkala Ilmiah Perikanan 3(2): 53-58
Armstrong, F.B. 1983. Biochemistry, Second Edition. Oxford University Press.135-139, 142-143.
August, E.G. 2000. Kajian lipase amobil dari Aspergillus niger pada pembuatanMAG yang bersifat antibakteri dati minyak kelapa. Tesis. Program PascaSarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Badan Pusat Statistik (BPS) Indonesia . 2016 . Produksi Perikanan Laut yangdijual di TPI. Jakarta.
Baehaki, A., Rinto dan A. Budiman . 2012. Isolasi dan Karakterisasi Proteasedari Bakteri Tanah Indralaya Sumatera Selatan. J. Teknol dan IndustriPangan112 : (37-41).
Balcazar, J.L., I. de Blas., I. Ruizzarzuela., D. Cunningham., D. Vandrell., danJ.L. Muzquiz. 2006. A review: The Role of Prebiotics in Aquaculture.Veterinary Mincrobiology 114 (2006): 173-186
49
Barrow, G.I. dan R.K.A. Feltham. 1993. Cowan and Steel’s Manual for theIdentification of Medical Bacteria Third Edition. Syndicate of theUniversity of Cambridge. United Kingdom.
Bergmeyer dan Grassl. 1983. Method of Enzymatic Analysis. Third Edition.VCH (Verlagsgesellschaft), Meinheim, Germany. Volume II (Samples,reagents, assesment of results). pp. 1 – 159.
Browdy, C.L., D.A.D. Bratvold., Stokes, dan R.P. Mcintosh. 2001. Perspective onthe application of closed shrimp culture system. P20-34. J. Jory (Eds).
Chaplin, M.F. dan Bucke. 1990. Enzyme Technology. Cambridge UniversityPress. England.
El-Sayed, M.H. 2015. Thermoalkali-Stable Pectinase from Bacillus subtilis StrainNVFO 19 Isolated from Agricultural Waste Dump Soil. 2015. CurrentResearch in Microbiology and Technology 3 (6) : 805-815.
Claus, D. dan R.C.W. Berkeley. 1986. Genus Bacillus Cohn 1872, 174. In Sneath,P. H. A., (ed.) Bergey’s manual of systematic bacteriology, Vol. 2,Williams and Wilkins, Baltimore, 1105-1139.
Cooper, T.G. 1994. The Tool of Biochemistry. John Wiley and Sons. Canada.
Prima, C.P. 2004. Pentingnya probiotik bagi tambak udang. CP Shrimp News.Surabaya.
Dalmin, G., Kathiresan., dan K. Purushothaman. 2001. Effect of Probiotics onBacterial Population and Health Status of Shirmp in Culture PondEcosystem. Indian J. Exp. Biol. 39, 939-942
Djajasukma. 1993. Isolasi Enzim Protease Dari Mucor javanicus. Pros. SeminarHasil Litbang SDH.
Esti, Y., L. Nurita., dan Arimurti .S. 2009. Karakterisasi Protease Ekstrak KasarBacillus sp 31. Jurnal Ilmu Dasar. 10 : (101-108)
Fadhilah, S.P., Z. Hasan, dan Haetami .K. 2012. Pengaruh Pemberian BakteriProbiotik Pada Pelet Yang Mengandung Kaliandra (Calliandracalothyrus)terhadap Pertumbuhan Benihan Nila (Oreochromis niloticus). J. Perikanandan Kelautan. Vol 3 (4): 285-291.
Feliatra., I. Efendi, dan E. Suryadi. 2004. Isolasi dan Identifikasi BakteriProbiotik dari Ikan Kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalamUpaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Natur Indonesia 6(2): 75-80.
50
Fooks, L.J. dan G.R. Gibson .2002. In-vitro investigation of the effect ofprobiotics and prebiotics on selected human intestinal pathogens. FEMSMicrobiol. Ecol. 39: 67 – 75.
