Production of Fungal Mycelial Protein in Submerged Culture of Soybean Whey

8/12/2019 Production of Fungal Mycelial Protein in Submerged Culture of Soybean Whey

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A P P L I E D MICROBIOLOGYV o l . 1 2 , N o . 4 , p . 3 3 0 - 3 3 4 July 9 6 4C o p y r i g h t 1 9 6 4 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yP r i n t e d i n U . S . A .A P P L I E D MICROBIOLOGYP r o d u c t i o n o f F u n g a l M y c e l i al P r o t ei n i n S u b m e r g e d C u l t u r e o f

S o y b e a n WheyHELCIO FALANGHE,l A . K . SMITH, A N D J . J . R ACKI S

N o r t h e r n R e g i o n a l R e s e ar c h L a b o r a t o r y , A g r i c u l t u r a l R e s e a r c h S e r v i c e ,U . S . D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e , P e o r i a , I l l i n o i sR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 4 F e b r u a r y 1 9 6 4

A B S T R A C TF A L A N G H E , H E L C I O ( N o r t h er n R e g io n al R e s e a r c h L a b o r a t o r y ,P e o r i a , I l l . ) , A . K . S M I T H , AN D J . J . R A C K I S . P r o d u c t i o n o f f u n g a lm y c e l i a l p r o t e i n i n s u b m e r g e d c u l t u r e o f s o y b ea n w h ey . A p p l .M i c r o b i o l . 1 2 : 3 3 0 - 3 3 4 . 1 9 6 4 . - V a r i o u s s o y b e a n w h e y m e d i a w e r et e s t e d a s s u b s t r a t e f o r s e v e n s p e c i e s o f f u n g i i n s u b m e r g e d c u l -t u r e . V e r y l i t t l e m y c e l i a l g r o w t h w a s o b t a i n e d w i t h M o r c h e l l ah y b r i d a , C o l l y b i a v e l u t i p e s , C a n t h a r e l l u s c i b a r i u s , a n d X y l a r i ap o l y m o r p h a . A g a r i c u s c a m p e s t r i s f a i l e d t o g r o w . T r i c h o l o m a n u d u ma n d B o l e t u s i n d e c i s u s s h o w e d t h e g r e a t e s t r a t e o f g r o w t h a n dp r o d u c t i o n o f m y c e l i a l p r o t e i n a n d t h e b e s t u t i l i z a t i o n o f s o y b e a nw h e y s o l i d s , w i t h much s h o r t e r i n c u b a t i o n t i m e s c o m p a r e d w i t ht h o s e o f t h e o t h e r s p e c i e s . T . nudum d e v e l o p e d a s s p h e r e s h a v i n gd i a m e t e r s o f a b o u t 5 t o 8 mm, i n s t e a d o f t h e u s u a l s l u r r y o ry e a s t l i k e f o r m , i n t h e p r e s e n c e o f a d d e d ammonium a c e t a t e . B .i n d e c i s u s a l w a y s d e v e l o p e d a s s p h e r e s . M y c e l i a l y i e l d s a n d p r o -d u c t i o n o f p r o t e i n b y T . nudum g r e a t l y d e c r e a s e d w i t h t h e a d d i -t i o n o f more t h a n 1 g l u c o s e t o s o y b e a n w h e y , w h e r e a s w i t h B .i n d e c i s u s t h e y i e l d o f p r o t e i n a l m o s t d o u b l e d w h e n u p t o 3g l u c o s e w a s a d d e d . T h e e f f e c t o f m i n e r a l s o n m y c e l i a l g r o w t h wasd e t e r m i n e d . W i t h s o y b e a n w h e y c o n c e n t r a t e d t o 5 0 , t h e r a t eo f m y c e l i a l g r o w t h o f T . nudum was n e a r l y d o u b l e d , b u t p r o t e i nc o n t e n t o f m y c e l i a was g r e a t l y r e d u c e d . M y c e l i a l g r o w t h a n dy i e l d o f p r o t e i n o f B . i n d e c i s u s g r o w n i n c o n c e n t r a t e d w h e y w e r ei n c r e a s e d g r e a t l y . A b o u t 4 t o 6 g o f m y c e l i a l p r o t e i n p e r l i t e r c a n

b e o b t a i n e d f r o m f e r m e n t a t i o n i n s o y b e a n w h e y , d e p e n d i n gu p o n t h e medium u s e d . U t i l i z a t i o n o f s o y b e a n w h e y b y f u n g a lf e r m e n t a t i o n ma y h a v e e co n o mi c v a l u e i n w h e y d i s p o s a l a n d i nt h e p r o d u c t i o n o f p r o d u c t s o f h i g h p r o t e i n c o n t e n t .

T h e p o s s i b i l i t y o f g r o w i n g m u s h r o o m s f o r f o o d a n d t h e i rn u t r i t i o n a l r e q u i r e m e n t s i n s u b m e r g e d c u l t u r e s o f v a r i o u sm e d i a h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d ( H u m f e l d , 1 9 4 8 ; H u m f e l da n d S u g i h a r a , 1 9 4 9 , 1 9 5 2 ) . When g r o w n i n c h e m i c a l l y d e -f i n e d m e d i a , A g a r i c u s c a m p e s t r i s p o s s e s s e s a p l e a s a n t n u to r c h e e s e - l i k e f l a v o r ( H u m f e l d a n d S u g i h a r a , 1 9 5 4 ) . F l a -v o r s d e v e l o p e d b y s e v e r a l s p e c i e s o f m u s h r o o m s a l s o h a v eb e e n d e s c r i b e d ( E d d y , 1 9 5 8 ; B l o c k , 1 9 6 0 ; M o u s t a f a ,1 9 6 0 ) . M u s h r o o m s a r e r i c h i n a m i n o a c i d s a n d B - v i t a m i n s ,a n d h a v e a b o u t t h e sa me n u t r i t i v e v a l u e a s d o e s t o r u l ay e a s t ( B l o c k e t a l . , 1 9 5 3 ; R e u s s e r , S p e n c e r , a n d S a l a n s ,1 9 5 8 a ) . M o r c h e l l a e s c u l e n t a can s y n t h e s i z e g r o w t h - p r o -m o t i n g s u b s t a n c e s t h a t i t r e q u i r e s ( S z u e c s , 1 9 5 6 , 1 9 5 8 ) .

1 I U n i t e d N a t i o n s , UN I C E F r e s e a r c h f e l l o w f r o m t h e I n s t i t u t oZ i m o t e c n i c o , E s c o l a S u p e r i o r d e A g r i c u l t u r a , L i u z d e Q u e i r o z ,U n i e , r n i t y o f S a o P a u l o , P i r a c i c a b a , E . S a o P a u l o , B r a z i l .

