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CONCEPTOS FUNDAMENTALES DE

CROMATOGRAFA


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INTRODUCCIN

En 1910, el botnico ruso M. Tswett describi por vez primera esta tcnica, que fue aplicada

a la separacin de pigmentos de plantas, dndole el nombre de cromatografa en referencia a las

bandas coloreadas de pigmentos que se separaban por su adsorcin selectiva sobre columnas de yeso.

Tras su descubrimiento, la cromatografa quedo prcticamente olvidada hasta 1930 ao en que fue

redescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para la separacin de carotenoides; a partir

de este momento, el uso de esta tcnica se fue extendiendo cada vez ms, al tiempo que se

desarrollaban diferentes versiones de la misma: cromatografa de reparto (Martin y Synge, 1941),

de papel (Consden, Gordon y Martin, 1944), de capa fina (Stahl, 1958), etc. Un hito importante en

el desarrollo de la cromatografa lo constituy el desarrollo de la cromatografa gas-lquido (Martin

y James, 1952), tcnica que encontr rpidamente aplicaciones de gran importancia, lo que llevo a

su vez al desarrollo de la teora de la separacin cromatogrfica (Van Deemter, 1956; Giddings,

1965, etc.) as como al desarrollo de una instrumentacin que permita un mayor control de las

condiciones de trabajo.

Hoy en da casi no hay campo de la qumica, biologa, medicina, etc. en el que no se utilice

la cromatografa en alguna de sus formas, tanto en su vertiente preparativa como en la analtica; por

otra parte el desarrollo sobre el uso conjunto de la cromatografa con otras tcnicas analticas, ascomo el desarrollo de otros tipos de cromatografa, como es por ejemplo la de fluidos supercrticos,

hace previsible una extensin an mayor de su uso.


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CONCEPTOS BSICOS

La cromatografa es esencialmente un mtodo fsico de separacin en el que los componentes

a separar se distribuyen entre dos fases, una inmvil (lecho estacionario), y otra mvil (fase mvil)

la cual percola a travs de la primera. El proceso cromatogrfico se da como resultado de repetidos

procesos de sorcin-desorcin durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados

por la fase mvil a lo largo del lecho estacionario (elucin), producindose la separacin debido a

las diferencias en las constantes de distribucin de los componentes de la mezcla entre la fase

estacionaria y la mvil. A la distribucin final de los componentes en funcin de su posicin sobre

el lecho estacionario, o del tiempo en que eluyen se le denomina cromatograma.

Prcticamente no existen restricciones sobre la naturaleza de las fases a utilizar, siempre que

la fase estacionaria sea slida o lquida y la fase mvil lquida o gaseosa, por lo que es posible, en

principio, realizar por medio de estas tcnicas la separacin de los componentes de cualquier mezcla.

Por otra parte, la utilizacin de las tcnicas cromatogrficas no esta exenta de dificultades, debido

fundamentalmente a la gran cantidad de parmetros que pueden influir en el proceso de separacin,

lo cual dificulta la eleccin de las condiciones ptimas de separacin y en muchas ocasiones implica

la irreproducibilidad de los resultados. Por ello la cromatografa no es una tcnica de rutina que

pueda aplicarse sin ms a cualquier mezcla, sin invertir en muchos casos gran cantidad de esfuerzoy tiempo.

Tipos de cromatografa

Las tcnicas cromatogrficas pueden clasificarse en funcin del mecanismo de separacin

de los componentes entre las fases, o bien por la forma de operar del sistema.

a) Mecanismos de separacin

En funcin del mecanismo de separacin, las tcnicas de cromatografa pueden clasificarse


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en:

- Cromatografa de adsorcin. La separacin depende de los equilibrios de adsorcin-

desorcin de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria slida y la fase mvil

lquida o gaseosa. La fuerza con que es adsorbido un componente depende de la polaridad

de este, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase mvil. En general cuanto

ms polar es un compuesto ms fcilmente ser adsorbido. El orden general de elucin de

algunos compuestos orgnicos, de la actividad de algunos adsorbentes y de la fuerza de

elucin de algunos disolventes comunes, se recogen en la Tabla I. La cromatografa de

adsorcin, es una tcnica que est particularmente bien adaptada para la separacin de

compuestos de polaridad baja y media. La separacin de compuestos muy polares mediante

cromatografa de adsorcin requiere, debido a la gran retencin que ofrecen, la utilizacin

de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos qumicos previos para la preparacin

de la muestra (preparacin de trimetilsilil derivados, etc.) a fin de reducir su polaridad.

- Cromatografa de reparto. Est basada en la separacin de una mezcla de substancias

mediante el reparto existente entre la fase mvil (lquido o gas) y la fase estacionaria

(lquida) soportada o ligada sobre un slido adecuado. La mayor o menor migracin de un

compuesto en este tipo de cromatografa, ser funcin del coeficiente de reparto de ste entrela fase estacionaria y la fase mvil:

La cromatografa de reparto es utilizable para la separacin de mezclas de compuestos de

polaridad media y alta. Ejemplos de este tipo de cromatografa, son las cromatografas sobre

papel, slice hidratada y la cromatografa lqida de alta eficacia en fase reversa.

