Slide 1
Bioprocess Development For Canine Adenovirus Type 2
VectorsKELOMPOK 5INTRODUCTIONAlya zahra dan Shinta
MarlinAdenovirusVektor virus saat ini merupakan media yang paling
efisien untuk transfer gen in vivo. Vektor Adenovirus (AdV) lebih
sering digunakan daripada vektor lainnya.Beberapa karakteristik
Adenovirus antara lain :Tropisme sel luas pada sel yang diam maupun
bergerakTiter produksi yang tinggi diperoleh pada biakanNamun,
khasiat transfer gen dan penggunaan klinis Adenovirus bisa
terhambat oleh imunitas humoral dan seluler yang ada pada
manusia.Canine Adenovirus tipe 2Canine adenovirus tipe 2 (CAdV-2,
atau lebih sering disebutsebagai CAV-2) mungkin memiliki
karakteristik terbaik.Kekurangan antibodi dan memori sel T pada
manusia, dan transfer gen yang efisien diperoleh karena adanya
E1-deleted (DE1) pada vektor CAV-2 dalam sistem saraf pusatmembuat
virus ini menjadi media yang menjanjikan untuk terapi gen pada
manusia.Kemampuan yang luar biasa untuk menghantarkan sinyal saraf,
dikombinasikan dengan kapasitas yang luar biasa dari transportasi
aksonal membuat vektor CAV-2 dapat dipertimbangkan untuk pengobatan
penyakit neurodegenerative.
Produksi Vektor AdVKebutuhan akan vektor Adenovirus yang tinggi
pada akhirnya membutuhkan proses yang efisien dan kuat untuk
produksi dan pemurnian pada skala besar sesuai dengan GMP yang
baik.Oleh karena itu, protokol skala laboratorium harus
disesuaikan. Komposisi bahan serta variabilitas yang tinggi dari
batch-ke-batch serum, bersama-sama dengan potensi sumber
kontaminasi menimbulkan keprihatinan keamanan dan menghalangi
proses standarisasi kultur sel untuk produksi
biopharmaceuticals.Introduction#2ALYA ZAHRASampai saat ini, vektor
CAV-2 telah diproduksi dalam garis sel yang dihasilkan dari ginjal
anjing (Dog Kidney). Namun, sel-sel ini tidak diatur untuk produksi
biofarmasi yang menghalangi potensi penggunaan klinis vektor
CAV-2.Baru-baru ini, telah dikembangkan garis sel CAV-2
E1-transcomplementing berdasarkan MDCK. Sel MDCK diterima di FDA
dan European Medicine Agency, dan digunakan untuk produksi banyak
vaksin virus.
Bahkan, baru-baru ini, vaksin flu berbasis sel yang diproduksi
di MDCK diluncurkan di pasaran oleh Novartis Vaccines (Optaflu)
(Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH & Co. KG, Marburg,
Germany).Dengan demikian, penggunaan garis sel berbasis MDCK akan
Memfasilitasi produksi CAV-2 vektor.
Meningkatkan pemulihan vektor, meminimalkan persyaratan validasi
dan pemurnian pelacakan cepat adalah tantangan dalam proses hilir
untuk produk vektor virus.Penggunaan tahap kromatografi adalah
untuk memfasilitasi proses scale up. Matriks kromatografi yang
tersedia saat ini memiliki dimensi pori (30-80 nm) yang
mengecualikan vektor virus, sehingga kemampuan mengikatnya rendah.
Kelemahan ini bisa diatasi dengan menggunakan tentakel pendukung,
yaitu membran kromatografi dan kolom adsorben monolitik.
Tantangan lain bagi pemurnian virus adalah peningkatan ukuran
kromatografi eksklusi yang digunakan untuk polishing, karena
memiliki kapasitas beban rendah yang membatasi skalabilitas dari
proses dan operasi pada laju alir linear yang rendah.Dengan
demikian, alat-alat baru seperti matriks yang beroperasi di mode
negatif menjanjikan untuk pemurnian skala yang besar dari vektor
CAV-2Telah dikembangkan bioproses terintegrasi untuk produksi dan
pemurnian CAV-2 vektor.Sel MDCK-E1 tumbuh di microcarriers
digunakan sebagai sel inang untuk produksi virus, pemurnian virus
hanya berdasarkan langkah kromatografi.Dampak parameter hulu,
seperti konsentrasi sel inokulum dan jenis microcarrier pada
pertumbuhan sel dievaluasi.
MATERIAL AND METHODSAngelina Wening dan Good WillCell lines and
Culture Media
Sel DKZeo yang dihasilkan dari Sel DK ditumbuhkan dalam DMEM
dengan 10%FBS dan 1% asam amino non esensial Sel MDCK E1 didapatkan
dengan menyerang MDCK dengan pCl-neo plasmid untuk melindungi gen
E1 dari CAV-2 MDCK E1 dikultivasi di MEM dengan 10%FBS, 2mM
glutamin, dan 1% asam amino non esensialSel disubkultur 2 kali
seminggu dalam 150cm2 t-flask dan dijaga dalam inkubator keadaan
lembab (5%CO2 pada suhu 37C)Untuk memisahkan atau mengumpulkan sel,
monolayer dicuci dengan saline buffer fosfat yang diinkubasi dengan
0,25% trypsin EDTA pada 37C sampai sel lepas dan terlihat jelas.
Setelah itu, sel disuspensikan dalam medium kultur.Sel
diinokulasikan dengan media kultur yang mengandung FBS (MEM dan
DMEM), sel kemudian diresuspensi dalam medium segar.
