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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE MENTOURI CONSTANTINE FACULTE DES SCIENCES EXACTES
DEPARTEMENT DE CHIMIE N°d’ordre :……………
Série :………………….
MEMOIRE
Présenté pour obtenir le diplôme de Magister en Chimie Organique
Option : Analyse Physico-Chimique et Substances Naturelles
Par : Sous la direction du Professeur :
HAMMOUD Leila BENAYACHE Fadila
Devant le jury : Mr BENAYACHE Samir Pr. Univ. Mentouri Constantine Président
Mme BENAYACHE Fadila Pr. Univ. Mentouri Constantine Rapporteur
Mme BOUMAZA Ouahiba M.C. Univ. Mentouri Constantine Examinatrice
Mr BOUHEROUM Mohamed M.C. Univ. Mentouri Constantine Examinateur
Mr ZAÏTER Lahcene M.C. Univ. Mentouri Constantine Examinateur
Juin 2009
Dédicace
A mes chères parents,
à mes grands parents,
à ma sœur,
à mes frères,
à toute ma famille,
à mes amis,
pour leur présence de tous les instants,
pour le soutien qu’ils m’ont apporté,
avec toute mon affection et ma reconnaissance .
Remerciements
Ce travail a été réalisé au laboratoire de Phytochimie et Analyses Physico-Chimiques et
Biologiques, Faculté des Sciences Exactes, Université Mentouri de Constantine, sous la direction
de madame le professeur Fadila BENAYACHE, à qui je tiens à exprimer toute ma
reconnaissance pour m’avoir accueillie au sein de ce laboratoire et particulièrement pour ses
conseils précieux, ses efforts, ses compétences scientifiques et pour le soutien qu’elle m’a
témoigné tout au long de cette étude.
J’exprime mes sincères remerciements à Monsieur Samir. BENAYACHE, professeur à
l’Université Mentouri de Constantine, d’avoir accepté de présider le jury de ce mémoire et pour
les conseils précieux qu’il m’a prodigués tout au long de ce travail .
Je suis très honorée de la présence en tant qu’examinateurs de Mr Mohamed
BOUHEROUM, Mme Ouhiba BOUMAZA et Mr Lahcene ZAÏTER, Maîtres de conférences à
l’Université Mentouri Constantine, je les en remercie sincérement.
Je remercie vivement monsieur la professeur P. MOSSET de l’Ecole Nationale de Chimie
de Rennes pour l’enregistrement des spectres de RMN et de SM du composé F16-1 et madame le
professeur A. LOBSTEIN et le docteur M. CHAABI de la Faculté de Pharmacie de Strasbourg
pour l’enregistrement des spectres de RMN du composé F9-3-1.
J’adresse mes plus vifs remerciements à Monsieur Ramdane SEGHIRI Maître de
conférences à l’Université Mentouri Constantine, pour son aide, ses conseils précieux et pour
tout ce qu’il m’a appris.
Je voudrais également remercier l’ensemble du personnel du laboratoire pour leur
disponibilité : Mlle Ratiba MEKKIOU, Mr Ali BENTAMENE, Mr Messaoud KERKATOU, Mlle
Sabrina BICHA, Mlle Ouahiba BENAISSA , Mlle Hanene ZAATER, Mme Samia MEZHOUD ,
Mme Hayet TOUAHER ainsi que mes amis et collègues, pour avoir simplement été eux-mêmes
et pour les moments inoubliables qu’ils m’ont permis de partager : Ouissaf, Souad, Amel,
Nacera, Fatima, Hanene, Kaouther, Lamia, Nassima, Linda, Samia, Ratiba, Saïda.
Je remercie toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à ce que la réalisation
de ce travail se soit déroulée dans les meilleures conditions.
Abréviations CHCl3 : Chloroforme
CDCl3 : Chloroforme deutérié
MeOH : Méthanol
MeOH-d4 : Méthanol deutérié
Me2CO : Acétone
CD3CO CD3 : Acétone deutériée
CH2Cl2 : Dichlorométhane
AcOEt : Acétate d’éthyle
isPrOH :Isopropanol
Et2O : Ether diéthylique
CCM : Chromatographie sur couche mince
Rf : Facteur de retardement (retardation factor)
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire 13C : Carbone 13 1H : Proton
Me : Methyl (-CH3)
Glc: Glucose
Gluc : Glucuronide
Rut : Rutinose
Rham : Rhamnose
DEPT: Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
HSQC :Heteronuclear Single Quantum Coherence
HMBC : Heteronuclear Multiple Bonding Connectivity
COSY : Correlated Spectroscopy
MHz : MegaHertz
ppm : Partie par million
δ : Déplacement chimique
J(Hz) : Constante de couplage exprimée en Hertz
s : Singulet
d : Doublet
dd : Doublet de doublets
Cq : Carbone quaternaire
m : Multiplet
SMIE : Spectrométrie de masse sous impact électronique
ESI : Ionisation electospray (Electro spray Ionisation)
m/z : Masse / Charge électrique
g : Gramme
˚C : Température en degrés Celsius
ml : Millilitre
HCl : Acide chlorhydrique
H3BO3 : Acide borique
NaOAc : Acétate de sodium
NaOH : Hydroxyle de sodium
AlCl3 :Chlorure d’alimunium
UV : Ultra violet
SOMMAIRE
Introduction générale ………………………………………………...………..............1
Chapitre I :Les flavonoїdes
І-1-Introduction.……………………………………………………………………………….4
І-2-Structure chimique et classification des flavonoїdes.………………………………….......4
I-2-1-Flavones………………………………………………………………………………….6
I-2-2-Flavonols……………………………………………………………………………........9
I-2-3- -Flavanones et dihydroflavonols …………….………………………………………..12
I-2-4- Flavan-3-ols, flavan-3,4-diols et anthocyanidols ……………………………………...12
I-2-5-Chalcones et aurones…………………………………………………….……...............13
І-3-Distribution et localisation ………………………………………………………………..13
I-4- Proprietés des flavonoїdes …………………………………………………….................17
І-5- Activités biologiques des flavonoїdes …………………………………………………...17
I-6- La biosynthèse des flavonoїdes…………………………………………………………...18
І-7-Les principales substitutions du squelette flavoniques …………………………………...19
I-7-1-L’hydroxylation ……………………………………………………………..…….........19
I-7-2- La méthoxylation ou méthylation ……………………………………………………...19
I-7-3- La O-glycosylation .........................................................................................................20
I-7-4- La C-glycosylation…...……………………………………………………….…...…...20
І-8- Méthodes de séparation et d’analyse des flavonoϊdes……………..……………………..20
І-8-1- Méthodes de séparation …………………………………………………………..........20
І-8-1-a-La chromatographie liquide sur colonne (CC)…………………………………..........21
І-8-1-b- La chromatographie préparative sur papier (CP)…………………………………….21
І-8-1-c- La chromatographie préparative sur couche mince (CCM)…………………………21
I-8-2- Méthodes d’analyse…………………………………………………………………….21
I-8-2-a- La fluorescence sous lumière de Wood ……………………………………………..22
I-8-2-b- Facteur de retardement et comportement chromatographique……………………….22
I-8-2 -c-La spectrophotométrie UV-Visible…………………………………………………..23
I-8-2 -c-1- Addition de réactifs……………………………………………………………….24
• l’addition de AlCl3 et AlCl3 + HCl…………………………………………………...25
• l’addition de NaOAc + H3BO3……………………………………………………….25
• l’addition de NaOH et de NaOAc…………………………………………………….25
I-8-2-d-La Spectrométrie de masse ……………………………………………………....…..27
I-8-2-e- La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) ………………...…….27
I-8-3 - L’hydrolyse acide des hétérosides………………………………………………..........28
Chapitre II :Les lactones sesquiterpéniques
II-1-Introduction ...……………………………………………………………………………30
II-2-Structure chimique des lactones sesquiterpéniques ...………………………….………...30
II-3-Classification des lactones sesquiterpéniques ..………………………….…...………….31
II-3-1-Les germacranolides …………………………………………………………………..31
II-3-2-Les élémanolides …………………………………………………………………........32
II-3-3-Les eudesmanolides …………………………………………………………………...33
II-3-4-Les guaianolides ………………………………………………………………….........34
II-3-5-Les héliangolides ………………………………………………………………………34
II-4-Biosynthèse des lactones sesquiterpéniques ………………………………………..........35
II-5-Activités biologiques des lactones sesquiterpéniques …………………………………...36
II-6- Les méthodes de séparation et d’analyse des lactones sesquiterpéniques ………............37
II-6-1- Les méthode de séparation ……………………………………………………………37
II-6-1- a- La chromatographie sur colonne ……………………………………………….…..38
II-6-1- b- Chromatographie sur couche mince ……………………………………………….39
II-6- 2- Les méthodes d’analyse ……………………………………………………………...40
Chapitre III : Partie expérimentale
III-1 - Etude phytochimique de Centaurea nicaeensis ………………………………………42
III-1.1 - Place dans la systématique …………………………………………………………..42
III-1.2 - Description de l’espèce Centaurea nicaeensis ……………………………………...42
III-1.3 - Travaux antérieurs…………………………………………………………………...44
III-2- Travaux personnels …………………………………………………………………….46
III-2-1-Extraction de Centaurea nicaeensis ….……………………………………………..46
III-2-2-Séparation chromatographique de l’extrait acétate d ’éthyle………………………..48
III-2-2-1-Séparation chromatographique sur colonne ………………………………………..48
III-2-2-2-Séparation et purification des fractions……………………………………………..51
III-3-Conclusion…………………………………………………………………………...….52
Chapitre VI : Résultats et Discussion
VI-1-Identification du produit F9-3-1…………………………………………………………..55
VI-2-Identification du produit F10-1…………………………………………………………...66
VI-3-Identification du produit F16-1 …………………………………………………………...72
VI-4-Identification du produit F16-4……………………….…………………………………..94
VI-5-Identification du produit F17-2…………………….………..…………………………..103
Références bibliographiques…………………….…………………………………..111
Conclusion générale…………………………………………….………………...……119
Introduction générale
1
Introduction générale :
Le 21ème siècle s’ouvre e t de nombreuses maladies à fort taux de mortalité restent encore sans
traitement. Dans certains cas, on devrait plutôt dire sans traitement adapté, car les malades du
paludisme ou du SIDA meurent souvent faute de ne pas avoir accès à des traitements trop
coûteux. Des résistances aux médicaments les plus utilisés ( e t les moins chers) se répandent.
La recherche de nouvelles molécules, plus actives, bon marché, sans e f f e t s secondaires trop
marqués, est aujourd’hui une urgence pour l’homme.
Les plantes sont depuis toujours une source essentielle de médicaments. Aujourd’hui encore
une majorité de la population mondiale, plus particulièrement dans les pays en voie de
développement, se soigne uniquement avec des remèdes traditionnels à base de plantes. De
l’aspirine au Taxol, l’industrie pharmaceutique moderne elle-même s’appuie encore largement
sur la diversité des métabolites secondaires végétaux pour trouver de nouvelles molécules aux
propriétés biologiques inédites. Cette source semble inépuisable puisque seule une petite partie
des 400 000 espèces végétales connues ont été étudiées sur les plans phytochimique et
pharmacologique, et que chaque espèce peut contenir jusqu’à plusieurs milliers de constituants
différents [1]. En Algérie il en existe 3000 espèces appartenant à plusieurs familles botaniques
dont 15% sont endémiques [2] .
La diversité des espèces utilisées e t des métabolites secondaires déjà isolés l a i sse présager
de l'ampleur de ce qui reste à découvrir. On considère effectivement que, jusqu’à ce jour,
moins de 10 % des espèces de végétaux supérieurs qui peuplent actuellement la planète ont été
explorées pour leurs propriétés chimiques e t biologiques.
On peut classer les métabolites secondaires en plusieurs grands groupes : parmi ceux ci, les
composés phénoliques, les terpènes e t stéroïdes e t les composés azotés dont les
alcaloïdes. Chacune de ces classes renferme une très grande diversité de composés qu i
possèdent une très large gamme d'activités biologiques [3-5].
Parmi les milliers de plantes médicinales recensées à ce jour, ceux de la famille des astéracées
(composées) l'une des plus grandes familles des angiospermes, avec environ 1100 genres et
25 000 espèces sont présentes dans pratiquement toutes les régions du globe.
Introduction générale
2
Le genre Centaurea de la famille des composées , comptant environ 700 espèces et 600 sous-
espèces, est très repandu en Algérie où il est représenté par 45 espèces dont 7 au sud [6,7].
Les espèces de ce genre sont utilisées dans la médecine traditionnelle pour leurs activités
stimulante, tonique [8,9], antidiabétique [10,11], diurétique [12] et antirhumatismale [13].
Le genre Centaurea a fait l’objet d’un grand nombre d’études phytochimiques qui ont révélé la
présence de sesquiterpènes [14-19], de triterpènes [20], de stéroïdes [21], d’alcaloïdes [22], de
lactones sesquiterpéniques [23,24] et de composés phénoliques notamment les flavonoïdes [25-
27].
Vu l’importance de ces plantes médicinales, plusieurs centaurées ont été étudiées dans notre
laboratoire de recherche. Dans le but de continuer ces investigations, nous avons choisi de
poursuivre l’étude de Centaurea nicaeensis All. variété walliana Maire.
Les principales parties de ce travail constituant quatre chapitres, sont traitées comme suit :
Le premier chapitre, consacré à l’étude bibliographique des flavonoїdes, renferme une
présentation de leurs différentes structures chimiques , leur biosynthèse ainsi que leur intérêt
thérapeutique. Il reporte également toutes les démarches et les méthodes nécessaires à la
séparation, la purification et l’établissement de structures de cette famille de substances
naturelles.
Dans le deuxième chapitre nous reportons sur un autre type des métabolites secondaires ;
les lactones sesquiterpéniques. Cette étude inclut : leur difinition et leur classification, leur
biosynthèse, leurs activités biologiques ainsi qu’une présentation des méthodes nécessaires à leur
séparation, leur purification et l’établissement de leur structure.
Le troisième chapitre concerne la partie expérimentale relative à nos travaux ainsi qu’une
présentation des techniques d’isolement et d’analyse utilisées.
Le quatrième chapitre reporte les résultats obtenus suivis de discussions et d’une
conclusion générale.
Chapitre I Les flavonoїdes
4
І-1-Introduction :
Les flavonoïdes ont constitué un intérêt global croissant pendant la dernière décennie et, en
raison de cette croissance dans la recherche, le nombre de flavonoïdes connus a augmenté
considérablement. En effet, au début des années 90, le nombre de structures de flavonoïdes
repportées était d’environ 4000 (Harborne,1994) [28], durant cette dernière decennie, ce
nombre avoisine les 6500 structures différentes (Harborne et Baxter1999) [29].
І-2-Structure chimique et classification des flavonoϊdes :
Structuralement parlant, les flavonoïdes ont un squelette de base commun, constitué de 15
atomes de carbone répartis sur deux noyaux benzéniques (A et B) qui sont reliés par une
chaîne linéaire de 3 atomes de carbone (Schéma 1) [30] formant en général un hétérocycle
après condensation avec un OH phénolique du noyau A [31].
A
B
Schéma 1 : Squelette de base des flavonoïdes.
Tous les flavonoïdes peuvent être classés en plusieurs groupes selon le degré d’oxydation du
cycle pyranique central (la chaîne en C3) [32], le noyau B est relié à l’hétérocycle C dans les
positions 2, 3 ou 4 (Schéma 2) .
Chapitre I Les flavonoїdes
5
O1
2
345
6
78
A
2' 3'
4'
5'6'
BC
Schéma 2 : Différentes positions du cycle B sur l’hétérocycle C.
Selon la structure du cycle intermédiaire (cycle C), les flavonoïdes se répartissent en plusieurs
classes de molécules dont les plus importantes sont : les flavones, les flavonols, les flavanones,
les dihydroflavonols, les flavan-3-ols et les flavan-3,4-diols (Schéma 3).
O
O
O
O
OH
OO
OH
O
OH
O
A C
1
456
7
8O
O
CHO
O
O
OH
O
O
OHO
OH
OH
3
33
34
Chalcones
Flavanones
Flavones
DihydroflavonolsDihydrochalcones
FlavonoïdesIsoflavones
Flavonols
Aurones
Anthocyanidines
Flavan-3-ol Flavan-3,4-diol
O2
3
1'
2' 3'
4'
5'6'
B
OH
O
3
Schéma 3: Représentation des principaux groupes de flavonoïdes.