Gaggia, F., P. Mattarelli, dan B. Biavati. 2010. Probiotic and prebiotics inanimal feeding for safe food production. Intl. J. Food Microbiol. 14:515 – 528.
Gatesoupe, F. 1999. A Review: The Use of Probiotic in Aquaculture.Aquaculture 180:147-165
Gismondo, M.R., L. Drago, dan A. Lombardi. 1999. Review of ProbioticsAvailable to Modify Gastrointestinal Flora. Internasional Journal ofAntimicrobial Agents, 12: 287-292
Guarto dan E.A. Hendrajat. 2008. Budidaya Udang Vaname (Litopenaeusvannamei) pada Pola Semi Intensif dengan Applikasi Jenis ProbiotikKomersial. J. Ris. Akuakultur, 3(3):303-313.
Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi. Gramedia. Jakarta.
Hala, Y. 1999. Penggunaan gen penanda molekular untuk deteksi pelekatan dankolonisasi vibrio harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon)[Disertasi]. Bogor. Institut Pertanian Bogor, Program Pascasarjana, 91hlm.
Hartley, B.S. 1960. Proteolytic enzymes. Annu Rev Biochem 29. 45-72.Inten, HN., Nengah IW., Mayun, LAAIA. 2015. Analisis PotensiProtease Ekstraselluler Tanah Hutan Mangrove Pantai Suwung KauhBali.Cakra Kimia. 3(2): 84-90.
Haryanti, S.K., S. Tsamura, dan T. Nishijima. 2000. Vibriostatic bacteriumisolated from seawater: Potentiality as probiotic agent in the rearing ofPenaeus monodon larvae. Ind. Fish. Res. J., 6: 26-32.
Hill, B.J. 2005. The Need for Effective Disease Control in InternationalAquaculture. Dev. Biol. (Basel) (121): 3–12
Irianto, A. 2003. Probiotik Akuakultur. Gadjah Mada University Press.Yogyakarta.
Jayani, R.S., S. Saxena, dan R. Gupta. 2005. Microbial pectinolyticenzymes: a review. Process Biochemistry, Vol.40, pp. 2931-2944
Kashyap, D.R., S. Chandra., A. Kaul, dan R. Tewari. 2000. Production,purification and characterization of pectinase from Bacillus sp. DT7.World journal of Microbiology and Biotechnology, Vol.16, pp. 277-282
51
Kristanti, N.D. 2001. Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Lipase Ekstraselulerdari Kapang Rhizopus oryzae TR 32. Tesis, Program Pascasarjana, IPB.Bogor
Kumar, D. dan T.C. Bhalla. 2004. Purification and Characterization of a SmallSize Protease from Bacillus sp. APR-4. Exp Biol 42: 515-517
Lehninger, A.L. 1990. Dasar – Dasar Biokimia Jilid 1. Terjemahan MaggyThenawidjaja. Jakarta : Penerbit Erlangga.
Lidya, B. dan N.S. Djenar. 2000. Dasar Bioproses. Direktorat Jendral|Pendidikan Tinggi DEPDIKNAS, Jakarta.
Mack, D.R., S. Michail., L. Wei., Mcdougall, dan M.A. Holingsworth. 1999.Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro inducingintestinal mucin gene expression. Amer. J. Physiol. 267(4 Pt 1): G941G950.
Mann, C.M. dan J.L. Markham .1998. A new method for determining theminimum inhibitory concentration of essential oils, Journal of AppliedMicrobiology, 84, 538-544.
Martoharsono, S. 1990. Biokimia Jilid I. UGM Press. Yogyakarta.
Marzuki, I. 2014. Enzim Struktur, Nomenklatur dan Mekanisme Kerja Enzim. UIPress. Jakarta.
Moriaty, D.J.W. 1998. Control of luminous Vibrio species in penaeidaquaculture ponds. Aquaculture,184:351-358.
Muliani, Nurbaya., A.Tompo, dan M. Atmomarsono.2004. Eksplorasi bakterifilosfer dari tanaman mangrove sebagai bakteri probiotik pada budidayaudang windu Penaeus monodon, J. Pen. Perik. Indonesia, 2: 47-57.