- Cromatografa por tamao molecular, tambin llamada de permeacin de gel o de tamiz

molecular. Consiste en la separacin de las molculas basndose en su tamao en lugar de


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en su solubilidad o polaridad. Las fases estacionarias empleadas para este tipo de

cromatografa son inorgnicas (zeolitas), o geles orgnicos compatibles con disolventes

acuosos (agarosa, poliacrilamida) u orgnicos (copolmeros estireno/divinilbenceno). Estas

fases estacionarias poseen cavidades en las cuales las molculas de los compuestos a separar

pueden penetrar y ser retenidas, siendo las molculas mayores las eluidas de la columna en

primer lugar; el rango de trabajo de estas fases estacionarias, se define como el intervalo de

pesos moleculares que pueden ser separados; otro parmetro que caracteriza a este tipo de

fases, es su lmite de exclusin, que se define como el peso molecular a partir del cual los

compuestos pasarn a travs del lecho estacionario sin experimentar retencin.

- Cromatografa de cambio inico. Las separaciones por intercambio inico, se llevan a cabo

con materiales insolubles y de textura porosa, los cuales presentan grupos reactivos asociados

a iones lbiles capaces de intercambiarse con los del medio que les rodea, por lo que

inevitablemente este tipo de cromatografa ha de realizarse en medio lquido. La

cromatografa de intercambio inico, es utilizable para la separacin de substancias inicas,

tanto inorgnicas como orgnicas. Las separaciones por cambio inico, estn basadas en los

diferentes equilibrios de reparto de los iones de la mezcla entre el material cambiador y la

disolucin:

En general, se utilizan tres tipos de materiales para cromatografa de cambio inico: resinas,

geles y celulosas. La diferencia fundamental entre ellos reside en su microestructura ya que,

generalmente, las resinas presentan un tamao de poro mucho menor, siendo apropiadas para

la separacin de substancias de pequeo volumen molar. Otras diferencias existentes entre

los diversos materiales de cambio inico son debidas a la naturaleza de los grupos

cambiadores (fuerza del grupo cambiador) y al nmero de estos por unidad de peso de

material (capacidad de cambio).

Debe tenerse en cuenta que los mecanismos de separacin descritos, son aproximaciones a


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las situaciones reales y que, aunque en una tcnica concreta predomine alguno de ellos, la separacin

suele estar basada en la conjuncin de diversos mecanismos.

TABLA I.- Adsorbentes y disolventes ms comunes en cromatografa.Orden de elucin, actividad de adsorbentes y fuerza de elucin de los disolventes

Secuencia Orden de elucin decompuestos

Actividad deadsorbentes

Fuerza de elucin dedisolventes

-

+

Hidrocarburos saturados Celulosa Eter de petrleo

Hidrocarburos aromticos Ciclohexano

Derivados halogenados

Eteres

Benceno

Tetracloruro de carbono

Sulfato clcico (yeso) Diclorometano

Cetonas Slice Cloroformo

Aldehdos Florisil Eter dietlico

Esteres Oxido de magnesio Acetato de etilo

Alcoholes

Aminas

Almina

Acidos Carbn activo Acetona

n-propanol

Etanol

Metanol

Agua

Acido actico


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b) Formas de separacin.

Otra posible clasificacin de las tcnicas cromatogrficas, est basada en la forma de operar

del sistema cromatogrfico. Bsicamente existen cuatro formas de operacin:

- Anlisis por desarrollo. Es el mtodo utilizado en los experimentos iniciales de

cromatografa. El cromatograma se desarrolla hasta que el frente de disolvente

alcanza el final del lecho estacionario, de forma que los constituyentes de la mezcla

una vez separados permanecen sobre el lecho al finalizar la separacin. La tcnica de

anlisis por desarrollo presenta la ventaja de que es analizable la totalidad de la

muestra, incluyendo los compuestos de muy baja o muy alta retencin. Se utiliza

fundamentalmente en cromatografa de papel y capa fina.

- Anlisis por elucin. Es la tcnica utilizada en casi todas las separaciones

cromatogrficas analticas y en muchas preparativas. En ella, el paso de la fase mvil

se contina indefinidamente hasta que los componentes separados de la mezcla

emergen al final del lecho cromatogrfico. Esta tcnica presenta la desventaja de que

los compuestos con retenciones muy altas pueden no ser observados.

- Anlisis frontal. Este mtodo est basado en la diferencia de afinidad del adsorbente

por cada una de las sustancias a separar. Se utiliza una pequea columna, que es

saturada sucesivamente por cada una de las substancias a separar, emergiendo de ella

el primer componente puro hasta que la columna se satura del segundo componente,

momento en el que empezar a emerger ste mezclado con el primero. El anlisis

frontal tiene su principal aplicacin como tcnica preparativa para la purificacin de

substancias.