Chapitre I Les flavonoїdes
6
I-2-1-Flavones:
O
O
H
Schéma 4 : Structure chimique de base des flavones.
Tous les types des flavonoïdes dérivent de la 4,2’,4’,6’-tétrahydroxychalcone et par
conséquent, possèdent tous au moins trois hydroxyles phénoliques en C-5, C-7 et C-4’, cela
étant, l’un d’entre eux peut être absent.
Dans plus de 90% des cas, le cycle A des flavones est substitué par deux hydroxyles
phénoliques en C-5 et en C-7. Ces hydroxyles peuvent être libres ou éthérifiés. D’autres
substitutions sont possibles avec des fréquences variables: hydroxyles libres ou éthérifiés en
C-7 et/ou en C-8, méthylation en C-7 ou en C-8, implication du C-6 et/ou C-8 dans une liaison
carbone-carbone avec un sucre.
D’autre part, dans plus de 80% des cas, le cycle B est substitué en C-4’ ou disubstitué en C-3’
et C-4’, ou moins fréquemment trisubstitué en C-3’,C-4’et C-5’; ces substituants peuvent être
des groupes hydroxyles (OH) comme ils peuvent être des methoxyles (OCH3). Les autres
positions (C-2’ et C-6’) ne sont qu’exceptionnellement substituées.
Le tableau 1 rassemble quelques exemples de ce type de flavonoïdes isolés dans notre
laboratoire de quelques centaurées algériennes.
Chapitre I Les flavonoїdes
7
Les centaurées Flavones Structures Réf
C. incana
7,3’,4’,5’-tetramethoxy tricétine
7,3’,5’-trimethoxy tricétine
2’’-O-glucosyl-6-C-glucosyl apigénine
6-methoxy apigénine
6-methoxy lutéoline
7-O-methyl glucuronosyl apigénine
7-O-glucosyl hispiduline
Vicénine-2
01
02
17
03
04
05
06
18
[27]
C. pullata
Jacéosidine
Cirsilinéol
07
08
03
09
06
[33]
Hispiduline
Cirsimaritine
7-O-glucosyl hispiduline
[34]
C. parviflora
Eupatorine
Eupatiline
Cirsilinéol
5,7,4’-trihydroxy-6,3’-dimethoxyflavone
10
11
08
07
12
13
19
[35]
Genkwanine
5-hydroxy-6,7,3’,4-’tetramethoxyflavone
7,4’-dihydroxy-5-methoxyflavone
[36]
C. sphaerocephala
Apigénine
3’- methoxy apigénine
Lutéoline
6-methoxy lutéoline
14
15
16
04
[37]
Tableau 1 : Quelques exemples de flavones isolés des centaurées .
Chapitre I Les flavonoїdes
8
Les structures des flavones de 01 à 16 sont les suivantes :
O
H
O
R2O
R1
R3
OR4
R5
OH
Structures R1 R2 R3 R4 R5
01 H Me OMe Me OMe
02 H Me OMe H OMe
03 OMe H H H H
04 OMe H OH H H
05 H Megluc H H H
06 OMe Glc H H H
07 OMe H OMe H H
08 OMe Me OMe H H
09 OMe Me H H H
10 OMe Me OH Me H
11 OMe H OMe Me H
12 H Me H H H
13 OMe Me OMe Me H
14 H H H H H
15 H H OMe H H
16 H H OH H H
Chapitre I Les flavonoїdes
9
Les structures des flavones de 17 à 19 sont les suivantes:
O
O
OH
H
OH
H
H
H
H
OH
O
OHH
HO
H
H
HO
H
OH
OH O
OH
HO
O
O
HO
GlcC
OH
OH
CGlc
17 18
O
O
HO
OH
O CH3
19
I-2-2-Flavonols:
O
O
A C
B
OH
Schéma 5 : Structure chimique de base des flavonols.
Chapitre I Les flavonoїdes
10
Les flavonols se distinguent des flavones par la présence d’un groupement OH en position C-3.
Les variations structurales sont de même nature que celles décrites pour les flavones.
Le tableau 2 reporte quelques exemples de molécules de ce groupe et isolées dans notre
laboratoire à partir de centaurées algériennes.
Les centaurées Flavonols Structures Réf
C. incana
6-methoxy quercetine
6-methoxy 7-O-glucosyl quercetine
Rutine
6-methoxy kaempférol
7-O-glucosyl-3-methoxy myricétine
3,5’-dimethoxy-7-O-glucosyl myricétine
20
21
23
24
30
31
[27]
C. pullata
Kaempférol
7-O-glucosyl patulétine
3-O-glucosyl-6-methoxy kaempférol
25
21
26
[34]
C. calcitrapa L.
Kaempférol
6-methoxy kaempférol
7-O-glucosyl-6-methoxy kaempférol
3-O-rutinosyl kaempférol
3-O-glucosyl-6-methoxy kaempférol
3-O-glucosyl quercétine
3-O-glucosyl kaempférol
25
24
29
27
26
22
28
[38]
Tableau 2 : Quelques exemples de flavonols isolés des centaurées.
Chapitre I Les flavonoїdes
11
Les structures des flavonols de 20 à 23 sont les suivantes :
Les structures des flavonols de 24 à 28 sont les suivantes :
Les structures des flavonols de 29 à 31 sont les suivantes :
O
OOH
OH
OH
GlcO
H3CO
O
OOH
OCH3
OH
GlcO
OH
OH
29 30
O
OOH
OCH3
OH
GlcO
OH
OCH3
31
Structures R1 R2 R3
20 OMe H H
21 OMe Glc H
22 H H Glc
23 H H RhamGlc
Structures R1 R2
24 OMe H
25 H H
26 OMe Glc
27 H Rut
28 H Glc
O
OOH
OR3
OH
OH
R2O
R1
O
OOH
OR2
OH
HO
R1
Chapitre I Les flavonoїdes
12
I-2-3 -Flavanones et dihydroflavonols :
O
O
HO
OH
OH
O
O
HO
OH
OH
OH
Flavanone 32 dihydroflavonol 33
Schéma 6 : Structures chimiques de base des flavanones et dihydroflavonols.
Les flavanones et les dihydroflavonols sont caractérisés par l’absence de la double liaison C-2
- C-3 et par la présence de centres d’asymétrie. Les variations structurales sont de même
nature que celles décrites pour les flavones et les flavonols.
Les dihydroflavonols se distinguent des flavanones par l’ hydroxylation de la position C-3.
Cette classe de flavonoïdes semble un peu moins fréquente que son homologue insaturé
rassemblant les flavones et flavonols.
Les composés les plus distribués dans ces deux groupes de flavonoïdes sont la naringénine 32
et le dihydrokaempférol 33.
I-2-4- Flavan-3-ols, Flavan-3,4-diols et Anthocianidols :
O
OH
O
OH
OH
O+
Flavan-3-ol Flavan-3,4-diol Anthocyanidol
Schéma 7 : Structures chimiques de base des Flavan-3-ols, flavan-3,4-diols et anthocyanidols.
A la différence des flavonoïdes ci-dessus décrits, ces trois groupes de molécules sont toujours
hydroxylés en position C-3 et se caractérisent par l’absence du groupe carbonyle en C-4. Cette
Chapitre I Les flavonoїdes
13
position peut être libre (cas des flavan-3-ols et anthocyanidols) ou hydroxylée (cas des flavan-
3,4-diols).
Les flavan-3-ols et les flavan-3,4-diols sont à l’origine des polymères flavaniques appelés
proanthocyanidols ou tanins condensés.
I-2-5- Chalcones et Aurones:
O
O
CH2'
3'4'
5'6'
2 3
4
561' 4
5
67
O
2' 3'
4'
5'6'23
1
AuroneChalcone
β
α
Schéma 8 : Structures chimiques de base des chalcones et aurones.
Les chalcones sont différents des autres types de flavonoïdes cités au-dessus. De par l’ouverture
du noyau pyranique central, elles sont constituées par deux unités aromatiques reliées par une
chaîne tricarbonée, cétonique, α, β-insaturée (Schéma 8). Le noyau B est assez fréquemment non
substitué, alors que les substitutions sur le cycle A sont le plus souvent identiques à celles des
autres flavonoïdes.
Les aurones sont caractérisées par une structure de 2-benzylidène-coumarone.
Pour ces deux types de molécules, la numérotation des positions est différente de celle des autres
flavonoïdes décrits précédemment.
І-3-Distribution et localisation :
Les flavonoïdes sont largement abondants dans les légumes feuilles (salade, choux, épinards,
etc…, ainsi que dans les téguments externes des fruits. Ils sont également présents dans le vin
rouge et le thé.
Les céréales, les épices et les herbes aromatiques (persil, thym, céleri) sont considérés aussi
comme des sources importantes de flavonoïdes. De nombreux travaux ont montré que certains
Chapitre I Les flavonoїdes
14
fruits et légumes sont très riches en flavonols, flavones et flavanones [39-41]. Le tableau 3
regroupe la distribution des flavonoïdes dans des sources alimentaires.
Flavonoïdes Aliments
Flavanones
Naringénine 32
fruits du genre citrus
Flavones
Chrysine 34
apigénine 14
lutéoline 16
peau des fruits
persil, thym, romarin, céleri
persil, céleri
Flavonols
Kaempférol 25
Quercétine 35
Myricétine 36
radis, brocoli, thé noir
oignon, pomme, olive, vin rouge, tomate
canneberge, vin rouge
Flavan-3-ols
Epicatéchine 37
catéchine 38
épigallocatéchine 39
thé vert, thé noir
thé vert, thé noir
vin rouge
Anthocyanidols
Cyanidol 40
Malvidol 41
Apigénidol 42
cassis, myrtilles
raisins, fraises, cassis
framboises, fraises
Tableau 3 : Sources alimentaires des flavonoïdes .
Les flavones apigénine 14 et lutéoline 16 sont très spécifiquement détectées dans les herbes
aromatiques comme le persil, le thym, le romarin et le céleri. Pour ce dernier, les concentrations
de ces deux flavones sont largement supérieures à celles présentes dans les tiges. Dans les
tomates, il y a autant de naringénine 32 que de quercétine 35. Cette dernière se retrouve de façon
majoritaire dans la quasi-totalité des végétaux. Le kaempférol 25, autre flavonol, y est également
largement détecté.
Chapitre I Les flavonoїdes
15
Parmi les autres flavonoïdes souvent étudiés, les anthocyanes confèrent aux fruits et légumes
leurs teintes rouges ou bleutées. Ils se trouvent surtout dans les myrtilles, cassis, airelles,
groseilles, mais également, à un degré moindre, dans tous les autres fruits rouges comme les
raisins, les fraises et les framboises. On peut aussi les trouver dans certains légumes comme le
chou rouge et les radis.
Le monde animal est lui aussi concerné par les flavonoïdes. On trouve par exemple de la
chrysine 34, de la quercétine 35 et de la galangine 43 dans la propolis des abeilles. Ces insectes
les synthétisent à partir des sécrétions de bourgeons de nombreux arbres comme le bouleau,
l’aulne, le sapin, et les modifient grâce à leurs enzymes salivaires.
Les structures des flavonoïdes de 34 à 43 sont les suivantes :
Chapitre I Les flavonoїdes
16
OOH
HO O
34
OHOOH
HO O
OHOH
35
OHOOH
HO O
OHOH
OH
36
OHOH
HO O
OHOH
37
OHOH
HO O
OHOH
38
OHOOH
HO O
43
OHOH
HO O
OHOH
OH
39
OHOH
HO O
OHOH
40
OHOH
HO O
CH3
OH
CH3
41
OH
HO O
OH
42
Chapitre I Les flavonoїdes
17
I-4- Propriétés des flavonoïdes :
Une des propriétés majeures des flavonoïdes est de contribuer à la couleur des plantes et
notamment à celle des fleurs. Or, c’est par la couleur de ses fleurs que la plante exerce un effet
attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs, ce qui assurent par ce biais, une étape
fondamentale de sa reproduction.
On peut également noter que les flavonoïdes, en repoussant certains insectes par leur goût
désagréable, peuvent jouer un rôle dans la protection des plantes.
Les flavonoïdes montrent d’autres propriétés intéressantes dans le contrôle de la croissance et du
développement des plantes en interagissaant d’une manière complexe avec les diverses
hormones végétales de croissance. Certains d’entre eux jouent également un rôle de
phytoalexines, c’est-à-dire de métabolites que la plante synthétise en grande quantité pour lutter
contre une infection causée par des champignons ou par des bactéries.
Par ailleurs, les flavonoïdes présentent un intérêt thérapeutique qui date de la découverte de la
vitamine C par Szent Gyorgyi (Prix Nobel, 1937), chercheur de l’Université de Szeged
(Hongrie), qui a constaté que les symptômes hémorragiques du scorbut, liés à la fragilité ou
l’hyperperméabilité des vaisseaux, étaient guéris par des extraits de paprika ou de jus de citron,
riches en vitamine C et flavonoïdes. Cette action a été appelée propriété vitaminique P (P étant
la première lettre du mot perméabilité).
Malgré ces premiers résultats prometteurs, les recherches ne permirent pas ensuite d’attribuer un
rôle essentiel aux divers polyphénols du monde végétal. A partir des années quatre-vingt, c’est
la découverte du rôle des radicaux libres dans les processus pathologiques qui a relancé l’intérêt
pour ces molécules dont les propriétés antioxydantes sont très marquées.
І-5- Activités biologiques des flavonoïdes :
Des études épidémiologiques ont montré qu’une consommation régulière de fruits frais et de
légumes diminue le risque de développement des maladies cardiovasculaires et d’apparition de
certains cancers [42]. Ces effets sont attribués, en partie, aux concentrations relativement
importantes des flavonoïdes présents dans les fruits et les légumes.
Chapitre I Les flavonoїdes
18
Les flavonoïdes sont également reconnus pour leurs nombreuses activités biologiques, citons
par exemple les activités : anti-allergiques et antivirales [43-45], anti-inflammatoires [46-48].
Ces activités sont en général attribuées à leur capacité à piéger les radicaux libres, chélater les
ions métalliques ou inhiber les enzymes responsables de la formation des radicaux.
І-6- La biosynthèse des flavonoϊdes:
L’enzyme clé pour la formation du squelette flavonoique est la chalcone synthase (CHS) qui
catalyse l’étape de condensation de trois unités acétate à partir de malonyl-CoA avec la 4-
coumaroyl-CoA pour donner l’intermédiaire en C15, la 4,2’,4’,6’-tétrahydroxychalcone [49].
Cette chalcone est l’intermédiaire caractéristique de la synthèse des différentes classes de
flavonoïdes (Schéma 9).
Les flavonoïdes peuvent ensuite être modifiés par des réactions d’hydroxylation, méthylation,
glycosylation et acylation [50].
OH
CoAS
O
COOHH2C
CO-S-CoA3
Malonyl-CoA
4-Coumaroyl-CoA
Chalcone Synthase
O
2',4',6',4-tetrahydroxychalcone
OHHO
OH
OH
Chalcone Isomérase
O
HO
OH
OH
OFlavone Synthase
Flavanone (naringénine )
OOH
HO O
OH
Flavone (apigénine )
Schéma 9 : Biosyntèse des flavonoïdes : exemple des flavones.
Chapitre I Les flavonoїdes
19
І-7- Principales substitutions du squelette flavonique :
Les composés flavoniques de chaque sous classe se distinguent par le nombre, la position et la
nature des substituants (groupes hydroxyles, méthoxyles et autres) sur les deux noyaux
aromatiques A et B et l’hétérocycle C.
I-7-1- L’hydroxylation :
D’une manière générale pour les flavones et les flavonols, et, d’après les réactions de
biogenèse les hydroxyles en positions 5 et 7 du noyau A et l’hydroxyle en position 4’ du
noyau B sont considérés comme originaux et existent avant la constitution du noyau chalcone
[51].
L’hydroxylation du noyau B dans la position 3’ se fera après la fermeture de l’hétérocycle C,
c'est-à-dire après la formation du squelette chalcone, tandis que la polyhydroxylation sur le
noyau B (les positions 3’, 5’) se fera par le biais des enzymes (hydroxylases) [52, 53].
Les positions 2’ et 6’ du cycle B sont rarement hydroxylées [52].
