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10/15/08
1
AC – BPBS 1
Probenarten
Feststoff
Aerosol
Emulsion
Flüssigkeitstropfen feste Teilchen
Gas
Flüssigkeit
Homo- und Heterogenes Stoffgemisch
(2 unmischbare Flüssigkeiten)
Suspension (unlöslicher Feststoff in Flüssigkeit)
?
HS 2008
AC – BPBS 2
Ziel der Probenaufbereitung
“Original” zu behalten “Kontaminieren” zu vermeiden
Kost- und Zeitaufwand zu beachten
“geeignete Konzentration” zu halten
HS 2008
“In Lösung” zu bringen
“Störende” abzutrennen
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2
AC – BPBS 3
Probenaufbereitung
Feststoff
Aerosol
Emulsion
Suspension
Flüssigkeitstropfen feste Teilchen
Gas
Flüssigkeit
(unlöslicher Feststoff in Flüssigkeit)
Homo- und Heterogenes Stoffgemisch
(2 unmischbare Flüssigkeiten) LLE, SPE, SPM, SPME
Extraktion
Batch-E Soxhlet-E Soxtec-E Ultraschall-E MAE, ASE SPE, SWE
Adsorption Filtration GC
HPLC EP
mit
MS NMR IR UV
Löslich oder unlöslich
Aufkonzentrierung Vortrennung und Anreicherung Probenarten
Messung
HS 2008
?
Aufreinigung
HS 2008 AC – BPBS 4
in gasförmiger, flüssiger oder feste Form
Anreicherung Verdünnung
aus fester Matrix von störenden Substanzen
“Analytenproben”
in Lösung
von unlöslichem Polymer/Teer von störenden Substanzen
Analyten
abtrennen
Analytenproben
Unlösliche, Farbstoff, “störende” Substanzen
Chromatographische Methode
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3
Praktische Beispiele: Blut-, Urin- und Erdprobe
HS 2008 AC – BPBS 5
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
?
mp: 109 °C bp: 260 °C
Extraktion (Analyten von Beimengen abtrennen) mit
Batch-E Soxhlet-E Soxtec-E Ultraschall-E MAE, ASE SPE, SWE
Dekantieren oder abfiltrieren Einengen Aufreinigung
Filtration Säulenchromatographie, HPLC
Einengen => Probe ––––> Analyse
Getrocknet Zerrieben Wiegen
HS 2008 AC – BPBS 6
Bestandteile einer Säulenchromatographie
ElutionsLM
Säule
Glaswolle
Kieselgel
Sand
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4
HS 2008 AC – BPBS 7
Illustrationen aus Tswetts erster Publikation
Entwicklung der ersten chromatographischen Technik durch Mikhail Semenovich Tswett im Jahr 1903 (Trennung verschiedener Chlorophylle aus Blättern an Calciumcarbonat)
Mikhail Semenovich Tswett
Chromatographie: chroma Farbe graphein schreiben
HS 2008 AC – BPBS 8
Geschichte der Chromatographie
1903 Tswett: Arbeiten zur Trennung von Chlorophyll mittels Adsorptionschromatographie - Namensgebung für die Methode
1938 Iszmailov und Schraiber: Grundlagen der DC
1938 Kuhn: Nobelpreis 1938 für seine Anwendung der Tswett'schen Adsorptionschromatographie an Carotinoiden und Vitaminen
1940 Martin und Synge: Nobelpreis 1952 für Arbeiten zur Verteilungschromatographie, theoretische Grundlagen durch Analogieerklärungen zur Extraktion, Einführung der HETP als chromatographische Kenngröße
1951 Erster Gaschromatograph von Martin und James
1956 van-Deemter-Gleichung von der Gruppe Klingenberg (Shell)
1965 Stahl: Einzug der DC in die chemische Analytik
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5
HS 2008 AC – BPBS 9
Analytische Chemie für Biologie Pharmazie Bewegungs-
wissenschaften und Sport
Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren
Theoretische Grundlagen
529-1041-00 G HS2008
HS 2008 AC – BPBS 10
