Irena Lovětinská Šlamborová

Petr Exnar

Herbertov 2014

Křemičitá nanovlákna OBSAH

1. Příprava

2. Vlastnosti

3. Testy zdravotní nezávadnosti

4. Možnosti imobilizace biomolekul

5. Využití jako nový typ obvazového materiálu

6. Léčba rány

7. Kazuistiky

8. Patenty

Příprava výchozí sol připraven metodou sol-gel

z TEOS (tetraethyl orthosilicate) a zahuštěn na obsah SiO2 přes 34 hmotn. %

připravená nanovlákna (podle konkrétních požadavků) s průměrem 150 až 600 nm

nanovlákna tepelně stabilizována v rozmezí teplot 150 °C (postupně rozpustná ve vodě) až 850 °C (nerozpustné křemenné sklo)

Povrchová úprava nanovláken povrchová silylace nanovláken

(3- aminopropyltriethoxysilanem APTES ve

2-propanolu)

vlastní imobilizace organických biomolekul

(antibiotika, analgetika, enzymy, kortikoidy,

peptidy, cytostatika, … )

ANTIBIOTIKA

ENZYMY

Nanovlákenná vrstva

Připravená nanovlákna

Vlastnosti vysoká stabilita při biochemických reakcích

rozpustnost v tělních tekutinách (rychlost rozpouštění řízena teplotou tepelného zpracování křemičitých nanovláken – rychlé rozpouštění bez vedlejších negativních důsledků – nanovlákno je rozpouštěno na kyslinu křemičitou, která je odváděna močí

povrch obsahuje velké množství Si-OH skupin a je velmi dobře modifikovatelný reakcemi, při kterých jsou na tyto Si-OH skupiny kovalentní vazbou navázány aminoalkylalkoxysilany, které následně svojí aminoskupinou zajišťují vznik relativně pevné peptidické nebo o něco slabší vodíkové vazby s imobilizovanými biomolekulami

Vlastnosti velký měrný povrch

jednoduchými reakcemi lze imobilizovat organické

biomolekuly (antibiotika a další léčiva)

nedochází k botnání nebo jiným změnám, nanovlákna

nedráždí ani nepodléhají sekundárním biochemickým

reakcím

Testy zdravotní nezávadnosti BIOPERSISTENCE (rozpustnost nanovláken) – schopnost

odolávat fyziologickým podmínkám organismu

ukazatel umožňující odhadnout jejich potencionální zdravotní

nezávadnost

IN VIVO TESTY – t0,5 = doba odbourání poloviny vláken

v pokusném zvířeti

IN VITRO TESTY – R = rychlost rozpouštění v simulované

plicní tekutině

Studie firmy Johns Manville [1] – nezávadná jsou vlákna

s rychlostí rozpouštění v desítkách až stovkách ng.cm-2.h-1

[1] Hesterberg,T.W., Hart,G.A.: Healt&Safety Aspects of Fiber Glass, Battery Conference on Applications and

Advances, Long Beach,CA,SA,2000.

Testy zdravotní nezávadnosti

Porovnání dvou způsobů testů bylo zveřejněno výrobcem skelných a minerálních vláken, firmou Johns Manville.

Křemičitá nanovlákna R = 69,6 ng.cm-2.h-1

Azbest (amosit) po 90 dnech v plicích krys („in vivo“ ) Hesterberg, T. W. a kol.: Toxicol. Appl. Pharmacol. 151, 1998, s. 262-275.

Rychlost rozpouštění nanovláken

v závislosti na teplotní stabilitě VZOREK Rychlost rozpouštění

[ng.cm-2.h-1]

180°C

69,6

450°C

23,8

650°C

17,1

850°C

5,0

Testy rozpustnosti v dalších tělních tekutinách

1. Plicní tekutina pH= 7,4 (7,2)

2. Synoviální tekutina pH = 7,4

3. Střevní tekutina pH = 7,0

4. Krevní plasma

5. Fyziologický roztok

6. Destilovaná voda

Výsledek po 8 hodinách rozpouštění

Fyziologický roztok

Synoviální tekutina

Plicní tekutina

5000 x 25000 x 50 000 x

100 000 x

po 73 hod.

50 000 x

Vyčištění rány

Imobilizace tetracyklinu - testy 1. Fluorescenční mikroskop

2. Antibakteriální testy

2. Zjištění množství kovalentně navázaného a volně

zachyceného – vyvíjena metodika

a) pomocí UV VIS (isothyokyanát fluoresceinu)

b) pomocí HPCL

Možnosti imobilizace biomolekul imobilizace tetracyklinu(400-530nm)

Průkaz imobilizace

Křemičitá nanovlákna STANDARD–

fluorescenční mikroskop Olympus BX51, camera DP

72, zvětšeno 200x

Autofluorescence TETRACYKLINU –

fluorescenční mikroskop Olympus BX51, camera DP

72, zvětšeno 200x.