I-7-2- La méthoxylation ou méthylation :
La méthylation par l’intermédiaire d’une jonction C-C se fait uniquement en C-6 et ou en C-8
par contre la fixation du groupement méthyle pour former un groupement methoxyle, se fait
après celle du groupement hydroxyle et nécessite la présence d’une enzyme (O-
methyltransferase) qui joue le rôle de transporteur à partir de la S-adenosyl-methionine (SAM)
qui représente le donneur du radical méthyle. Cette transformation se fera avant la formation
du noyau chalcone [54, 55].
Cette réaction de méthylation peut se faire sur le noyau A (carbones 5, 6, 7, 8), sur le noyau B
(carbones 2’, 3’, 4’, 5’) et l’hétérocycle C (carbone 3) après la formation du noyau chalcone
dans le cas de flavones et flavonols [54].
Chapitre I Les flavonoїdes
20
I-7-3- La O-glycosylation :
Elle s’effectue entre un hydroxyle du squelette flavonique et un hydroxyle alcoolique du sucre
(glucose, rhamnose, xylose, galactose et arabinose). La O-glycosylation se fait en présence de
l’enzyme Glycosyltransferase et un donneur de sucre comme UDP-Glu (Uridine diphosphate
glucose).
L’hydroxyle de la position 7 constitue le site préférentiel de la glycosylation dans le cas des
flavones alors que dans le cas des flavonols c’est l’hydroxyle de la position 3 [56].
I-7-4- La C-glycosylation :
Les flavonoïdes C-glycosylés ne sont pas rares, on y trouve plus de 350 hétérosides [57]. Dans
ce type de composés, le sucre est lié directement au cycle benzénique par une liaison carbone-
carbone. Cette liaison résiste à l’hydrolyse acide [58].
D’une manière générale, la liaison carbone-carbone est rencontrée souvent en position C-6 et
ou en position C-8 .
І-8-Méthodes de séparation et d’analyse des flavonoϊdes :
І-8-1- Méthodes de séparation :
La séparation des composés flavoniques commence d’abord par l’extraction d’une quantité
importante de plante macérée dans du méthanol ou de l’éthanol (solvant polaire) en présence
ou non d’eau. Après filtration et concentration, l’extrait obtenu additionné d’eau distillée subit
des affrontements successifs par des solvants de polarité croissante menant ainsi à une
séparation partielle en fonction de la polarité des constituants. En général, ce travail débute par
le chloroforme qui permet l’extraction des aglycones méthoxylés et hydroxylés, puis par
l’acétate d’éthyle qui permet l’extraction des aglycones polyhydroxylés et monoglycosylés, et
en dernier par le n-butanol qui accède aux hétérosides polyglycosylés. Les phases organiques
ainsi obtenues sont séchées, concentrées et soumises à la batterie chromatographique pour la
séparation. Les techniques usuelles utilisées pour la séparation des flavonoïdes sont en
général :
Chapitre I Les flavonoїdes
21
І-8-1- a-La chromatographie liquide sur colonne (CC) :
Elle est basée sur l’utilisation d’une phase stationnaire comme le gel de silice, la cellulose ou le
polyamide et une phase mobile constituée par divers systèmes de solvants comme éluant. Elle
est la plus utilisée pour la séparation des quantités de mélanges importantes et complexes [59].
І-8-1-b- La chromatographie préparative sur papier (CP) :
Basée sur l’utilisation d’une surface plane de cellulose considérée comme support maintenant
par imprégnation une phase stationnaire liquide, les systèmes de solvants les plus utilisés dans
cette technique sont [60] :
• L’acide acétique 15 et 30 % constituant des systèmes aqueux.
• Le n-butanol / Acide acétique/ Eau (BAW) 4 /1/ 5 constituant un système organique.
І-8-1-c- La chromatographie préparative sur couche mince (CCM) :
Cette méthode est très simple et très rapide, elle est utilisée aussi bien pour la séparation que
pour la purification. Elle se sert de diverses phases stationnaires et de systèmes d’élution
solvants appropriés.
La purification ultime des composés phénoliques isolés se fait généralement sur une colonne
de Sephadex LH20 en utilisant du méthanol pur comme éluant.
I-8-2- Méthodes d’analyse :
La fluorescence sous lumière UV, la valeur de Rf dans différents systèmes de solvants, les
résultats de la spectrométrie de masse (SM) avec différents modes d’ionisation : impact
éléctronique (IE), ionisation chimique (IC), electrospray (ESI) et bombardement par des
atomes accélérés (FAB), la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) avec
ses différentes expériences monodimensionnelles (1H, 13C, DEPT) et bidimensionnelles
(COSY, HSQC, HMBC, COLOC, NOESY…) et la spectrophotométrie UV-Visible qui donne
des indications importantes sur la nature du flavonoïde et son mode de substitution, sont les
techniques utilisées pour l’identification et la détermination des structures flavoniques .
Chapitre I Les flavonoїdes
22
I-8-2-a- La fluorescence sous lumière de Wood :
L’absorption des substances flavoniques sous lumière de Wood à la longueur d’onde de 365
nm donne des renseignements préliminaires sur la structure chimique. Le tableau 4 montre la
relation entre la fluorescence et la structure chimique [60].
La fluorescence Les structures possibles
Violette noire Flavones avec 5-OH
Flavonol avec 3-OR, 5-OH, 4’-OH
Chalcones.
Bleue Flavone ou flavonol sans OH libre en 5.
Flavanone avec OH en 3 ou flavanol.
Flavonol avec 3-OH et sans 5-OH.
Jaune ou jaune terne Flavonol avec 3-OH, et avec ou sans 5-OH
Orange fluorescente Isoflavones
Jaune-verte Aurones
Bleue-verte Flavanone sans 5-OH
Tableau 4 : Relation entre la fluorescence sous lumière de Wood et les stuctures flavoniques
I-8-2-b- Facteur de retardement et comportement chromatographique :
La valeur du Rf est définie comme suit :
Distance entre l’origine et la tache du produit après élution Rf = Distance entre l’origine etle front du solvant après élution
Cette valeur varie avec la nature du solvant utilisé (organique ou aqueux), le type de support
chromatographique (gel de silice, polyamide, cellulose), la nature du produit lui-même
(aglycone ou glycosyle), ainsi que de la disposition des différents substituants sur le squelette
flavonique [59-61]. Le tableau 5 montre l’influence de la substitution du squelette flavonique
sur la valeur du Rf.
Chapitre I Les flavonoїdes
23
Structure flavonique Rf Augmentation des groupes hydroxyles Rf diminue dans les systèmes de solvants
organiques et augmente dans les systèmes de solvants aqueux
Methylation des groupements hydroxyles Rf augmente dans les systèmes de solvants organiques et diminue dans les systèmes de solvants aqueux
Glycosylation Rf diminue dans les systèmes de solvants organiques et augmente dans les systèmes de solvants aqueux.
Tableau 5 : La relation entre le Rf et la structure flavonique.
I-8-2 -c-La spectrophotométrie UV-Visible :
C’est la méthode la plus importante pour l’identification des structures flavoniques. Elle est
basée essentiellement sur l’enregistrement d’un spectre dans un milieu alcoolique (méthanol ou
éthanol) qui sera caractérisé par deux bandes d’absorption principales, la bande I et la bande II
[62].
Ces deux bandes représentent les absorptions dans le proche UV, des chromophores composant
le squelette flavonique. Ainsi, la bande I présentant un maximum d’absorption entre 300 et 400
nm, est attribuée à l’absorption du système cinnamoyle qui résulte de la conjugaison du
groupement carbonyle avec la double liaison (C2-C3) et le noyau B, elle donne donc, des
renseignements sur les variations structuralesdu cycle B et l’hétérocycle C (Schéma 10). La
bande II, présentant un maximum d’absorption entre 240 et 280 nm, est attribuée à l’absorption
du système benzoyle qui dérive de la conjugaison du groupement carbonyle avec le noyau A et
donne des informations sur les variations structurales du cycle A [59] (Schéma 10).
Chapitre I Les flavonoїdes
24
O
O
A C
Absorption de la partie cinnamoyle bande I
Absorption de la partie benzoyle bande II
B
Schéma 10: Les bandes caractéristiques d’un squelette flavonique
Le tableau 6 donne l’intervalle du maximum d’absorption des deux bandes en milieu
méthanolique pour quelques types de flavonoïdes.
Type de compose flavonique Bande I Bande II
Flavones 320-350 250-270
Flavonols 352-385 250-280
Flavanones 300-330 245-275
Tableau 6 : Relation entre le maximum d’absorption en UV et le type de flavonoïdes.
Le maximum d’absorption d’une telle ou telle bande dépend du nombre et de la position des
groupements hydroxyles ou méthoxyles sur le squelette flavonique. L’augmentation du
nombre de groupements hydroxyles fait déplacé le maximum d’absorption vers des longueurs
d’onde plus élevées, par contre la substitution des groupements hydroxyles par des
groupements méthoxyles ou glycosyles fait déplacé ce maximum vers des longueurs d’onde
plus courtes [63].
I-8-2 -c-1-Addition de réactifs :
Le spectre méthanolique d’un composé flavonique sera modifié par addition d’un certain
nombre de réactifs tels que NaOH, AlCl3, AlCl3+HCl, NaOAc et NaOAc+H3BO3. Ces réactifs
réagissent avec les groupements hydroxyles par formation de sels et de complexes qui se
Chapitre I Les flavonoїdes
25
traduiront sur le spectre UV par des déplacements bathochromiques ou hypsochromiques des
bandes d’absorption, permettant la localisation des hydroxyles libres sur le squelette
flavonique.
• l’addition de AlCl3 et AlCl3 + HCl :
L’addition de AlCl3 à la solution du flavonoïde dans le méthanol mène à la formation de
complexes entre les hydroxyles ortho, l’hydroxyle en 3 et la fonction carbonyle et l’hydroxyle en
position 5 et la fonction carbonyle [64]. Ce qui entraîne un effet bathochrome de la bande I.
L’addition de HCl dans ce même échantillon provoque la disparition des complexes instables
(complexe formé entre deux hydroxyles) et le maintien des complexes stables (hydroxyle et
carbonyle). Ceci se manifeste par un déplacement hypsochrome de la bande I par rapport à celui
en présence de AlCl3 et bien évidement un effet bathochrome moins important par rapport au
spectre dans le méthanol pris comme référence.
• l’addition de NaOAc + H3BO3 :
Le H3BO3 est additionné à l’échantillon en présence de NaOAc et les informations apportées
indiquent l’existence ou l’absence de systèmes ortho dihydroxyle sur le cycle B ou sur le cycle
A (6, 7 ou 7, 8) à cause des complexes formés. l’effet qui observé est un déplacement
bathochrome de la bande I par rapport au spectre enregistré dans le méthanol [65].
• l’addition de NaOH et de NaOAc :
NaOH :
L’addition du NaOH indique le nombre et la position des hydroxyles libres sur le squelette
flavonique essentiellement les OH des positions 7, 4’et 3 par un effet bathochromique de la
bande I, accompagné ou non d’une augmentation d’intensité renseignant ainsi sur un 4’-OH libre
ou substitué. Dans ce spectre, la présence d’un 7-OH libre est déduite de l’apparition d’une
nouvelle bande entre 320 et 335 nm. Par contre la décomposition de l’échantillon après cinq
minutes indique la présence simultanée d’un 3-OH et d’un 4’-OH libres.
Chapitre I Les flavonoїdes
26
NaOAc :
Ce réactif sert à détecter les groupements hydroxyles essentiellement celui de la position 7 par un
léger effet bathochrome de la bande II, il ionise les OH les plus acides comme les hydroxyles des
positions 3, 7 et 4’ [65]. Le tableau 7 donne les informations obtenues des spectres en présence
de réactifs [59, 66, 67]
Tableau 7 : Informations obtenues des séries spectrales UV-Vis
Réactifs Déplacement en nm Bande I Bande II Interprétation
MeOH
304-350 250-280 352-385 250-280 350-380 250-280
Flavones Flavonols (3-OH) Flavonols (3-OR)
NaOH
+44 à 65 1)- avec stabilité ou augmentation d’intensité 2)-avec diminution d’intensité une nouvelle bande entre 320-335
4’-OH 3-OH et 4’-OR 7-OH
AlCl3/MeOH + 20 à 45 + 60
5- OH 3- OH
AlCl3+HCl/AlCl3
-20 à -40 -20 à -25
Ortho di OH (noyau B) Ortho di OH (noyau A) +ortho di OH (noyau B)
AlCl3 +HCl/MeOH
+ 17 à 20 + 35 à 55
+ 50 à 60
5- OH (avec 6- oxygénation) 5-OH flavone et 3-OMe flavone 3- OH avec ou sans 5- OH
NaOAc /MeOH
+ 5 à 20 Déplacement très faible Diminution d’intensité avec le temps Le spectre se décompose avec le temps
7- OH 7- OR 6, 7 ; 7, 8 ou 3’, 4’ di OH 5, 6, 7 ; 5, 7, 8 ou 3, 3’ ,4’ – tri OH
NaOAc + H3BO3 + 12 à 36 + 5 à 10
3’, 4’ di OH 6, 7, ou 7, 8 di OH
Chapitre I Les flavonoїdes
27
I-8-2-d-La Spectrométrie de masse :
Cette technique permet la détermination du pic moléculaire des aglycones qui donne
globalement le nombre et la nature des substituants hydroxyles ou méthoxyles [68, 69].
Les pics de fragmentation caractéristiques fournissent des renseignements utiles, notamment
sur les structures des substituants des noyaux A et B [70]. Cette technique connaît un véritable
succès dans ce domaine avec le développement de divers mode d’ionisation permettant
l’analyse des structures glycosylés à l’état natif tels que la FAB, et l’électro-spray.
De nos jours, la spectrométrie de masse trouve diverses applications grâce au couplage avec
les techniques chromatographiques. Ces techniques de couplage permettent des analyses très
rapides et très rigoureuses.
I-8-2-e- La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) :
Très précise et très efficace, elle est couramment utilisée et permet entre autre :
La localisation des protons de la molécule [70].
De déterminer le nombre, la nature et la position des sucres [71,72].
D'identifier les liaisons C-sucre et O-sucre.
D’identifier les substituants acylés et leur sites d’acylation.
L’identification des substituants oxygénés.
Les tableau 8 et 9 contiennent quelques déplacements chimiques et constantes de couplage des
protons du noyau A et du noyau B [73].
Protons du noyau A Nature du flavonoïde
(H-5) δ, ppm J, Hz
(H-6) δ, ppm J, Hz
(H-8) δ, ppm J, Hz
5, 7 – OH 6,0-6,2 d 2,5 6,3-6,5 d 2,5 5-OH, 7-OR (R=Gluc.) 6,2-6,4 d 2,5 6,5-6,9 d 2,5 7-OR (R=H, sucre) 8,0 d 9 6,7-7,1 dd (9,0 ; 2,5) 6,7-7,0 d 2,5 5, 6, 7-OR R=H, sucre 5, 7, 8-OR
6,3 s
6,3 s
Tableau 8 : Les déplacements chimiques et constantes de couplage des protons du noyau A.
Chapitre I Les flavonoїdes
28
Protons du noyau A
Nature du flavonoïde
(H-5)
δ, ppm J, Hz
(H-6)
δ, ppm J, Hz
5, 7 – OH 6,0-6,2 d 2,5
5-OH, 7-OR (R=Gluc.) 6,2-6,4 d 2,5
Tableau 9 : Les déplacements chimiques et constantes de couplage des protons du noyau B.
I-8-3 - L’hydrolyse acide des hétérosides :
Cette manipulation concerne dans un premier temps les flavonoïdes O-glycosylés, elle
renseigne sur la nature du sucre qui peut être étudié une fois détaché ainsi que celle de
l’aglycone. L’identification du sucre se fait par co-chromatographie avec des solutions
authentiques.
Les hétérosides C-glycosylés résistent à l’hydrolyse acide, cette propriétés permet de
différencier ce type de liaison dans les flavonoïdes glycosylés.
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
30
II-1-Introduction :
La famille des lactones sesquiterpéniques est très représentée dans la nature. Depuis les années
70, le nombre de structures élucidées n’a cessé d’augmenter pour dépasser, les 2500 molécules
[74]. Plus de 5000 structures sont connues [75,76].
Les lactones sesquiterpéniques constituent un grand et divers groupe de métabolites secondaires,
qui se distinguent dans leurs propriétés et leurs structures, elles sont appelées aussi les principes
amers à cause de leur gout amer.