Trennmethoden auf Unterschied in Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften
Typen von Trennmethoden: Klassifizierung
Beweglichkeit in Einzelphase
Gleichgewicht & Beweglichkeit
Eindring- geschwindigkeit
1 2 1 2 + + + 1
2 m
S
Verteilung
Adsorption/Desorption
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6
HS 2008 AC – BPBS 11
Fundmentale Konzepte Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften
Mobile Phase: gasförmig, flüssig Stationäre Phase: flüssig, fest
Verteilungsgleichgewicht (flüssige stationäre Phase)
Adsorption/Desorption Gleichgewicht (feste stationäre Phase)
Zwischen beiden Phasen:
1
2 m
S
Verteilungs gleichgewicht
Adsorption/Desorption
2. Phase
1. Phase
2. Phase
1. Phase
[A]m
[A]s
Verteilung Adsorption/Desorption
Beweglichkeit
HS 2008 AC – BPBS 12
Übersicht Trennmethoden Zweite Phase
gasförmig fluid flüssig fest
gasförmig thermische Diffusion
Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GC)
Gas-Adsorptions-Chromatographie
fluid Fluid-Flüssigkeits-Chromatographie
Fluid-Adsorptions-Chromatographie
flüssig Destillation Flotation
Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie (LC, HPLC) Dialyse Flüssig-Flüssig-Extraktion
Ultrafiltration
Flüssigkeits- Adsorptions-Chromatographie Ionenaustausch Ausfällen Kristallisieren
Abscheiden (Zonenelektrophorese)
Erste Phase
fest Sublimation Fluid-Fest-Extraktion
Flüssig-Fest-Extraktion
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7
HS 2008 AC – BPBS 13
Übersicht Chromatographische Methoden Gas Überkritisches Fluid Flüssigkeit MP
flüssig SP
Form
Adsorbens Gebundene
Phase
SFC GSC GLC
fest
Säule Säule
Molekularsieb Adsorbens
flüssig fest flüssig fest
Säule Säule Säule Säule Säule Säule planar
LLC
Adsorbens Gebundene Phase
Harz Gel
planar
TLC LSC BPC SEC IEC
GC LC/TLC/HPLC
HS 2008 AC – BPBS 14
Übersicht Chromatographische Methoden Chemische Trennmethode beruht auf
chemische Eigenschaften von der zu trennenden Substanzen.
Physikalische Trennverfahren basiert an kinetische oder Gleichwichts–eigenschaften von
der zu trennenden Substanzen.
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8
HS 2008 AC – BPBS 15
Trennsäule – Hauptteil
HS 2008 AC – BPBS 16
Theoretische Grundlagen zum Chromatographie • Anschauliches Prinzip
– Nernst-Verteilung – Craig-Verteilung
• Einflussfaktoren – Retentionszeit (tM, tR und tR’) – Retentionsfaktor (k) oder Kapazitätsfaktor (k) – Trennfaktor (α) – Phasenverhältnis (β)
• Klassische Theorie: (HETP) • Auflösung (R)
• Kinetische Theorie: Van-Deemter-Gleichung • Optimieren einer Chromatographie • Quantitative Methoden
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9
HS 2008 AC – BPBS 17
Verteilungskoeffizient K
€
K =A[ ]stationärA[ ]mobil
[A]m
[A]s
Mobile Phase
Stationäre Phase
Nernst-Verteilung
einstufig
HS 2008 AC – BPBS 18
Craig-Veteilung K = 1
27.3% K = 1 80% K = 9
1.
2.
3.
9.
K = 0.1 80%
0.4% 3.1% 10.9% 21.9% 0 10 200
10
20
30
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10
HS 2008 AC – BPBS 19
Prinzip der Chromatographie
stationäre Phase (flüssig oder fest)
mobile Phase (gas oder flüssig) Probe
tR
Transport durch mobile Phase
Alle chromatographischen Verfahren basieren auf einer wiederholten Einstellung des Gleichgewichts in mobiler und stationärer Phase und Transport durch MP.
