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GUÍA PRACTICA DE BIOTECNOLOGIA
Dra. Rosa Altamirano Diaz
2011
El control de insectos plaga en la agricultura y de vectores de enfermedades humanas
se ha realizado principalmente con la aplicación de insecticidas químicos. Estos
insecticidas han generado problemas de contaminación ambiental, de toxicidad a
insectos no blancos y, de manera más importante, a los agricultores que los aplican.
Por otra parte, los insecticidas químicos han perdido su eficacia en el control de
insectos, ya que su aplicación ha generado la aparición de poblaciones de insectos
resistentes
. Una posible alternativa para solucionar este problema es el control biológico,
definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente y/o sus
productos para reducir los efectos de insectos plaga.
Se ha reportado la existencia de más de 1500 especies de microorganismos
entomopatógenos con potencial para el control microbiano de insectos, en relación a su
diversidad se señalan: hongos, virus, protozoarios y bacterias, en donde las últimas
son las de mayor importancia. De las bacterias la más sobresaliente pertenece al
género Bacillus . Bacillus thuringiensis, es una bacteria GRAM positiva esporulada,
nativa del suelo, caracterizada por producir inclusiones paraesporales de constitución
proteica.
Dra. Rosa Altamirano D.
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Desde su descubrimiento en el siglo pasado, B. thuringiensis se
ha convertido en el entomopatógeno más utilizado a nivel
mundial, con ventas que representan de 90% del mercado de
bioplaguicidas, y además es aprovechado para obtener plantas
resistentes a insectos
En el siguiente informe se evaluó la actividad insecticida,
producidas en un Biorreactor, de la cepa nativa Bacillus
thuringiensis para ratificar su valor como alternativa para el
control biológico sobre plagas agrícolas.
1.-Evaluar su capacidad de bioinsecticida en los diferentes géneros de
lepidóptera.
2.- determinar en qué estadio larvario es mucho más eficaz la acción
de la toxina.
3.-determinar el tiempo de efecto de la toxina durante la aplicación.
4.-observar las características corporales que presentan las larvas
durante el bioensayo.
5.-determinar mediante la comprobación de la responsabilidad de la
toxina de Bacillus thuringiensis en la muerte de las larvas.
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1. Cepa de Bacillus thuringiensis
2. 25 larvas de Heliothis sp. (Lepidóptero)
3. Hojas y granos de Maíz
1. Balanza analítica
2. Microscopio
3. Centrifuga
4. Biorreactor Loop air
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1. Matraz Erlenmeyer de 500 y
2000 mL
2. Pipetas de 5 y 10 mL
3. Vaso de precipitados de 250 y
1000 mL
4. 10 tubos de centrífuga
5. porta y cubreobjetos
6. vagueta
1. Asa microbiológica
2. Espátula
3. Mechero o lámpara de alcohol
4. Pinzas de disección
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1. Algodón
2. Papel aluminio
3. 4 tapers
4. Ligas
5. Cinta de pH
1. Agar nutritivo
2. Azul de Comassie
3. Colorantes para tinción de
Gram
MEDIO DE FERMENTACIÓN
Nutrientes (g)
Glucosa 1
Extracto de levadura 2
(NH4 )SO4 2
CuSO4 0.005
MgSO4 7H2O 0.2
FeSO4 7H2O 0.005
CaCl2 2H2O 0.025
ZnSO4 7H2O 0.005
MnSO4 0.05
K2HPO4 0.5
Agua destilada 1 L
Ajustar el pH, con NaOH 1 N. a 7.0.
Esterilizar 121°C durante 15 minutos.
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PROCEDIMIENTOS GENERALES
5.1 OBTENCIÓN DE BIOMASA DE Bacillus thuringiensis
5.2 OBTENCIÓN DE CRISTALES PROTEICOS TOXICOS.
5.3 EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE LOS CRISTALES PROTEICOS DE B.
thuringiensis SOBRE LARVAS DE INSECTOS PLAGA (BIOENSAYOS).
Repicar por estría una cepa nativa de B. thuringiensis en tubos con agar nutritivo.
Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
Nota: se realizo la preparación del medio larvita, que consistió en coger larvas de
Heliothis sp. se trituraron en agua destilada y se cogió un hisopo se sembro y se
incubo.