On les trouve dans plus de 15 familles de plantes et très majoritairement chez les Asteraceae
[77]. Les lactones sesquiterpéniques sont fréquement localisées dans des poils sécréteurs situés
au niveau des feuilles, des tiges et des bractées de l’inflorescence [78].
Les lactones sesquiterpéniques sont connues depuis 1830, date à laquelle le premier d’entre eux,
l’α-santonine a été isolée sous forme cristalline [79].
O
O
O
Schéma 11: α-santonine
II-2-Structure chimique des l actones sesquiterpéniques :
Les lactones sesquiterpéniques ont comme base un squelette de 15 atomes de carbone qui
contient généralement au moins le groupe γ-lactonique, sa formation vient de trois unités
isopronèques qui sont liées ensemble sous forme" tête-queue" en formant le composé 2,6,10-
triméthyldodécane (Schéma 12).
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
31
Schéma 12 : Squelette de base des lactones sesquiterpéniques.
II-3- Classification des lactones sesquiterpéniques :
Les lactones sesquiterpéniques majoritaires dans le genre Centaurea sont: les germacranolides,
les élémanolides, les eudesmanolides, les guaianolides et les héliangolides [80].
II-3-1-Les germacranolides :
Ce sont des composés monocycliques, leur squelette de base est un cycle à 10 atomes de
carbone, avec deux doubles liaisons l’une entre C-1 et C-10 et l’autre entre C-4 et C-5. Ce cycle
est attaché à un autre cyclique formé de 5 atomes caractérisant la fonction γ-lactone qui peut être
fermée en 6 ou en 8 .
Le schéma 13 montre un exemple de germacranolide isolé de Centaurea lippi et de plusieurs
autres centaurées dans notre laboratoire: la cnicine [81].
O
OOH
HOO
O OH
1
2
3 45
67
89
10
11
14
15 12
13
Schéma 13: La cnicine .
Des études réalisées sur les germacranolides ont montré que ce type de lactones
sesquiterpéniques est constitué essentiellement de trois classes différentes : 6α,12-olide; 8α,12-
olide et furanogermacrane [82].
Unité d’isoprène (x 3)
Combinaison linéaire « tête-queue »
2,6,10-triméthyldodécane
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
32
II-3-2-Les élémanolides :
Ce sont des lactones sesquiterpéniques qui ont comme squelette de base un monocycle à 6
atomes de carbone, comme le montre le schéma 14, ce squelette est caractérisé par la
stéréochimie α de la liaison C1-C10 et la stéréochimie β de la liaison C4-C5.
O
O
X
12
34
5
14
15
67
8
9
10
1113
12
Schéma 14: Squelette de base des élémanolides.
Ils dérivent par un réarrangement de Cope des germacra-1(10),4(5)-diènolides [83,84] (Schéma
15).
O
O
(CH3)2NH,MeOH
O
O
NMe2
205ºC, N2,5min
O
O
NMe2
1.CH3I2.NaHCO3
O
O
Schéma 15 :Réarrangement de Cope d’un germacranolide.
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
33
II-3-3-Les eudesmanolides :
Ils sont aussi appelés les sélinanolides, et ont comme squelette de base deux cycles hexagonaux,
comme le montre schéma 16. La fermeture de la fonction γ-lactone peut s’effectuer aussi bien en
6 qu’en 8 avec une jonction cis comme avec une jonction trans.
OH
O
X
12
34
56
7
910 8
11
13
12
14
15
Schéma 16 :Exemple de squelette de base des eudesmanolides.
Ils dérivent généralement de la cyclisation trans annulaire entre C-5 et C-10 du système
cyclodécadiène des germacra-1,5-diènes ou de leurs dérivés 1,10 et 4,5 époxydes [85], ces
réactions peuvent être catalysées par un acide de Lewis.
Le schéma 17 montre la cyclisation du germacra-1,5-diène [86,87], formant un mélange de deux
eudesmanolides via un cation intermédiaire.
Schéma 17: Formation d’élémanolide via le costunolide.
+
OH
O
OO
OH
O
OH
O
+
+H+
-H +
H +
β- cyclocostunolide α-cyclocostunolide
Cation intermédiaire
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
34
II-3-4-Les guaianolides :
Les guaianolides constituent un large groupe de lactones sesquiterpéniques, ils ont comme
squelette de base un cycle pentagonal et un autre heptagonal, comme le montre schéma 18 .
Ce type de lactones sesquiterpéniques se distingue par la stéréochimie α des protons des
positions 1 et 5.
OO
HO HOH
H
H
123
45
67
8910
11
12
13
14
15
Schéma 18 : Deacylcynaropicine.
II-3-5-Les héliangolides :
Ce sont des germacranolides avec des doubles liaisons de configuration E pour C-1, C-10 et Z
pour C-4, C-5. Le squelette de base de ce type de composés est représenté dans le schéma 19 .
O
O
1
2
3
4
15
109
8
7
12
5 11
6
13
14
Schéma 19 : Structure du squelette héliangolide
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
35
II-4- Biosynthèse des lactones sesquiterpéniques :
La biosynthèse des α-méthylène-γ-lactones sesquiterpéniques serait la suivante: ces composés
proviendraient de la cyclisation du trans,trans-farsényl-pyrophosphate. Une série de
fonctionnalisations du cyclodécadiène obtenu permettrait ensuite de former une grande diversité
de sesquiterpènes (Schéma 20).
OPP co2Me
O
O
O
O
O
O
HO HO
HO
O
O
O
O
HO OO
ou
Trans, trans-Farnésyl Pyrophosphate
germacranolides
guaianolides
eudesmanolides
Schéma 20 : biosynthèse de α-méthylène-γ-lactones sesquiterpéniques
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
36
II-5-Activités biologiques des lactones sesquiterpéniques :
Plusieurs études ont tenté d’identifier le lien entre l’activité biologique et la structure de ces
sesquiterpènes lactones[88-93].
Celles-ci ont démontré que les α-méthylène-γ-butyrolactones alkyleraient, par réaction de
Michael, des nucléophiles biologiques tels que la L-cystéine ou des enzymes contenant des thiols
(Schéma21).
OO
OO
S-Enz+ Enz-SH
Schéma 21: mode d’action supposé des α-méthylène-γ-lactones.
La réactivité des α-méthylène-γ-lactones insaturées avec les thiols et les amines, en particulier la
cystéine[94-96], est bien établie et peut suggérer que la cytotoxicité des lactones
sesquiterpéniques résulte de l’alkylation des centres nucléophiles de systèmes biologiques. Mais
les γ-lactones α,β-insaturées endocycliques réagissent lentement avec la cystéine et certains
adduits sont même inertes.
Un grand nombre de lactones sesquiterpéniques, dont la vernolépine, l’aromaticine, et
l’éléphantopine, peuvent inhiber la prolifération des tumeurs. Elles présentent toutes une lactone
α ,β-insaturée dont la double liaison conjuguée est exocyclique (Schéma 22).
OOH
OO
O
H
O
OO
OO
O
O
O
O
O
Schéma 22: de gauche à droite: la vernolépine, l’aromaticine et l’éléphantopine
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
37
En général, les lactones sesquiterpéniques possèdent des propriétés d’inhibition de la Farnésyl
Protéine Transférase (FPTase).
La protéine Ras joue un rôle important [97] puisqu’elle régule le cycle de vie des cellules. Une
altération de cette protéine entraîne une prolifération excessive de cellules, formant des tumeurs.
Ce phénomène a été identifié dans plus de 30% des cancers humains.
La FTPase permet la farnésylation des protéines Ras. Cette étape est indispensable avant leur
ancrage dans la membrane plasmatique. La FTPase est donc nécessaire à l’expression de la
protéine Ras: inhiber la FTPase des cellules cancéreuses revient à annihiler le développement de
tumeurs. Les agents inhibiteurs de FTPase, tels que les lactones sesquiterpéniques, sont donc des
agents thérapeutiques pour le traitement des cancers.
Parmi les autres activités biologiques des lactones sesquiterpéniques ,on peut citer : l’activité
inflammatoire [98-100], antimigraineuse [101], antioxydante [102], antifonqique [103-105],
cytoprotectrice gastrique [106] et antimicrobienne[107].
Malgré l’importance des lactones sesquiterpéniques ces substances peuvent aussi être
allergisante [108] et neurotoxique [109], car des allergies peuvent apparaître lors d'un contact
direct ou indirect avec la plante. Des études ont montré que leur présence dans des plantes est
responsable d’empoisonnement de mammifères.
II-6-Les méthodes de séparation et d’analyse des lactones
sesquiterpéniques :
II-6-1- Les Méthode de séparation :
Les travaux de la littérature montrent que plus de 90% des lactones sesquiterpéniques isolées et
déterminées l’ont été à partir d’espèces de la famille des composées. Cependant, bien que
certaines plantes soient de grandes accumulatrices de ces métabolites, le passage par des
techniques de séparations chromatographiques différentes est obligatoire pour les atteindre.
Chercher des lactones sesquiterpéniques et faire leur séparation commence d’abord par
l’extraction d’une quantité importante de plante macérée dans du méthanol ou de l’éthanol
(solvant polaire) en présence ou non d’eau. Après filtration et concentration, l’extrait obtenu
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
38
additionné d’eau distillée subit des affrontements successifs par des solvants de polarité
croissante menant ainsi à une séparation partielle en fonction de la polarité des constituants. En
général, ce travail débute par de l’hexane ou de l’éther de pétrole pour récupérer les cires et les
hydrocarbures suivi par au moins trois extractions au chloroforme pour avoir les lactones
sesquiterpéniques moyennement polaires. Ces deux étapes sont suivies par une extraction à
l’acétate d’éthyle dont l’extrait pourrait contenir des lactones sesquiterpéniques trop
fonctionnalisées et enfin par des affrontements au n-butanol pour rechercher les produits
beaucoup plus polaires tels les hétérosides souvent de type flavonoïde.
Les phases organiques ainsi obtenues sont séchées, concentrées et soumises à la batterie
chromatographique pour la séparation. Les techniques usuelles utilisées pour la séparation des
lactones sesquiterpéniques sont en général la chromatographie sur colonne et la chromatographie
sur couche mince.
II-6-1- a- La chromatographie sur colonne :
Les lactones sesquiterpéniques ont des polarités similaires. En effet, leur séparation en produits
purs est souvent complexe et consomme énormément de temps et de solvants.
L’étape initiale pour leur séparation est la chromatographie sur colonne utilisant le gel de silice
comme phase stationnaire éluée par des systèmes de solvants en mode gradient ou en mode
isocratique. Cette étape doit être précédée par une analyse par chromatographie sur couches
minces pour rechercher l’éluant donnant la meilleure séparation.
Le tableau 10 rapporte quelques systèmes de solvants utilisés pour séparer les lactones
sesquiterpéniques sur colonne.
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
39
Systèmes de solvant Proportions
CHCl3- Me2CO 9:1; 7:1; 5:1; 3:1, 3:2; 1:1; 2:3; 1:3
Hexane-AcOEt 9:1; 4:1; 2:1; 1:1; 2:3; 1:3
Haxane-CHCl3- AcOEt 1:1:1; 1:1:2; 2:2:1
CHCl3-MeOH 99.5:0.5; 99:1; 98:2; 95:5; 50:1; 10:1
CHCl3-AcOEt 1:1
Hexane-Et2O 1:3
CH2Cl2-Me2CO 1:1
CH2Cl2-isPrOH 99:1; 98:2; 97:3; 19:1; 9:1; 3:1
Et2O-Toluène-CH2Cl2 1:1:1
Tableau 10 : Systèmes de solvants utilisés pour séparer les lactones sesquiterpéniques sur
colonne.
II-6-1- b- Chromatographie sur couche mince :
Cette méthode utilisée de manière analytique donne une idée sur la composition de l’extrait à
étudier. De manière preparative, elle permet des séparations correctes suivies de purifications.
Dans notre cas pour les lactones sesquiterpéniques le support fréquemment utilisé reste le gel de
silice 60 avec indicateur fluorescent. La révélation des plaques preparatives se fait sous lumière
UV à 254 nm.
Les plaques analytiques, peuvent être révélées sous lumière UV à 254 nm ou par pulvérisation de
l’acide sulfurique suivie de chauffage à 100 °C pendant 3 minutes.
Cette dernière technique de révélation peut donner des informations sur la nature et la position de
certains substituants sur le squelette sesquiterpénique de type guaianolide de la lactone en
question en fonction de la couleur que prennent les spots après chauffage. Par exemple, une
couleur verte indique la présence d’un groupement chlorométhylène en C-4 et un groupement
hydroxyle en C-3 [110].
Chapitre II les lactones sesquiterpéniques
40
II-6- 2- Les Méthodes d’analyse :
Le développement des méthodes d’analyse de nos jours a facilité l’investigation structurale des
molécules complexes, notamment celles des lactones sesquiterpéniques.
a- La spectroscopie d’absorption infrarouge (IR) montre la présence de la fonction γ – lactoneα,
β-saturée ou α, β- insaturée par l’existence de bandes caractéristiques à 1780 ou 1755 cm-1
respectivement. Les bandes à 1740, 1735 et 1720 cm-1 respectivement confirment la présence
d’un groupement acétate [111,112], esters saturés et esters insaturés.
Cette étape est définie comme étape initiale de l’identification des lactones sesquiterpéniques.
b- La spectrométrie de masse avec ses divers modes d’ionisation permet en plus de la
visualisation d’un pic pseudo moléculaire (ionisation douce) permettant d’arriver à la masse
moléculaire [113], la détermination de la nature des substituants sur le squelette
sesquiterpénique.
c- La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire est la technique la plus performante dans
la recherche structurale des lactones sesquiterpéniques. En effet, les expériences
multiimpulsionnelles et bidimensionnelles homo et hétéronucléaires permettent non seulement
d’arriver à la structure mais peuvent donner d’excellentes informations sur la stéréochimie des
centre asymétriques.
d- La diffraction des rayons X est également très utilisée. Elle donne toutes les informations
nécessaires à l’établissement de la structure y compris la stéréochimie des centres chiraux mais
exige une bonne cristallisation de l’échantillon.
Chapitre III Partie expérimentale
42
III-1 - Etude phytochimique de Centaurea nicaeensis :
III-1.1 - Place dans la systématique :
III-1.2 - Description de l’espèce Centaurea nicaeensis :
Centaurea nicaeensis est une plante bisannuelle à fleurs nettement jaunes et des tiges bien
marquées (Schéma 23). Elle est très polymorphe à feuilles inférieures pétiolées et lyrées, les
supérieures sont sessiles et amplexicaules. Les capitules sont de 1-1,5 cm de large sur 2,5-3 cm
de long, les akènes sont pâles de 3 mm de long et à aigrettes deux fois plus courtes.
Cette plante est assez répandue sur tout le Tell, dans les forêts claires et les pâturages arides [2].
Elle possède deux sous-espèces :
• Les bractées à appendices dont l’épine médiane est très marquée jusqu’à 2 cm et de
couleur claire, elle est accompagnée de courtes épines en nombre variable (Schéma 24) ssp.
nicaeensis Q. et S.
Embranchement Angiospermes
Classe Dicotylédones
Ordre Astérales
Famille Compositae
Sous-famille Tubiflores
Tribu Cynarées
Genre Centaurea
Espèce Nicaeensis sous-espèce walliana M.
Chapitre III Partie expérimentale
43
Schéma 24 : La fleur de Centaurea nicaeensis Q. et S.
• Les bractées à appendices dont l’épine médiane est très courte 3-4 mm et de couleur noire
(Schéma 25) ssp. nicaeensis walliana M.
Schéma 25 : La fleur de Centaurea nicaeensis var. walliana M.
Nous nous sommes intéressés dans ce travail à la sous espèce nicaeensis var. walliana M.
Schéma 23: Centaurea nicaeensis var. walliana M.