- Anlisis por desplazamiento. En este caso, la substancia desplazante va incorporada

dentro de la fase mvil. Este metodo se utiliza tanto para separaciones analticas

como preparativas, siendo muy utilizada en cromatografa de cambio inico.


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PARMETROS BSICOS DE CROMATOGRAFA

El tratamiento terico del proceso cromatogrfico, fue desarrollado fundamentalmente en

base a las tcnicas instrumentales de cromatografa que utilizan el mtodo de anlisis por elucin y,

en consecuencia, como parmetros para definir la banda cromatogrfica, se utilizan el tiempo o el

volumen de eluyente a que aparece dicha banda al final de lecho estacionario (tiempo o volumen de

retencin); no obstante, es necesario precisar que los parmetros que definen una separacin

cromatogrfica, son extrapolables a las separaciones que utilizan tcnicas de desarrollo.

Retencin y factor de capacidad

Cuando se introduce un compuesto en la corriente de fase mvil de un sistema

cromatogrfico, de no existir interaccin de ste con la fase estacionaria, la banda que forma se

desplazara a la misma velocidad que la fase mvil y emergera del lecho estacionario cuando el

volumen total de fase mvil utilizado fuese igual al volumen vaco o intersticial de la columna

(volumen muerto); sin embargo, como las molculas de la muestra interaccionan de hecho con la fase

estacionaria, aquellas necesitan para su elucin el paso de un volumen mayor de fase mvil, que se

denomina volumen de retencin de la muestra. Dado que en un sistema cromatogrfico que operea caudal constante, el volumen eludo y el tiempo son proporcionales, los conceptos de volumen

muerto y volumen de retencin, son directamente intercambiables por los de tiempo muerto (tM) y

tiempo de retencin (tR).

En la figura 1, se muestran los parmetros de retencin para el caso de una nica banda

cromatogrfica. Se observa que el tiempo de retencin de la banda, puede dividirse en dos partes:

el tiempo muerto (tM) y el tiempo transcurrido a partir de este momento hasta la aparicin del

mximo de la banda. A partir de la definicin de tiempo muerto, se induce que el segundo, es el

tiempo real que la fase estacionaria ha retrasado el avance del compuesto, y se conoce con el nombre

de tiempo de retencin corregido (t'R).


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Figura 1.- Cromatograma de un componente y sus parmetros caractersticos

En base a los parmetros de retencin descritos, se define el factor de capacidad (k') como:

Este factor adimensional expresa la retencin de un compuesto por la fase estacionaria,

independientemente del caudal de la fase mvil. En la prctica, los compuestos de inters deben

presentar, en el sistema cromatogrfico elegido, valores de k' comprendidos entre 1 y 15, con el fin

de no alargar excesivamente los tiempos de separacin.

Dispersin de bandas

Cuando se introduce, en forma de banda muy estrecha, una mezcla de los componentes a


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Figura 2.- Parmetros caractersticos de un pico gaussiano

separar en una columna cromatogrfica (cabeza de columna), al eluir la mezcla desde un extremo

a otro de la columna, se observa que las bandas de soluto se van ensanchando al mismo tiempo que

se separan; este proceso es debido fundamentalmente a la difusin termodinmica de las molculas

de la banda, que tienden a distribuirse uniformemente en todo el volumen disponible. El proceso de

difusin es dependiente del tiempo, de forma que la dispersin de la banda aumentar en funcin del

tiempo de elucin. Dado que los procesos de difusin de las molculas tienen su fundamento en

movimientos de las mismas al

azar, la concentracin final de las

molculas dentro de una banda

cromatogrfica adoptar, en un

caso ideal, un perfil de

distribucin normal, y el registro

de las concentraciones de la

banda en funcin del volumen

eludo o del tiempo, dar lugar a

una forma gaussiana de anchura

definida por la desviacin

standard de la dispersin. Los

parmetros caractersticos de unpico gaussiano se ilustran en la

figura 2.

Eficacia

Para realizar una separacin cromatogrfica ptima, debe evitarse en lo posible, el

ensanchamiento de las bandas debido a la dispersin; en efecto, cuanto mas anchas sean las bandas,

menor nmero de ellas podrn ser resueltas en un espacio de tiempo dado; en otras palabras, cuanto

mas agudos sean los picos que emergen de una columna mejor estar actuando dicha columna. Las

anchuras de las bandas cromatogrficas dependen de las caractersticas de la columna (tamao de


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las partculas del lecho estacionario, homogeneidad de este, etc.), as como de otros factores como

por ejemplo, la velocidad de la fase mvil. Para expresar la calidad de un pico, se utiliza un

parmetro relativo que tenga en cuenta tanto la retencin como la anchura de la banda; este

parmetro es el cociente entre el tiempo de retencin y la desviacin standard de la banda

cromatogrfica:

En la prctica, se define la eficacia de una columna como el cuadrado del cociente anterior

y se expresa como nmero de platos tericos:

As el nmero de platos tericos de una columna puede calcularse utilizando la anchura de

uno de sus picos, normalmente el ltimo que pueda medirse directamente sobre el cromatograma