T h e a b i l i t y o f M o r c h e l l a t o u t i l i z e v a r i o u s s u g a r s a s a s o u r c eo f e n e r g y w a s r e p o r t e d b y L i t c h f i e l d , O v e r b e c k , a n d D a v i d -s o n ( 1 9 6 3 ) . P r o t e i n a n d f a t c o n t e n t s o f s e v e r a l m u s h r o o m sg r o w n i n v a r i o u s m e d i a w e r e d e s c r i b e d b y R e u s s e r e t a l .( 1 9 5 8 b ) a n d b y F a l a n g h e ( 1 9 6 2 ) .S o y b e a n w h e y i s a n i n d u s t r i a l b y - p r o d u c t r e s u l t i n g f r o mt h e i s o l a t i o n o f s o y b e a n p r o t e i n a n d p r o t e i n c o n c e n t r a t e s .A l t h o u g h v a r y i n g i n y i e l d a n d c o m p o s i t i o n , w h o l e w h e ya c c o u n t s f o r a p p r o x i m a t e l y o n e - t h i r d o f t h e d e f a t t e d m e a la n d c o n t a i n s a b o u t 1 1 o f t h e t o t a l m e a l n i t r o g e n . On ad r y b a s i s , w h e y s o l i d s c o n t a i n 2 . 5 t o 3 . 5 n i t r o g e n , a b o u t5 0 o f w h i c h i s p r o t e i n n i t r o g e n a n d 2 5 t o 3 5 o f w h i c hi s s o l u b l e s u g a r s ( S m i t h , S c h u b e r t , a n d B e l t e r , 1 9 5 5 ; S m i t he t a l . , 1 9 6 2 ) . T h e e s s e n t i a l a m i n o a c i d c o n t e n t o f t o t a l w h e yp r o t e i n s a n d h e a t - c o a g u l a b l e p r o t e i n i s i n d i c a t i v e o f h i g hn u t r i t i o n a l v a l u e ( V a n E t t e n e t a l . , 1 9 5 9 ; R a c k i s e t a l . ,1 9 6 1 ) . B e c a u s e o f i t s l o w s o l i d s c o n t e n t ( 3 t o 4 % ) , r e c o v e r yo f w h e y i s n o t now e c o n o m i c a l l y f e a s i b l e a n d i t i s d i s c a r d e d .B e c a u s e t h i s p r a c t i c e i n c r e a s e s t h e b i o l o g i c a l d e m a n d o fs e w a g e s y s t e m s , u s e o f t h e w h e y s o l u t i o n a s a s u b s t r a t e w a si n v e s t i g a t e d f o r p r o d u c t i o n o f h i g h - p r o t e i n p r o d u c t s b yf u n g i f e r m e n t a t i o n i n s u b m e r g e d c u l t u r e . R a t e o f m y c e l i a lg r o w t h , p r o t e i n c o n t e n t o f m y c e l i u m , a n d f e r m e n t a t i v ec a p a c i t y a r e r e p o r t e d .

M A T E R I A L S AND M I E T H O D SWhey w a s p r e p a r e d f r o m d e h u l l e d a n d u n d e n a t u r e df l a k e s p r o c e s s e d f r o n m H a w k e y e s o y b e a n s , 1 9 6 1 c r o p y ea r( F i g . 1 ) . D e h u l l e d , d e f a t t e d m e a l w a s p r e p a r e d b y c r a c k i n g

t h e w h o l e b e a n s b e t w e e n c o r r u g a t e d r o l l s i n t o s i x t o e i g h tp a r t s a n d b y r e m o v i n g h u l l s b y a s p i r a t i o n i n a E u r e k a s e e dc l e a n e r ; t h e r e s u l t i n g c h i p s w e r e p r e s s e d i n t o f l a k e s b e -t w e e n s m o o t h r o l l s , a n d o i l w a s e x t r a c t e d w i t h h e x a n e( b o i l i n g p o i n t , 3 0 t o 6 0 C ) . F a c t o r s a f f e c t i n g t h e c o n m p o s i -t i o n o f w h e y w e r e r e p o r t e d b y S m i t h e t a l . ( 1 9 5 5 ) . C u l t u r e so f T r i c h o l o m a nudum NRRL 2 3 7 1 , C o l l y b i a v e l u t i p e s NRRL2 3 6 7 , M . h y b r i d a NRRL 2 6 0 0 , a n d C a n t h a r e l l u s c i b a r i u sNRRL 2 3 7 0 w e r e o b t a i n e d f r o m C . W. H e s s e l t i n e , N o r t h -e r n R e g i o n a l R e s e a r c h L a b o r a t o r y ; B o l e t u s i n d e c i s u s G r a y1 6 8 a n d X y l a r i a p o l y m o r p h a G r a y 1 5 4 w e r e o b t a i n e d f r o nW. D . G r a y , O h i o S t a t e U n i v e r s i t y , C o l u m b u s ; a n d A .c a m p e s t r i s w a s o b t a i n e d f r o m C e n t r a a l b u r e a u v o o r S c h i m -m e l c u l t u r e s , B a a r n , T h e N e t h e r l a n d s . C u l t u r e s w e r e m a i n -t a i n e d i n t h e d a r k o n m a l t a g a r s l a n t s a t 2 5 C .

3 3 0


2/5

P R O D U C T I O N O F F U N G A L P R O TE I N I N SOYBEAN WHEYI n o c u l u m was p r o d u c e d b y a s e p t i c t r a n s f e r o f m y c e l i a lb i t s t o 2 5 0 - m l s t a n d a r d - t a p e r E r l e n m e y e r f l a s k s c o n t a i n -i n g g l a s s b e a d s a n d 4 0 m l o f 5 m a l t e x t r a c t b ro t h . F l a s k s

were s t o p p e r e d w i t h c o t t o n p l u g s a n d i n c u b a t e d f o r 1 0 d a y sa t 2 5 C i n t h e d a r k . T h e m y c e l i u m was t h e n w a s h e d w i t hs t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r ; 4 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r were a d d e d ;a n d t h e m y c e l i u m was b r o k e n up b y v i g o r o u s s h a k i n ga f t e r r e p l a c i n g t h e c o t t o n w i t h a g l a s s p l u g . T h e r e s u l t i n gs u s p e n s i o n was u s e d a s i n o c u l u m ( 2 m l pe r f l a s k ) .T h e c u l t u r e s were grown i n t h e d a r k i n 5 0 0 - m l E r l e n -meyer f l a s k s c o n t a i n i n g 2 0 0 m l o f s t e r i l i z e d s o y b e a n wheymedium s h a k e n a t 2 0 0 r e v / m i n i n a r o t a t o r y s h a k e r h a v i n gan e c c e n t r i c i t y o f 2 . 2 5 i n . ( 5 . 7 2 c m ) a t 2 5 C .A n a l y t i c a l m e t h o d s . R e d u c i n g s u g a r s were d e t e r m i n e dc o l o r i m e t r i c a l l y w i t h t h e a l k a l i n e copper r e a g e n t o fS o m o g y i ( 1 9 4 5 ) a n d t h e a r s e n o m o l y b d a t e r e a g e n t o fN e l s o n ( 1 9 4 4 ) . T o t a l c a r b o h y d r a t e s were d e t e r m i n e d w i t ha n t h r o n e ( M o r r i s , 1 9 4 8 ) . T o t a l s o l i d s i n t h e w h e y m e d i aw e r e d e t e r m i n e d b y e v a p o r a t i n g t o d r y n e s s a t 1 1 0 C .M y ce l i al w e i gh t s were o b t a i n e d b y f i l t e r i n g , w a s h i n g w i t hd i s t i l l e d w a t e r , a n d d r y i n g a t 6 0 C u n d e r vacuum f o r 2 4h r . T o t a l n i t r o g e n was d e t e r m i n e d b y t h e m i cr o - K j e l d a hlm e t h o d , a n d t h e f a c t o r 6 . 2 5 was u s e d t o c a l c u l a t e c r u d ep r o t e i n . T h e r e p o r t e d d a t a a r e t h e av er ag e o f a t l e a s t t w oc u l t u r e r uns.

