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Principe de de la résonance plasmonique de surface
Lorsqu'un faisceau de lumière polarisée monochromatique illumine une interface entre deux milieux d'indice de réfraction différent, une partie de la lumière incidente est réfléchie sur l'interface et l'autre partie de la lumière est réfractée à travers la surface.
Plaque de verre
Air
Liquide
Lumière polarisée monochromatique
Lumière réfléchie
Lumière réfractée
Air
Liquide
Lumière polarisée monochromatique
Lumière réfléchie
Selon l'angle d'incidence du faisceau toute la lumière peut être réfléchie. Lorsqu'il n'y a pas de réfraction, une des composantes électromagnétiques de la lumière, l'onde évanescente, se propage perpendiculairement à l'interface sur une distance équivalente à sa longueur d'onde.
Principe (suite)
Onde évanescente
Si une couche fine de métal, riche en électrons libres est déposée à l'interface, ceux-ci entrent en résonance avec les photons du faisceau incident, ce phénomène est appelé résonance plasmonique de surface. Une conséquence énergétique de cette résonance est visible dans le faisceau réfléchi qui, analysé avec une barrette de diodes présente une chute d'intensité à un angle défini. Cet angle d'intensité minimum est l'angle de résonance. Il varie en fonction de l'indice de réfraction du milieu présent dans le champ évanescent.
Principe (suite)
Air
Liquide
Lumière polarisée monochromatique
Lumière réfléchie
Onde évanescente
iPlaque de verre
Film d’or
Barette de diodes
I
Le Biacore a pour fonction de visualiser en temps réel des interactions entre biomolécules non marquées dans un débit continu de tampon.
Principe de fonctionnement du Biacore
Un des réactifs, le ligand, est retenu de manière spécifique sur une interface appelée sensor chip (biocapteur).
L'analyte dilué dans un tampon circule à flux constant à la surface du biocapteur. Les changements de masse induits par l'association ou la dissociation des complexes modifient la réfringence du milieu et décalent la position de l'angle de résonance.L'enregistrement de la variation de l'angle de résonance permet de suivre en temps réel la fixation des molécules injectées sur le biocapteur. Le signal de résonance est exprimé en unités de résonance (RU). L'enregistrement de ce signal s'appelle un sensorgramme.
Le sensorgramme.
Le cycle d’analyse en temps réel
Ligand
Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse
Analyte
Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse
Phase d’association
Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse
Analyte + Ligand Complexe
Phase de dissociation
Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse
Tampon
Analyse Mathématique
Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse
Analyse cinétique deLa liaison analyte - ligand
Le cycle d’analyse Le cycle d’analyse
Phase de régénération
Agent régénérant
Interactions en Temps Réel par BIACORE
Applications majeuresConstantes d’affinités (KD=10-4 -10-12 M) et cinétiques (ka, kd) Concentration active d’un analyteCartographie épitopiqueValidation de molécules recombinantesDétection de molécules (milieux complexes)Etude paramétriqueMicropurification et récupération
Molécules concernéesprotéines, acides nucléiques, sucres,lipides, petites molécules, drogues, peptidescellules, particules virales...