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- PROLIFERACIÓN CELULAR: sembrar en toda la superficie de 1 placa con agar
nutritivo e incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
- COSECHA CELULAR:
a. Añadir 3 ml de caldo nutritivo en la placa con el cultivo y 5 perlas de vidrio
estériles. Mover las placas suavemente hasta obtener una suspensión
celular.
b. Tomar la suspensión celular y colocarlo en un frasco schott de 150 ml
estéril y enrazar hasta 50 ml con caldo nutritivo.
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- OBTENCIÓN DEL INÓCULO:
a. Incubar el frasco schott con la suspensión celular en agitación a 150 rpm a
temperatura ambiente por 18 a 24 horas (alternativa estufa a 37 ºC).
b. Realizar el recuento celular mediante siembras por incorporación en agar
nutritivo de diluciones seriadas del cultivo hasta 10-5. (el recuento directo
con cámara de Petroff-Hausser).
CONCENTRACION DEL INOCULO:
45 X 108 cel/ml
4.5 X 109 cel/ml
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Armar y esterilizar el biorreactor rector loop “air lift”.
MIDIENDO LOS VVM.
VOL REACTOR/VOL.DEL AIRE/MIN
200 ml 2s donde 3950 es vol de trabajo
x 60 s
x = 200 x 60 = 6000
2
Luego : 6000 / 3950 = 1.52 VVM
a. Colocar el inóculo y el medio de fermentación hasta un volumen de
trabajo de 3950 ml. en el biorreactor. (inicio del proceso 104 cél/ml).
DATOS:
C1 = 45 X 108cel/ml
V1 = 0.5 ml
C2 = X
V2 =3950 ml
Hallando la concentración inicial
de fermentación
(45 x 108) x (0.5 ml) = c2 x (3950
ml)
c2 = 0.005696 x 108
c2 = 5.6 x 104
c1 v1 = c2 v2
c2 = 6 x 105
CONCENTRACIÓN INICIAL DE
FERMENTACIÓN
6 x 105ufc/ml
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b. Insuflar aire estéril a 1.5 VVM.
c. Poner en funcionamiento por espacio de 48 – 72 horas a temperatura
ambiente.
d. Dejar en reposo por 48 h para que las células esporulen y formen los
cristales proteicos.
Observar la turbidez del medio de cultivo cada 24 horas que indica el
crecimiento bacteriano y la formación de las endotoxinas por la aparición de
precipitados en el reactor y aclaración del medio.
Decantar el sobrenadante y mediante centrifugación a 6000 rpm por 5 min
separar las espora – cristal.
CONCENTRACION FINAL DE FERMENTACION:
1 x 1013 ufc / ml
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Verificar la producción de cristales proteicos mediante una tinción con azúl de
coomassie (realizar la extensión, fijación del sedimento y colorear con el
colorante por 5 minutos, lavar con agua corriente y observar con el objetivo de
inmersión).
Resuspender el sedimento en 8 ml de una solución de NaCl 0.85 %, centrifugar a
6000 rpm por 5 min y eliminar el sobrenadante. Repetir el lavado.
Añadir al sedimento anterior 4 volúmenes de acetona y dejar reposar por 5’.
Centrifugar a 5000 rpm por 5 min. y eliminar el sobrenadante.
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Colocar el sedimento en una placa Petri por 24 horas y verificar el secado del
mismo. Extraer el sedimento seco con ayuda de una espátula y triturarlo en un
mortero hasta obtener un polvo fino. Conservar el complejo de espora-cristales
en un tubo Eppendorff a 4ºC.
Identificar larvas de lepidópteros de importancia agroindustrial que según
sus características morfológicas pertenezcan a estadios I y II.
DESCRIPCION DE LA LARVA DE Heliothis Sp.
Larva en
estadio I
Larva en
estadio II
DAÑOS: El daño lo ocasiona la larva que se alimenta del choclo destruyéndolo, en las zonas de Sierra alcanza 100% de daño. Las infestaciones limitan la comercialización de
maíz y choclo.
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Resuspender la toxina conservada en 100ml de SSF estéril(1 mg/mL)
Lavar cuidadosamente con agua destilada estéril la superficie de las hojas
que servirán de alimento de las larvas a ensayar.