R E S U L T S AND D I S C U S S I O NS o y b e a n w h e y c o n t a i n s a p p r e c i a b l e a m o u n t s o f n i t r o g e n ,

c a r b o h y d r a t e s , a n d a s h . N i t r o g e n i s i n t h e f o r m o f p r o t e i n s ,

p e p t i d e s , f r e e a m i n o a c i d s , a n d o t h e r n i t r o g e n o u s comp o u n d s ; w h e y a l s o c o n t a i n s o l i g o s a c c h a r i d e s s u c h as s u -crose, r a f f i n o s e , s t a c h y o s e , v a r i o u s g l y c o s i d e s , g a l a c t a n s ,a n d h e m i c e l l u l o s e s ( M a r k l e y , 1 9 5 1 ) . S u b s t a n t i a l a mo unt so f p h o s p h o r u s a n d m i n e r a l s , l a r g e l y a s p h y t a t e s a l t s , area l s o p r e s e n t . Whey c o n t a i n s a h e a t s t a b l e i n h i b i t o r o fR h i z o p u s o l i g o s p o r u s ( H e s s e l t i n e , d e C a m a r g o , a n d R a c k i s ,1 9 6 3 ) a n d a h e a t - s t a b l e t r y p s i n i n h i b i t o r ( s ) ( R a c k i s , 1 9 6 1 ) .S o l i d s c o n t e n t o f w h e y s o l u t i o n 1 ( F i g . 1 ) i s a b o u t 3 t o 4 .

I n i n i t i a l e x p e r i m e n t s i t was f o u n d t h a t d i l u t e d wheys o l u t i o n 1 , even i n t h e pr e s e n c e o f a d d e d g l u c o s e , d i d n o ts u p p o r t g o o d m y c e l i a l g r o w t h o f T . nudum a n d B . i n d e c i -sus; t h e p r o t e i n c o n t e n t o f m y c e l i u m was a l s o g r e a t l y l o w -

D e h u l l e d , D e f a t t e d S o y b e a l M e a lD o u b l e e x t r a c t i o n w i t h w a t e rt o m e a l r a t i o o f 1 0 : 1 a n d 5 : 1 ;s t i r h r a t r o o m t e m p e r a t u r e ; c e n t r i f u g e

R iResidue

A c i d - P r e c i p i t a t e d P r o t e i n

W a t e r E x t r a c tA c i d i f y t o p H 4 . 4 w i t h1 N H C I , c e n t r i f u g e

W h e y S o l u t i o n - 1H e a t f o r 1 5 m i n .a t 8 0 C c e n t r i f u g e

H e a t - C o a g u l a b l e P r o t e i n W h e y S o l u t i o n - 2F I G . 1 . P r e p a r a t i o n o f s o y b e a n w h e y f o r f u n g a l f e r m e n t a t i o n .

TABLE 1 . G r o w t h o f f u n g i i n s o y b e a n w h e y m e d i u m w i t h a d d e d ammonium s a l t s aM y c e l i u m E f f i c i e n c y d

Species~ M e d i u m ' Time D r y wt o f N i t r o g e n tuar a r b h l D r y m a t t e rP r o t e i n m y c e l i u m l used u s e d d r a t e s used S u g a r O r i g i n a lD r y w t c o n t e n t u s e d s u g a r

h r l i t e r?; T r i c h o l o m a nudum . . . . . . . . . . . . 1 7 2 6 . 0 5 4 . 6 5 1 . 7 3 7 . 4 9 8 . 9 9 6 . 7 5 4 . 1 7 0 . 3 6 9 . 6T . n u d u m 2 7 2 6 . 6 5 3 . 7 5 6 . 0 5 0 . 7 9 8 . 3 9 7 . 7 7 5 . 1 7 6 . 1 7 4 . 8T . nudum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 6 8 6 . 7 6 0 . 7 5 8 . 3 4 0 . 9 9 7 . 2 9 6 . 3 6 4 . 8 8 9 . 3 8 6 . 8B o l e t u s i n d e c i s u s . . . . . . . . . . . . . 1 1 9 2 6 . 9 3 4 . 1 5 9 . 3 3 0 . 8 9 9 . 1 9 6 . 8 5 0 . 6 5 0 . 3 4 9 . 9B . i nd e ci s u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 2 6 . 7 2 8 . 4 5 9 . 1 2 6 . 0 9 8 . 7 9 4 . 3 5 4 . 1 4 1 . 1 4 0 . 3B . i n d e c i s u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 9 2 8 . 4 3 3 . 1 7 4 . 3 3 5 . 5 9 8 . 9 9 4 . 4 6 0 . 5 6 0 . 0 5 9 . 2M o r c h e l l a h y b r i d a . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 0 4 . 1 4 8 . 3 4 7 . 4 2 0 . 0 8 9 . 4 7 1 . 9 3 2 . 6 4 6 . 9 4 2 . 0M . h y b r i d a 2 3 6 0 3 . 9 5 4 . 7 4 3 . 4 2 1 . 9 8 7 . 3 7 5 . 2 2 8 . 7 5 2 . 2 4 5 . 5M. h y b r i d a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 6 0 eC o l l y b i a v e l u t i p e s . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 0 2 . 7 3 6 . 2 2 9 . 2 1 9 . 4 7 1 . 5 7 7 . 5 4 2 . 5 2 9 . 2 2 0 . 9C . v e l u t i p e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 4 0 2 . 8 3 6 . 8 3 0 . 6 1 2 . 4 7 2 . 8 7 6 . 8 3 3 . 9 3 0 . 3 2 2 . 1C . v e l u t i p e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 4 0 6C a n t h a r e l l u s c i b a r i u s . . . . . . . . . . 1 2 4 0 2 . 0 5 3 . 8 2 2 . 9 1 2 . 1 7 3 . 7 7 3 . 6 3 5 . 6 3 1 . 3 2 3 . 1C . c i b a r i u s 2 2 4 0 2 . 0 4 9 . 1 2 2 . 1 9 . 6 7 3 . 5 7 5 . 7 2 7 . 0 2 8 . 5 2 0 . 9C c i b a r i u s ................... 3 3 6 0 2 . 8 5 0 . 0 3 0 . 9 2 1 . 3 7 2 . 2 7 4 . 4 4 1 . 6 4 0 . 6 2 9 . 3X y l a r i a p o l y m o r p h a 1 1 9 2 2 . 0 4 3 . 9 1 7 . 6 1 0 . 5 9 8 . 9 9 5 . 5 4 4 . 2 1 9 . 0 1 8 . 8X . p o l y m o r p h a 2 1 9 2 1 . 4 3 8 . 1 1 2 . 4 8 . 0 9 7 . 2 9 3 . 6 3 6 . 9 1 1 . 6 1 1 . 2X . p o l y m o r p h a ................ 3 2 4 0 c