Stoffaustausch HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate)
Wand aus “fused silica” mit Polyimid-beschichtung Flüssigkeitsfilm
HS 2008 AC – BPBS 20
Ein Chromatogramm
Mobile Phase
A + B
B
A
A B
tM tA tB
BA
Mobile Phase
Stationäre Phase
Stoffgemisch
M
€
KA =A[ ]SA[ ]M
€
KM = 0KA < KB
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11
HS 2008 AC – BPBS 21
Retentionszeit
tR Retentionszeit
€
v = LtR
;
Durchschnittlich linear Geschwindigkeit
€
u =LtM
tN = j • tR’ (in GC, j Kompressionskorrektorfaktor); tR’ (in LC))
tR’ reduzierte retentionszeit
tM Totzeit
HS 2008 AC – BPBS 22
Kapazitäts- / Retentionsfaktor k
Kapazitätsfaktor
€
k =tR − tMtM
=tR'
tMk zwischen 1 – 5, < 1 zu schnell ohne Trennung > 20 unerträglich langsam
€
v = u cMVM
cMVM + csVs
= u 1
1+csVs
cMVM
= u 1
1+ K Vs
VM
€
k = K Vs
VM
€
v = u 11+ k
€
LtR
=LtM
11+ k€
v = LtR
;
€
u =LtM
oder Retentionsfaktor k
Siehe R. Kellner, et al., S 526-8
Migrationsrate eines Analytes:
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12
HS 2008 AC – BPBS 23
Trennfaktor und Phasenverhältnis
€
α =KB
KA
€
α =kBkA
€
α =tR'( )BtR'( )A
Phasenverhältnis β
€
β =VGVS
=dc4d f
GC
€
β =VM
VSLC
Volumen der Gasphase
Volumen der Stationären Phase
Durchflussvolumen
Innendurchmesser der Kapillarsäule
Filmdicke der stationären Phase
€
VGVS
VM
dcd f
Trennfaktor α
norm
ierte
Sig
nalh
öhe h
tM
tA
tB
ZeitwA wB
B
A
€
tA'
€
tB'
HS 2008 AC – BPBS 24
Klassische Theorie
0.0
1.0
norm
ierte
Sig
nalh
öhe h
0.607
wb = 4σ
2σ0.500
0.134
0.882
4σ
wh = 2.354σ
σ
x
€
y = y0 ⋅ e−x 2
2σ 2
Idealer gaussförmiger Peak und daraus ableitbare Parameter: wb = Basisbreite, wh = Peakbreite in halber Peakhöhe, σ = Standardabweichung.
2 Abweichungsfälle:
• Fronting • Tailing
€
w = 2w12
= 4σ
€
σ 2 =w2
16
Varianz σ2 (ein Mass für die Breite des Peaks)
Idealer gaussförmiger Peak Peakbasisbreite und Standardabweichung
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13
HS 2008 AC – BPBS 25
Chromatographische Trennprinzipien
Physikalische Trennverfahren basiert an kinetische oder Gleichwichts–eigenschaften von
der zu trennenden Substanzen.
HS 2008 AC – BPBS 26
Wiederholte Extraktion K = 1
27.3% K = 1 80% K = 9
1.
2.
3.
9.
K = 0.1 80%
0.4% 3.1% 10.9% 21.9% 0 10 200
10
20
30
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HS 2008 AC – BPBS 27
K bestimmt Elutionsreihe Mobile Phase
A + B
B
A
A B
tM tA tB
BA
Mobile Phase
Stationäre Phase
Stoffgemisch
M
€
KA =A[ ]SA[ ]M
€
KM = 0KA < KB
Einflussfaktoren
HS 2008 AC – BPBS 28
norm
ierte
Sig
nalh
öhe h
tM
tA
tB
ZeitwA wB
B
A
€
tA'
€
tB'
€
K =A[ ]stationärA[ ]mobil
€
β =VM
VS
€
k = K Vs
VM
€
k =tR − tMtM
=tR'
tM
€
α =KB
KA
€
α =kBkA
€
α =tR'( )BtR'( )A
Phasenverhältnis
Analyt / Phasen
Säulenkapazität
Retentionsfaktor
Trennfaktor
tM, tA oder t’A
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15
HS 2008 AC – BPBS 29
Klassische Theorie
0.0
1.0
norm
ierte
Sig
nalh
öhe h
0.607
wb = 4σ
2σ0.500
0.134
0.882
4σ
wh = 2.354σ
σ
x
€
y = y0 ⋅ e−x 2
2σ 2
wb = Basisbreite σ = Standardabweichung
€
w = 2w12
= 4σ
€
σ 2 =w2
16
Varianz σ2 (ein Mass für die Breite des Peaks)
Idealer gaussförmiger Peak
HS 2008 AC – BPBS 30
Anzahl theoretischen Böden (N)
€
N =tR2
σ 2 =16 tRw
2
Anzahl theoretischen Böden (N) definiert als:
w: die Basispeakbreite tR: die Retentionszeit σ: die Standardabweichung
