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PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN CÉLULAS DE
MAMÍFEROS
• En 1986 el activador de plasminógeno tisular humano (tPA, Activase; Genentech USA) fue la 1er proteína terapeúticaproveniente de células de mamífero en ser aprobada para la venta.
• Más del 70 % de las proteínas recombinantes terapeúticas de las farmaceúticas son producidas en células de mamíferos
EXPRESIÓN DE GENES EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Nature Biotech. Vol 22, 11, 2004
21 días
Mejoramiento en 20 años
¿Cómo se mejoró la producción en estos años?
Mejoramiento de:
Vectores
Ingeniería de la célula huésped
Desarrollo de medios de cultivo
Métodos de screening
Desarrollo e ingeniería de procesos
EXPRESIÓN
ESTABLE
TRANSITORIA
EXPRESIÓN DE GENES ESTABLE
Integración del gen de interés en genoma por recombinación no homóloga
Ubicación aleatoria
Líneas celulares: CHO (Chinese hamster ovary)NSO (mouse myeloma)BHK (baby hamster kydney)HEK-293 (human embryo kidney)
MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN
Fosfato de calcio, DEAE dextran (tansit), polietileneimina
Electroporación
Liposomas
Bombardeo con partículas
Microinyección
La linearización de los plásmidos mejora la eficiencia de la transfección estable
Fosfato de calcio: precipita con el ADN
Polietileneimina: polímero catiónico
DEAE dextran: polímero catiónico
ENDOCITOSIS
ELECTROPORACIÓN
LIPOSOMAS
Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gunJohn A O'Brien and Sarah C R Lummis Nature Protocols 1, 977 - 981 (2006)
BIOLÍSTICA
MICROINYECCIÓN
VECTORES
Origen de replicación bacteriano
Marcador de selección bacteriano
Promotor para mamíferos y elementos regulatorios
Señal de terminación de la transcripción y poliadenilación
Marcador de selección para células de mamíferos
AGENTES DE SELECCIÓN
DHFR: dihidro folato reductasa
GS: glutamina sintetasa
ANTIBIÓTICOS: G418, puromicina, higromicina
El gen de selección y el gen recombinante pueden estar en el mismo vector o en vectores separados
Para aumentar la chance de obtener líneas celulares altamente productoras el gen de selección puede estar bajo un promotor débil
DHFR: convierte DHF en THF, requerido en síntesis de glicina, purinas y timidina
Células: CHO DHFR-
Medio de selección: sin hipoxantina, timidina, ni glicina
Amplificación génica: METOTREXATE (MTX)
Metotrexate (MTX)
DHFR
Metotrexate
AMPLIFICACIÓN GÉNICA CON MTX
αMEM, FCS dializado
Clonado: dilución límite
CLONADO DE CÉLULAS RESISTENTES
GLUTAMINA SINTETASA
Células: varias, NSO (murina), CHO K1, ambas con baja actividad de GS
Medio de selección: sin glutamina
Amplificación génica: METIONINA SULFOXIMINA (MSX)
Método más rápido que DHFR
Glufosinato: herbicida. Inhibe a GS, causa aumento de NH4 que envenena a las plantas
PROMOTORES y enhancers
Virales: CMV. MPSV (myeloproliferative sarcoma virus), SV40, AdMLP (adenovirus major late promoter)
Celulares: EF Iα (factor de elongación α), βactinaRegulables: tetraciclina
El transporte citoplasmático y la traducción eficiente del RNAm en eucariotas depende del splicing, por lo tanto agregar al menos 1 secuencia intrónica entre el promotor y el ADNc
VECTORES BI CISTRÓNICOS
INTERNAL RIBOSOME ENTRY SITE
expresión balanceada de genesIRES
marcador de selección
Para aislar células productoras x FACS
Expresión estable
Sistema de expresión regulada en células de mamíferos
ON: cumermicina OFF: novobiocina
Sistema para expresión transitoria y estable
Secuencia consenso KOZAK
Elemento regulatorio pos transcripcionalWOODCHUCK: WPRE
Secuencia presente en región 3´ no traducida (3´UTR) del virus de hepatitis B
Su presencia mejora la expresión genética a nivel post transcripcional modificando: poliadenilación, exportación y/o traducción.