(figura 3), utilizando las expresiones:

El nmero de platos de una columna cromatogrfica, depende lgicamente de su longitud,

por lo que para comparar la eficacia de columnas con diferente longitud, se introduce otro trmino,

denominado altura equivalente de un plato terico, que relaciona la eficacia de una columna con su

longitud y que se define como el cociente entre la longitud de la columna y su nmero de platos

tericos:


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Figura 3.- Cromatograma de dos bandas y parmetros para calcular eficacia y resolucin

Es de destacar que al considerar la eficacia, solamente se han tenido en cuenta los efectos

propios de la columna, aunque existen otros parmetros del sistema (anchura de banda inicial,

velocidad de la fase mvil, etc.) que contribuyen al ensanchamiento de las bandas cromatogrficas.De esta manera, no siempre la baja eficacia de un sistema cromatogrfico es atribuible a la columna,

sino que tambin contribuyen otros factores que ser preciso optimizar.

Separacin y resolucin

Hasta el momento, nicamente se ha considerado el caso de que en el cromatograma exista

una sola banda; sin embargo, el objeto de la cromatografa es separar mezclas de varios componentes

y es de suma importancia considerar la separacin entre ellos. Debe recordarse siempre que,

independientemente del nmero de componentes que pueda tener una mezcla, el problema de

separacin de todos ellos, queda siempre reducido al de las dos bandas adyacentes ms difciles de


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separar. La separacin entre dos bandas cromatogrficas (figura 3), puede estudiarse en funcin de

dos parmetros, la retencin relativa, definida como el cociente entre los tiempos de retencin

corregidos de las dos bandas:

Y la resolucin, que se define como el cociente de la distancia entre los centros de las dos bandas

y el valor medio de la anchura de las mismas:

En consecuencia, una separacin total de dos bandas requerir valores de "y de Rslo mas

elevados posible. Es de tener en cuenta que mientras que un valor elevado de Rspuede conseguirseaumentando la eficacia de la columna (mayor longitud de columna, menores dispersiones de banda,

etc.), el valor de " es constante para cada sistema cromatogrfico y solamente podr variarse

alterando la fase estacionaria o la mvil, en otras palabras, cambiando de sistema cromatogrfico.

La solucin de un problema real de separacin entre dos bandas deber darse en funcin de los

valores de "y Rs que presente; as, para valores altos de "y bajos de Rs, la separacin podr

conseguirse mediante un aumento de eficacia, mientras que para valores bajos de "no es practico

intentar la separacin en base a un aumento de eficacia y debe procederse a un cambio del sistema.


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LA CURVA DE AEPT

Como ya se ha visto, la eficacia de una columna cromatogrfica es de gran importancia a la

hora de conseguir una buena separacin; en consecuencia, es de gran inters el conocer los

parmetros de los que depende la eficacia.

La curva de AEPT, es la representacin de la altura equivalente a un plato terico, frente a

la velocidad lineal de la fase mvil. Como ya se ha visto, la altura de un plato terico viene dada por

la expresin:

O bin, por la expresin equivalente:

Es decir, el cociente entre la varianza de la banda cromatogrfica y la longitud de la columna.El valor de la varianza total del pico cromatogrfico, vendr dado por la suma de las varianzas

individuales de todos los fenmenos que contribuyan al ensanchamiento de la banda:

Los factores que contribuyen al ensanchamiento de una banda cromatogrfica que se mueve

a lo largo de una columna son los siguientes:

1.- Difusin molecular.


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2.- Irregularidades en el relleno (difusin de Eddy).

3.- Resistencia a la transferencia de materia en la fase mvil.

4.- Resistencia a la transferencia de materia en la fase estacionaria.

La difusin molecular es debida a la dispersin termodinmica de las molculas de la banda

cromatogrfica a lo largo de la columna, teniendo lugar esta dispersin tanto si la banda se mueve

como si est en reposo. La varianza originada por difusin molecular viene dada por la expresin:

Siendo Dmel coeficiente de difusin molecular, L la longitud de la columna, u la velocidad

lineal del eluyente y ( es el denominado coeficiente de tortuosidad, que tiene en cuenta la

perturbacin de la difusin molecular debida a irregularidades de la fase estacionaria.

El ensanchamiento de la banda cromatogrfica debido a la irregularidad de la faseestacionaria, viene dado por la expresin:

Donde a es un coeficiente que ser funcin del tamao medio de la partcula y del coeficiente

de dispersin en la fase mvil.

El ensanchamiento de la banda debido a la resistencia a la transferencia de materia, en la fase

mvil y en la fase estacionaria, vendr dado por las expresiones:


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Donde d es el dimetro medio de la partcula del lecho estacionario y Cm y Ce, dos

coeficientes que dependen respectivamente de la fase mvil y de la fase estacionaria.