der Peakbreite L: die Säulenlänge (m) H: die Bodenhöhe (mm)
€
H =L16
wtR
2
€
N = Neff ⋅k +1k
2
=tR'
σ
2
⋅k +1k
2
Effektive Bodenzahl
HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate) tR
€
N =LH
HETP
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16
HS 2008 AC – BPBS 31
Auflösung R – Trennleistung
€
R =tB − tAwB + wA
2
=2(tB − tA )wB + wA
wenn wB ≈ wA:
€
R =tB − tAwB
€
R =tB − tAtB
⋅N4
€
R =kB − kA1+ kB
⋅N4
€
R =α −1α
⋅
kB1+ kB
⋅N4
€
N =16 ⋅ tRw
2
€
tR = tR' + tM
k = tR'
tM
€
α = kB kA
Retentionsfaktor
Trennfaktor
Bodenzahl norm
ierte
Sig
nalh
öhe h
tM
tA
tB
ZeitwA wB
B
A
€
tA'
€
tB'
€
tR =16R2H
u⋅
αα −1
⋅1+ kB( )3
kB2
HS 2008 AC – BPBS 32
Die chromatographische Auflösung
€
R =2 ⋅ Δt
wB + wA
< 1 keine Trennung
= 1 gute Trennung aber mit wenig Überlagerung
= 2 komplette Trennung
? ×
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17
HS 2008 AC – BPBS 33
Zusammenfassung (1)
€
K =A[ ]SA[ ]M
€
v = LtR
€
u =LtM
€
k = K Vs
VM
€
k =tR − tMtM
=tR'
tM
€
α =KB
KA
€
α =kBkA
€
α =(tR' )B(tR' )A
€
N =LH
=tR2
σ 2 =16 tRw
2
€
tR' = tR − tM
Trennfaktor / Selektivätsfaktor
Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor
Retentionszeit / Geschwindigkeit
Verteilungskoeffizient
Auflösung
€
H =L16
wtR
2
Bodenzahl und Bodenhöhe
€
R =tB − tAwB + wA
2
=2(tB − tA )wB + wA
€
R =α −1α
⋅
kB1+ kB
⋅N4
€
tR =16R2H
u⋅
αα −1
⋅1+ kB( )3
kB2
HS 2008 AC – BPBS 34
Aufgabe 1 zur Chromatographie
Mit einer 12,5cm langen Säule wurden in der HPLC-Anlage die Stoffe Benzen und Toluen getrennt. Benzen hatte sein Peakmaximum nach 7,3min und Toluen nach 8,4min. Eine nicht retardierte Substanz hatte eine Retentionszeit von 2,1min. Die Basispeakbreite des Benzenpeaks war 0,74min, die des Toluen 0,87min. Das Volumen der stationären Phase ist mit 0,137mL und das der mobilen Phase mit 1,43mL angegeben.
1. Berechnen Sie das Phasenverhältnis in der Säule! 2. Wie groß sind die Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktoren) für beide Stoffe? 3. Wie lauten die Verteilungskoeffizienten für beide Stoffe? 4. Errechnen Sie den Trennfaktor (Selektivitätsfaktor)! 5. Wie groß ist die theoretische Bodenzahl für Toluen? 6. Berechnen Sie die Bodenhöhe für Toluen! 7. Welche Auflösung haben die Peaks? 8. Wie lang muss die Säule sein, die man für eine optimale Auflösung von 1,5 nutzen
müsste? 9. Wie lang ist die Retentionszeit des Toluen bei dieser Säulenlänge?
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HS 2008 AC – BPBS 35
Kinetische Theorie van Deemter Gleichung für Peakverbreiternde Prozesse
A: die eddy Diffusion B: die longitudinale Diffusion C: die Masstransfer zwischen den zwei Phasen u: Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase €
H = A +Bu
+ C ⋅ u
€
€
DM
€
DS
€
dD
€
df
€
td
€
dc
Diffusionskoeffizient in mobilen Phase
Diffusionskoeffizient in stationären Phase
Durchmesser der Packungsmaterialien
Filmdicke der flüssigstationären Phase
Desorptionsgeschwindigkeit des Analyts
Säuleninnendurchmesser
Säule
Analyt
MP/SP
€
H =L16
wtR
2
HS 2008 AC – BPBS 36
Eddy Diffusion
A Term: die eddy Diffusion
(diese tritt nur bei gepackten Säulen auf) €
H = A +Bu
+ C ⋅ u
Wegen Umwanderung der Molekül durch die Partikel des Packungs-materials legen die Analyten unterschiedliche Weglängen zurück.