MEJORAMIENTO DE LA PRODUCTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS LÍNEAS CELULARES
Método de transfección/cantidad de plásmido transfectado ??
Aumentando la rigurosidad de la presión de selección: altas dosis de MTX en células DHFR-transformadas con DHFR reducción de nº de líneas celulares a examinar
Pero, altas dosis de drogas crecimiento lento de las células
Atenuación del marcador de selección
Mutación del gen para reducir su actividad
uso de codones
promotor débil
Modulación de la expresión desestabilización del ARNm: sec. ARE
desestabilización de la proteína: sec. PEST
atenuación de IRES
PEST sequences and regulation by proteolysisMartin Rechsteiner and Scott W. Rogers TIBS 21 - JULY 1996
Ingeniería celular
Generación de líneas celulares con mayor productividad y supervivencia: transformación con proto oncogenes, genes reguladores del ciclo celular, genes de factores de crecimiento (ej.IGFI), genes antiapoptóticos.
Expresión de fosfatasa alcalina, junto con p27 y bcl-xl. Vector tricistrónico inducible
Optimización del medio de cultivo
Medios de cultivo de composición definida
Cultivos sin suero
Medios libres de suero
Suplementos: transferrinafactores de crecimiento: insulina/ IGF1hidrolizados (animales, levaduras, plantas)albúmina
Problemas: adaptación celularvelocidad de crecimiento reducidamenores rendimientos
MEJORAMIENTO DE SCREENING PARA DETECTAR LAS MEJORES
PRODUCTORAS
La células en suspensión pasan en “fila india” y son iluminadas por un rayo láser. La luz dispersada o la fluorescencia emitida (si fueron marcadas con un fluorocromo) es colectada, filtrada y convertida a valores digitales que son guardados en una computadora
Citometría de Flujo
Técnica analítica que mide propiedades de célulassuspendidas en un fluido
MEJORAMIENTO DE SCREENING PARA DETECTAR LAS MEJORES PRODUCTORAS
Métodos basados en FACS: fluorescense activatedcell sorting = citofluorometría de flujo
Extensión de la citometría de Flujo
Permite la separación física de poblaciones celulares seleccionadas, para luego utilizarlas en diferentes ensayos.
Luego del análisis, el fluído es separado en una seriede gotas.
Aquellas gotas que contengan las células de interés, son electrostáticamente cargadas y desviadas haciaun receptáculo.
FACS
FACS
Coexpresión del gen de interés (GI) con GFP, células seleccionadas por fluorescencia de GFP
Coexpresión del GI con una proteína de superficie que puede ser marcada por un anticuerpo específico fluorescente
Incubación de células transformadas con DHFR con MTX fluorescente
Para aislar células productoras x FACS
ClonePix
Selector de colonias automático
Se cultivan las células en medio semi sólido para formar colonias individuales
Los clones mejores productores son aspiradosy transferidos a una nueva placa
Cell Xpress
Identifica y purifica las células mejores productoras.Lisis foto mecánica de las células que producen poco
ESTABILIDAD DE LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE
Silenciamiento génico: reducción o eliminación de la transcripción del gen
Mayor determinante: estructura de la cromatina en el sitio de integración (hipoacetilación de histonas, metilación de H3, aumento de la metilación CpG del promotor) heterocromatinización
Las líneas celulares candidatas deben ser cultivadas durante varios meses sin presión de selección
Experiencia con CHO-DG44: sin presión de selección½: silenciamiento en días 1/3: silenciamiento gradual en 6 meses15-25%: estables sin selección
Hacker et al, Biotech. Advances, xxx, 2009
ESTRATEGIAS PARA EVITAR EL SILENCIAMIENTO
LCR (locus control region): segmento de ADN que controla la estructura de la cromatina aumentando la expresión de genes ligados, de manera tejido específica, dependiente del nº de copias e independientemente de la posición
Insulators: elementos regulatorios de la transcripción que modulan la interacción entre enhancers y promotores y protegen a los genes del silenciamiento por cromatina adyacente de manera tejido independiente
Bloqueo de desacetilación de histonas: butirato, ac. Valproico
Inhibidores de ADN metil transferasas: azacitidina.