A partir de las ecuaciones anteriores, se puede deducir que la varianza total de la banda

cromatogrfica vendr dada por la expresin:

Y en consecuencia, la altura equivalente de plato terico, vendr dada por la expresin:

Esta ecuacin, es la expresin matemtica de la curva de AEPT o ecuacin de Van Deemter,

que frecuentemente se encuentra abreviada bajo la forma:

La ecuacin de Van Deemter resulta de difcil manejo desde el punto de vista prctico, ya que


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Figura 4.- Representacin grfica de la curva de AEPT

muchos de los coeficientes que forman parte de ella son difciles de conocer. No obstante, pueden

extraerse de ella algunas informaciones interesantes; as, por ejemplo, puede verse que la altura de

plato es funcin del dimetro de las partculas de la fase estacionaria, mejorndose la eficacia del

sistema cromatogrfico a medida que disminuye el tamao de partcula. Por otra parte, puede verse

que la eficacia de una columna cromatogrfica, ser tambin funcin de la velocidad lineal de la fase

mvil, como se puede ver claramente en la representacin grfica de la ecuacin:


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Figura 5.- Parmetros correspondientes a diferentes formas de pico

DISTORSIONES DE BANDA

Asimetra de pico

Como primera aproximacin, se ha venido considerando que el sistema cromatogrfico se

comporta como un operador gaussiano, ensanchando la banda cromatogrfica hacia una distribucin

normal segn va pasando a travs de la columna cromatogrfica.

En la prctica, los picos cromatogrficos raramente son gaussianos, y la realizacin de

clculos sobre el cromatograma en base a esta suposicin, puede llevar a errores significativos si se

trabaja con picos muy distorsionados. El modelo de la curva de Gauss slo es apropiado cuando se

trabaja con picos cuya asimetra es ligera. En la figura 5, se muestran las caractersticas de simetra

de picos gaussianos (a), picos con cola (b) y picos con distorsin frontal (c).


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El factor de asimetra de un pico cromatogrfico, puede calcularse por medio de la ecuacin:

Donde:

Para los picos gaussianos, el factor de asimetra es igual a 1; si los picos presentan cola, se

asigna a As valor positivo, y cuando los picos presentan distorsin frontal, se le asigna valor

negativo.

Aunque prcticamente todos los picos cromatogrficos son ligeramente asimtricos, los

factores de asimetra exagerados deben ser evitados, tanto por la posibilidad de que se originen

errores en la cuantificacin, como por la prdida de resolucin que se origina (un pico con As = 1,1

ocasiona una prdida de eficacia de un 10 %).

La asimetra de los picos puede ser debida a un buen nmero de factores, tanto instrumentales

como cromatogrficos, entre ellos resolucin incompleta de dos bandas, presencia de puntos de gran

actividad en las fases estacionarias, reacciones qumicas del compuesto en la columna, volmenes

muertos en el sistema cromatogrfico, tcnicas de inyeccin incorrectas, etc.

Distorsin instrumental de banda

Hasta el momento, se han considerado algunos de los factores que originan el que las bandas

cromatogrficas experimenten una variacin de forma a lo largo del proceso cromatogrfico

(generalmente ensanchamientos). Si bien en la mayora de los casos no existe posibilidad de


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intervenir sobre estos factores, en otros, si existen posibilidades de optimizacin, no ya con el fin de

aumentar la eficacia de una columna, lo que es imposible, sino con la finalidad de no perder la

eficacia que puede proporcionar.

Inyeccin

La muestra inyectada, puede originar una deformacin de la banda cromatogrfica por dos

motivos: la inyeccin de una masa excesiva de muestra, puede llevar a una sobrecarga de la columna,

con la consiguiente prdida de capacidad de separacin; este motivo de distorsin no tiene otra

solucin que inyectar masas menores de muestra. Un segundo motivo de deformacin de las bandas

que, por otra parte, suele ser el caso ms frecuente es el de que aunque la masa inyectada no sea

suficiente para sobrecargar la columna, la inyeccin de un volumen excesivo, provoque una prdida

de la eficacia del sistema.

Cuando se inyecta un determinado volumen de muestra, sta ocupar en la cabeza de la

columna una cierta longitud. En el caso de una columna ideal, que no ensanchase los picos, la banda

cromatogrfica a la salida de la columna tendra la misma anchura que la banda inyectada; este ancho

de banda inicial ocasionado por la inyeccin, nunca se reducir a su paso por la columna, sino quepor el contrario se har mayor. Es evidente, en consecuencia, la necesidad de inyectar volmenes

adecuados, as como de utilizar mtodos capaces de proporcionar inyecciones de alta calidad.

La calidad instrumental de un sistema de inyeccin, se expresa en funcin de un parmetro

K, en la expresin:

Donde V0es el volumen inyectado y Fila desviacin tpica de la banda ocasionada por la

inyeccin. De la ecuacin anterior, se deduce que la inyeccin ser tanto mejor cuanto mayor sea el


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parmetro instrumental K y cuanto menor sea el volumen inyectado. La anchura total del pico

cromatogrfico a la salida de la columna, vendr dada por la expresin:

Siendo Ft2la varianza total del pico a la salida de la columna y Fc

2la varianza del pico debida

a la columna. A partir de esta ecuacin, es posible obtener el valor de K de un inyector,

representando Ft2en funcin de V0

2. Se puede demostrar tericamente que para un inyector ideal, K

= 3,5, aunque en la prctica, para sistemas de inyeccin aceptables K = 2.