a M e d i a c o n t a i n e d ( p e r l i t e r ) : 0 . 1 6 n i t r o g e n , 0 . 4 7 r e d u c i n g s u g a r s , 1 . 2 0 t o t a l c a r b o h y d r a t e s , a n d 2 . 3 3 t o t a l s o l i d s ; i n i t i a l p Hwas 5 . 4 0 . A l l d a t a a r e a v e r a g e o f two f l a s k s .b M e d i a 1 , 2 , a n d 3 c o n t a i n e d 1 g o f a d d e d n i t r o g e n a s ammonium s u l f a t e , ammonium t a r t r a t e , a n d a mmo ni um a c e t a t e , r e s p e c t i v e l y .c E x p r e s s e d a s g p e r 1 0 0 g o f t o t a l c a r b o h y d r a t e u s e d .

d R a t i o o f g o f p r o t e i n p e r 1 0 0 g o f r e d u c i n g s u g a r s .- No g r o w t h .

V O L . 1 2 ) 1 9 6 4 3 3 1


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FALANGHE, SMITH, AND R A C K I Se r e d . D i l u t i o n a n d a d d i t i o n o f g l u c o s e h a d n o e f f e c t o nm y c e l i a l g r o w t h o f C . c i b a r i u s a n d C . v e l u t i p e s . Whey c o n -c e n t r a t e d 5 0 g r e a t l y i n c r e a s e d g r o w t h b u t r e d u c e dp r o t e i n c o n t e n t o f T . nudum a n d B . i n d e c i s u s . T h e s e p r e -l i m i n a r y r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t s o y b e an w h ey , a t i t s n o r -m a l c o n c e n t r a t i o n , c o u l d s u p p o r t a d e q u a t e g r o w t h .S t e r i l i z e d w h e y s o l u t i o n 1 c o n t a i n e d s u s p e n d e d p a r t i c l e so f h e a t - c o a g u l a t e d p r o t e i n , w h i c h p r e v e n t e d u n i f o r m d e -v e l o p m e n t o f m y c e l i u m t h r o u g h o u t t h e medium a n d i n t e r -f e r e d w i t h t h e d e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n . To a v o i d t h i sd i f f i c u l t y , s t e r i l i z e d w h e y w a s c l a r i f i e d b y f i l t r a t i o n , w h i c hr e m o v e d a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e n i t r o g e n . T h u s , i n a l lo t h e r e x p e r i m e n t s , w h e y s o l u t i o n 2 w a s u s e d ( F i g . 1 ) .T h e n , ammonium a c e t a t e , t a r t r a t e , o r s u l f a t e w a s a l s oa d d e d t o t h e m e d i a t o m a i n t a i n a s u i t a b l e r a t i o o f n i t r o g e nt o c a r b o n .

O f t h e s e v e n s p e c i e s o f f u n g i i n o c u l a t e d i n s o y b e a n w h e ym e d i a c o n t a i n i n g d i f f e r e n t ammonium s a l t s , o n l y s i x d e -T A B L E 2 . G r o w t h o f v a r i o u s f u n g i o n s o y b e a n w h e y m e d i a c o n t a i n i n g

ammonium a c e t a t e a n d a d d e d g l u c o s eM y c e l i u m

G l u c o s e I n c u b a - _______Protein D r y w tF u n g u s a d d e d t i o n p r o o f m y -t i m e D r y P r o t e i n d u r c e - d c e l i u m aw t c o n t e n t h r g / l i t e r g l l i t e r

T r i c h o l o m a n u d u m b O c 1 4 4 7 . 4 5 5 . 1 4 . 1 6 4 . 50 2 8 8 7 . 4 5 5 . 1 4 . 1 6 4 . 51 1 4 4 7 . 7 5 5 . 2 4 . 3 3 6 . 61 2 8 8 7 . 6 5 2 . 7 4 . 0 3 6 . 42 1 4 4 2 . 7 4 9 . 5 1 . 3 9 . 82 2 8 8 1 0 . 2 6 1 . 0 6 . 3 3 1 . 13 1 4 4 2 . 8 4 8 . 2 1 . 4 7 . 33 2 8 8 9 . 0 6 0 . 2 5 . 4 2 0 . 1

B o l e t u s i n d e c i s u s b 0 1 9 2 8 . 0 3 4 . 9 2 . 8 7 0 . 60 2 1 6 8 . 9 3 3 . 6 3 . 0 7 8 . 71 1 9 2 1 4 . 4 3 3 . 9 4 . 9 6 9 . 11 2 1 6 1 3 . 2 2 7 . 0 3 . 6 6 3 . 62 1 9 2 1 8 . 8 2 8 . 8 5 . 4 5 7 . 82 2 1 6 1 7 . 9 2 5 . 0 4 . 5 5 4 . 93 1 9 2 1 7 . 2 2 7 . 4 4 . 7 5 3 . 43 2 1 6 2 2 . 2 2 5 . 3 5 . 6 5 0 . 0C o l l y b i a v e l u t i p e s d 0 2 1 6 5 . 4 4 5 . 9 2 . 5 3 8 . 90 2 8 8 4 . 1 3 7 . 4 1 . 5 2 9 . 81 2 1 6 4 . 8 4 1 . 5 2 . 0 3 2 . 31 2 8 8 7 . 1 4 2 . 9 3 . 0 4 0 . 62 2 1 6 5 . 4 4 8 . 9 2 . 6 2 2 . 32 2 8 8 7 . 1 3 8 . 2 2 . 7 2 4 . 33 2 1 6 5 . 7 4 0 . 7 2 . 3 2 0 . 53 2 8 8 7 . 7 3 4 . 1 2 . 6 1 8 . 6

a E x p r e s s e d a s g p e r 1 0 0 g o f t o t a l c a r b o h y d r a t e u s e d .b I n i t i a l pH was 5 . 1 0 .c The medium w i t h o u t a d d e d g l u c o s e c o n t a i n e d ( p e r l i t e r ) :0 . 1 1 n i t r o g e n , 0 . 5 8 r e d u c i n g s u g a r , 1 . 1 8 t o t a l c a r b o h y d r a t e s ,a n d 2 . 0 0 t o t a l s o l i d s ; w i t h 1 a d d e d g l u c o s e : 1 . 7 6 r e d u c i n g

s u g a r , 2 . 1 2 t o t a l c a r b o h y d r a t e , 2 . 8 5 t o t a l s o l i d s ; w i t h 2g l u c o s e : 2 . 9 0 r e d u c i n g s u g a r , 3 . 3 0 t o t a l c a r b o h y d r a t e , 3 . 8 0t o t a l s o l i d s ; w i t h 3 g l u c o s e : 4 . 0 8 r e d u c i n g s u g a r , 4 . 5 0 t o t a lc a r b o h y d r a t e , a n d 4 . 8 6 t o t a l s o l i d s . A l l m e d i a c o n t a i n e d 0 . 5 6 g o fn i t r o g e n a s ammonium a c e t a t e ; i n i t i a l pH w a s 5 . 1 0 . A l l d a t a a r ea v e r a g e o f tw o f l a s k s .d I n i t i a l pH w a s 4 . 5 0 .