Nature Biotechnology 21, 71 - 76 (2003)
Rational design of a CD4 mimic that inhibits HIV-1 entry and exposes cryptic neutralization epitopes
Loïc Martin1, François Stricher1, Dorothée Missé2, Francesca Sironi3, Martine Pugnière4, Philippe Barthe5, Rafael Prado-Gotor5, Isabelle Freulon1, Xavier
Magne2, Christian Roumestand5, André Ménez1, Paolo Lusso3, Francisco Veas2 & Claudio Vita1
MiniCD4 protéine mimétique (3kD) faite par synthèsepeptidique à partir d’un fragment de toxine de scorpion donnant les caractéristiques structurales du CD4
Objectifs de l ’étude
Etude des interactions entre gp120 et miniCD4
Démontrer que miniCD4 peut démasquer des épitopes neutralisants de la gp120 rec. et sur la gp120 native
BIACORE
Interaction protéine-virus : HIV
Martin L, Stricher F, Misse D, Sironi F, Pugnière M, Barthe P, Prado-Gotor R,Freulon I, Magne x, Roumestand C,Menez A, Lusso P, Veas F and Vita C. (2003). Nat Biotechnol 21(1): 71-6
STRUCTURE DU VIH
intégrase
enveloppe
RT
gp120
gp41
ARN
P17(matrice)
P24(capside)
P7(nucléocapside)
core
protéase
90 à 120 nm
HIV Lifecycle
Rambaut A. et al. Nat. Rev. Genet. 5:52-61, 2004
Entrée du virus dans la cellule : 1re étape du cycle de réplication virale
Cellules infectées ou exprimant des protéines de l’enveloppe virale
Glycoprotéinesde l’enveloppe
CCR5 ou CXCR4 (corécepteur)
Interaction
entre le complexe trimérique
de l’enveloppe
et le récepteur CD4 modification conformationnelle de la gp120 et de la gp41 augmentation de 100 à 1 000 fois de l’affinité pour le corécepteur
VIH
CD4
Cellules cibles exprimant CD4 et corécepteur
CROI 2003 - D’après E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé
11
Les différentes étapes déclenchant la fusion
- D’après E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé
Attachement cellulaire
non spécifique
Fixation au récepteur CD4
Initiation de la modificationconformationnelle
de l’enveloppe
Fixation au corécepteur
Fin de la modificationconformationnelle
de l’enveloppe
Formation d’une structureen épingle à cheveux,
hélicoïdale avec rapprochement des membranes
Initiation de la fusion des membranes lipidiques
1. Inhibition de la fixation
au CD4
2. Inhibitionde la fixation
au corécepteur
3. Inhibition de la modificationconformationnellede la gp41 (fusion)
gp120
gp41
CD4
Corécepteur
Étapespossiblesdu blocagede l’entrée
Cellule cible
Virus
22
Structure of HIV-1 gp120/CD4 Complex
CD4
gp120
Blue: glycosylation sites
STRATEGIES ANTI-VIH : bloquer les étapes
Inhibiteurs de la fusion
Inhibiteurs de la RT
Inhibiteurs de l’intégrase
Inhibiteurs de l’assemblage
Analogues nucléosidiquesNon nucléosidiques
Inhibiteurs de la transcriptionARNm
ARN viral
gp120CD4
ADN proviral
ADN intégré
Rétro Transcriptase
protéines
Inhibiteurs de protéaseGC/VIH/99
Synthétiser une mini proteine qui mime CD4 et qui inhibe l’entrée de HIV dans la Cellule
interaction : gp120 sur CD4M33 immobiliségp120 ka kd KD chi2
104(1/M) 10-4(1/s) 10-9(1/M)
HXB2(X4) 4.54+/-0.04 3.70+/-0.02 8.15+/-0.08 1,88
W61D(R5) 5.44+/-0.06 6.7+/-0.03 12.3+/-0.1 0,76
JRFL(R5) 7.28+/-0.09 9.63+/-0.04 0.756+/-0.01 2,88
Les gp120 se lient au CD4M33
Interaction protéine-virus :HIV
Interactions Moléculaires en Temps Réel (M. Pugnière, F. Roquet)CNRS-UMR 5160 site CRLCC Val d’Aurelle
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-200 0 200 400 600 800 1000
Liaison gp120_HXB2 sur M33 (50 RU)RUR
esp
on
se
sTime
Le CD4M33 induit les changements de conformation de la gp120 HXB2 soluble ou de la gp120 portée par les particules virales nécessaires pour exposer les épitopes du 48D et du 17B.
+ CD4s ou M33
- CD4 ou +M0
gp120WT-CD4 / 48D
Part. virales+CD4 / 48D+M33
Interaction protéine-virus :HIV
--Elles amènent une quantification de l’affinité mais surtout des données cinétiques.-Etude des interactions à plus de deux partenaires-Etude paramétrique de ces interactions-Méthode applicable à grand nombre de molécules etaux interactions complexes-Récupération possible
Conclusions