Muliani, S.A. dan Y. Hala. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asal lautSulawesi untuk biokontrol penyakit vibriosis pada larva udang windu(Penaeus monodon Fab.). J. Hayati, 10: 6-11.
Murray, J., B. Zhang., S.W. Taylor., D. Oglesbee., E. Fahy., M.F. Marusich.,S. S. Goshs, dan R.A. Capaldi. 2002. J Biol Chem 278, 13619-13622
Murdianto. 2015. Study on the effects of probiotic, Pediococcusacidilactici in thediet on some biological indices of Oscar astronautsocellatus.International Research Journal of Applied and Basic Sciences, 4 (11):3458-3464.
52
Novita, W., K. Arief., F.C. Nisa, dan U. Murdiyatmo. 2006. Karakterisasi ParsialEkstrak Kasar Enzim Protease dari Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-14396, Jurnal Teknologi Pertanian, 7(2), 96-105.
Orten, J.M. dan O.W. Neuhaus. 1970. Biochemistry C. V. Mosby Company.Saint Louis. 430-435.
Page, D.S. 1989. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta.
Palmer, J.K. 1981. The Banana. Dalam: Hulme, A.C. (Ed). The Biochemistryof Fruits and Their Product. Vol 2. Academic Press London and NewYork.
Poedjiadi, A.F.M., dan T. Supriyantini. 2005. Dasar-dasar Biokimia.UI Press. Jakarta.
Poliana, J. dan A.P. MacCabe. 2007. Industrial Enzymes; Structure, Function,and Applications. Dordrecht: Springer. Halaman:174. ISBN 978-14020-53764
Purnobasuki, H. 2005. Tinjauan perspektif hutan mangrove. AirlanggaUniversity Press. Surabaya.
Rao, M.B., A.M. Tanksale., M.S. Ghatge dan V.V Deshpe. 1998. Molecular &Microbiology. UK. London.
Rajab, F. 2010. Isolasi dan seleksi bakteri probiotik dari lingkungan tambak danhatcheri untuk pengendalian penyakit vibriosis pada larva udang windu,Penaeus monodon. J. Ris. Akuakultur, 5: 103-113.
Rahayu, K. 2010. Teknologi Enzim. PAU Pangan dan Gizi UGM. Yogyakarta.
Rosa, D., T.I. Zafran, dan M.A. Girsang. 1997. Pengendalian Vibrio harveyisecara biologis pada larva udang windu (Penaeus monodon): I. IsolasiBakteri Penghambat. J. Penel. Perik. Indonesia, 3: 1-10.
Sakai, T., T. Sakamoto., J. Hallaert, dan E.J. Vandamme.1993. Pectin, pectinaseand protopectinase: production, properties and applications. Advances inApplied Microbiology, Vol.39, pp. 213-294
Salminen, S. dan A. Von-Wright. 1999. Lactic Acid Bacteria. New YorkMarcel Dekker.
Said, M.I. dan J.C. Likadja. 2012. Isolasi dan Identifikasi Bakteri yangBerpotensi sebagai Penghasil Enzim Protease pada Industri PenyamakanKulit Pt.
53
Saono, S.1976. Metabolisme dari Fermentasi. Ceramah Ilmiah ProceedingLokakarya Bahan Pangan Berprotein Tinggi. LKN-LIPI, Bandung.Hal 5-7.
Sariningsih, R. 2000. Produksi Enzim Protease Oleh Bacillus subtilis BAC-4.Skripsi. Universitas Padjajaran. Bandung.
Scopes, R.K. 1982. Protein Purification. Springer Verlag. New York.
Soedigdo, 1988. Studi Akivitas Enzim Lipase dari Aspergillus niger sebagaibiokatalis pada proses gliserolisis untuk menghasilkan momoasilgliserol.Thesis. Universitas Diponegoro.