Ausmass Homogenität
Dichte
€
A = 2 ⋅ λ ⋅ dpdp Teilchendurchmesser λ Packungsfaktor
1 2
1 2
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19
HS 2008 AC – BPBS 37
Longitudinale Diffusion
B Term: die longitudinale Diffusion
€
H = A +Bu
+ C ⋅ u
€
Bu
=2kDDM
uDM: Diffusionskoeffizienten in der mobilen Phase, kD: Labyrinthfaktor, constant
In GC: B Term => einen entscheidenden Beitrag zu Peakverbreiterung leistet,
insbesondere bei niedrigen u.
In der LC kann der B-Term wegen der sehr kleinen DM-Werte ignoriert werden.
HS 2008 AC – BPBS 38
Massentransfer-Effekte
C Term: die Masstransfer zwischen den zwei Phasen
€
CM ⋅ u =f (dp
2,dc2)u
DM
In der mobilen Phase In HPLC, klein DM => grosse CM
€
C ⋅ u = CS ⋅ u + CM ⋅ u
Gleichgewichtseinstellung zwischen S/M Phasen benötigt Zeit => da die mobile Phase aber in Bewegung ist, kann sich der Gleichgewichtszustand nicht vollständig einstellen => Zunahme der Höhe eines theoretischen Boden (HETP)
€
H = A +Bu
+ C ⋅ u
€
CS ⋅ u =qk ⋅ d f
2 ⋅ u(1+ k)2 ⋅DS
€
CS ⋅ u =2td ⋅ k ⋅ u(1+ k)2
Gleichgewichts einstellung
In flüssigstationären Phase Filmdicke df und DS
In feststationären Phase sehr klein Desorptions-geschwindigkeit td ≈0 HETP
u
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20
HS 2008 AC – BPBS 39
Minimum kinetischer Bodenhöhe
Minimaler H-Wert
Theo
retis
che
Bod
enhö
he H
€
H = 2λ ⋅ dp +2kD ⋅DM
u+ u ⋅
f (dp2,dc
2)DM
+q ⋅ k ⋅ d f
2
(1+ k)2DS
oder 2td ⋅ k(1+ k)2
optimale u
Minimum H
1. Kapillarsäulen A = 0 2. Optimale u => Minimum
der Terme B und C 3. Dünne L-Filmdicke
HS 2008 AC – BPBS 40
Optimierung eines Chromatogramms
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21
HS 2008 AC – BPBS 41
Optimierungsfaktoren
• System – Säule (stationäre Phase) und mobile Phase (Polarität) • Analyteneigenschaften • Operationsbedingungen (Fliessrate, Temperatur- und LM-Gradienten)
€
α =KB
KA
€
k = K Vs
VM €
N =LH
€
H = A +Bu
+ C ⋅ uSP und Analyten Ideal: k = 5 - 10
Analyten SP und MP Temperatur
Säulenlänge Bodenhöhe
stark beinflusst durch u, D, df und dp
€
R =α −1α
⋅
k21+ k2
⋅N4
€
tR =16RS
2Hu
⋅α
α −1
⋅1+ k2( )3
k22
Kurze Retentionszeit tR’ genügende Auflösung R
idealer Peakform (schmal wb und symmetrisch)
HS 2008 AC – BPBS 42
Einfluss der Korngrösse und der Kornoberfläche
Bei gleicher Korngrösse führt eine unregelmäßigere und porösere Kornoberfläche zu breiteren Peaks (schlechtere Auflösung)
Bei kugelförmigem Packungsmaterial geringer Porösität erhält man bei kleinerer Korngrösse eine schmalere Peaks
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22
HS 2008 AC – BPBS 43
Optimierung einer Chromatographie
unvollständige Auflösung
k erhöhen
N erhöhen
α erhöhen
HS 2008 AC – BPBS 44
Auflösung R vs α, k und N
€
R =α −1α
⋅
k21+ k2
⋅N4
N
α
k
R = 1.5
10/15/08
23
HS 2008 AC – BPBS 45
Auflösung und Retentionszeit vs Retentionsfaktor
€
tR =16RS
2Hu
⋅α
α −1
⋅1+ k2( )3
k22
Retentionsfaktor k
Auflösung R
Retentionszeit tR
€
RS =α −1α
⋅
k21+ k2
⋅N4
k = 1 – 5
HS 2008 AC – BPBS 46
Peakformen
Peaksymmetrie
Überlagerung und Reinheit Auflösung Trennleistung
Tailing Fronting
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24
HS 2008 AC – BPBS 47
Efficient Separation in Short Time
1. Solid stationary phase with small particle size (dp) or a thin coating (df) of a stationary liquid film
2. Homogenous packing (λ) of the stationary phase using packing materials with a narrow size distribution
3. A small column diameter (dc), which over time has led to columns getting increasingly narrower
4. Large diffusion coefficients (DS) in the stationary phase and small diffusion coefficients in the mobile phase. In GC, diffusion coefficients (DM) in the mobile phase can be distinctly reduced by working at lower temperatures (T).
