Problembakterier – karakterisering og genotyping · PDF fileFør 1900 Morfologi, Vekstbetingelser, Sykdomsfremkallende potensiale 1900 - 1960 Morfologi, Fysiologi, Biokjemi 1960

Problembakterier – karakterisering og genotyping

André Ingebretsen Avdeling for smittevern og Avdeling for

mikrobiologi Oslo universitetssykehus

NSFFNS vårkurs 2013

Mikroorganismer finnes i alle

miljøer

?




Estimat av biodiversitet


Estimat av biodiversitet

Rappé & Giovannoni.2003.Ann.Rev. Microb. 57: 369-

394.


Helgenomprosjekter

• Totalt 3701 ferdige genomprosjekter

– Bakterier: 3359

– Archaea: 159

– Eukaryoter: 183

• 13801 pågående genomprosjekter

– Bakterier: 11032

– Archaea: 218

• 1776 planlagte genomprosjekter

– Bakterier:1537 Genomes online database 27.8.2012



Strategi for genotyping av mikroorganismer

• Primærstrategi: – Overvåkning av

infeksjonssykdommer • Bekrefte reinfeksjon eller

residiv infeksjon

– Utbruddsoppklaring i sykehus

• Sekundærstrategi: – Fylogenetiske studier,

populasjons genetikk

– Patogenese studier, virulens.

– Kvalitetssikring: Krysskontaminering i lab


Utbrudd i sykehus

• Bruk av typingsmetoder genererer og tester hypoteser

• Korrekt bruk av typing vil øke effektiviteten på kontrolltiltakene som kan føre til avledning av utbruddet

• Fokus på disse mikroorganismene: – S.aureus

– C.difficile

– P.aeruginosa

– A.baumannii

– S.maltophilia

– Gramnegative med økt resistens (ESBL, NDM-1)

– Gjær- og muggsopp


Klassifisering av Bacteria og Archaea Historikk

Før 1900 Morfologi, Vekstbetingelser, Sykdomsfremkallende potensiale

1900 - 1960 Morfologi, Fysiologi, Biokjemi

1960 - 1980 Kjemotaksonomi, Numerisk taksonomi, DNA-DNA hybridisering

1980 - Genotypiske analyser, Multilokus sekvensanalyser, ”Average Nucleotide Identity”, Helgenom analyser

Tidsepoke Klassifisering i hovedsak basert på


Genotyping

• Genetisk karakterisering av organismer

• Optimalt: Helgenomanalyse

• Genetiske markører

• Genotyping: forandringer i markørsekvenser


Klassifisering av typingsmetoder

Populasjons biologi

Evolusjon

Langsiktig epidemiologi

Typing av bakterier

Kortsiktig epidemiologi

Fenotypiske metoder

Genotypiske metoder

Systematikk

MLEE

MLST

Mikrosatellitter

MORFOLOGI

NGS

PFGE

VNTR/SLST

RIBOTYPING

FAG-TYPING

RESISTENS TYPING

METABOLSK TYPING

SEROTYPING

OPPLØSLIGHET


Utbrudd av E.coli O104:H4 2011

• STEC utbruddet i Tyskland 2011

• Bønnespirer

• 3842 tilfeller

– 2987 lab.konfirmerte E.coli gastroenterittert

• 18 dødsfall

– 855 HUS • 35 dødsfall


Sekvenseringsplatformer

Ion Torrent PGM (Semiconductor

OpGen Argus Optical Mapper


Utbrudd av E.coli O104:H4 2011

Mellmann A et al. (2011) PLoS ONE 6(7): e22751.

doi:10.1371/journal.pone.0022751


Optical mapping


Optical mapping


Utbrudd av E.coli O104:H4 2011 Mellmann A et al. (2011) PLoS ONE 6(7): e22751.

doi:10.1371/journal.pone.0022751


Helgenomsekvensering

• Gir oss nye metoder for å utforske den genetiske diversiteten mellom stammer av samme art.