Fluorescenční mikroskopie

Antibakteriální testy Staphylococcus aureus MRSA

Halo zóna

Standardy – bez účinku – bez halo zóny Spodina vzorků - čistá

Testované bakteriální kmeny Escherichia coli – CCM 2024

Staphylococcus aureus – CCM 299

MRSA 1– CCM 7112

MRSA 2 – CCM 4223

Acinetobacter baumanii – CCM 2265

Pseudomonas aeruginosa – CCM 1959

Proteus vulgaris – CCM 1956

Proteus mirabilis – CCM 1944

Bacillus subtilis – CCM 2216

Odstranění débridementu

Možnosti imobilizace biomolekul imobilizace enzymů

Enzym histochemický průkaz enzymu esterázy – Důkaz reakcí s α-naphtylacetátem v přítomnosti o-dianisidinu

Vytipované vhodné proteolytické

enzymy 1. Endopeptidázy

a) serinové proteázy:

TRYPSIN (pH opt. 7,5 - 8,5), přednostní štěpení - Arg, Lys

CHYMOTRYPSIN (pH opt. 7 – 8), přednostní štěpení – Tyr, Trp, Phe, Leu

b) cysteinové proteázy:

BROMELAIN, PAPAIN (pH opt. 5), přednostní štěpení – Arg, Lys, Phe

2. Exopeptidázy

AMINOPEPTIDÁZA – metallopeptidázy (pH opt. 7 - 8,4), C- koncové zb., N-koncové zb.

Metody analýzy

Křemičitá nanovlákna Příklad - křemičitá nanovlákna

s imobilizovaným enzymem

SEM

Rány a jejich klasifikace Rána – porušení celistvosti kůže, sliznice nebo povrchu orgánu

A) Dle hloubky poškození:

1. povrchové rány – odřenina, pořezání, tržná rána, lehčí popálenina

2. hluboké rány – náchylné k sekundární infekci, nutné odstranit debridement

B) Dle přítomnosti choroboplodných zárodků:

1. Čisté

2. Infikované (septické), u kterých rozlišujeme

a) Primární infekce

b) Sekundární infekce

Infikovaná rána - nejčastější komplikací při hojení ran

Původci: stafylokoky, streptokoky, klebsiely, pseudomonády

a kvasinky.

Projevy kolonizace: zarudnutí, otok, hnisavý sekret, bolest,

zápach a zastavení procesu hojení

Fáze hojení rány

Schéma časového průběhu fází hojení ran (1. zánětlivá fáze, 2 proliferační fáze, 3. granulační fáze)

Druhy nejčastějších ran 1. „Syndrom diabetické nohy“ 2. Dekubity

3. Bércový vřed – stádia vzniku

I. stádium

II. stádium

III. stádium

IV. stádium

Nekrotická ložiska

Postup aplikace Nanovlákno položit na ránu, zvlhčit (destilovanou vodou), překrýt

vhodným tzv. vlhkým krytím (Hydrocool, Askina,…), standardně

zavázat obvazem.

Frekvence převazů – jednou za 2-3 dny, po zlikvidování infekce

převazy za 5-7 dnů

Muž 90 let, polymorbidní stav

1.den 3.den 10.den

28.den 38.den 56.den

Muž 78 let, sakrální dekubit IV. stupně – onkologická léčba

1.den 8.den 14.den

20.den –

hospitalizace

nemocnice

Turnov –

zhoršení stavu

rány

Žena

87 let, recidiva bércového vředu

3. den

42. den

7.den 10.den

14.den 24.den

Muž 60 let, na přání lékaře – přerušena

léčba

Muž – 60 let, amputace článků prstů L i P DK (6.1.2014)

Po aplikaci bez výraznějších bolestí, po prvním týdnu udává mírné zlepšení,

24.1.2014 24.1.2014 31.1.2014

granulace Zatahování okrajů

DALŠÍ ANTIBIOTIKA

Aminopeniciinlové antibiotikum, baktericidní,

inhib. G+

Chemoterapeutikum, inhibitor gyrázy,

fluorochinol 2. skupiny Makrolidové bakteriostatické

antibiotikum – chlorovaný derivát linkomycinu

Patenty Šlamborová, I., Zajícová, V., Exnar, P. a Studničková, J.

Nanovlákenná struktura s imobilizovaným organickým

agens a způsob její výroby. ČR. Patent CZ303911,

přihlášeno 14.8.2012, přijat 9.5.2013.

Šlamborová, I., Zajícová, V., Exnar, P. a Studničková, J.

Nanofiber structure with immobilized organic agens and

the method of its preparation. PCT WO 2014/026656,

přihlášeno 20.2.2014.

Poděkování

Výsledky byly získány za finančního přispění

projektu Ministerstva školství, mládeže a

tělovýchovy "Národní program udržitelnosti I"

LO 1201 a projektu OP VaVpI Centrum pro

nanomateriály, pokročilé technologie

a inovace CZ.1.05/2.1.00/01.0005.

Děkuji za pozornost