Respecto al volumen de muestra inyectado, su valor mximo para que se origine una prdida

de eficacia de )N platos en una columna, viene dado por la ecuacin:

Como se puede ver, el volumen mximo que se puede inyectar depender, adems de la

calidad del inyector, de las caractersticas de la columna (dimetro de la columna, porosidad,

longitud y altura de plato) y de la retencin del pico que se trate de analizar (k'). Es fcil deducir, que

si se quieren evitar prdidas elevadas de eficacia, los volmenes inyectados deben ser pequeos, en

particular si se trabaja con columnas muy eficaces (bajo valor de H), de pequeo dimetro, y muy

en particular, cuando los compuestos a analizar presentan pequeas retenciones. Como estimacin

prctica, para limitar a un cierto valor la prdida de eficacia de una columna, en la que el pico de

inters presente un volumen Vp, los volmenes mximos a inyectar (Vi), son los recogidos en la

Tabla II.


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Tabla II.- Prdidas de eficacia del sistema en funcin del

volumen inyectado

Vi Prdida de resolucin (%)0,25 Vp 5

0,33 Vp 8

0,40 Vp 10

0,57 Vp 20

Conexiones

Los tubos capilares y los diferentes sistemas de unin utilizados para conectar los diferentes

componentes del cromatgrafo, deben ser considerados a todos los efectos como volmenes muertos

capaces de originar prdidas de eficacia del sistema.

El radio interno y la longitud del tubo de conexin que pueden provocar una prdida de )N

platos, vienen dados por la ecuacin:

Como puede verse, el factor fundamental en la prdida de eficacia, es en este caso el radio

del tubo de conexin, ya que la prdida de eficacia aumenta en funcin de su cuarta potencia; este

hecho, obliga a que todos los tubos de conexin en sistemas de alta eficacia sean extremadamente

finos (del orden de 0,1 mm de dimetro).

Respecto a las conexiones entre tubos, debe estarse extremadamente seguro de que a la hora


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Figura 6.- Volmenes muertos provocados por conexiones mal realizadas

de realizar la conexin no se introducen volmenes muertos de ningn tipo (figura 6), no slo debido

al ensanchamiento de banda que provocara, sino al hecho, de mayor importancia todava, de que un

volumen muerto en este tipo de conexiones deja frecuentemente zonas que no son barridas por el

flujo de fase mvil, lo que conduce no slo a ensanchamientos de banda, sino tambin a distorsiones

de la forma de la banda que en ocasiones pueden llegar a ser de gran importancia.


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Figura 7.- Cromatograma tpico de una mezcla

INTERPRETACIN DEL CROMATOGRAMA

Como ya se ha mencionado, la cromatografa es bsicamente un mtodo de separacin, tal

vez el ms potente de que se puede

disponer en un laboratorio, aunque

debe tenerse siempre en cuenta que

la cromatografa, a efectos

analticos, es una tcnica ciega. Los

mtodos cromatogrficos, por si

mismos, pueden informar, en el

mejor de los casos, del nmero de

compuestos qumicos que estn

presentes en una mezcla (figura 7),

pero nunca de proporcionar

informacin sobre su naturaleza.

Anlisis cualitativo

A pesar de la limitacin mencionada, ya desde los primeros trabajos publicados sobre

tcnicas cromatogrficas instrumentales, se indicaba que los parmetros de retencin (tiempo o

volumen) de un compuesto, eran constantes para un sistema cromatogrfico dado, por lo que podan

ser utilizados de forma cualitativa para identificar compuestos.

Evidentemente, los parmetros de retencin de un compuesto dependen de un gran nmero

de variables, por lo que la identidad entre analitos y patrones solamente puede ser establecida para

un sistema dado y en un momento dado, lo que hace muy trabajosa la identificacin de una

substancia por este mtodo. Aunque existen en la bibliografa colecciones de datos de retencin para

diversos compuestos, estos datos tienen un valor puramente orientativo, ya que resulta muy difcil

reproducir los datos de retencin (de unos laboratorios a otros e incluso dentro del mismo


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laboratorio) debido a la irreproducibilidad de los sistemas cromatogrficos. De forma anloga, las

ecuaciones empricas desarrolladas para correlacionar datos de retencin con la estructura qumica

de diversos compuestos es utilizable nicamente para la identificacin de compuestos pertenecientes

a series homlogas muy bien definidas.

Teniendo en cuenta estas limitaciones, el mejor mtodo para realizar un anlisis cualitativo,

es, todava, la comparacin directa de los parmetros de retencin de los picos de la muestra con los

de substancias patrn, trabajando en ambos casos con el mismo sistema cromatogrfico. A la hora

de realizar las comparaciones, es conveniente utilizar determinados parmetros, que si bien no

eliminan totas las posibilidades de variabilidad de los resultados, si permiten al menos corregir la

variabilidad inducida por determinadas condiciones; como parmetros de retencin utilizados

frecuentemente para anlisis cualitativo, los ms utilizados son:

1.- Tiempos o volmenes de retencin corregidos.