• Gir oss mulighet til å modifisere eksisterende metodikk

• Gir oss mulighet til å designe nye molekylære verktøy for rask genotyping.

• Gir oss mulighet til å spesialkonstruere medier



PFGE = Genomisk scanning

De

tek

sjo

n a

v D

NA

mig

ras

jon


PFGE


KLEB ESBL April 2011 (21 entries)

PFGE

100

500

PFGE

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

910401827

910104870

909210295

911301588

911501729

911501816

911501795

910411956

911403154

910405799-1

910405799-2

910301441

910401701

910405692

910403750

910505058

910410378

910410630

910407048

910409275-1

910409275-2

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

20.02.2010

13.09.2010

16.12.2009

09.04.2011

11.04.2011

14.04.2011

14.04.2011

22.12.2010

04.04.2011

16.06.2010

16.06.2010

31.03.2010

16.02.2010

14.06.2010

19.04.2010

01.11.2010

08.11.2010

15.11.2010

28.07.2010

08.10.2010

08.10.2010

UR

SS

IA

BLD

TR

TR

TR

UR

UR

UR

UR

BLD

UR

UR

UR

TR

UR

UR

UR

UR

UR

KIRTXS

MEPNYOBS

BKLS4

NKIS2

INTI1

INTI1

INTI1

KIRUROS

OFNS3

MEPNYTX

MEPNYTX

MEPNYTX

MEPNYTX

MEPNYTX

MEPNYTX

NKIV1S

KIRTXS

KIRTXS

KIRUROS

BKLS4

BKLS4

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.


Clostridium difficile


PCR ribotyping

___16S____ ____23S____ ___5S_____

rRNA operon

- Flere rRNA operons pr.

genom

-Stammeavhengig variasjon av

størrelse på regionen mellom

16S-23S

-Variasjon av PCR produkter

der antall og størrelse vil

variere fra stamme til stamme.


Ribotyping av C. difficile i Norge

027 027 027 078 078 078 078


Tandem repeats

GAGCGATACAAACTGGGAAACAGGGAAACTGGGTCCACAGGA

Tandem repeats

Flanke Repeats Flanke


Variasjon i Tandem repeats

Stamme 1

Stamme 2

Stamme 3

Stamme 4

Variable-Number Tandem Repeats = VNTR


Multilocus VNTR analyse (MLVA)

• Regioner med korte, tandemrepeterte DNA-sekvenser finnes over hele genomet.

• Varierer mellom bakteriestammer

• Antall korte, repeterte sekvenser ved valgte loci gir en unik profil innen bakteriestammen.


MLVA på C.difficile

Markør Repetert sekvens Lokalisasjon i CD 630

A6 AAGAGC 755721

B7 ATCTTCT 3688632

C6 TATTGC 3239736

E7 ATAGATT 167124

F3 TTA 1954915

G8 TAAAAGAG 664660

H9 TCTTCTTCC 4116072

A6 B7 C6 E7 F3 G8 H9

21 19 21 10 4 13 2

21 19 22 10 4 13 2

(Van den Berg et al. J. Clin. Microb. 2006; 45:1024-

1028.)



Populasjonsstruktur Clostridium difficile



European Clostridium difficile Infection Survey 2008-2009

• 106 laboratorier

• 34 land

• 509 pasienter

• Karakterisering av isolerte stammer Nov`08

• 65 forskjellige PCR ribotyper identifisert

Lancet. 2011;377:63-73

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21084111




ECDIS net : 2011-2014

• Laboratorienettverk

• Harmonisering laboratoriediagnostikk

• Harmonisering av typingsteknikk

• Felles stammebank

• Overvåkning på Europeisk plan

• Overvåkning i Norge-MSIS

Documents

Problembakterier – karakterisering og genotyping · PDF fileFør 1900 Morfologi, Vekstbetingelser, Sykdomsfremkallende potensiale 1900 - 1960 Morfologi, Fysiologi, Biokjemi 1960