“Gene targeting”: dirigir inserción a zonas de eucromatina
Barras: células que expresan IL2R, promedio de 10 líneas celulares estables(blancas: 1 copia del gen , negras: multicopia)
La presencia del insulator cHS4 βglobina protege la expresión del transgen en el tiempo
Methods in Molecular Biology, vol 267: Recombinant Gene Expression
Recombinación sitio-específica
Recombinasas fago P1: cre loxSaccharomyces cerevisiae: flp FRT (Flp recombination target)fago λ: λ integrasa attP y attB
Mammalian Chromosome Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 738, 2011
Integración dirigida
ZFN: Zn finger n.
Endonucleasas TALENS: transcription activator-like effector n.
Meganucleasas
Cortan secuencias específicas de ADN se favorece la integración de genespor recombinación homóloga
Integración dirigida
Endonucleasa sitio específica que reconoce sitios de reconocimiento grandes(12-30 pb)
La frecuencia de recombinación homóloga aumenta por corte específico de la doble hebra de ADN
Locus transcripcionalmenteactivo
Gen de timidina quinasa para eliminar integraciones no deseadas con ganciclovir
Cromosomas artificiales: tecnología ACE
Fundamentalmente secuencias repetitivas, ADN satélite, ricas en AT
Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 21
Cromosomas artificiales: tecnología ACE
Transferencia de cromosomas a otras líneas celulares
Aislamiento de los ACEs por citometría de flujo. Tinción diferencial con Hoescht 33258 (AT) y cromomicina-A3 (GC).
Cultivos celulares para producción
Células adheridas
microcarriers
Roller bottles
Células en suspensión
Adaptación de las células a crecer en suspensión
Transformación de células en suspensión
Desarrollo de bioprocesos en escala pequeña, “scale down”
Spinner flask
Volúmen min. 50 ml. Densidad celular 2-3 10 6 cel/ml
TubeSpin reactors
Tubos ventilados de 50 ml . Se alcanzaandensidades celulares > 107 cel/ml en 5-20 ml
SimCell technology
EXPRESIÓN DE GENES TRANSITORIA
¿Para qué?
• Verificar la identidad del gen clonado por la expresión de una actividad
• Probar efecto de mutaciones sobre la actividad de una proteína
• Aislar genes de una biblioteca por la expresión de una actividad
• Ahorrar tiempo y dinero
CÉLULAS COS: African green monkey cellstransformadas con virus SV40 defectuoso en el origen de replicación. Producen el antígeno T grande pero no partículas virales.
Vector: ori de SV40, 10.0000 a 100.000 copias/célula.
CÉLULAS WOP: células de ratón 3T3 transformadas con virus polioma defectuoso en el origen de replicación. Producen ag. T grande pero no partículas virales.
Vector: ori de polioma.
Supresor ambar: Se propaga en E. coli que contiene el plásmido helper P3 que tiene mutaciones ambar en gen de R a tetraciclina y ampicilina
EXPRESIÓN TRANSITORIA
Células COS
Expresión transitoria: 2 sitios de clonado
CÉLULAS COS
No introducen fucosas.
En algunos casos la glicosilación es pobre
EXPRESIÓN TRANSITORIA A GRAN ESCALA
• Período: 1-14 días post transfección en cultivos en suspensión.
• Células: CHO y HEK-293 (human embryonic kidney)Sistemas episomales: HEK-293 T (Ag T SV40), HEK-293 EBNA (Ag virus Epstein Barr), CHO-T (Ag T Py).
• Desarrollo de vectores para expresión episomal(producen el Ag T)
• Volúmen hasta 2008: 100 l.
• Ahorro de tiempo y $: no hay selección
• En HEK293: se llegó hasta 1 g/l en 14 días (2008)
• No hay proteína de uso terapeútico aprobada hasta el momento.
• Transfección: fosfato de calcio, polietileneimina, DEAE dextrano o electroporación. Eficiencia: > 70 %
• Infección viral: alfavirus, adenovirus, vaccinia.