v e l o p e d m y c e l i a ( T a b l e 1 ) . A . c a m p e s t r i s d i d n o t d e v e l o pm y c e l i a i n a n y o f t h e t h r e e s o y b e a n w h e y m e d i a . T h e a d d i -t i o n o f ammonium a c e t a t e t o s o y b e a n w h e y medium c o m -p l e t e l y i n h i b i t e d g r o w t h o f C . v e l u t i p e s , M. h y b r i d a , a n d X .p o l y m n o r p h a ; i n c r e a s e d t h e l a g p e r i o d o f T . n u d u m ; a n di n c r e a s e d m y c e l i u m g r o w t h o f B . i n d e c i s u s . T . n u d u m e x -h i b i t e d s l u r r y o r y e a s t l i k e g r o w t h i n w h e y m e d i a c o n t a i n -i n g ammonium s u l f a t e a n d ammonium t a r t r a t e , w h e r e a s ,w i t h ammonium a c e t a t e , f o r m a t i o n o f s p h e r e s o f 5 t o 8mm i n d i a m e t e r w a s a d i s t i n c t a d v a n t a g e i n f i l t e r i n g a n dh a r v e s t i n g t h e m y c e l i u m . T . nudum a n d B . i n d e c i s u ss h o w e d t h e m o s t r a p i d r a t e o f g r o w t h a n d t h e h i g h e s t p r o -d u c t i o n o f m y c e l i a l p r o t e i n w i t h s h o r t e r i n c u b a t i o n p e r i o d s ,c o m p a r e d w i t h t he o t he r s p e c i e s . D e p e n d i n g u p o n t h e t y p eo f m e d i a , T . nudum p r o d u c e d 3 . 1 t o 4 . 1 g o f p r o t e i n p e rl i t e r , a n d B . i n d e c i s u s , 1 . 9 t o 2 . 8 . F e r m e n t a t i v e e f f i c i e n c i e sa n d c o n v e r s i o n o f w h e y s o l i d s a n d n i t r o g e n i n t o m y c e l i a lp r o t e i n w e r e a l s o h i g h f o r t h e s e t w o o r g a n i s m s . E v e n a f t e r3 6 0 h r o f i n c u b a t i o n , t h e o t h er s p e c i e s d i d n o t p r o d u c en e a r l y a s much m y c e l i a . T h e f o r m a t i o n o f s p h e r i c a l f o r m so f T . nudum a n d B . i n d e c i s u s a n d t h e i r r a p i d r a t e o f g r o w t hw e r e t h e c r i t e r i a u s e d t o s e l e c t t h e s e o r g a n i s m s f o r a d d i -t i o n a l s t u d y .T h e e f f e c t o f a d d e d g l u c o s e o n g r o w t h o f v a r i o u s m u s h -r o o m s i n w h e y m e d i a c o n t a i n i n g ammonium a c e t a t e i ss h o w n i n T a b l e 2 . W i t h a n i n c u b a t i o n p e r i o d o f 1 4 4 h r , 1 g l u c o s e h a d l i t t l e o r n o e f f e c t o n m y c e l i a l g r o w t h , p r o t e i nc o n t e n t , a n d y i e l d o f p r o t e i n o f T . n u d u m . M o r e t h a n 1 g l u c o s e i n a p e r i o d o f 1 4 4 h r g r e a t l y i n h i b i t e d m y c e l i a lT A B L E 3 . G r o w t h o f T r i c h o l o m a nudum i n s o y b e a n w h e y m e d i a

c o n t a i n i n g d i f f e r e n t ammonium s a l t s a n d a d d e d i r o n ,s u l f u r , a n d z i n cM y c e l i u mS o y b e a w h e y m e d u * I n c u b a t i o nS o y b e a n w h e y m e d i u m * t i m e Dr y w t P r o t e i n

c o n t e n t

h r g l l i t e rW i t h ammonium t a r t r a t e 7 2 6 . 8 5 3 . 4

1 4 4 5 . 5 5 2 . 12 1 6 4 . 6 4 9 . 9

P l u s F e , S , a n d Z n 7 2 6 . 9 5 5 . 81 4 4 5 . 8 5 2 . 42 1 6 4 . 9 4 9 . 1

W i t h a mmo ni um a c e t a t e 7 2 -t1 4 4 7 . 0 5 5 . 92 1 6 5 . 7 5 0 . 7

P l u s F e , S , a n d Zn 7 21 4 4 -t2 1 6

a F i n a l c o n c e n t r a t i o n o f n i t r o g e n i n a l l m e d i a w a s 0 . 1 1 % , i n -c l u d i n g t h e a d d i t i o n o f 5 6 0 mg o f n i t r o g e n e i t h e r a s a mmo ni umt a r t r a t e o r a mmo ni um a c e t a t e ; when a d d e d , m e d i a a l s o c o n t a i n e d1 1 1 m g o f S a s s u l f u r i c a c i d , 0 . 6 m g o f i r o n a s f e r r o u s s u l f a t e , a n d0 . 6 m g o f z i n c a s z i n c s u l f a t e p e r l i t e r . The pH o f m e d i a c o n t a i n i n ga mmo ni um t a r t r a t e w a s 4 . 5 0 ; t h a t f o r a m m on iu m a c e t a t e w a s 5 . 2 0 .bNo g r o w t h .

3 3 2 A P P L . M I C R O B I O L .