Chapitre III Partie expérimentale
44
III-1.3- Travaux antérieurs:
Trois études sur Centaurea nicaeensis All. ont été effectuées au sein de notre laboratoire. La
première concerne C. nicaeensis var.Q. et S. Cette étude a permis d’isoler 12 flavonoïdes, parmi
lesquels 8 de type flavone et 4 de type flavonol [114]. Il s’agit de:
• 6-methoxy lutéoline (Népétine) 04
• 7-O-glucosyl hispiduline 06
• 6-O-methoxy chrysoeriol (Jacéosidine) 07
• 6, 7-dimethoxy chrysoeriol ( cirsilinéol) 08
• 3'-methoxy salvigenine 13
• 6, 8-di-glucosyl apigénine (Vicénine-2) 18
• 6-methoxy quercetine 20
• 7-O-glucosyl patulétine 21
• 6-methoxy kaempférol 24
• 7-O-glucosyl isoorientine 44
• 6-O-glucosyl isoorientine 45
• 7-O-glucosyl- 6 –methoxy isorhamnétine 46
O
OOH
OH
OH
R3O
R2 R1
La deuxième étude également effectuée sur Centaurea nicaeensis var. Q. et S. reporte
l’isolement de quatre lactones sesquiterpéniques [115] , il s’agit de:
Structures R1 R2 R3
44 H CGlc Glc
45 H CGlcOGlc H
46 OH OMe Glc
Chapitre III Partie expérimentale
45
• 11β-H, 13-dihydrocnicine :
O
OOH
HOO
O OH
1
2
34
56
7
89
10
11
14
15 12
13H
1617
18
1920
• 11β-H, 13-dihydrosalonitenolide :
O
HO
H
OH1
2
3 4
15
5
109
8
76 11 13
12
O
14
• La mélitensine :
O
O
OH2
1
34
56
7
89
10
14
111215
H
H
CH3
HO
13
• 5α,6β,7α,8β,11β-15-hydroxy-8-(1’, 2’-dihydroxyethyl)-acryloelema-1,3-dien-6,12-olide :
O
O
21
3
4
56
7
89
10
14
111215
H
H
CH3
HO
OOH
O OH
13
16
18
1719
20
Chapitre III Partie expérimentale
46
La troisième a été effectuée sur Centaurea nicaeensis var. walliana M., soit la variété qui a fait
l’objet de ce travail. Cette étude concernant l’investigation de la phase chloroforme de l’extrait
hydro alcoolique a mené à la séparation de 2 composés flavoniques de type flavone [116]. Il
s’agit de :
• 5,7,4’-triihydroxy 6, ,3’-dimethoxyflavone (Jacéosidine) 07
• 5,4’-dihydroxy 6,7,3’-trimethoxyflavone ( cirsilinéol) 08
III-2- Travaux personnels :
III-2-1- Extraction de Centaurea nicaeensis :
La plante a été récoltée au mois de juin 1998, des montagnes de Souk-Ahras. Après séchage dans
un endroit sec et aéré à l’abri de la lumière directe du soleil, les parties aériennes broyées
(feuilles et fleurs) sont pesées (m=1,95 kg).
Le matériel végétal a subit une macération dans un mélange hydroalcoolique (Ethanol/Eau) dans
les proportions (70/30; v/v) pendant 24 heures. Cette macération est répétée 3 fois avec
renouvellement du solvant. Les 3 extraits hydroéthanoliques sont réunis, concentrés à une
température n’excédant pas environ 35 ºC.
La solution obtenue diluée avec de l’eau distillée à raison de 400 ml pour 1kg de matière sèche,
est additionnée d’acétate de plomb [(CH3COO)4Pb] pour éliminer la chlorophylle par
précipitation. Après filtration, la solution devenue rouge-brune, subit des extractions successives
de type liquide-liquide en utilisant des solvants de polarité croissante en commençant par le
chloroforme, puis l’acétate d’éthyle et en dernier le n-butanol.
Les trois phases organiques ainsi obtenues (chloroforme, acétate d’éthyle et n-butanol) sont
séchées par du sulfate de sodium anhydre (Na2SO4), puis filtrées et concentrées à sec sous
pression réduite.
Le protocole d’extraction est résumé dans le schéma 26 :
Chapitre III Partie expérimentale
47
Schéma 26 : Protocole d’extraction de Centaurea nicaeensis.
Extrait chloroforme m = 35 g
Extrait AcOEt m =23 gPhase
organique
• Séchage par Na2SO4 anhydre • Filtration • Concentration à t = 35°C
• Extraction par Le n-butanol (x3)
• Décantation
• Séchage par Na2SO4 anhydre • Filtration • Concentration à 60°C
• Extraction par de l’AcOEt (x1) • Décantation
Phase aqueuse
Phase organique
• Concentration non à sec (t = 35°C) • Dilution avec 760 ml de H2O
distillée. • Précipitation de la chlorophylle par
le (CH3COO)4Pb. • Filtration
• Extraction par du CHCl3 (x3) • Décantation
• Macération à froid dans un mélange EtOH/H2O (70 : 30 ; v/v) 3 fois 24h
• Filtration
Extrait éthanolique
Filtrat
• Séchage par Na2SO4 anhydre • Filtration • Concentration à t = 35°C
Extrait n-butanol m = 68 g
Matière végétale m = 1950 g.
Phase organique
Phase aqueuse
Phase aqueuse
Chapitre III Partie expérimentale
48
L’investigation de l’extrait acétate d’éthyle a débuté par l’enregistrement d’un spectre de RMN
de proton (spectre 1). Ce spectre montre la présence de signaux dans la zone attribuée aux
terpenoïdes et également dans celle attribuée aux flavonoïdes.
Spectre 1 : Spectre de RMN du proton de l’extrait acétate d’éthyle.
III-2-2-Séparation chromatographique de l’extrait acétate d’éthyle :
III-2-2-1- Séparation chromatographique sur colonne :
La séparation sur colonne a débuté par une recherche sur plaques analytiques de gel de silice 60,
du meilleur système d’élution. Les tests effectués ont montré que la meilleure séparation est
obtenue avec le système (CHCl3/MeOH) dans les proportions (9/1) comme le montre le
chromatogramme suivant (schéma 27).
Chapitre III Partie expérimentale
49
Schéma 27 : Chromatogramme de l’extrait acétate d’éthyle dans le système CHCl3/MeOH
(9: 1). Révélateur : L’acide sulfurique.
Ainsi, cette étude a débuté sur une colonne de gel de silice préparée dans le chloroforme où
environ 14 g de l’extrait acétate d’éthyle y ont été déposés.
L’élution a été faite par du chloroforme avec un gradient de méthanol et un fractionnement tous
les 25 ml. Le suivi de la composition des fractions a été effectué par chromatographie sur couche
mince de gel de silice 60 sur support aluminium.
Les plaques sont visualisées sous lumière UV (λ=254 et 365nm) puis révélées par l’acide
sulfurique et chauffées à 100 °C pendant 3 min. Les pots de même composition sont rassemblés,
on obtient ainsi 28 fractions, le tableau 11 rassemble les résultats de cette colonne.
Chapitre III Partie expérimentale
50
Fractions Tubes (25 ml)
Eluant Observations CHCl3
%MeOH
% F1 1-27 100 0 /
F2 28-76 99.5 0.5 Des traces 77-79
99 1
F3 80 Mélange séparable avec une quantité faible
F4 81 Mélange séparable avec une quantité faible
F5 82 Mélange séparable avec une quantité faible
F6 83-84 Mélange séparable avec une quantité faible
F7 85-115 Mélange séparable 116-147
98 2 F8 148-184 Mélange séparable
F9 185-202
Mélange séparable 203-210
96 4 F10 211-232 Mélange séparable F11 233-265 Mélange séparable
F12 266-271
Mélange séparable 272-298 94 6
F13 299-308 Mélange séparable F14 309-336
90 10
Mélange séparable F15 337-344 Mélange séparable F16 345-359 Mélange séparable F17 360-368 Des cristaux
F18 369-378 Des cristaux 379-384
85 15
F19 385-396 Mélange séparable F20 397-403 Mélange séparable F21 404-419 Mélange séparable F22 420-431 Mélange séparable
F23 432-436
Mélange séparable 437-440
80 20 F24 441-451 Mélange complexe F25 452-464 Mélange complexe
F26 465-478 Mélange complexe 479-488
50 50 F27 489-496 Mélange complexe F28 497-510 0 100 Mélange complexe
Tableau 11: Le fractionnement de la colonne.
Chapitre III Partie expérimentale
51
Parmi les fractions obtenues, on a procédé à la séparation des fractions: F9, F10, F16, F17.
III-2-2-2- Séparation et purification des fractions:
• La fraction F9 :
Cette fraction a subit une séparation sur plaques préparatives de gel de silice normale en
utilisant comme système éluant: Ether diéthylique/Hexane dans les proportions respectives (4:1).
Cette étude a mené à 5 sous fractions. Vu les quantités faibles obtenues, nous n’avons pu nous
intéresser qu’à la purification de la sous fraction F9-3.
Cette sous fraction F9-3, testée sur plaque analytique de gel de silice 60 révélée par de l’acide
sulfurique a montré deux taches dont une très minoritaire.
Ainsi, cette sous fraction jugée intéressante a subi une purification par chromatographie sur
plaques préparatives de gel de silice normale éluées par le système CHCl3/AcOEt/MeOH dans
les proportions respectives (3:1:0,5). Pour donner le produit F9-3-1 à l’état pur et natif sous forme
des cristaux blancs.
• La fraction F10 :
Cette fraction a été chromatographiée sur plaques préparatives de gel de silice normale éluées 2
fois par le système éther diéthylique/Hexane (4:1) pour donner le produit F10-1 à l’état pur et
natif.
• La fraction F16 :
Intéressante du point de vue quantitatif, la fraction F16 a retenu notre intérêt. Ainsi, le test
chromatographique sur couche mince de gel de silice normale de cette fraction, a montré 4 spots
dont deux très intenses. La couleur de leur fluorescence sous lumière UV à λ=366nm nous a
orientés vers des structures flavoniques.
Après cette analyse, cette fraction chromatographiée sur plaques préparatives de gel de silice
éluées par le système CHCl3/MeOH (9:1), a donné les produits flavoniques F16-1 et F16-4.
Chapitre III Partie expérimentale
52
• La fraction F17 :
Cette fraction se présente sous forme cristallisée contenant un produit majoritaire mêlé à d’autres
produits en faible quantité. Pour cette raison, cette fraction a été chromatographiée sur une
colonne de gel de silice normale éluée par le système CH2Cl2/MeOH en gradient de polarité. Le
tableau 12 montre les résultats de cette colonne après regroupement des pots selon les tests
chromatographiques sur couche mince de gel de silice 60.
F17 Tubes
(25 ml)
Eluant Observations
CH2Cl2 % MeOH %
F17-1 1-29 100 0 Mélange de plusieurs produits
F17-2 30-74 90 10
Monotache (produit pur) 75-95 85 15
F17-3 96-112 70 30
Couleur marron (traînée) 113-130 50 50
Cette fraction a ainsi mené au composé F17-2 à l’état pur et natif.
III-3- Conclusion :
Ce travail, réalisé en complément d’une étude effectuée sur la phase chloroforme de cet extrait
hydroéthanolique, dans notre laboratoire [116] a ainsi mené à la séparation et la purification de 5
composés purs que nous avons soumis à l’analyse physico-chimique en vue de l’établissement de
structures. Il s’agit des composés: F9-3-1, F10-1, F16-1, F16-4 et F17-2.
Le schéma 28 résume les travaux chromatographiques effectués sur colonnes et plaques
préparatives sur couches minces de gel de silice.
Chapitre III Partie expérimentale
53
Schéma 28: Résumé des travaux chromatographique effectués.
F9
F9-3-1
F17F16
F16-4
CCM
CCM
F17-2
Une colonne de gel de silice
Extrait acétate d’éthyle de Centaurea nicaeensis
F10
CCM
F9-3
CCM
F10-1 F16-1
Chapitre IV Résultats et discussion
55
IV-1- Identification du produit F9-3-1 :
Le composé F9-3-1 est caractérisé par une couleur noire sous lumière UV 254 nm et une couleur
rose après révélation par l’acide sulfurique.
L’étude simultanée des spectres de RMN 13C (Spectre 2), DEPT 135 (Spectre 3) et DEPT 90
(Spectre 4) du composé F9-3-1 montre la présence de 15 atomes de carbone que nous pouvons
répartir comme suit:
- 3 carbones quaternaires dont:
• 1 à δ =179,0 ppm caractéristique d’un carbonyle d’une γ-lactone sesquiterpénique
α,β-saturée
• 1 à δ =143,9 ppm attribuable à un carbone éthylénique
• 1 à δ = 40,2 ppm attribuable à un carbone hybridé sp3 et non oxygéné
- 6 groupements CH dont:
• 1 éthylénique à δ =146,2 ppm
• 1 à δ =77,7 ppm (oxygéné) caractéristique d’un CH de fermeture d’une γ-lactone
• 1 oxygéné à δ = 66,6 ppm
• 3 non oxygénés à δ =57,2; 49,4 et 39,9 ppm
- 4 groupements CH2 dont :
• 2 éthyléniques à δ =110,2 et 109,8 ppm
• 1 oxygéné à δ = 64,3 ppm
• 1 non oxygéné à δ = 47,8 ppm
- 2 groupements CH3 à δ = 16,8 et 12,2 ppm
Chapitre IV Résultats et discussion
56
Spectre 2: RMN 13C (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1.
Spectre 2-1: RMN 13C (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).
C-9 C-7
Chapitre IV Résultats et discussion
57
Spectre 2-2: RMN 13C (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).
Spectre 2-3: RMN 13C (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).
C-14
C-10
C-12
C-1 C-6
C-8
C-15
C-4
C-2C-3 C-5
C-11 C-13
Chapitre IV Résultats et discussion
58
Spectre3-1 : DEPT 135 (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1.
Spectre 3-2: DEPT 135 (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).
C-1 C-13
C-14 C-11
C-7 C-5 C-8
C-6
C-15 C-9 C-2C-3
C-3 C-2
Chapitre IV Résultats et discussion
59
Spectre 4: DEPT 90 (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1.
Un décompte de l’ensemble des noyaux formant ces groupements mène à une formule brute
partielle de C15H20O4. Comme cette molécule ne comporte que 15 atomes de carbone, cela
suppose qu’ils sont tous engagés dans le squelette sesquiterpénique, par conséquent, les deux
groupements CH2 et CH oxygénés précedemment signalés, sont porteurs de groupements
hydroxyles. Cette observation mène à une molécule de formule brute totale C15H22O4
comportant 5 insaturations. Comme elle comporte une fonction lactone et deux doubles
liaisons, il en résulte que cette lactone sesquiterpénique admet un squelette monocyclique.
L’éxamen du spectre RMN 1H (Spectre 5) montre un singulet d’intégration 3H à δ =1,05
ppm, cette donnée ajoutée à la présence du carbone quaternaire à δ = 40,2 ppm, oriente vers
une structure portant un méthyle angulaire. Comme il s’agit d’un squelette sesquiterpénique
monocyclique, il ne peut être que de type élémanolide. Cette hypothèse est confortée par la
présence d’un CH éthylénique résonant sous forme d’un doublet de doublets (J = 18,0, 9,0
Hz) à δ = 5,76 ppm (δC = 146,2 ppm) attribuable à H-1, la presence d’un CH2 (δC =109,8
ppm) éthylénique résonant sous forme de deux doublets larges, le premier à δ = 4,91 ppm (J
= 9,0 Hz); le second à δ = 4,87 ppm (J = 18,0 Hz). Ces deux noyaux montrant un couplage
cis et un couplage trans avec le CH éthylénique précédent sont attribuable à H-2 et H-2’
C-6C-8
C-5
C-7
C-11 C-1
Chapitre IV Résultats et discussion
60
respectivement. Le squellette élémane est également apuyé par la présence du groupement
CH2 (δC =110,2 ppm) résonant sous forme de deux singulets larges à δ = 5,29 ppm et
δ = 4,72 ppm attribuables à H-3 et H-3’. Ce spectre montre également un triplet à δ = 4,30
ppm (J = 12,0 Hz) attribuable au CH de fermeture de la γ-lactone (δC = 77,7 ppm). La
multiplicité de ce signal permet son attribution à H-6 et mène par conséquent à une lactone
sesquiterpénique de type élémanolide fermée en C-6. Par ailleurs ce spectre montre un
système AB à δ = 3,96 et 3,92 ppm (J = 15,0 Hz) attribuable, vu la multiplicité, à H-15 et
H-15’ respectivement, la valeur des déplacements chimiques de ces noyaux confirment bien
la présence d’un groupement hydroxyle en C-15. Le fait que cette lactone soit de type
élémanolide permet l’attribution du doublet à δ = 2,21 ppm (J = 12,0 Hz) à H-5, le doublet à
δ =1,24 ppm (J = 6,0 Hz) à H-13, le doublet de quadruplets à δ = 2,63 ppm (J = 15,0; 6,0 Hz)
à H-11, le multiplet à δ =1,64 ppm à H-7. A ce stade de notre étude structurale, il ne reste
plus qu’à placer le 2ème groupement hydroxyle, lequel ne peut être qu’en position C-8 ou en
position C-9.