€
H = A +Bu
+ C ⋅ uA Low plate height reached, H(u) function proceed as smoothly as possible, since high separation rates can then be guaranteed without losing efficiency. Low Hmin value and smooth H(u) curves can be obtained by:
Since the diffusion coefficients vary with molecular size, the broadening of a peak also depends on the relative molar mass. Small molar masses favor column efficiency. The molar masses are, however, determined by the substances to be separated, so that they cannot be freely selected.
HS 2008 AC – BPBS 48
Informationsgewinns aus einem Chromatogramm
Chromatogramm einer Probe
Qualitativ Quantitativ
Strukturaufklärung Identifizierung mit bekanntem Stoff
Kalibrieren Kopplung mit IR, UV/Vis, NMR, MS
Peakzuordnung Fragmentierung
Spektrendatenbank
Retentionszeiten Retentionsindizes
selektiver Detektor
mit externem Standard mit internem Standard
Standardaddition
Mengenbestimmung
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25
HS 2008 AC – BPBS 49
Identifizierung Peaks im Chromatogramm Um eine bekannte Substanz im Chromatogramm wieder zu finden
Identizierung einer Verbindung über Vergleichsstoffe
Vergleichsstoffe
Probe X
A B C
Probe mit 3 verschiedenen Vergleichsstoffe mischern
Eine Chromatographie durchführen (3 Chromatogramm)
Chromatographieren mit anderem Eluenten Chromatographieren mit anderer stationärer
Phase Chromatographieren mit anderem T-program
A+X B+X C+X Wenn Peaksübereinstimmung zwischen Probe und eine Vergleichsstoff gefunden wird, wird die Probe identifiziert
HS 2008 AC – BPBS 50
Peak-Identifizierung durch Retentionsindices
€
I =100 ⋅ (y − x)log(tPr obe / ty )log(ty / tx )
+100x
x – C-Anzahl des Gliedes mit der Retentionszeit vor der Probe
y – C-Anzahl des Gliedes mit der Retentionszeit nach der Probe
t – Retentionszeiten Log(tR) vs NC-atome
10/15/08
26
HS 2008 AC – BPBS 51
Normierungsverfahren
Geeignet für Homologe und die ungefähre Zusammensetzung
No tR A A-% 1 0,78 374 18,79 2 1,06 8 0,40 3 1,57 1 0,05 4 1,68 34 1,71 5 1,92 128 6,43 6 2,29 98 4,93 7 2,63 46 2,31 8 2,87 246 12,36 9 3,56 36 1,81 10 4,02 840 42,21 11 4,25 1 0,05 12 6,43 164 8,24 13 7,28 14 0,70
€
Ci,% =Ai
Aii=1
n∑
⋅100 A – Peakfläche Ci,% – Konzentration Analyt i i – Analyt i
HS 2008 AC – BPBS 52
Peakhöhe oder Peakfläche?
Bei gut aufgelösten Peaks ist die Peakhöhe zur Konzentration des Analyten proportional.
Bei gut aufgelösten Peaks ist die Peakfläche zur Konzentration des Analyten proportional.
Im Gegensatz zur Peakhöhe liefert die Peakfläche auch bei unsymmetrischen Peaks genaue Ergebnisse.