Emplear 2 vasos descartables de 1 litro con tapa perforada y cubierta con
un tul: uno de ellos se utilizará como ensayo (E) y el otro como control
negativo (N).
BIOLOGIA La larva recién emergida es de color marrón claro con cabeza oscura a medida que crece su coloración es muy variada, se encuentran tonos verdes, amarillo, rosado y negro. La larva madura presenta cuatro manchas oscuras en forma de trapecio en cada uno de los segmentos abdominales.
E N
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Para el vaso E: colocar 2 a 3 hojas humedecidas en la superficie con la
suspensión de bioinsecticida en estudio.
Para el vaso N: colocar 2 a 3 hojas humedecidas en la superficie con SSF
estéril.
A cada vaso colocar 25 larvas con un mínimo 10 larvas de lepidóptero de I o
II estadio.
Observar cuidadosamente la ingestión de las hojas por parte
de las larvas y anotar el tiempo de efecto de la toxina hasta
un lapso de 72 horas y registrar los resultados.
Colocar hojas frescas en los controles después de 24 horas.
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Tabla 1. Susceptibilidad de diferente especies de Lepidópteras frente a
toxinas de Bacillus thuringiensis durante 72 horas.
*Ensayo: ensayo que obtuvo mayor numero de larvas muertas durante un
periodo de 72 horas.
Tabla 2. Susceptibilidad de Heliothis sp. (Grupo 1) frente a toxinas de
Bacillus thuringiensis durante 72 horas.
Evaluación Tiempo de Evaluación (horas) TOTAL
0 0.5 1 2 4 6 12 28 48 72 muertas % vivas % Ensayo - - - - - 3 1 6 5 5 20 80 5 20 25
Negativo - - - - - 2 2 - - 3 7 28 13 72 25
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Grafica 1. Numero de larvas muertas VS tiempo en horas
Grafica 2. Evaluación toxicológica de Bacillus thuringiensis frente a un
control negativo en larvas de Heliothis sp.
y = 0,2608x + 1,9495R² = 0,974
0
5
10
15
20
25
0 20 40 60 80
Nu
mer
o d
e La
rvas
Mu
erta
s
Tiempo de evaluacion ( horas )
larvas muertas
Lineal (larvas muertas)
1 2 3 4 5 6
ENSAYO 0 3 4 10 15 20
NEGATIVO 0 2 4 7
0
5
10
15
20
nu
mer
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rvas
mu
erta
s p
or
un
idad
de
tiem
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Grafica 3. Susceptibilidad de larvas de Heliothis sp. Comparada con larvas de
Spodoptera sp. Frente a la toxina de Bacillus thuringiensis
Grafica 4. Susceptibilidad de larvas de Heliothis sp. Comparada con larvas de Pectinophora
gossypiella frente a la toxina de Bacillus thuringiensis
1 2 3 4 5 6
heliothis 0 3 4 10 15 20
spodoptera 3 11 13 21
0
5
10
15
20
25
NU
MER
O D
E L
AR
VA
S M
UER
TAS
1 2 3 4 5 6
Pectinophora gossypiella 1 2 3 3 4 20
Heliothis sp. 0 3 4 10 15 20
0
5
10
15
20
25
nu
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Grafica 5. Susceptibilidad de larvas de Spodoptera sp. Comparada con larvas de
Pectinophora gossypiella frente a la toxina de Bacillus thuringiensis
Grafico 6.-Evaluación de Cristales Tóxicos de Bacillus thuringiensis sobre 3
especies de Larvas de Importancia Agrosanitaria.
1 2 3 4 5 6
Pectinophora gossypiella
1 2 3 3 4 20
Spodoptera sp. 3 11 13 21
0
5
10
15
20
25
nu
me
ro d
e la
rvas
mu
ert
asp
or
un
idad
de
tie
mp
o
1 2 3 4 5 6
Pectinophora gossypiella
1 2 2,8 3 4 20
Heliothis sp. 0 3 4 10 15 20
Spodoptera sp. 3 11 13 21
0
5
10
15
20
25
nu
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o d
e la
rvas
mu
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run
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PRUEBA CONFIRMATIVA si la Toxina que mato a las larvas era de Bacillus
thuringiensis se cultivo en placas con Agar Nutritivo y Plate Count observándose los
resultados:
RESULTADO: las colonias crecidas si pertenecen a Bacillus thuringiensis para ello
Se Observo Sus Características Morfológicas Y Observación
Microscópica Con Coloración Gram.
