PROBENVORBEREITUNG UND UMGANG MIT … · 14 Probenvorbereitung Probenvorbereitung für spezielle chemische Anforderungen: PFA (Perfluoralkoxy; trade name: Teflon) • Hochreines Polymer

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PROBENVORBEREITUNG UND UMGANG MIT BIOLOGISCHEN MATERIALIEN

Gewebehomogenisierung

Potter Elvehjem Homogenisator

Ultraschall‐homogeni‐sator

Blender Hochleistungs‐homogenisator

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Blutabnahme und ‐aufarbeitung • Für größere Mengen an Blut:

• Venipunktion

Blutabnahme und ‐aufarbeitung

• Für größere Mengen an Blut: • Venipunktion (einmalig) oder • Katheder (venflow)

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Blutabnahme und ‐aufarbeitung

• Für größere Mengen an Blut: • Venipunktion (einmalig) oder • Katheder (venflow)

• Für kleinere Mengen: • Kapillarblut (aus der Fingerspitze)

Probennahme: Blut ‐ Gerinnungshemmung

• Heparinplasma (Li‐Heparin) • EDTA‐Plasma (K2EDTA) • Zitrat‐Plasma (3.8% Zitronensäure)

• Serum mit/ohne Trenngel

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Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten

• Zentrifugation (bei relativ niedriger g‐Zahl) • Eventuell Waschen • Weitere Auftrennung (Differential(ultra)zentrifugation)

Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten

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Probennahme: Auftrennung der Lipoproteine

• Differential(ultra)zentrifugation

Plasma

NaBr- Lösung

VLDL

LDL

HDL

(Ch)

Probennahme: Auftrennung der Lipoproteine

• Differential(ultra)zentrifugation

• Trennung aufgrund der Dichte • (Chylomikronen, VLDL, LDL, HDL)

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Probenvorbereitung 1. Fettextraktion

2. Spurenelementanalytik

3. Festphasenextraktion (solid phase extraction, SPE) in Hinblick auf LC/MS Analysen

1. Fettextraktion

Soxhlet Fettextraktion

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1. Fettextraktion

Automatische Extraktionsgeräte: Einzelne Schritte (Extraktion, Spülen und Trocknen) lassen sich programmieren Vorteil: die tatsächliche Anzahl an erforderlichen Extraktionszyklen wird auf jeder Position durchlaufen ‐> reproduzierbare Extraktionsbedingungen

1. Fettextraktion

Probenvorbereitung für die Analyse von Fettsäuren

Fettextraktion

eventuell HPTLC der Membranphospholipide

Verseifung der Triglyceridester

Reveresterung der freien Fettsäuren zu Methylfettsäureestern

GC‐Analyse der Methylfettsäureester

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1. Fettextraktion

Rotationsverdampfer

1. Fettextraktion

Accelerated Solvent Extraction (ASE)

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1. Fettextraktion

Accelerated Solvent Extraction (ASE)


Trockene Veraschung:

Proben werden in geeigneten Gefäßen (Porzellan, Platin) unter

Hitzezufuhr (500‐1000° C) verascht

Zur Bestimmung des Aschegehalts (Differenzwägung)

Zur Bestimmung von Mengenelementen (Na, K, Ca, Mg)

Ungeeignet für die Analyse von flüchtigen Spurenelementen (J, Se)

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Trockene Veraschung:

Muffelofen


Nasse Veraschung:

Proben werden unter Zugabe eines Oxidationsmittels verascht (in

der Regel eine Mischung aus H2O2 und HNO3)

Aufschluss erfolgt durch Erhitzung in der Mikrowelle oder unter Hochdruck

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Nasse Veraschung:

Mikrowellen‐aufschlussgerät


Nasse Veraschung:

Rotoren und Reaktionsgefäße für Mikrowellenaufschluß

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Nasse Veraschung:

Hochdruck‐aufschlussgerät

2. Spurenelementanalytik Probennahme

Probennahme

L4

L1

L2

L3

L5

ca. 5 g Lungengewebe von jedem Lungenlappen (Alveolare Region) 5 g Gewebe von Leber und Niere -> tiefgekühlt: -30°C -> gefriergetrocknet -> Mikrowellenaufschluss

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Probenvorbereitung – menschliche Gewebe

0.5 g gefriergetrocknetes Gewebe

gespiked mit 196Pt, 108Pd + 4 mL HNO3 + 1 mL H2O2

Mikrowellenaufschluss 1 min/250W; 1min/0W; je 5 min

250W/400W/600W; 220°C Abrauchverfahren (offen)

Einengen auf 500 µL + 100 µL HF + 2 mL HCl (37%)

Isotopenverdünnungsanalyse (194Pt/196Pt; 195Pt/196Pt; 105Pd/108Pd; 106Pd/108Pd)

Mikrowellenaufschluss 1h, 400W, 220°C

Abrauchverfahren (offen) einengen auf 200 µL; + 2 mL aqua regia einengen auf 200 µL; + 1 mL HCl (37%)

einengen auf 200 µL; + H2O subb; 5 mL Endvolumen

Verdünnung vor dem Messen 1:4; ID‐ICP‐MS

nebulizer

spray chamber plasma torch

extraction lens

sampler cone

skimmer cone

electrostatic analyser

magnetic sector field

ion optics

detector (SEM)

Analytisches set up

Analytisches set‐up: USN 6000AT+ Element 1 Quantifizierung: IDMS (194Pt/196Pt, 195Pt/196Pt)

ICP‐SFMS

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Probenvorbereitung

Probenvorbereitung für spezielle chemische Anforderungen: PFA (Perfluoralkoxy; trade name: Teflon) • Hochreines Polymer (Herstellung erfolgt unter Ausschluss von Weichmachern und Füllstoffen) • sehr gute chemische Beständigkeit gegen fast alle Chemikalien • hohe thermische Stabilität von ‐270°C bis +250°C • extrem glatte Oberflächen herstellbar ‐> leicht zu reinigen ‐> keine memory Effekte • autoklavierbar und sterilisierbar

Probenvorbereitung

Säure Ausdämpf Apparatur: zur Reinigung und Vorbereitung von Probengefäßen in der Ultra‐Spurenanalytik Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen) Säurereinigung

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Probenvorbereitung

Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen)

How does it work? Vapor rises from the bath and condenses on the vessels; droplets carrying impurities and return to the acid bath.

