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Produção de proteínas em Produção de proteínas em bactériasbactérias
Prof. Fabricio Rochedo Conceiçã[email protected]
06 de abril de 2010
Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Biotecnologia Microbiana II
Proteína recombinante
Proteína produzida a partir da expressão de uma moléculade DNA recombinante em um sistema
de expressão adequado.
DNA recombinante
Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes.
Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?
Estudos bioquímicos
Determinação da estrutura 3D
Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico...
Alternativa para as seguintes limitações:
Quantidade
Dificuldade de purificação a partir do tecido original
Contaminação (príons, vírus, oncogenes...)
Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas
Processo completamente controlado
Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos
Mycoplasma hyopneumoniae
Pneumonia Micoplásmica Suína
Sistemas de expressão heteróloga
***Animais e plantas
Produção de proteínas recombinantes em bactérias
Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!
Escherichia coli Bacillus subtilis
Engenharia genética X expressão heteróloga
1. Obtenção do DNA a ser clonado
2. Preparo do vetor
3. Ligação do vetor com o “inserto”
4. Transformação da bactéria
5. Seleção dos clones recombinantes
• Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG
• Sítio de múltipla clonagem (polylinker)
• Promotores induzíveis (controle da expressão)
• Sinais de secreção
• Fusão com proteínas carreadoras (solubilidade e purificação)
Vetores de Expressão
pAE2831 bp
AmpR
6x His
f1 ori
pUC ori
pT7
Bam HI (137)
Eco RI (171)
Hin dIII (178)
Apa LI (1092)
Apa LI (2338)
Ava I (131)
Ava I (146)
Vetor de expressão em E. coli
RBS ou sequência de Shine Dalgarno
Regulação da expressão gênica – controle da expressão
Operon Lac
Vetores da família pET (Novagen)
• Altos níveis de expressão• Promotor T7 é mais forte que o lac• Controle rigoroso pelo lacO• Necessita de cepa de E. coli especial – BL21(DE3)
IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)
Extrato total proteico de bactérias separado em SDS-PAGE
não induzidas
induzidas com IPTG
Proteína recombinan
te de 70 kDa
Produção de proteínas recombinantes em bactérias
(sistema pET)
Vetor de expressão com cauda de histidina
Cromatografia de afinidade – Ni-Sepharose
-Purificação de proteínas com cauda de histidina (his-tag)
-Minimizar a proteólise-Maximizar a expressão-Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas)-Facilitar o folding-Solubilidade
Algumas companhias que comercializam vetores de expressão
http://www.promega.com
http://www.neb.com
http://www.stratagene.com
http://www.invitrogen.com
Primeiro hormônio recombinante disponível comercialmente para humanos;
Antes de ser disponibilizada comercialmente era extraída de pâncreas de animais;
Atualmente a forma recombinante é a mais usada no tratamento do diabetes.
Produção de insulina recombinante(Humulin: Human insulin da Eli Lilley Corporation)
Estrutura e biossíntese da molécula de insulina humana
Cadeia α
Cadeia β
Ligações dissulfeto
Seq sinal
Peptídeo CCadeia β Cadeia α
Clivagem da sequência sinal de secreçãoPreproinsulina
ProinsulinaClivagem do peptídeo C
Insulina funcinal
Peptídeo CCadeia β Cadeia α
Obtenção de insulina recombinante
Algumas proteínas recombinantes disponíveispara terapia humana
Insulina (rhI);
Hormônio do crescimento (rhGH);
Hormônio folículo estimulante (rhFSH);
Fator VIII (rhFactorVIII);
Eritropoetina (EPO);
Fator estimulante de colônias de granulócitos (rhG-CSF);
N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (rhASB);
DNAse
Ativador do plasminogênio tecidual (rhTPA);
Glicocerebrosidase (rhGBA);
Interferon-alfa, -beta e gama (rhIFN-alpha, -beta e -gama);
Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1).
Vantagens Desvantagens
Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais
Enorme variedade de vetores disponíveis
Atividade biológica pode diferir da proteína natural
Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas
Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção
Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão
Vantagens e desvantagens do sistema de expressão heteróloga em E. coli
* Formar grupos com 4 componentes
* Buscar no PubMed artigo científico relacionado a expressão de
proteína heteróloga em E. coli
* Entregar até 12-04-10
- Referência bibliográfica - Descrição da proteína recombinante - Aplicação da proteína recombinante - Vetor utilizado para a expressão - Características do vetor de expressão - Estratégia de purificação da proteína recombinante - Resultados relacionados a expressão da proteína recombinante
Trabalho complementar