En effet, toujours sur le spectre de RMN 1H, on relève un signal sous forme de triplet à
δ = 1,55 ppm (J = 12,0 Hz) partiellement recouvert par un autre signal sous forme de doublet
large à δ = 1,49 ppm (J = 12,0 Hz). Les multiplicités et les valeurs des constantes de
couplage dans ces signaux supposent une interaction de couplage géminal et une interaction
de couplage vicinal de type axial-axial dans le premier signal et une interaction de couplage
géminal et une interaction de couplage vicinal de type équatorial-axial dans le second signal.
Ces conditions ne peuvent être satisfaites que si le groupement OH est en position C-8 .Par
conséquent le premier signal est attribué à H-9 axial ou H-9α et le second signal est attribué à
H-9 équatorial ou Η−9β.
Chapitre IV Résultats et discussion
61
Spectre 5: RMN 1H (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1.
Spectre 5-1: RMN 1H (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).
H-1
H-3
H-14
H-13
H-5 H-7 H-9α
H-9β
Chapitre IV Résultats et discussion
62
Spectre 5-2: RMN 1H (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).
Spectre 5-3: RMN 1H (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).
H-3’
H-6
H-11
H-15 H-15’
H-8 H-5
H-2 H-2’
Chapitre IV Résultats et discussion
63
La combinaison de l’ensemble de ces données mène à la formule partiellement plane reportée
dans le schéma 29.
O
O
OH2
1
34
56 7
89
10
14
1113
12CH2OH15
Schéma 29: Structure partiellemnt plane du composé F9-3-1.
Cette molécule renferme 6 centres asymétriques qui sont: C-10, C-5, C-6, C-7, C-8, et C-11.
- La stéréochimie de C-10 est déduite de la valeur du déplacement chimique du CH3-14 qui lui
confère une orientation β.
− La stéréochimie de C-5, C-6 et C-7 est déduite des valeurs des constantes de couplage relevées
dans les signaux de H-5, H-6 qui montrent des interactions trans diaxiales entre H-5, H-6 et H-6,
H-7. Ceci confère des orientations α pour H-5, β pour H-6 et α pour H-7.
− La stéréochimie de C-8 est déduite de la valeur de la constante de couplage relevée dans le
signal de H-9 axial (orientation α) qui montre une interaction de couplage vicinal de type axial-
axial, orientant ainsi vers une stéréochimie β−H-8.
- La stéréochimie de C-11 est déduite du signal de H-11 (dq, J = 15,0; 6,0 Hz), où il apparait
clairement que H-11 et H-7 admettent une disposition trans, orientant ainsi vers une stéréochimie
β-H-11.
Ces dernières informations mènent à la structure finale du composé F9-3-1 reportée dans le
schéma 30 , elle est connue sous le non de melitensine et a été isolée et décrite de Centaurea
melitensis [117 ] et de Centaurea nicaeensis All [115].
Chapitre IV Résultats et discussion
64
L’ensemble des données spectroscopiques de ce composé est reporté dans les tableaux 13 et 14.
O
O
OH2
1
34
56 7
89
10
14
1112CH2OH15
H
H
CH3
Schéma 30: Structure finale du composé F9-3-1, La melitensine.
H Multiplicité J (Hz) δ(ppm)
1
2’
2
3’
3
5
6
7
8
9α
9β
11
13
14
15’
15
dd
d
d
s
s
d
t
m
m
t
dl
dq
d
s
d
d
18.0 ;9.0
18.0
9.0
/
/
12.0
12.0
/
/
12.0
12.0
15.0; 6.0
6.0
/
15.0
15.0
5.76
4.87
4.91
4.72
5.29
2.21
4.30
1.74
3.83
1.55
1.49
2.63
1.24
1.05
3.92
3.96
Tableau 13: Résultats RMN 1H (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
65
C δ(ppm)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
146.2
109.8
110.2
143.9
57.2
77.7
49.4
66.6
47.8
40.2
39.9
179.0
12.2
16.8
64.3
Tableau 14: Résultats RMN 13 C (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
66
IV-2-Identification du produit F10-1:
La fluorescence noir-violette de ce produit sous la lumière ultra-violette (365nm) est
caractéristique d’une flavone ou d’un flavonol substitué en position 3.
Le comportement chromatographique indiqué par les valeurs du Rf dans les deux systèmes SI et
SII indique que le composé est un aglycone
SI : Toluène / Méthanol / Méthyléthylcétone (4:3:3)
SII : H2O / MeOH / Méthyléthylcétone / Acétylacétone (13:3:3:1)
La fluorescence noir-violette et la valeur de la longueur d’onde d’absorption maximale de la
bande I dans le méthanol (λ = 365 nm), sur le spectre UV (Spectre 6) sont caractéristiques d’une
flavone.
L’effet bathochrome de la bande I (+55 nm) après addition de NaOH par rapport au spectre
méthanolique avec une augmentation de l’intensité d’absorbtion, oriente vers la présence d’un
OH libre en position 4’. L’apparition d’une nouvelle bande à λmax = 327 nm indique la présence
d’un OH libre en position 7. Ceci est confirmé par l’effet bathochrome de la bande II (∆λ = +6
nm) par rapport au spectre pris dans le MeOH observé sur le spectre après addition de NaOAc.
La comparaison du spectre enregistré en présence de HCl +AlCl3 par rapport au spectre dans le
MeOH montre un effet bathochrome de la bande I (∆λ = +38 nm) indiquant la présence d’un OH
libre en position 5.
Aucun effet bathochrome de la bande I n’est observé après addition de H3BO3 en présence de
NaOAc par rapport au spectre dans le méthanol, ce qui indique l’absence de systèmes ortho di-
OH sur le noyau A et le noyau B. Cette hypothèse est confirmée par l’étude du spectre en
présence de AlCl3 dont les longueurs d’onde d’absorption maximale restent inchangées après
addition de HCl.
Systèmes SI SII
Rf 0,55 0,03
Chapitre IV Résultats et discussion
67
Ces résultats rassemblés dans le tableau 15 mènent à la structure partielle reportée dans le
schéma 31 avec R1, R2, R3, R4, R5 et R6 différents de OH.
O
OH
R4
R6
R5
R3
R1
R2
HO
OH O
H
2
34
5
6
7
8
2'3'
4'
5'
6'
Schéma 31: Structure partielle du composé F10-1
.
250 300 350 400 450 500 5500,0
0,2
0,4
0,6
0,8
F10+ MeOH
Abso
rban
ce
Longueur d'onde (nm)
250 300 350 400 4500,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
F10+MeOHF10+MeOH+NaOHF10+MeOH+NaOH+5mn
Abs
orba
nce
Longueur d'onde (nm)
250 300 350 400 4500,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
F10+MeOHF10+MeOH+AlCl3F10+MeOH+AlCl3+HCl
Abso
rban
ce
Longueur d'onde (nm)250 300 350 400 450
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
F10+MeOHF10+MeOH+NaOAcF10+MeOH+NaOAc+H3BO3
Abs
orba
nce
Longueur d'onde (nm)
Spectre 6 : Série spectrale UV du composé F10-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
68
Réactifs Bande I Autres bandes Bande II
MeOH 338 / 269
NaOH 393 327 275
AlCl 3 380 350 302 275
AlCl 3+ HCl 376 342 300 277
NaOAc 366 300 275
NaOAc+H3BO3 341 / 270
Spectre stable avec NaOH après 5min
Tableau 15: Données de la série spectrale UV(λmax nm) du composé F10-1.
L’examen du spectre proton (Spectre 7) montre la présence de deux doublets (J = 6,9 Hz)
d’intégration 2H chacun, caractéristiques d’un noyau B oxygéné en position 4'. Le premier à
δ=7,96 ppm est attribué aux noyaux H2' et H6'; le second à δ = 7,04 ppm est attribué aux noyaux
H3' et H5' [118].
Ce spectre renferme également un signal sous forme de singulet à δ = 6,64 ppm, attribuable au
proton en position C-3 et deux autres doublets formant un système AM (J = 2,1 Hz) à δ = 6,55
ppm et δ= 6,26 ppm, attribuables à H8 et H6 respectivement.
Ces données consignées dans le tableau 16 mènent à la structure finale reportée dans le schéma
32 soit la 4',5,7-trihydroxy flavone, connue sous le nom d’apigénine. Cette molécule est
commune pour le genre Centaurea (Compositae) [37,119].
Chapitre IV Résultats et discussion
69
O
OH
H
H
H
H
H
H
HO
OH O
H
2
34
5
6
7
8
2'3'
4'
5'
6'
Schéma 32: Structure finale du composé F10-1 (Apigénine).
δ(ppm) Intégration Multiplicité J (Hz) Attribution
7 ,96 2H d 6,9 H-2’ ; H-6’
7,04 2H d 6,9 H-3’ ; H-5’
6,64 1H s / H-3
6,55 1H d 2,1 H-8
6,26 1H d 2,1 H-6
Tableau 16: Données de la RMN (Acétone-d6, 250 MHz) du composé F10-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
70
Spectre 7: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 250 MHz) du composé F10-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
71
Spectre 7-1: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 250 MHz) du composé F10-1 (Etalement).
H-2’, H-6’ H-3’ , H-5’ H-3
H-8 H-6
Chapitre IV Résultats et discussion
72
IV-3- Identification du produit F16-1 :
Le spectre de masse en mode ESI positif à haute résolution de ce composé (Spectre 8), donne un
pic quasimoléculaire de masse exacte 483,0894 Da correspondant à la formule brute
C22H20O11Na (calculée 483.09033). Ce résultat mène à une molécule de formule brute
C22H20O11, de masse 460 Da, comportant 13 insaturations.
.
Spectre 8: Spectre SMHR ESI du composé F16-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
73
La fluorescence sous la lumière UV (365 nm) de ce composé est noir-violette, indiquant une
structure de type flavone ou flavonol substitué en position 3.
L’examen du spectre de RMN 1H (Spectre 9) montre la présence de:
- Un singulet à δ = 13, 02 ppm, attribuable à un OH en C-5
- Deux doublets d'intégration 1H chacun, formant un système AM à δ = 6,82 ppm et δ = 6,46
ppm, (J = 2,2 Hz) caractéristiques des protons H-8 et H-6 respectivement, du noyau A d’un
flavonoïde.
- Deux doublets d'intégration 2H chacun, formant un système AM à δ = 7,96 ppm et δ = 7,04
ppm, (J = 8,9 Hz) attribuables à H-2’, H-6’ et à H-3’, H-5’ respectivement, indiquant ainsi une
oxygénation du noyau B en position 4’ d’un flavonoïde.
- un signal à δ = 6,70 ppm, d'intégration 1H sous forme d'un singulet attribuable au H-3, ce qui
oriente vers la structure d'une flavone.
- Un doublet à δ = 5,36 ppm (J = 7,4 Hz), attribuable au proton anomérique d’un sucre relié à
l’aglycone, d’après la valeur de son déplacement chimique, par un pont oxygène. D’après la
valeur de la constante de couplage de ce proton anomérique avec son voisin en C-2’’, cette entité
pourrait dériver soit d’un glucosyle soit d’un galactosyle avec une configuration β du carbone
anomérique.
L’ensemble de ces données mène à la structure partielle reportée dans le schéma 33 qui est un
hétéroside ayant comme génine l’apigénine.
O
O
H
H HH
H
HH O-sucre
OH
OH
(Sucre-O)
(OH)1
2
356
2'
6'
4'
Schéma 33: Structure partielle du composé F16-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
74
Ce spectre montre également:
- Un singulet à δ = 3,73 ppm, attribuable à un groupement methoxyle.
- Trois doublets d’intégration 1H chacun à δ = 4,89 ppm (J = 4,0 Hz), δ = 4,65 ppm (J = 4,8 Hz)
et δ = 4,58 ppm (J = 4,0 Hz). Les valeurs des constantes de couplage de ces noyaux sont
caractéristiques de couplages vicinaux de protons de groupements hydroxyles avec des
groupements CH. Ces observations orientent vers la présence de trois groupements hydroxyles
dans l’entité sucre. Cette hypothèse est appuyée par la présence d’un triplet de doublets
d’intégration 1H à δ = 3,63 ppm (J = 8,9; 4,0 Hz) et de deux doublets de doublets dédoublés à δ
= 3,58 ppm (J = 8,9; 7,4; 4,0 Hz) et à δ = 3,72 ppm (J = 9,6; 8,9 ; 4,8 Hz), ce dernier signal se
trouve partiellement recouvert par celui du methoxyle précédemment signalé. D’après les valeurs
des constantes de couplage de ces noyaux, il apparait clairement que ces signaux sont
attribuables aux trois protons des trois groupements CH porteurs des trois hydroxyles.
- Un doublet à δ = 4,27 ppm, J = 9,6 Hz, d’intégration 1H. D’après les résultats précedents, ce
CH doit faire partie du cycle de l’entité sucre.
Spectre 9: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
75
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
0.79
62
Inte
gral
13.0
199
13.0
155
(ppm)
13.00513.01013.01513.02013.02513.03013.035
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Spectre 9-1: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
2.00
40
Inte
gral
3210
.37
3194
.08
3191
.19
3189
.11
3184
.38
3182
.25
3179
.39
(ppm)
7.907.927.947.967.988.008.02
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Spectre 9-2: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1(Etalement).
H-2’ , H-6’
OH en C-5
Chapitre IV Résultats et discussion
76
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
2.03
69
Inte
gral
2825
.63
2822
.72
2820
.63
2815
.88
2813
.80
2810
.87
(ppm)
7.007.027.047.067.087.10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Spectre 9-3: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
1.00
00
0.98
56
Inte
gral
2732
.34
2730
.42
2728
.21
2683
.45
2681
.88
(ppm)
6.686.706.726.746.766.786.806.826.846.86
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Spectre 9-4: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1(Etalement).
H-3’, H-5’
H-8
H-3
Chapitre IV Résultats et discussion
77
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
0.97
00
Inte
gral
2587
.95
2586
.58
2584
.40
(ppm)
6.446.456.466.476.486.49-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Spectre 9-5: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
0.27
04
0.97
40
Inte
gral
2252
.89
2149
.71
2142
.36
2137
.16
(ppm)
5.305.355.405.455.505.555.605.655.70
0.0
0.5
1.0
1.5
Spectre 9-6: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1(Etalement).
H-6
H-1’’
Chapitre IV Résultats et discussion
78
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
0.27
04
0.97
40
0.91
85
0.81
96
0.89
36
0.98
51
0.23
250.
1389
3.80
57
2.21
93
Inte
gral
5.63
04
5.37
255.
3542
5.34
12
4.89
034.
8801
4.65
274.
6407
4.58
714.
5772
4.28
294.
2589
3.81
273.
7756
3.72
80
3.63
613.
6258
3.61
453.
6049
3.59
703.
5884
3.57
83
(ppm)
3.54.04.55.05.5
0.0
0.5
1.0
1.5
Spectre 9-7: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1(Etalement).
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
0.91
85
0.81
96
0.08
97
0.89
36
Inte
gral
1956
.77
1952
.69
1861
.70
1856
.88
1851
.75
1846
.75
1835
.44
1831
.48
(ppm)
4.554.604.654.704.754.804.854.90
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Spectre 9-8: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
H-1’’ 3 groupements –OH du sucre
H-5’’
-OCH3
OH-4’’
OH-3’’
OH-2’’
Chapitre IV Résultats et discussion
79
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
0.98
51
0.04
53
0.05
95
0.05
57
Inte
gral
1713
.73
1704
.13
1699
.76
1690
.08
1680
.13
1679
.18
1673
.00
1672
.10
(ppm)
4.164.184.204.224.244.264.284.30
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Spectre 9-9: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1(Etalement).