2.- Factores de capacidad.

3.- Tiempos de retencin relativos.

De entre estos parmetros, los dos primeros permiten corregir las diferencias de retencin

debidas a los volmenes muertos de cada sistema.

Los tiempos de retencin relativos se definen mediante la ecuacin:

Donde t es el tiempo de retencin del compuesto que se trata de identificar y tpel tiempo de

retencin de un compuesto que se toma como patrn. La utilizacin de los tiempos de retencin

relativos, permite eliminar todos los factores de variabilidad, salvo los que pueden afectar a los


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valores de k' (naturaleza de la fase estacionaria, naturaleza de la fase mvil y temperatura), por lo

que este parmetro es el ms adecuado para la identificacin cualitativa de compuestos en base a los

datos bibliogrficos.

Una ltima consideracin sobre la utilizacin de las tcnicas cromatogrficas para el anlisis

cualitativo, es que estas tcnicas permiten realizar una identificacin negativa, es decir, permiten

asegurar con absoluta certeza que un compuesto determinado no se encuentra presente en una mezcla

pero, por el contrario, no permiten nunca asegurar la presencia de un compuesto, ya que no se puede

excluir la posibilidad de que dos compuestos diferentes presenten los mismos parmetros de

retencin sobre un sistema dado. Este problema puede soslayarse en parte realizando la identificacin

sobre diversas columnas, con diferentes fases estacionarias. Por supuesto, es obvio que los resultados

cualitativos son ms fiables cuanto mayor nmero de columnas se utilicen, pero el mtodo es largo

y tedioso; como norma general se puede decir que la identificacin de un compuesto sobre tres

columnas, aunque no proporciona una certeza absoluta, ofrece una fiabilidad suficiente a todos los

efectos.

Anlisis cuantitativo

Si bien, como se ha mencionado en el apartado anterior, las tcnicas de anlisis

cromatogrfico ofrecen escasas posibilidades para la realizacin de anlisis cualitativos, sus

posibilidades como tcnica cuantitativa son enormes. La cromatografa permite separar mezclas muy

complejas de productos, aun cuando stos sean de naturalezas muy semejantes, lo que permite un

anlisis directo de muestras que de otra manera seran muy difciles de cuantificar. Por otra parte,

los detectores que se utilizan en cromatografa ofrecen una respuesta muy fcil de relacionar con la

cantidad de analito contenida en la disolucin inyectada, y con una sensibilidad que, en ocasiones,

es casi imposible de alcanzar por medio de cualquier otra tcnica.

La medida del rea o de la altura del pico cromatogrfico, es el factor ms importante a la

hora de realizar un anlisis cuantitativo. La utilizacin de la altura de pico para la cuantificacin es


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de gran comodidad, pero nicamente proporciona una exactitud aceptable en cromatogramas que

presenten picos agudos, estrechos, claramente definidos y muy simtricos; este procedimiento de

cuantificacin es interesante para anlisis de rutina, en los que se puede sacrificar la exactitud en

favor de la sencillez y la rapidez de las cuantificaciones. La utilizacin para el anlisis cuantitativo

de las reas de los picos, es el procedimiento de uso ms general cuando se requiere exactitud en las

cuantificaciones.

Existen multitud de mtodos que permiten medir las reas bajo los picos cromatogrficos,

aunque la medida por medio de integracin electrnica es con mucho la ms utilizada; de entre los

restantes mtodos, slo se mencionar el de la "altura por la mitad de la anchura", un mtodo muy

sencillo y que ofrece muy buenos resultados. Este mtodo consiste en medir la anchura del pico

cromatogrfico a la mitad de su altura (W1/2), el producto de este valor por su altura:

A = W1/2h

Ofrece un valor A, que es proporcional al rea del pico. Este mtodo proporciona muy buenos

resultados para picos de forma aproximadamente gaussiana, pero los resultados son menos

satisfactorios para picos no simtricos o para picos pequeos y anchos.

Al margen de cualquier otro mtodo de medida de reas, el sistema ms utilizado actualmente

es el integrador electrnico; un dispositivo de esta naturaleza digitaliza la seal analgica

proporcionada por el detector, detecta el comienzo y el final de cada pico cromatogrfico, integra

digitalmente el rea bajo la curva y corrige automticamente la linea de base. El nico problema que

presentan los integradores digitales se plantea a la hora de integrar picos parcialmente resueltos

(figura 7), ya que muchos integradores tienen limitadas sus posibilidades de medida en estos casos

a muy pocos mtodos, llegando a realizar en algunos casos extremos integraciones totalmente

disparatadas. Este problema, no obstante, se resuelve bastante bien mediante la utilizacin de

integradores basados en ordenadores personales, que permiten al usuario tanto la visualizacin de

la forma en que se han integrado los picos, como la posibilidad de modificar la forma de integracin

en caso de ser necesario.