Steer, T., H. Carpenter., K. Tuohy., G.R. Gibson, dan T.E. Steer. 2000.Perspectives on the role of the human gut microbiota and its modulationby pro- and prebiotics. Nutr. Res. Rev. 13: 229 – 254.
Suastika, I.B.M., A. Taslihan, dan N.H. Abidin. 1996. Penerapan TeknikProduksi dan Preservasi Bakteri Remediasi. Techner 27:12-14.
Subasinghe, R.2001. Aquaculture development, health and wealth. Inaquaculture in the third millennium. Technical proceedings of theconference on aquaculture in the third millennium (Subasinghe, R.P. et al.,eds). pp. 167-191. Bangkok and FAO, NACA.
Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Departemen Pendidikan danKebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Antar UniversitasBioteknologi Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Suhartono, M.T., A. Suwanto, dan H. Widjaja. 1992. Diklat Struktur danBiokimiawi Protein. Penelitian Antar Universitas. IPB. Bogor.
Suwanto A. 1994. Pulsed-field gel electrophoresis: A revolution in microbialgenetic. Aspac. J. Mol. Biotechnol. 2:78-85.Dieffenbach dan Dveksler1995).
Tjahjadi M.R., S.L. Angka, dan A. Suwanto.1994. Isolation and evaluation ofmarine bacterial for biocontrol of luminous bacterial diseases in tigershrimp larvae (Penaeus monodon Fab ). Aspac J Mol Biol Biotechnol2:347-352.
Tsao. 1984. Alcohol from cellulose. Chemical Technology. 10(5): 315-319.
Vaseeharan, B. dan P. Ramasamy. 2003.Control of pathogenic Vibrio spp. ByBacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tigershrimp Penaeus monodon. J. Microbiol 36 (2) 8-7
54
Verschuere, L., G. Rombaut., P. Sorgeloos, dan W. Verstraete. 2000. ProbioticBacteria as Bioloical Control Agents in Aquaculture. Microbial andMolecular Biol Rev 64: 655-671
Wahyuntari B. dan H.Hendrawati. 2012.Properties of an Extracellular Protease ofBacillus megaterium DSM 319 as Depilating Aid of Hides. MicrobiologyIndonesia 6(2). doi : 10.5454/mi.6.2.4.
Walsh,G. dan D.R. Headon. 1994. Immobilized Enzym. John Wiley and Sons Ltd.New York.
Wheeler, M.F. 1994.Mikrobiologi Dasar Jilid II. Terjemahan SoenartomoAdisoemarto. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Whitaker, J.R. 1990. Microbial pectinolytic enzymes. Microbial enzymes andbiotechnology (2nd edition), W.M. Fogarty & C.T. Kelly, (Eds.), pp. 133176, Elsevier Science Ltd., ISBN: 1851664866, London, England.
Winarno, F. G. 1986. Enzim. Jakarta. Gramedia Pustaka Utama.
Wirahadikusuma, M. 2001. Biokimia Protein, Enzim dan Asam Nukleat.Bandung: ITB.
.Wolfe, S.L. 1993. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Publishing
Company. California.
Yahya, S. 2014. Bio-template Synthesis of SilikaRuthenium Catalyst ofBenzylation of Toluene. Journal of Physical Science. Vol. 24. No. 1.Pp. 29-35.
Yandri, T.S., H. Dian, dan H. Sutopo. 2007. The chemical modification ofprotease enzyme isolated from local bacteria isolate, Bacillus subtilisITBCCB148 with cyanuric chloride polyethylenglycol. Europ. J. Scien.Resea., 23: 177-186.
Yati, S.S. dan Sulistiani. 2014. Karakterisasi Protease Bacillus subtilis A1 InaccB398 yang Diisolasi Dari Terasi Samarinda. Berita Biologi 13 (2), 203211.
Yuniati, R., T.T. Nugroho, dan F. Puspita. 2015. Uji Aktivitas Enzim Proteasedari Isolat Bacillus sp Galur Lokal Riau. JOMP FMIPA. 1 :116-122.