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P R O D U C T I O N O F FU N G A L P R O TE I N I N S O Y B E A N WHEYg r o w t h a n d r e d u c e d p r o t e i n c o n t e n t s l i g h t l y . Y i e l d s o fm y c e l i a l p r o t e i n w e r e a l s o d r a s t i c a l l y r e d u c e d . H o w e v e r ,w i t h a n i n c u b a t i o n p e r i o d o f 2 8 8 h r a n d 2 a d d e d g l u c o s e ,m a x i m a l m y c e l i a l g r o w t h a n d p r o t e i n c o n t e n t w e r e o b -t a i n e d : a b o u t 6 . 3 g o f p r o t e i n p e r l i t e r c o m p a r e d w i t h a b o u t4 . 1 g o f p r o t e i n i n t h e a b s e n c e o f g l u c o s e .W i t h B . i n c d e c i s u s , m a x i m a l m y c e l i a l g r o w t h a nd p r o d u c -t i o n o f p r o t e i n w e r e o b t a i n e d w i t h 3 a d d e d g l u c o s e a n d2 1 6 h r o f i n c u b a t i o n . P r o t e i n c o n t e n t o f m y c e l i u m t e n d e dt o d e c r e a s e s l i g h t l y w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f g l u -c o s e . B . i n d e c i s u s y i e l d e d 5 . 6 g o f p r o t e i n p e r l i t e r o f w h e ym e d i a c o n t a i n i n g 3 c g l u c o s e , c o m p a r e d w i t h a b o u t 3 g i nt h e a b s e n c e o f g l u c o s e .A d d e d g l u c o s e a n d 2 8 8 h r o f i n c u b a t i o n i n c r e a s e dm y c e l i a l g r o w t h o f C . v e l u t i p e s , b u t h a d v e r y l i t t l e e f f e c t o ny i e l d o f m y c e l i a l p r o t e i n . T h e e f f e c t o f a d d e d g l u c o s e o nm y c e l i a l g ro w t h a n d p r o t e i n c o n t e n t d e p e n d s u p o n t h es p e c i e s a n d i n c u b a t i o n t i m e .

A d d i t i o n o f i r o n a s f e r r o u s s u l f a t e , s u l f u r a s s u l f u r i c a c i d ,a n d z i n c a s z i n c s u l f a t e i n t h e c o n c e n t r a t i o n s u s e d h a dp r a c t i c a l l y n o e f f e c t o n g r o w t h o f T . nudum i n s o y b e a nw h e y m e d i a c o n t a i n i n g ammonium t a r t r a t e ( T a b l e 3 ) .T h e s e m i n e r a l s , h o w e v e r , c o m p l e t e l y i n h i b i t e d g r o w t h o fT . n u d u m i n w h e y c o n t a i n i n g ammonium a c e t a t e e v e na f t e r 2 1 6 h r o f i n c u b a t i o n .P h o s p h o r u s a s p h o s p h o r i c a c i d g r e a t l y i n h i b i t e d m y c e l i a lg r o w t h a n d p r o t e i n y i e l d o f T . nudum ( T a b l e 4 ) . P o t a s s i u ma s p o t a s s i u m h y d r o x i d e s h o w e d s m a l l l o s s e s i n m y c e l i a lg r o w t h a n d y i e l d o f p r o t e i n , w h e r e a s m a g n e s i u m , a s t h es u l f a t e , i n c r e a s e d m y c e l i a l g r o w t h b y 1 7 a n d y i e l d o fp r o t e i n b y 1 1 .T h e e f f e c t o f d o u b l i n g w h e y c o n c e n t r a t i o n i n t h e m e d i ao n m y c e l i a l g r o w t h , p r o t e i n c o n t e n t , a n d f e r m e n t a t i v ee f f i c i e n c y o f T . nudum a n d B . i n d e c i s u s i s s h o w n i n T a b l e5 . M a x i m a l m y c e l i a l g r o w t h o f T . nudum o c c u r r e d a f t e r1 4 4 h r o f i n c u b a t i o n , a n d w a s n e a r l y t w i c e a s g r e a t a s t h a to b t a i n e d w i t h n o r m a l w h e y m e d i a ( T a b l e s 1 a n d 2 ) a tc o m p a r a b l e i n c u b a t i o n p e r i o d s . B e c a u s e p r o t e i n c o n t e n t o ft h e m y c e l i a i n c o n c e n t r a t e d w h e y w a s d e c r e a s e d , y i e l d o fT A B L E 4 . G r o w t h o f T r i c h o l o m a nudum i n s o y b e a n w h e y c o n t a i n i n gammonium a c e t a t e a n d a d d e d m i n e r a l s a

S o y b e a n w h e y m e d i u m b MyceliumD r y w t P r o t e i n c o n t e n tg p e r l i t e r

C o n t r o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 . 5 5 4 . 9Added p h o s p h o r u s c. . . . . . . 1 . 4 6 4 . 2Added p o t a s s i u m d . . . . . . . . . . . . . . 6 . 1 4 9 . 1Added m a g n e s i u m e . . . . . . . . . . . . . . 7 . 6 5 3 . 1a I n c u b a t i o n t i m e i n a l l m e d i a was 1 4 4 h r .b A l l m e d i a c o n t a i n e d 0 . 5 6 g o f n i t r o g e n a s a mmo ni um a c e t a t e ;0 . 1 1 f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f n i t r o g e n ( p H 5 . 6 0 ) .c Amount a d d e d w a s 1 5 0 m g o f p h o s p h o r u s p e r l i t e r a s p h o s -

p h o r i c a c i d .d Amount a d d e d w a s 3 0 0 m g p e r l i t e r a s p o t a s s i u m h y d r o x i d e .e Amount a d d e d w a s 2 0 m g p e r l i t e r a s m a g n e s i u m s u l f a t e .