Probenvorbereitung

Säurereinigung: subboiling Reinigung für Säuren (HNO3, HCl) oder H2O

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Probenvorbereitung – Urin

2 g Urin

Gespiked mit 108Pd + Standardaddition

+250µL HNO3, 1000µL H2O2, 500µL HCl, 1240 µL H2O

Abrauchverfahren (offen) einengen auf 200µL + 1 mL HCl (37%)

einengen auf 200 µL 2 g Probenvolumen

UV-Aufschluss

Isotopenverdünnungsanalyse (105Pd/108Pd; 106Pd/108Pd)

Welche Probenvorbereitung ist die richtige?

Manuell oder automatisch?

On‐line oder off‐line?

Verdünnen oder Aufkonzentrieren?

Probenvorbereitung bei der LC/MS Kopplung

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Warum Probenvorbereitung?

Minimierung der Matrixeffekte

Eliminierung von Störsubstanzen

Aufkonzentrieren des Analyten

Verdünnen des Analyten

Belastung des LC/MS Systems wird verringert (geringere Kosten in der Erhaltung)

Genauere Ergebnisse

Probenvorbereitung bei der LC/MS Kopplung

Manuelle oder automatisierte Probenvorbereitung ?

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Automatisierung • Probenvorbereitung: off‐line SPE, LLE Manuell oder automatisiert • Probenvorbereitung: on‐line SPE, mehrdimensionale SPE, Säulenschaltung

SPE is an extraction process

whereby an aqueous sample is filtered through a thin bed of

sorbent particles,

the analytes of interest are removed from the liquid matrix,

and concentrated onto the sorbent.

Once concentrated, the analytes are removed by an eluting

solvent.

Principles of SPE

3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)

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SPE Column


Comparison of LLE vs SPE Disk

LLE

Uses 200 ‐ 500 ml solvent

Shaking / continuous process

Forms emulsions

Little selectivity

Takes 1 ‐ 2 hours / sample

Uses 2 ‐ 20 ml solvent

Filtration process

No emulsions formed

Wide selectivity

(adsorbent)

Takes 10 ‐ 20 min. / sample

SPE disk


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What are the Benefits of SPE?

SPE uses less solvent than LLE

SPE is faster (at least 5 times)

High capacity

Total SPE costs are considerably less than LLE

High selectivity: broad choice of bonded phases and solvents

Automation much easier


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SPE Column accessories


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Silicagel‐Phases Reversed Phase

C18

Adsorption

Si‐OH

Normal Phase

NH2

CN C‐OH(OH)


Anion Exchange

N+

NH2

Cation Exchange

C6H5‐SO3H

COOH

SO3H

Biochromatography

WP PEI (NH2)

WP Butyl (C4)

WP CBX (COO)

Sephadex G‐25

Phases


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Interactions

Non polar: van der Waals ~20 KJ/mole

Polar: Dipole / Dipole ~ 40 KJ/mole

Hydrogen bond ~40 KJ/mole

Electrostatic: Ionic ~600 KJ/mole!


4 Steps in SPE


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Experiment 1: Rapid Extraction of natural dyes in beverages: sample load


Experiment 1: Rapid Extraction of natural dyes in beverages: washing step


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Experiment 1: Rapid Extraction of natural dyes in beverages: elution step



Online SPE‐LC

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Online SPE‐LC

3. Festphasenextraktion (SPE)

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Proteinfällung

Vorteile:

hohe Wiederfindungsrate bei geeignetem Fällungsreagenz

universell einsetzbar

schnell durchführbar

geringe Fehlerquellen, da keine komplizierten Bauteile oder Schaltungen verwendet werden

Nachteile:

schwer automatisierbar

Ionische Matrix bleibt erhalten ‐> Belastung des LC/MS Systems

Verdünnen (Dilute and Shoot)

Vorteile:

Alle Komponenten bleiben für die Messung erhalten (Analyt und Matrix!)

geringer Aufwand für die Probenvorbereitung

leicht automatisierbar

kostengünstig

Nachteile:

Die Matrix muss chromatographisch abgetrennt werden

Belastung der analytischen Säule und des MS mit der Matrix

hohe Empfindlichkeit des MS erforderlich

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Festphasenextraktion

Vorteile:

leicht automatisierbar

direktes Einsetzen der Probe beim on‐line Betrieb

Abtrennung der Matrix

Nachteile:

schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten

hoher Zeitaufwand beim Einengen des Eluates

Kosten für die Kartuschen (Einmalkartuschen)

höherer Zeitaufwand für die Methodenentwicklung als bei der Proteinfällung

nicht universell einsetzbar

Flüssig‐Flüssig‐Extraktion (LLE)

Vorteile:

kostengünstiger als SPE

schnelleres Einengen des Eluates als bei der SPE

Matrix wird abgetrennt

Nachteile:

schlechter automatisierbar als SPE

schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten

nicht universell einsetzbar

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