10/15/08
27
HS 2008 AC – BPBS 53
Bestimmung der Peakflächen
€
A = 12 ⋅ h ⋅ wb
€
wb
€
A = 12 ⋅ h ⋅ (w15% + w85%)
€
w15%
€
w85%
Integrieren durch Software mithilfe personaler Erfahrung
HS 2008 AC – BPBS 54
Quantitative Analyse um die Menge des identifiertes Analyts zu bestimmen
Lineares Ansprechen des Detektors auf zu erwartenden Konzentrationsbereich
für den Analyten
€
Re sponsei =Signali
Konzentration
Kalibrierung mit externer Standardlösung (identisch wie Analyt) Kalibrierung mit interner Standardlösung (sehr ähnlich wie Analyt) Kalibrierung mit interner Standardaddition (identisch wie Analyt)
Gleiches LM-Gemisch, nicht überladen, selbe Operationsbedingung wie Fliessrate, T-Program oder LM-Gradient, eindeutige Peakerfassung und keine Peaküberlagerung
€
Ax = fx ⋅ X[ ]
€
fx =Ax
X[ ]
€
X[ ] =Ax
fx
10/15/08
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HS 2008 AC – BPBS 55
Kalibrierung mit externem Standard
Vom zu bestimmenden Stoff (Analyt) werden bekannte, verschieden konzentrierte Lösungen, Gasmischungen, Pasten oder Feststoffmischungen hergestellt, die als Standardproben dienen. Sie werden vermessen und zur Aufstellung der Kalibrierfunktion genutzt. Der Analytgehalt der Proben wird dann unter denselben Bedingungen wie die Standards gemessen und errechnet.
€
A = A0 + f ⋅Cs tan dard
f: Steigung
A
HS 2008 AC – BPBS 56
Quantifizierung mit einem externen Standard Der externe Standard bekannter Konzentration wird gemessen: Cs, ys Die Probe unbekannter Konzentration wird gemessen: yx Berechnung des Analytgehaltes über Verhältnisgleichun: Cx
€
Cx =yxys⋅Cs
10/15/08
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HS 2008 AC – BPBS 57
Interner Standard – Eine Beispiel
[KS] A[KS] [IS] A[IS] A[KS]/A[IS] KS 0 0 5 293 0
“ 4 212 5 307 0.690
“ 8 443 5 310 1.429
“ 12 650 5 309 2.103
“ 16 844 5 306 2.760
Probe ? 567 5 248 2.295
N
N N
N
O
O
CH3
CH3
H3CN
N N
HN
O
O
CH3
H3C
Coffein Theophyllin
Externer Standard Interner Standard €
AAnalyt
AIntS
= b + a ⋅CAnalyt
Interner Standard, der dem Analyten meist chemisch ähnlich, aber nicht mit ihm identisch ist.
2.295
100 mg⋅L–1 Coffein in Wasser 100 mg⋅L–1 Theophyllin in Wasser Probe: Extrakt aus 1 g Teepulver in 25 ml Theophyllin (500 mg⋅L–1), 100fach verdünnen
33 mg⋅g–1 Coffein im Teepulver
HS 2008 AC – BPBS 58
Standardaddition mit internem Standard
€
AP
AP +IS
=CP
CP + CIS
€
AP +IS = AP ⋅ (1+CIS
CP
)
AP – Peakfläche der Probe AP+IS – Peakfläche der Probe und Standardzusatz CP – [C] des Analyten in der Probe CIS – [C] des Analyten aus Zusatz
€
CIS = 0,
€
AP +IS = AP
€
AP +IS = 0,
€
CpC(internStandard)
Peakfläche
10/15/08
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HS 2008 AC – BPBS 59
Zusammenfassung – Quantitative
Kalibrierung mit internem Standard
Kalibrierung mit externem Standard
Kalibrierung mit Standardaddition
identisch mit Analyt Analytenstandardlösung
sehr ähnlich wie Analyt Analytenstandardlösung (Viele systematische Fehler wie Verluste bei Anreicherung, Wäge- und Volumenfehler zu vermeiden)
identisch mit Analyt Analytenstandardlösung
€
AAnalyt
AIntS
= b + a ⋅CAnalyt
€
AP
AP +IS
=CP
CP + CIS
€
A = A0 + f ⋅Cs tan dard
ENDE