3 3 3p r o t e i n ( 3 . 5 t o 4 . 0 g p e r l i t e r ) w a s a b o u t t h e s a n m e a s t h a to b t a i n e d w i t h t h e n o r m a l w h e y m e d i a ( 3 . 1 t o 4 . 3 g p e rl i t e r ) . G r o w t h o f B . i n d e c i s u s i n c o n c e n t r a t e d w h e y m e d i aw a s g r e a t l y i n c r e a s e d . T h e a m o u n t o f m y c e l i a a n d p r o t e i np r o d u c e d w i t h B . i n d e c i s u s w a s c o m p a r a b l e t o t h a t o b -t a i n e d w i t h n o r m a l w h e y m e d i a i n t h e p r e s en c e o f 2 a n d 3 a d d e d g l u c o s e ( T a b l e 2 ) , a n d w a s n ea rl y t w ic e a s g r e a t a st h a t o b t a in ed w i t h w h e y m e d i a d e s c r i b e d i n T a b l e 1 . T h u s ,b o t h T . nudum a n d B . i n d e c i s u s c o n v e r t e d w h e y n i t r o g e nt o m y c e l i a l p r o t e i n m o r e e f f i c i e n t l y i n c o n c e n t r a t e d w h e y .T h e d i f f e r e n c e s i n p r o t e i n y i e l d o f t h e s e t w o s p e c i e s , a n dt h e t y p e o f s o y b e a n w h e y m e d i a u s e d , w i l l h a v e i m p o r t a n te c o n o m i c e f f e c t s o n s o y b e a n w h e y u t i l i z a t i o n . D i f f e r e n c e si n f e r m e n t a t i v e e f f i c i e n c y , a s w e l l a s d i f f e r e n c e s i n t h ea m o u n t o f w h e y s o l i d s u t i l i z e d d u r i n g f e r m e n t a t i o n , w i l la l s o h a v e t o b e c o n s i d e r e d i n d i s p o s a l o f w h e y .R e c o v e r y o f c o a g u l a b l e w h e y p r o t e i n a n d u s e o f w h e ys o l i d s i n f u n g i f e r m e n t a t i o n s h o u l d r e d u c e t h e b i o l o g i c a lo x y g e n d e m a n d o f t h e l i q u o r a f t e r h a r v e s t i n g t h e m y c e l i a .I n p r a c t i c e , r e c o v e r y o f t h e h e a t c o a g u l a t e d p r o t e i n s e p a -r a t e l y ma y b e u n n e c e s s a r y , b e c a u s e i t c o u l d s e r v e a s p a r to f t h e c u l t u r e m ed i a a n d b e r e c o v e r e d i n p a r t w i t h t h e m y -c e l i a .T h e d e c r e a s i n g e f f e c t , r e s u l t o f a l o n g e r l a g p h a s e , o fi n c r e a s e d r a t i o s o f c a r b o n t o n i t r o g e n o n m y c e l i u m g r o w t ho f T . nudum i s s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d w i t h o t h e r s p e c i e si n o t h e r m e d i a ( R e u s s e r e t a l . , 1 9 5 8 b ; M o u s t a f a , 1 9 6 0 ;L i t c h f i e l d e t a l . , 1 9 6 3 ) . H o w e v e r , t h e e f f e c t w a s n o t o b -s e r v e d w i t h B . i n d e c i s u s a n d C . v e l u t i p e s .D i f f e r e n c e s i n f e r m e n t a t i v e e f f i c i e n c y o b t a i n e d w i t hT . nudum a n d B . i n d e c i s u s i n c o n c e n t r a t e d s o y b e a n w h e yT A B L E 5 . G r o w t h o f T r i c h o l o m a nudum a n d B o l e t u s i n d e c i s u s i ns o y b e a n w h e y c o n c e n t r a t e d t o 50

S p e c i e s

T r i c h o l o m anudum . . .

T . n u d u m . .T . n u d u m . .T . n u d u m . .B o l e t u s i n -d e c i s u s . . B . i n d e c i s u sB . i n d e c i s u sB . i n d e c i s u s

_0h r

7 29 6

1 4 41 9 21 9 22 1 62 4 02 6 4

D r y wt o fm y c e l i u m t

g l u i e r9 . 0

1 0 . 41 1 . 41 0 . 41 6 . 31 7 . 01 6 . 81 7 . 1

( 4 4 . 2 )( 5 0 . 6 )( 5 3 . 4 )( 5 0 . 7 )( 7 6 . 3 )( 7 9 . 3 )( 7 8 . 6 )( 8 0 . 0 )

2

34 4

E

3 9 . 13 6 . 93 4 . 43 9 . 227.626.626.427.1

b G._(A

o

65.670.072.773.2

80.280.279.379.3

0Wun8: 3

9 7 . 89 8 . 29 8 . 39 8 . 59 8 . 79 8 . 79 8 . 89 8 . 8

TI

0coH

96.997.498.098.2

97.397.497.497.4

6 3 . 76 7 . 37 2 . 87 2 . 87 4 . 07 4 . 37 4 . 07 4 . 0

E f f i c i e n c yb d10 0

. .6 6 . 07 1 . 47 2 . 97 6 . 3

6 4 . 57 0 . 17 1 . 67 5 . 2

4 2 . 7 4 2 . 24 2 . 7 4 2 . 24 2 . 0 4 1 . 54 4 . 0 4 3 . 4

S o y b e a n w h e y medium c o n t a i n e d : 1 . 0 8 % o f r e d u c i n g s u g a r s ,2 . 1 5 t o t a l c a r b o h y d r a t e s , 0 . 1 0 n i t r o g e n , a n d 3 . 8 1 t o t a l s o l i d s( p H 4 . 4 0 ) . A l l d a t a a r e a v e r a g e o f t w o f l a s k s .t F i g u r e s i n p a r e n t h e s e s i n d i c a t e amount e x p r e s s e d a s g p e r1 0 0 g o f t o t a l c a r b o h y d r a t e s u s e d . R a t i o o f g o f p r o t e i n p e r 1 0 0 g o f r e d u c i n g s u g a r s .

V O L . 1 2 , 1 9 6 4


5/5

FALAN GHE, S M \ I I T H , AND RA CKISa s t h e s o l e s o u r c e o f n i t r o g e n a n d i n w h e y c o n t a i n i n g a m i i -m o n i u m s a l t s w e r e n o t v e r y l a r g e .

F a r b e t t e r e f f i c i e n c i e s w e r e o b t ai ne d w i t h T . nudum a n dB . i n d e c i s u s c u l t u r e d i n c o n c e n t r a t e d s o y b e a n w h e y a n di n w h e y c o n t a i n i n g ammonium s a l t s , t h a n i n m e d i a c o n -t a i n i n g m o l a s s e s o r w a s t e s u l f i t e l i q u o r ( R e u s s e r e t a l . ,1 9 5 8 b ) a n d i n s o m e v i n a s s e m e d i a ( F a l a n g h e , 1 9 6 2 ) .F e r m e n t a t i v e e f f i c i e n c y o f T . n u d u m w a s h i g h e r t h a n t h a to f B . i n d e c i s u s .T . n u d u r n u s u a l l y f o r m s y e a s t l i k e o r s l u r r y m y c e l i u m( F a l a n g h e , 1 9 6 2 ; C i r i l l o , H a r d w i c k , a n d S e e l e y , 1 9 6 0 ) .T h i s f o r m o f m y c e l i u m w a s o b t a i n e d w i t h T . nudum i n a l ls o y b e a n w h e y m e d i a , e x c e p t t h o s e c o n t a i n i n g ammoniuma c e t a t e ; b u t , i n i t , m y c e l i u m d e v e l o p e d a s u n i f o r m s p h e r e s ,w h i c h w a s a d e f i n i t e a d v a n t a g e i n f i l t e r i n g a n d h a r v e s t i n g .B . i n d e c i s u s f o r m e d s p h e r e s i n a l l s o y b e a n whey m e d i a .

ACKNOWLEDGMENTW e a r e i n d e b t e d t o L . I . W i l s o n f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .

LITERATURE CITEDB L O C K , S . S . 1 9 6 0 . D e v e l o p m e n t s i n t h e p r o d u c t i o n o f m u s h r o o mm y c e l i u m i n s u b m e r g e d l i q u i d c u l t u r e . J . B i o c h e m . M i c r o b i o l .

