7
Zamorano Carrera de Ciencia y Producción Agropecuaria Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagación Módulo de Biotecnología Aplicada Cultivo de Tejidos Vegetales y Propagación in vitro 5.5 Organogénesis Directa Explante: Porciones de Lámina Foliar Material Vegetal: Violeta Africana (Sainpaulia ionantha) Introducción En la micropropagación de violeta africana (Saintpaulia ionantha) y otras gesneriáceas (Episcia, Ajuga) dos tipos de explante han dado buenos resultados: tejido de pecíolo y de hojas. El propósito de esta práctica de laboratorio es familiarizar a los estudiantes con los procedimientos de extracción, esterilización, y establecimiento in vitro de explantes de violeta africana. Materiales y Métodos 1. Hojas maduras de violeta africana (para la práctica de establecimiento) 2. Material establecido in vitro en etapas II ó III (para las prácticas de multiplicación y/o enraizamiento) 3. Material en etapa III, listo para salir al invernadero 4. Platos Petri estériles 5. Pinzas y bisturíes No. 11 6. Solución de 70% Ethanol 56

produccion in vitro de violeta africana

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: produccion in vitro de violeta africana

ZamoranoCarrera de Ciencia y Producción Agropecuaria

Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagación

Módulo de Biotecnología AplicadaCultivo de Tejidos Vegetales y Propagación in vitro

5.5 Organogénesis DirectaExplante: Porciones de Lámina FoliarMaterial Vegetal: Violeta Africana (Sainpaulia ionantha)

Introducción

En la micropropagación de violeta africana (Saintpaulia ionantha) y otras gesneriáceas (Episcia, Ajuga) dos tipos de explante han dado buenos resultados: tejido de pecíolo y de hojas. El propósito de esta práctica de laboratorio es familiarizar a los estudiantes con los procedimientos de extracción, esterilización, y establecimiento in vitro de explantes de violeta africana.

Materiales y Métodos

1. Hojas maduras de violeta africana (para la práctica de establecimiento)2. Material establecido in vitro en etapas II ó III (para las prácticas de multiplicación y/o

enraizamiento)3. Material en etapa III, listo para salir al invernadero4. Platos Petri estériles5. Pinzas y bisturíes No. 116. Solución de 70% Ethanol7. “Solución desinfectante” preparada con 2% Ca(OCl) (hipoclorito de Ca) más 2 gotas

de tween 80 por cada 100 ml de solución.8. Agua destilada estéril para los enjuages9. 10 frascos / estudiante conteniendo medio para establecimiento de violeta (Etapa I)10. 10 frascos / estudiante conteniendo medio para multiplicación / enraizamiento de

violeta africana (Etapas II y III)11. Bandejas multiceldas y microinvernaderos para la práctica de aclimatación (Etapa IV)12. Macetas para la transferencia a contenedores individuales

56

Page 2: produccion in vitro de violeta africana

Procedimientos

1. Obtenga varias hojas maduras de violeta africana con aproximadamente 2 a 3 cm. de pecíolo.

2. Coloque las hojitas en un beaker, cubra con gasa y ajuste con una banda.3. Remueva las partículas superficiales de polvo y rastros de suelo poniendo el beaker

con los segmentos directamente bajo el chorro de agua de la llave durante 15 min. (usar agua fría).

4. Limpie la cámara de flujo laminar y el espacio donde va a trabajar con 70% ethanol.5. Luego del enjuage bajo el agua de la llave, manipule las hojas solamente con las

pinzas, no con las manos. Separe los pecíolos de las láminas y coloquelos en un beaker para proceder a su desinfección.

6. Coloque los explantes en una solución de 70% ethanol durante 15 segundos.7. Transfiera los explantes a la “solución desinfectante” y mantenga los dos tipos de

explante en esta solución durante15 minutos.8. Transfiera el beaker con las hojas y los pecíolos en la “solución desinfectante” a la

cámara de flujo laminar. Vacíe la solución desinfectante en otro recipiente.9. Enjuague las hojas tres veces con agua destilada estéril.10. Luego del último enjuage en agua destilada estéril, coloque las hojas en un plato petri

estéril conteniendo papel filtro.11. Con la ayuda de pinzas y bisturí proceda a cortar los explantes según demostración del

instructor.12. Coloque uno de los explantes de hoja en un tubo con medio. Repita para los otros

tubos provistos.13. Coloque uno de los explantes de pecíolo en un tubo con medio. Repita para los otros

tubos provistos.14. Sellar los tubos con parafilm y anotar la fecha y el nombre según instrucciones.15. Colocar los cultivos en el cuarto de crecimiento (16 horas luz; 25oC).

57

Page 3: produccion in vitro de violeta africana

Violeta Africana

Etapa I (Secciones de Hoja y Peciolo)Componente 1 Litro

½ Macroelementos MS 50 ml (Solución madre 10x)EDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solución madre 200x)Microelementos MS 1 ml (Solución madre 1000x)Inositol 100 mgAcido nicotinico 0.25 mgGlicina 1.0 mgTiamina 0.05 mgBAP 0.5 mgSacarosa 30 gPhytagel 3.75 gpH = 5.8Referencia: protocolo desarrollado en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagación, Zamorano

Etapa II (Secciones de Hoja y Peciolo)Componente 1 Litro

½ Macroelementos MS 50 ml (Solución madre 10x)EDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solución madre 200x)Microelementos MS 1 ml (Solución madre 1000x)Inositol 100 mgTiamina 0.4 mgAIA 1.0 mgSacarosa 15 gPhytagel 3.75 gpH = 5.8Referencia: protocolo desarrollado en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagación, Zamorano

58

Page 4: produccion in vitro de violeta africana

Violeta Africana

Etapa I, II, III (Secciones de Hoja)Componente 1 Litro

½ Macroelementos MS 50 ml (Solución madre 10x)EDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solución madre 200x)Microelementos MS 1 ml (Solución madre 1000x)NaH2PO4 170 mgInositol 100 mgPiridoxina 0.4 mgNiacina 0.4 mgTiamina 0.4 mgBAP 0.08 mgAIA 2.0 mgSacarosa 30 gPhytagel 3.75 gpH = 5.5Referencia: Kyte, L. Plants from test tubes. An introduction to micropropagation.

Etapa I,II,III (Secciones de Peciolo)Componente 1 Litro

½ Macroelementos MS 50 ml (Solución madre 10x)EDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solución madre 200x)Microelementos MS 1 ml (Solución madre 1000x)NaH2PO4 170 mgBAP 0.01 mgSacarosa 15 gPhytagel 3.75 gpH = 5.5Referencia: Kyte, L. Plants from test tubes. An introduction to micropropagation.

59