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
0.23
25
0.13
89
3.80
57
Inte
gral
1525
.58
1510
.72
1502
.38
1497
.55
1497
.15
1491
.68
1490
.32
1489
.78
1489
.36
1488
.91
1488
.50
1488
.13
1484
.05
1483
.68
1479
.13
1478
.87
(ppm)
3.683.703.723.743.763.783.803.823.84
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Spectre 9-10: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1(Etalement).
H-5’’
H-4’’
Chapitre IV Résultats et discussion
80
H1 - CD3COCD3/TMS
H.L. F16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
3.80
57
2.21
93
1479
.13
1478
.87
1463
.83
1459
.74
1454
.91
1450
.79
1446
.26
1443
.33
1442
.89
1442
.45
1442
.07
1439
.25
1438
.77
1435
.84
1431
.80
1430
.26
1427
.12
1422
.96
1422
.63
1416
.89
(ppm)
3.543.563.583.603.623.643.663.683.70
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Spectre 9-11: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1(Etalement).
L’examen du spectre COSY (1H 1H) (Spectre 10) permet la localisation H-2’’du sucre (ddd) à
δ = 3,58 ppm (J = 8,9; 7,4 ; 4,0 Hz), grâce à sa corrélation avec le proton anomérique H-1’’.
Cette attribution de H-2’’ permet la localisation de OH-2’’ (d) à δ = 4,89 ppm (J = 4,0 Hz) et
H-3’’ (td) à δ = 3,63 ppm (J =8,9 ; 4,0 Hz). L’attribution de ce dernier noyau permet celle de
OH-3’’ (d) à δ = 4,58 ppm (J = 4,0 Hz) et celle H-4’’ (ddd) à δ = 3,72 ppm (J =9,6; 8,9 ; 4,8 Hz).
Toujours sur le même spectre, H-4’’ permet de localiser OH-4’’(d) à δ = 4,65 ppm (J = 4,8 Hz)
et montre une corrélation avec le noyau relatif au signal sous forme de doublet à δ = 4,27 ppm,
J = 9,6 Hz, d’intégration 1H. Ce noyau ne peut être que H-5’’ de l’entité sucre comme
précedemment signalé. La multiplicité de ce dernier signal suppose l’absence de protons en
position C-6’’ du sucre; la valeur de sa constante de couplage (9,6 Hz) indique une interaction de
type axiale-axiale entre ce noyau et son voisin H-4’’. Cette observation oriente vers une entité
sucre dérivée du glucose. Ceci est apuyé par les valeurs des constantes de couplage relevées dans
les signaux de H-3’’ et H-4’’.
H-3’’ H-2’’
Chapitre IV Résultats et discussion
81
Spectre 10: Spectre COSY (1H 1H) (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.
Spectre 10-1 : Spectre COSY (1H 1H) (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
H-1’’
OH-2’’
OH-4’’ OH-3’’ H-5’’
H-3’’ H-4’’ H-2’’
H-5’’,H-4’’
OH-3’’,H-3’’
OH-4’’,H-4’’
OH-2’’,H-2’’
H-1’’,H-2’’
Chapitre IV Résultats et discussion
82
Le spectre RMN 13C (Spectre 11) confirme la présence de ces éléménts et montre également un
carbone quaternaire à δ = 169,7 ppm. La valeur de son déplacement oriente vers un carbonyle
d’ester.
C13 - DÚc. total H1
CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
206.
1769
206.
1683
206.
1598
206.
1512
206.
1426
206.
1340
206.
1250
183.
2986
169.
6854
165.
6055
163.
9160
163.
0607
162.
0925
158.
3751
129.
4051
123.
1799
116.
9330
106.
9407
104.
3692
101.
0616
100.
4049
95.6
051
76.9
538
76.4
821
74.2
424
72.5
697
55.4
990
52.4
559
30.4
216
30.2
293
30.0
366
29.8
443
29.6
520
29.4
598
29.2
670
0.00
01
(ppm)
0 50 100 150 200
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Spectre 11 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1 .
C13 - DÚc. total H1
CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
183.
2986
(ppm)
183.20183.30183.40
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
169.
6854
169.
1257
165.
6055
165.
0332
163.
9160
163.
0607
162.
0925
158.
3751
(ppm)
158160162164166168170-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Spectre 11-1: Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1(Etalement).
C-9
C-5
C-4’ C-7
C-2
C-6’’
C-4
Chapitre IV Résultats et discussion
83
C13 - DÚc. total H1
CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
129.
4051
123.
1799
120.
8301
116.
9330
(ppm)
116118120122124126128130
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Spectre 11-2 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
C13 - DÚc. total H1
CD3COCD3/TMS
H.L. F16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
76.9
538
76.4
821
74.2
424
72.5
697
(ppm)
72737475767778
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Spectre 11-3 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1(Etalement).
C-3’’ ,C-5’’
C-1’
C-2’ ;C-5’
C-4’’C-2’’
C-5’’
C-3’’
Chapitre IV Résultats et discussion
84
C13 - DÚc. total H1
CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
55.4
990
52.4
559
(ppm)
52.052.553.053.554.054.555.055.556.0
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Spectre 11-4 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1(Etalement).
C13 - DEPT 135
CD3COCD3/TMS
H.L. F 16
produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg
104.
3689
101.
0560
100.
4025
95.6
021
78.2
174
76.9
514
76.4
807
74.2
414
72.5
707
(ppm)
70 75 80 85 90 95100105 -5
0
5
10
15
Spectre 11-5 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
OMe
C-4’’
C-2’’
C-5’’
C-3’’
C-8
C-6
C-1’’C-3
Chapitre IV Résultats et discussion
85
La présence du carbonyle d’ester est vérifiée par la présence d’une tache de corrélation sur le
spectre relatif à l’expérience HMBC (Spectre 12), entre le carbone de ce carbonyle et les protons
du groupement methoxyle précedemment signalé. Ce spectre (HMBC) montre également une
tache de corrélation entre le carbone de ce carbonyle et le proton H-5’’. Cette donnée permet
d’attribuer le carbone de ce carbonyle au C-6’’ de l’entité sucre qui est par conséquent est un
groupement 6-methyl glucuronyle. Toujours sur le spectre de l’expérience HMBC, le proton du
OH-5 permet la localisation de C-5 à δ = 162,1 ppm et le C-10 à δ = 106,9 ppm grâce aux trois
taches de corrélation observées entre ce noyau et les protons H-8, H-6 et H-3.
Les protons H-6 et H-8 montrent des taches de corrélation avec le carbone quaternaire oxygéné à
δ = 163,9 ppm, ce qui permet l'attribution de ce dernier au C-7. Par ailleurs et toujours sur le
même spectre, le proton H-8 montre une autre tache de corrélation avec le carbone à δ = 158,4
ppm qui ne peut être que C-9 et le proton H-3 mène à la localisation de C-1’ à δ = 123,2 ppm.
Cette attribution est confirmée par la corrélation observée entre ce noyau et les protons H-3’ et
H-5’, de même H-3, H-2’ et H-6’ permettent l’attribution de C-2 à δ = 165,6 ppm. Les protons
H-3’, H-5’, H-2’ et H-6’ mènent à la localisation de C-4’ à δ = 163,1 ppm.
Spectre 12: Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
86
Spectre 12-1: Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
Spectre 12- 2 : Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
C-5,H(OH en 5)
C-6’’,H(OMe) C-6’’, H-5’’
C-10, H-5
C-6, H-5
Chapitre IV Résultats et discussion
87
Spectre 12-3 : Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
Spectre 12-4 : Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
C-1’ ,H-3C-1’ ,(H-3’,H-5’)
(C-3’, C- 5’),(H-3’,H-5’)
C-10,H-8
C-6,H-8
C-4’ ,(H-2’,H-6’)
C-2 ,(H-2’,H-6’)
C-4’ ,(H-3’,H-5’) C-9 , H-8
C-7, H-8C-2 ,H-3
C-4 ,H-3
C-7 ,H-6
C-8 ,H-6
C-5 ,H-6
C-10 ,H-3 C-10 ,H-6
Chapitre IV Résultats et discussion
88
Spectre 12-5: Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
Toujours sur le spectre de l’expérience HMBC, le proton anomérique du glucuronate de methyle
montre une tache de corrélation nette avec le carbone C-7 (δ = 163,9 ppm).
Spectre 12-6: Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
C-7, H-1’’
C-4’, (H-2’, H-6’)
C-2, ,(H-2’,H-6’)
(C-2’, C- 6’),(H-2’,H-6’)
Chapitre IV Résultats et discussion
89
La présence de cette corrélation entre le C-7 et le proton anomérique, indique de l’entité sucre est
placée en C-7, ce qui mène à la 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine reportée dans le schéma 34 .
Cette molécule est commune pour le genre Centaurea (Compositae) [27, 120].
O
O
OH
O
OH
O
OHOHOH
OO
CH3
Schéma 34: Structure du composé F16-1, 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine
L'examen du spectre HSQC (Spectre 13 ) permet de localiser C-2’ et C-6' à δ = 129,4 ppm, C-
3’et C-5' à δ = 116,9 ppm, C-3 à δ = 104,4 ppm, C-6 à δ = 100,4 ppm, C-8 à δ = 95,6 ppm, C-1"
à δ = 101,1 ppm, C-2’’ à δ = 74,2 ppm, C-3’’ à δ = 77,0 ppm, C-4’’ à δ = 72,6 ppm, C-5’’ à δ =
76,5 ppm et le carbone du groupement méthoxyle à δ = 52,5 ppm.
Spectre 13: Spectre HSQC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
H-6’,H-2’ H-5’,H-3’
Chapitre IV Résultats et discussion
90
Spectre 13-1: Spectre HSQC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
C-6
’,C-2
’ C
-5’,C
-3’
C-3
C-1
’’
C-8
C
-6
H-8H-3 H-6 H-1’’
H-3’ , H-5’ H-2’ , H-6’
Chapitre IV Résultats et discussion
91
Spectre 13-2: Spectre HSQC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).
C-3
’’
C-5
’’C
-2’’
O
Me
C-4
’’
C-4’’- H-4’’
C-2’’- H-2’’
C-3’’- H-3’’
H-3’’ H-4’’ H-2’’
H-5’’
OMe
Chapitre IV Résultats et discussion
92
L’ensemble des données spectroscopiques de ce composé est reporté dans les tableaux 17 et 18.
δ( ppm) Multiplicité Intégration J (Hz) Attribution
13 ,02 s 1H / OH en C-5
7,96 d 2H 6 ,9 H-2’ ; H-6’
7,04 d 2H 6,9 H-3’ ; H-5’
6,82 d 1H 2,2 H-8
6,70 s 1H / H-3
6,46 d 1H 2,2 H-6
5,36 d 1H 7,4 H-1’’
4,27 d 1H 9,6 H-5’’
3,73 s 3H / -OCH3
4,89 d 1H 4,0 -OH2’’
4,65 d 1H 4,8 -OH4’’
4,58 d 1H 4,0 -OH3’’
3,63 td 1H 8,9 ; 4,0 H-3’’
3,58 ddd 1H 8,9 ; 7,4 ; 4,0 H-2’’
3,72 ddd 1H 9,6 ; 8,9 ; 4,8 H-4’’
Tableau 17 : Résultats RMN 1H (δ ppm, Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
93
C δ (ppm) 2 165,6
3 104,4
4 183,3
5 162,1
6 100,4 7 163,9 8 95,6 9 158,4 10 106,9 1’ 123,2
2’, 6’ 129,4 3’, 5’ 116,9
4’ 163,1 1’’ 101,1 2’’ 74,2 3’’ 77,0 4’’ 72,6 5’’ 76,5 6’’ 169,7
-OCH 3 52,5
Tableau 18 : Résultats RMN 13 C(δ ppm, Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.
Chapitre IV Résultats et discussion
94
IV-4-Identification du produit F16-4 :
La fluorescence sous la lumière UV (365 nm) de ce composé est noir-violette, indiquant une
structure de type flavone ou flavonol substitué en position 3.
La comparaison du spectre de RMN 1H (500 MHz) enregistré dans l’acétone –d6 de ce produit
(Spectre 14) avec celui du produit F16-1 révèle qu’ils sont très similaires notament la présence des
signaux:
- Un singulet à δ = 13, 01 ppm, attribuable à un OH en C-5.
- Deux doublets d'intégration 1H chacun, formant un système AM à δ = 6,82 ppm et δ = 6,47
ppm, (J = 2,2 Hz) caractéristiques des protons H-8 et H-6 respectivement, du noyau A d’un
flavonoïde.
- Deux doublets d'intégration 2H chacun, formant un système AM à δ = 7,96 ppm et δ = 7,05
ppm, (J = 8,8 Hz) attribuables à H-2’, H-6’ et à H-3’, H-5’ respectivement, indiquant ainsi une
substitution para du noyau B oxygéné en position 4’ d’un flavonoïde.
- un signal à δ = 6,70 ppm, d'intégration 1H sous forme d'un singulet attribuable au H-3 , ce qui
oriente vers la structure d'une flavone.
L’ensemble de ces données relatives au noyau flavonique oriente vers une génine à squelette
apigénine.
La portion du spectre RMN 1H relative au sucre de F16-4 est également très similaire à celle de
F16-1. On y observe en effet:
- Un doublet à δ = 5,36 ppm (J = 7,4 Hz) d’intégration 1H, attribuable au proton
anomérique du sucre.
- Un doublet à δ = 4,26 ppm (J = 9,6 Hz) d’intégration 1H, attribuable au proton H-5’’.
- Un singulet d’intégration 3H à δ = 3,74 ppm supperposé avec le signal central d’un dd
d’intégration 1H (J = 9,6 ; 9,1 Hz). Ce singulet est attribuable au groupement methoxyle
du glucuronyle de methyle, le dd centré sur ce signal (δ = 3,74 ppm) est attribuable au
proton H-4’’ du sucre..
Chapitre IV Résultats et discussion
95
- Un triplet (J = 9,1 Hz) et un doublet de doublets (J = 9,1; 7,4 Hz) présentant un effet de
toit, à δ = 3,64 et δ = 3,59 ppm respectivement, attribuables d’après l’ensemble de ces
observations aux protons H-3’’ et H-2’’respectivement.
Ces données et surtout les valeurs des constantes de couplage sont un faveur d’une entité sucre
de type 6’’-methylglucuronyle.
Spectre 14 : Spectre RMN1H (CD3CO CD3 , 500 MHz) du composé F16-4.
OH
en 5
Chapitre IV Résultats et discussion
96
Spectre 14-1: Spectre RMN1H (CD3COCD3, 500 MHz) du composé F16-4 (Etalement).
L’examen simultané des spectres de RMN 13C (Spectre 15) et HSQC (Spectre 16) permet de
localiser aisemment les atomes de carbone du noyau flavonique à:
- δ = 182,4 ppm C-4
- δ = 128,5 ppm C-2’ et C-6’
- δ = 122,3 ppm C-3’ et C-5’
- δ = 103,5 ppm C-3
- δ = 99,6 ppm C-6
- δ = 94,7 ppm C-8
De même, ce spectre permet de localiser aisemment les atomes de carbone du groupement 6’’-
methylglucuronyle notamment:
- à δ = 100,2 ppm C-1’’
- à δ = 76,1ppm C-3’’
- à δ = 75,6 ppm C-5’’
H-2’ ,H-6’ H-3’ ,H-5’
H-1’’H-6
H-3
H-8 H-5’’
OMe
Chapitre IV Résultats et discussion
97
- à δ = 73, 4 ppm C-2’’
- à δ = 71,7 =ppm C-4’’
- à δ = 168,8 =ppm C-6’’
- à δ = 51,5 =ppm OCH3 en C-6’’
Spectre 15: Spectre RMN13C (CD3CO CD3 , 125 MHz) du composé F16-4.
Spectre15-1: Spectre RMN13C (CD3CO CD3 , 125 MHz) du composé F16-4 (Etalement).
Chapitre IV Résultats et discussion
98
Spectre 15-2: Spectre RMN13C (CD3CO CD3 , 125 MHz) du composé F16-4 (Etalement).
Spectre 16 : : Spectre HSQC (CD3CO CD3 , 400 MHz) du composé F16-4
Chapitre IV Résultats et discussion
99
L’ensemble de ces données oriente vers une structure de type apigénine portant un OH libre en
position C-5 et un groupement 6’’-methylglucuronyle en position C-7 ou en position C-4’.