T e c h n o l . E n g . 2 : 2 4 3 - 2 5 2 .B L O C K , S . S . , T . W. S T E A R N S , R . L . S T E P H E N S , AND R . F . J . M c -C A N D L E S S . 1 9 5 3 . Mushroom m y c e l i u m , e x p e r i m e n t s w i t h s u b -m e r g e d c u l t u r e . J . A g r . F o o d C h e m . 1 : 8 9 0 - 8 9 3 .C I R I L L O , V . P . , W . A . HARDWICK, AND R. D . S EE L EY . 1 9 6 0 . Fermen-

t a t i o n p r o c e s s f o r p r o d u c i n g e d i b l e mushroom m y c e l i u m . U . S .P a t e n t 2 , 9 2 8 , 2 1 0 .E D D Y , B . P . 1 9 5 8 . P r o d u c t i o n o f mushroom m y c e l i u m b y s u b -m e r g e d c u l t i v a t i o n . J . S c i . F o o d A g r . 9 : 6 4 4 - 6 4 9 .F A L A N G H E , H . 1 9 6 2 . P r o d u c t i o n o f mushroom m y c e l i u m a s a p r o -t e i n a n d f a t s o u r c e i n s u b m e r g e d c u l t u r e i n medium o f v i n a s s e .

A p p l . M i c r o b i o l . 1 0 : 5 7 2 - 5 7 6 .H E S S E L T I N E , C . W . , R . D E C A M A R G O , AND J . J . R A C K I S . 1 9 6 3 . Am o u l d i n h i b i t o r i n s o y b e a n s . Nature 2 0 0 : 1 2 2 6 .H U M F E L D , H . 1 9 4 8 . The p r o d u c t i o n o f mushroom m y c e l i u m ( A g a r i -

c u s c a m p e s t r i s ) i n s u b m e r g e d c u l t u r e . S c i e n c e 1 0 7 : 3 7 3 .H U M F E L D , H . , AND T . F . S U G I H A R A . 1 9 4 9 . M u sh r o o m m y c e l i u m

p r o d u c t i o n b y s u b m e r g e d p r o p a g a t i o n . Food T e c h n o l . 3 : 3 5 5 -3 5 6 .H U M F E L D , H . , AND T . F . S U G I H A R A . 1 9 5 2 . The n u t r i e n t s r e q u i r e -m e n t s o f A g a r i c u s c a m p e s t r i s g r o w n i n s u b m e r g e d c u l t u r e .M y c o l o g i a 4 4 : 6 0 5 - 6 2 0 .H U M F E L D , H . , AN D T . F . S U G I H A R A . 1 9 5 4 . Submerged c u l t u r e o ft h e m y c e l i u m o f v a r i o u s s p e c i e s o f m u s h r o o m . A p p l . M i cr o b io l .2 : 1 7 0 - 1 7 2 .

L I T C H F I E L D , J . H . , R . C . OVERBECK, AN D R . S . I ) A V I D S O N . 1 9 6 3F a c t o r s a f f e c t i n g t h e g r o w t h o f m o r e l mushroom m y c e l i u m i ns u b m e r g e d c u l t u r e . J . A g r . F o o d C h e m. 1 1 : 1 5 8 - 1 6 2 .MARKLEY, K . S . [ e d . ] 1 9 5 1 . S o y b e a n s a n d s o y b e a n p r o d u c t s , v o l .I . I n t e r s c i e n c e P u b l i s h e r s , I n c . , Ne w Y o r k .M O R R I S , I ) . L . 1 9 4 8 . Q u a nt i t at i v e d e t e rm i na t i o n o f c a r b o h y d r a t e sw i t h d r y W o o d ' s a n t h r o n e r e a g e n t . S c i e n c e 1 0 7 : 2 5 4 - 2 5 5 .N I O U S T A F A , A . M . 1 9 6 0 . N u t r i t i o n a n d t h e d e v e l o p m e n t o f m u s h -room f l a v o r i n A g a r i c u s c a m p e s t r i s m y c e l i u m . A p p l . M i c r o b i o l .8 : 6 3 - 6 7 .N E L S O N , N . 1 9 4 4 . A p h o t o m e t r i c a d a p t a t i o n o f t h e S o m o g y im e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f g l u c o s e . J . B i o l . Chem. 1 5 3 :

3 7 5 - 3 8 0 .R A C K I S , J . J . 1 9 6 1 . P r o t e i n e f f i c i e n c y s t u d i e s o n s o y b e a n m e a l a n di t s f r a c t i o n s . U . S . D e p t . A g r . AR S 7 1 - 2 2 , p . 1 1 0 - 1 1 9 .R A C K I S , J . J . , R . L . A N D E R S O N , H . A . S A S A M E , A . K . S M I T H , AN D C .H . VANETTEN. 1 9 6 1 . Amino a c i d s i n s o y b e a n h u l l s a n d o i l m e a lf r a c t i o n s . J . A g r . F o o d C h e m . 9 : 4 0 9 - 4 1 2 .R E U S S E R , F . , J . F . T . S P E N C E R , AND H . R . S A L A N S . 1 9 5 8 a . T r i c h o -

l o m a nudum a s a s o u r c e o f m i c r o b i o l o g i c a l p r o t e i n . A p p l .M i c r o b i o l . 6 : 5 - 8 .R E U S S E R , F . , J . F . T . S P E N C E R , AND H . R . S A L A N S . 1 9 5 8 b . P r o t e i na n d f a t c o n t e n t o f s o m e m u s h r o o m s grown i n s u b m e r g e d c u l -t u r e . A p p l . M i c r o b i o l . 6 : 1 - 4 .

S M I T H , A . K . , A . M . N A S H , A . C . E L D R I D G E , AND W. J . W O L F . 1 9 6 2 .R e c o v e r y o f s o y b e a n w h e y p r o t e i n w i t h e d i b l e gums a n d d e -t e r g e n t s . J . A g r . F o o d C h e m . 1 0 : 3 0 2 - 3 0 4 .

S M I T H , A . K . , E . N. SCHUBERT, AND P . A . BELTER. 1 9 5 5 . Soybeanp r o t e i n f r a c t i o n s a n d t h e i r e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s . J . Am .O i l C h e m i s t s ' S o c . 3 2 : 2 7 4 - 2 7 8 .

S O M O G Y I , M . 1 9 4 5 . A n ew r e a g e n t f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f s u g a r s .J . B i o l . C h e m . 1 6 0 : 6 1 - 7 3 .S Z U E C S , J . 1 9 5 6 . Mushroom c u l t u r e . U . S . P a t e n t 2 , 7 6 1 , 2 4 6 .S Z U E C S , J . 1 9 5 8 . Method o f g r o w i n g mushroom m y c e l i u m a n d t h er e s u l t i n g p r o d u c t s . U . S . P a t e n t 2 , 8 5 0 , 8 4 1 .V A N E T T E N , C . H . , J . E . H U B B A R D , J . M . M A L L A N , A . K . S M I T H ,

AND C . W. B L E S S I N . 1 9 5 9 . Amino a c i d c o m p o s i t i o n o f s o y b e a np r o t e i n i f r a c t i o n s . J . A g r . F o o d C h e m . 7 : 1 2 9 - 1 3 1 .

3 3 4 A P P L . - A I I C R O B I O L .

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Production of Fungal Mycelial Protein in Submerged Culture of Soybean Whey