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Figura 8.- Posibles mtodos de integracin de picos no resueltos

Mtodos de calibrado

Una vez conocida el rea o la altura del pico que se pretende cuantificar, es posible conocer

su masa o su concentracin en la muestra inyectada si se conoce la curva de calibracin que relaciona

la respuesta del detector con la cantidad de compuesto inyectada.

Las concentraciones de un analito que pueden ser medidas en cada caso dependen del rango

dinmico del detector, una caracterstica de cada combinacin detector/analito, que se define como

el rango de concentraciones de soluto entre las cuales el detector produce una respuesta dependiente

de la concentracin de soluto que llega a l; el valor mnimo de este rango se corresponde con la

sensibilidad del detector, y el mximo con la concentracin de soluto a partir de la cual la respuesta

del detector es constante (saturacin). Dado que casi todos los detectores presentan curvas de

respuesta de tipo sigmoide, debe tenerse en cuenta que lo ms conveniente es trabajar, siempre que

sea posible, dentro del rango dinmico lineal del detector, que se define como la zona del rango

dinmico en la que la respuesta del detector es lineal frente a la concentracin de soluto (figura 9);

las cuantificaciones realizadas fuera del rango dinmico lineal (figura 10) deberan ser evitadas en


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Figura 9.- Calibracin con respuesta lineal

Figura 10.- Calibracin con respuesta exponencial

lo posible, realizndose nicamente en caso de trabajar con concentraciones muy prximas al lmite

de sensibilidad del detector.

De los diferentes mtodos que existen para realizar el calibrado, los ms utilizados con

mucho son el mtodo del estndar externo y el mtodo del estndar interno.

El mtodo del estndar externo, consiste en inyectar en el equipo volmenes constantes de


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disoluciones de concentraciones conocidas y crecientes del compuesto que se pretende cuantificar;

tras este proceso, se representa la cantidad de compuesto frente al tamao del pico (rea o altura),

debindose obtener una linea recta. A partir de esta recta de calibrado, es posible realizar la

cuantificacin en una muestra desconocida, por interpolacin grfica o matemtica del pico obtenido

en la recta de calibrado. El principal problema que plantea la calibracin por medio de este mtodo

es la reproducibilidad de la inyeccin, o bien el control estricto de las cantidades inyectadas, aunque

tomando las debidas precauciones, la exactitud alcanzada puede ser notablemente alta. Por otra parte,

la calibracin debe repetirse peridicamente para verificar la fiabilidad de la cuantificacin, lo que

en algunos casos puede hacer que este mtodo sea un poco tedioso.

La calibracin por el mtodo del estndar interno, se utiliza con frecuencia en el anlisis

cuantitativo para compensar posibles errores derivados de la manipulacin de la muestra. Este

mtodo consiste en esencia en aadir una cantidad conocida de un compuesto patrn a la muestra

a analizar antes de realizar con ella cualquier manipulacin; en el cromatograma, aparecern los

picos correspondientes al analito y al patrn aadido, y de la relacin entre el tamao de ambos,

podr calcularse, previo calibrado, la cantidad de analito existente en la muestra. Para efectuar el

calibrado en este mtodo, se preparan disoluciones de concentracin creciente del compuesto a

analizar a las que se aade una cantidad idntica en todos los casos del compuesto patrn; tras

obtener los correspondientes cromatogramas, se representa la concentracin del compuesto acuantificar en funcin de la relacin de los picos problema/patrn, con lo que se obtendr una recta

en la que es posible interpolar la relacin entre los dos picos que se obtenga al realizar el

cromatograma de una muestra desconocida. Los requisitos que debe cumplir un producto para ser

utilizado como patrn interno, sern:

a) El producto patrn debe dar un pico totalmente resuelto de los de la mezcla a analizar.

b) El pico del compuesto patrn debe estar situado en el cromatograma en las proximidades

de los picos de inters.

c) A lo largo de todo el proceso de anlisis, debe tener un comportamiento similar al de los


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compuestos a cuantificar.

d) En ningn caso debe estar presente en la muestra a analizar.

e) Debe ser qumicamente estable, tanto frente a los componentes de la muestra como frente

a los compuestos que se puedan utilizar durante el proceso de anlisis.

Debe destacarse que, para los dos mtodos de calibracin mencionados, muchos sistemas de

integracin permiten realizar el clculo nicamente en base a un factor de respuesta obtenido a partir

de una sola concentracin de patrn; este mtodo de clculo asume implcitamente que la respuesta

del detector es lineal frente a la concentracin con pendiente 1, lo que muy raramente se cumple en

la prctica. En estos casos la calibracin debe realizarse nicamente con patrones cuya

concentracin de analito sea muy similar a la de las muestras ya que, en caso contrario, las

cuantificaciones realizadas mediante este tipo de clculo pueden alejarse notablemente de la realidad,

tanto ms cuanto mayor sea la diferencia de concentraciones entre patrn y muestra.

Documents

principios_de_cromatografia.pdf