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1. Los biocristales de Bacillus thurigiensis son eficaces para un futuro control
de plagas en los campos de cultivo, puesto que se ha demostrado su
capacidad citotóxica en larvas de lepidópteros.
2. Las larvas presentaron características de muerte comunes: la parte ventral
(abdomen) adquiere una coloración negruzca, aspecto deshidratado que va
tornándose cada vez más oscuro y abarcando la totalidad del cuerpo.
3. La toxina de Bacillus thurigiensis es mucho más eficiente y mortífera,
cuando se aplica en estadios larval I.
4. La especificidad de la toxina de B. thurigiensis se demostró con un mayor
porcentaje, en las larvas del género de Spodoptera.
5. La periodicidad en el proceso de evaluación permitió el seguimiento y
verificación de la actividad citotóxica, a través de características
cualitativas observadas en las larvas.
Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram-positiva, aerobia estricta,
morfológicamente relacionada con Bacillus cereus y Bacillus anthracis.
Estas tres especies bacterianas, durante su ciclo de vida, presentan dos
fases principales, la fase de crecimiento vegetativo en donde las bacterias
se duplican por bipartición cada 30-90 min dependiendo del medio de
cultivo y la fase de esporulación (durante la fase estacionaria), la cual es
un programa de diferenciación de bacteria a espora, él, se dispara cuando
la bacteria se encuentra en limitación de nutrientes. La espora es una
forma de vida latente que puede permanecer en el ambiente por periodos
de tiempo muy largos (años) en ausencia de humedad y nutrientes. Cuando
la espora se encuentra de nuevo en un medio rico que contenga los
nutrientes necesarios puede germinar para comenzar de nuevo el
crecimiento vegetativo.
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Bacillus thuringiensis (Bt) es un patógeno de insectos y su actividad es
atribuida, amplia o completamente (dependiendo del insecto), a las ICPs y
su importancia radica en su tóxicidad contra larvas de insectos-plaga de
los ordenes lepidóptero, coleóptero, díptero, himenóptero, homóptero,
ortóptero, etc.
En el laboratorio tras reactivar el cultivo de Bacillus thuringiensis (Bt) se
logró inducir la esporulación de éste, al transferirlo a un reactor loop “air
lift” con pocos nutrientes, y para mayor seguridad del proceso, se dejo el
cultivo en reposo por 5 días.
En la etapa de bioensayos, empezamos el trabajo con un total de 25 larvas
por cada frasco (control y bioensayo) culminándose el monitoreo a las 72
horas.
La acción citotoxica en las larvas destinadas a los bioensayos produjo un
total de 20 larvas muertas, encontrando resultados similares con la mesa 3
y 5, quienes con la misma técnica reportaron 20 y 21 larvas muertas
respectivamente.
En relación con la mesa 2, quienes al igual que nuestra mesa, emplearon
como larva plaga a la especie Heliothis zea, nuestros reportes difieren,
obteniendo ventaja nuestra mesa, quienes al aplicar repetidas veces el
biocida observamos como resultado, mayor efectividad citotoxica.
Finalmente las semejanzas que se observo en todas las mesas, fue en el
envase control; en todos hubo un porcentaje no tan significativo de larvas
muertas, atribuyendo su causa a la mala manipulación de los ejemplares y/o
factores de nutrición. Y es así que nuestra mesa juntamente con la mesa 2,
4 ,5 y 6 representamos menos del 30% en obtener larvas muertes durante
el trabajo control.
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http://intimicro.blogspot.com//bacillus-thuringiensis-y-sus-
toxinas.html
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/ ulo_27.pdf
http://www.scielo.org.ar/pdf/ram/v40n2/v40n2a13.pdf
http://npic.orst.edu/factsheets/BTgen.pdf
http://www.controlbiologico.com
http://www.controlbiologico.com
http://whqlibdoc.who.int
http://web.catie.ac.cr
http://es.wikipedia.org.
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Bioreactor Loop
Airlife
Armar y esterilizar
el biorreactor (1.5
VVM)
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Decantar el bioreactor
Sedimento en los tubos con
cristales
Coloración con
Azul de comassi
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