Le chromatogramme (schéma 35) de la fraction F16 réalisé sur plaque analytique de gel de silice
éluée par le système CHCl3/MeOH (9:1), montre clairement la présence des deux produits F16-1
F16-4 à coté de deux autre produits minoritaires
Schéma 35: La fraction F16 éluée par le système CHCl3/MeOH (9:1)
Le fait que les Rf de ces deux produits soient différents indique que ces deux produits sont
différents. Comme il s’agit d’une apigénine comportant un OH libre en position C-5 dans les
deux cas et comme il a été montré sans aucune ambiguité que le composé F16-1 porte le
substituant 6’’-methylglucuronyle en C-7, le composé F16-4 est par conséquent la 4’-(6’’-
methylglucuronyl) apigénine.
La structure de ce composé et notamment la position de l’entité sucre sur le squelette flavonique
a été confirmée par l’analyse du spectre de l’expérience HMBC (Spectre 17) qui montre en effet,
une correlation entre les protons H-3’, H-5’ et H-2’, H-6’ et un carbone quaternaire à
δ = 161,2 ppm qui ne peut être que le C-4’. Par ailleurs ce spectre montre clairement une
corrélation nette entre ce carbone (C-4’) et le proton anomérique (δH = 4,26 :δC = 100,2). Ces
données confortent la structure de la 4’-(6’’-methylglucuronyl)apigénine reportée dans le schéma
36. Cette molécule est nouvelle et n’a par conséquent jamais été décrite dans la littérature.
Le spectre de l’expérience HMBC de ce prduit a également permis l’attribution des autres
carbones quaternaires notamment :
Chapitre IV Résultats et discussion
100
*C-2 à δC = 164,7 ppm grâce à sa corrélation avec H-2’, H-6’ et H-3.
*C-5 à δC = 162,2 ppm grâce à sa corrélation avec H-6.
* C-7 à δC = 163,0 ppm grâce à sa corrélation avec H-8.
* C-9 à δC = 157,5 ppm grâce à sa corrélation avec H-8.
*C-1’ à δC =122,3 grâce à sa corrélation avec H-3’, H-5’ et H-3.
*C-10 à δC = 106,1 grâce à sa corrélation avec H-6, H-8 et H-3.
O
OOH
OH
O OOHOH
O
OH O CH3
27
3
4'
1'
5
1''6''
Schéma 36: Structure finale du composé F16-4, la 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine .
Spectre 17 : : Spectre HMBC (CD3CO CD3 , 400 MHz) du composé F16-4
Chapitre IV Résultats et discussion
101
Les données de RMN 1H et 13C sont reportées dans les tableaux 19 et 20.
δ( ppm) Multiplicité Intégration J (Hz) Attribution
13 ,01 s 1H / OH en C-5
7,96 d 2H 8 ,8 H-2’ ; H-6’
7,05 d 2H 8,8 H-3’ ; H-5’
6,82 d 1H 2,2 H-8
6,70 s 1H / H-3
6,47 d 1H 2,2 H-6
5,36 d 1H 7,4 H-1’’
4,26 d 1H 9,6 H-5’’
3,73 s 3H / -OCH3
3,64 t 1H 9.1 H-3’’
3,59 dd 1H 9,1 ; 7,4 H-2’’
3,74 dd 1H 9,6 ; 9,1 H-4’’
Tableau 19: Résultats RMN 1H (δ ppm, Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-4.
Chapitre IV Résultats et discussion
102
C δ (ppm) 2 164,7 3 103,5 4 182,4 5 162,2 6 99,6 7 163,0 8 94,7 9 157,5 10 106,1 1’ 122,3
2’ , 6’ 128,5 3’, 5’ 122,3
4’ 161,2 1’’ 100,2 2’’ 73,4 3’’ 76,1 4’’ 71,7 5’’ 75,6 6’’ 168,8
-OCH 3 51,5
Tableau 20 : Résultats RMN 13 C(δ ppm, Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1
Chapitre IV Résultats et discussion
103
IV-5-Identification du produit F17-2:
L’examen du spectre RMN 1H (Spectre 18 ) montre la présence de signaux caractéristiques d’un
noyau aromatique monosubstitué dont : un signal d’integration 3H sous forme d’un multiplet à
δ = 7,45 ppm et un autre d’integration 2H sous forme également, d’un multiplet à δ = 7,60 ppm.
Le même spectre montre un ensemble de signaux caractéristiques d’un hexose notamment le
signal à δ = 4,27 ppm sous forme d’un doublet (J = 7,5 Hz) attribuable au proton anomérique
(H-1’) de l’hexose.
Deux signaux d’integration 1H chacun attribuables respectivement à H-6’a, H-6’b à δ = 3,92
ppm (dd, J = 12,0; 1,8 Hz) et δ = 3,72 ppm (dd, J = 11,7; 6,0 Hz).
-Un signal d’intégration 1H sous forme d’un singulet à δ =5,92 ppm, porté d’après le spectre
HSQC (spectre 19) par le carbone à δC = 67,5 ppm.
Un ensemble de multiplets dans l’intervalle 3,30 – 3,36 ppm attribuable aux protons 2’, 3’, 4’,5’
du substituant sucre.
Spectre 18 : Spectre RMN1H (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 .
H-2
Chapitre IV Résultats et discussion
104
Spectre 18-1: Spectre RMN1H (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).
Spectre 18-2 : Spectre RMN1H (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).
2H du noyau aromatique
3H du noyau aromatique
H-1’H-6’a H-6’b
Protons du sucre
Chapitre IV Résultats et discussion
105
L’examen du spectre de l’expérience HSQC (Spectre 19) relatif à ce composé permet de
localiser le carbone anomérique de ce sucre grâce à sa corrélation avec H-1’à δC = 101,0 ppm. La
valeur de ce déplacement chimique indique que cet hexose est relié à l’aglycone par une jonction
oxygène.
Spectre 19 : Spectre HSQC (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2.
La combinaison des analyses des spectres RMN 13C (Spectre 20) et DEPT 135 (Spectre 21)
montre la présence dans cette molécule de:
-5 groupements méthynes (CH) dont quatre d’entre eux à: δC =77,3; 76,8; 73,8;70,5 ppm, le 5ème
étant le carbone anomérique à δC =101,0 ppm.
-Un groupement méthylène (CH2) oxygéné à δC =61,8 ppm
Ces données notamment les valeurs des déplacements chimiques des carbones comparées à
celles de la littérature orientent vers un substituant de type glucosyle [72].
H-1’
C-1’
Chapitre IV Résultats et discussion
106
Les mêmes spectres montrent également la présence de:
- 1 atome de carbone quaternaire à δC = 133,8 ppm attribué à un carbone du noyau
aromatique.
- 3 groupements CH, correspondant aux autres carbones du noyau aromatique
monosubstitué notamment les C-4 et C-8 à δ = 128,0 ppm, les C-5 et C-7 à
δ = 129,2 ppm et le C-6 à δ =130,1 ppm.
Ce spectre montre également un signal correspondant à un carbone quaternaire à
δ =118,5 ppm. Le déplacement chimique de ce carbone est caractéristique du carbone d’un
groupement nitrile. La présence de ce groupement justifie l’abaissement du déplacement
chimique du groupement CH oxygéné à δ= 67,5 ppm explicable par la proximité de ce noyau
de la zone positivante de la triple liaison.de ce groupement nitrile.
L’ensemble de ces données reporté dans les tableaux 21 et 22 mène à la structure plane
reportée dans le schéma 37.
CH
CN
O-Glu
Schéma 37: Structure plane du composé F17-2
Chapitre IV Résultats et discussion
107
Spectre 20 : Spectre RMM 13C (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2.
Spectre 21-1 : Spectre DEPT 135 (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).
C-1’
C-6’
C-1
C-3 C-2
Chapitre IV Résultats et discussion
108
Spectre 21-2: Spectre RMN 13C, DEPT 135 (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).
Spectre 21-3 : DEPT 135 (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).
C-2 C-4’ C-2’
C-3’ C-5’
C-4 ,C-8 C-5 ,C-7
C-6
C-6’
Chapitre IV Résultats et discussion
109
La comparaison de nos données à celles de la littérature à permis d’établir la stéréochimie (R) du
centre asymétrique de cette molécule. En effet nos résultats sont en parfait accord avec ceux
d’une molécule naturelle isolée de Centaurea Aspera var. Subinermis [121], de Perilla
Frutescens var. Acuta [122] et d’Eucalyptus L’Hérit [123] connue sous le nom de prunasine et
reportée dans le schéma 38.
N
O
OHOHOH
HOCH2
HO
Schéma 38: Structure finale du composé F17-2 , la prunasine
1H δ (ppm) Multiplicite Integration Ј (Hz)
H-1’ 4 ,27 d 1H 7,5
H-6’a 3,92 dd 1H 12,0 ; 1,8
H-6’b 3 ;72 dd 1H 11,7 ; 6,0
H-2’, H-3’ ,H- 4’, H-5’ 3,30-3,36 m 4H /
H-4 , H-8 7,60 m 2H /
H-5, H-6, H-7 7.45 m 3H /
H-2 5.92 s 1H /
Tableau 21:Les résultats RMN1H du composé F17-2
Chapitre IV Résultats et discussion
110
13C δ(ppm)
1
2
3
4, 8
5 ,7
6
1’
2’
3’
4’
5’
6’
118,5
67,5
133,8
128,0
129,2
130,1
101.0
73, 8
76,8
70,5
77,3
61,8
Tableau 22:Les résultats RMN 13C du composé F17-2
IV-6-Conclusion :
Ainsi cette étude phytochimique, que nous avons menée sur l’isolement et la détermination des
métabolites secondaires de la phase acétate d’éthyle de l’extrait hydroéthanolique des parties
aériennes de Centaurea nicaeensis sous espèce walliana M a permis l’obtention et la
détermination structurale de cinq composés natifs qui sont:
Une flavone aglycone, l’apigénine
Deux flavones glycosylées: la 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine et la 4’-
(6’’-methylglucuronyl) apigénine
Une lactone sesquiterpénique de type élémanolide: la melitensine
Un composé cyanogénique: la prunasine
Il est important de signaler que la 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine est nouvelle et que nous
la décrivons pour la première fois dans la littérature. Une publication internationale reportant ces
résultats est en cours de soumission.
111
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119
Conclusion générale
Le but principal de notre travail est d’isoler et d’identifier les métabolites secondaires de la
phase acétate d’éthyle l’extrait hydroéthanolique de Centaurea nicaeensis variété walliana M
(Compositae). L’attention que nous avons donnée à cette plante est justifiée par le fait qu’elle
appartient au genre Centaurea, genre connu pour sa richesse en composés phénoliques
notamment les flavonoïdes, et les lactones sesquiterpéniques dont les activités biologiques
sont reconnues.
Cette étude complète les résultats préalables réalisés sur la phase chloroforme de cette
espèce.
Après extraction du matériel végétal suivi d’affrontements par des solvants de polarité
croissante (chloroforme, acétate d’éthyle, n-butanol), nos travaux de séparation et de
purification par des méthodes chromatographiques ont permis, l’isolement en l’état natif de 5
produits. Il s’agit de :
- Une flavone aglycone, l’apigénine
- Deux flavones glycosylées : la 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine et la
4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine
- Une lactone sesquiterpénique de type élémanolide : la melitensine
- Un composé cyanogénique : la prunasine
Les structures ont été établies par la combinaison des résultats des analyses physico-
chimiques notamment ceux de la RMN mono et bidimensionnelle et de la spectrométrie
de masse à haute résolution en mode ESI.
Il est important de signaler que la 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine est nouvelle et que
nous la décrivons pour la première fois dans la littérature.
Résumé
Ce travail fait partie de notre programme de recherche qui porte sur l’étude phytochimique des
plantes du genre Centaurea (Compositae). Ces espèces réputées pour leur richesse en
métabolites secondaires bioactifs.
L’étude que nous avons entreprise constitue une contribution dans ce domaine et concerne la
détermination des lactones sesquiterpéniques et des flavonoïdes de la phase acétate d’éthyle de
l’extrait hydro alcoolique des parties aériennes de Centaurea nicaeensis var. walliana M et
complète les résultats obtenus au sein de notre laboratoire concernant l’investigation de la phase
chloroforme d’où deux composés flavoniques ont été déterminés.
Après extraction des feuilles et fleurs de cette espèce, concentration et affrontements successifs
au chloroforme, à l'acétate d'éthyle et au n-butanol, l’extrait acétate d’éthyle a été soumis à la
séparation et à la purification par chromatographie sur colonne et sur couches minces de gel de
silice. Ce travail a mené à l’obtention de 5 composés en l’état pur et natif. Il s’agit de :
- Une flavone aglycone, l’apigénine
- Deux flavones glycosylées : la 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine et la
4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine
- Une lactone sesquiterpénique de type élémanolide : la melitensine
- Un composé cyanogénique : la prunasine
Les structures ont été établies par la combinaison des données de RMN1H, RMN 13C, des
expériences de la RMN bidimensionnelle, de la spectrométrie de masse et de la
spectrophotométrie UV-Vis.
Il est important de signaler que la 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine est une molécule nouvelle
et n’a par conséquent, jamais été décrite auparavant.
Summary This work belongs to our research program on the phytochemical study of Centaurea genus
(Compositae). The species of this genus, showed their wealth of bioactive secondary metabolites.
Our study, which concerns the isolation and the structural determination of sesquiterpene
lactones and flavonoids from the ethyl acetate soluble part of the aqueous-EtOH extract of the
aerial parts of Centaurea nicaeensis var. walliana M, constitute a contribution in this field and
supplement the results obtained in our laboratory from the chloroform soluble part which led to
the isolation and the structural establishment of two flavonoids.
After maceration of flowers and leaves of this plant, filtration, concentration and successive
extractions with chloroform, ethyl acetate and n-butanol, the ethyl acetate extract was submitted
to separation and purification by column and thin layer chromatography on silica gel 60.
This work led to the isolation in the native state of 5 compounds which were:
• A flavone : apigenin
• Two flavone glycosides : apigenin 7-(6’’-methylglucuronide) and
apigenin 4’-(6’’-methylglucuronide)
• A sesquiterpene lactone of elemanolide type-skeleton : melitensin
• A cyanogenic compound : prunasin
The structures were established by the combination of 1H NMR, 13C NMR, 2D NMR
experiments, mass spectrometry and UV-Vis spectroscopy data.
It is important to note, that apigenin 4’-(6’’-methylglucuronide) is new and then, was not
described elsewhere.
:ملخص
جنس سانتوريا من العائلة لنباتات ةيندرج هذا العمل ضمن برنامج بحث حول الدراسة الفيتوكيميائي .ذو الفعالية البيولوجية األيض الثانويب الغنيةالمركبة كويتربينية سالسي تهتم بتحديد المركبات الالكتونية التيالتي قمنا بها مساهمة في هذا المجال و اسةتعد الدر
Centaurea nicaeensis للمستخلص الكحولي لألجزاء الهوائية لـ اإليثيل خالت لطورو الفالفونيدية و المنجزة س النوع بالمستخلص الكلوروفورمي لنف الخاصةتكملة لنتائج سابقة و تعتبر هذه الدراسة
. ينيعلى مركبين فالفونيد من خاللها الحصولتم والتي بنفس المخبر متتالي بالكلوروفورم و الستخالص اإلالتركيز و ،ستخالص ألوراق و أزهار هذه النبتةبعد عملية اإل
و التنقية الفصل لعملياتاإليثيل خالتمستخلص أخضع. ثم بالبوتانول النظامييثيل اإل خالت .كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة التحضيريةبإستعمال العمود و الكروماتوغرافية
:نقية وهي مركباتخمسة سمحت هذه الدراسة الكروماتوغرافية بالحصول على apigénine: أجليكوني فالفونيد •
و apigénine (methylglucuronyl-’’6)-7: فالفونيدين جليكوزيديين • 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine
melitensine: الكتون سيسكويتربيني من نوع إيليمانوليد •
prunasine: مركب سيانيدي •
التحليل البنيوي لهذه المركبات تم اعتمادا على تجميع معطيات أطياف الرنين النووي المغناطيسي لبروتون بالنسبة لمركبات .ثنائية البعد باإلضافة إلى مطيافية الكتلة النووي المغناطيسي و الكربون و أطياف الرنين
.المرئية -األشعة فوق البنفسجية ألطيافنا أيضا أالفالفونيدية لج
مركب جديد ولم يسبق التعرف عليه apigénine (methylglucuronyl-’’6)-’4من الجدير باإلشارة أن
.مسبقا