Cell Growth assaysMDCK E1 ditumbuhkan pada kultur statis berupa
inokulum 1 x 104 sel/cm2 dalam 25/cm2 tflaskStirred culture
diperform dalam 125 ml spinner flask, kemudian disilikonisasi
dengan larutan dimetilklorosilane dalam toluen untuk mencegah
menempelnya sel pada dinding flask.Kedua mikrokarier non-pori,
Cytodex 3 dan Cytodex 1 disiapkan berdasarkan instruksi pembuatan.
Kurva pertumbuhan ditunjukkan dengan menggunakan inokulum 1 x 105
dan 2x105 sel/mL, konsentrasi mikrokarier 2 dan 3 mg/mL, dan
pengadukan 50rpm.Cell concentration determinationSel dihitung
dengan hemocytometer Fuchs-Rosenthal dengan metode eksklusi trypan
bluePada kultur statis, sel dihitung langsung dari suspensi setelah
lepasnya trypsin.Dalam kultur mikrokarier atau stirred culture ,
prosedur serupa diadaptasi.Dari 1 ml sample, microcarrier
distabilkan dan supernatant dibuang. Saline buffer fosfat
ditambahkan dalam jumlah yang sama untuk mencuci sel, lalu dibuang
setelah microcarrier stabil. Trypsin dalam jumlah yang sama
ditambahkan, sel diinkubasi dalam 37C hingga pemisahan terlihat
jelas, kemudian disuspensikan dan dihitung.DE1 CAV-2 vector stock
preparationCAVGFP, vektor DE1 CAV-2 disiapkan seperti yang telah
dideskripsikan sebelumnyaStok preparasi : 150 cm2 t-flasks berisi
sel DKZeo yang telah terinfeksi dengan MOI of 5 (IP) dan medium
exchange pada waktu infeksi.40 hpi, sel dikumpulkan dan dilisiskan
dengan 0,1% (v/v) Triton 100x.Lysate diklarifikasi dengan
sentrifugasi pada 3000g selama 10 menit pada 4C dan dipurifikasi
dengan gradien CsCl Vektor yang telah dipurifikasi disimpan dalam
saline buffer fosfat dengan 10% (v/v) gliserol pada -85C.Rasio
IP/physical particles (PP) adalah 1 :21 berdasarkan analisis
cytometry flow dan real time PCR.
MOI : ratio agent (phage) atau virus terhadap target infeksi
(sel)17CAVGFP production assaysThe infection assays ditunjukkan
dalam kultur jaringan pada Petri dengan diameter 10cm dan spinner
vessels 125 ml.MOI of 5 (IP) digunakan dan medium diganti bersamaan
dengan infeksi dilakukan.Saat menggunakan petri kultur jaringan, 8
x 104sel/cm2 diinokulasikan dan diinfeksi 24 jam setelah sel
memiliki confluence 80 - 90%. Dalam kultur spinner flask, 1 x
105sel/ml dan 2 x 105sel/ml diinokulasikan menggunakan MEM dan
media Optipro secara berurutan.Sel diinfeksi pada akhir fase
pertumbuhan eksponensial (~48h).Virus ekstraseluler dikumpulkan
dari supernatan. Virus intraseluler dikumpulkan dengan memisahkan
sel dalam suatu larutan buffer.Hasil sampel intraseluler and
ekstraseluler diklarifikasi pada 3000 gram selama 10 menit pada 4C
dan disimpan pada -85CTitration of infectious CAVGFP
particlesKuantifikasi IP ditunjukkan dengan monitor ekspresi gen
GFP menggunakan modifikasi metode.4 x 104 sel MDCK E1
diinokulasikan dalam 24 cawan dan diinfeksi dengan larutan suspensi
viral.Sel tanpa trypsin (24hpi) dan persen sel GFP positif
ditentukan dengan flow cytometry.
Measurement of total CAVGFP particles by real time PCRCAVGFP DNA
diekstrak dan dipurifikasi dengen High Pure Viral Nucleic Acid
Kit.Sebelumnya, plasmid coding untuk genom vektor DE1 CAV-2 yang
telah dipurifikasi digunakan sebagai standard.Amplifikasi
ditunjukkan dengan Light Cycler System dengan Fast Start Master
SYBR Green 1 KitDalam 20uL reaksi PCR, 10uL DNA template dan 10uL
mastermix ditambahkan pada tiap kapiler.Isi mastermix berupa 3mM
MgCl2 dan 0,5mM tiap primer.Forward primer yang digunakan adalah
50-AAATATACAGGACAAAGAGGTGTGG-30 dan reverse yang digunakan adalah
50-GAACTCGCCCTGTCGTAAAA-30Program standar ditunjukkan berdasarkan
Light Cycler RT PCR dan dianalisa menggunakan software Light
Cycler.Protein dan DNA AnalysisAnalisa total protein diketahui
dengan Pierce BCA kit 23225DNA total analisis dikonduksi
menggunakan PicoGreen dsDNA assay kitSerapan terbaca pada 562nm
untuk menentukan total protein, dan flourosensi hijau diukur dalam
fluorimeter untuk mendeteksi DNAPicoGreen assay memiliki batas
deteksi 25pg/ml dsDNAMaterial and Method#2Good will Protein profile
of CAVGFP by SDS-PAGE and western blotPartikel virus diendapkan
dalam etanol absolut pada suhu 20C selama semalam, disentrifugasi
pada 10000 g selama 10 menit dan konsentrasikan pada SDS-PAGE
loading-buffer pada 30 g protein per volume total untuk dipindahkan
pada gel. SDS-PAGE dilakukan sesuai dengan protokol NuPAGE Novex
Bis-Tris Mini Gel menggunakan peralatan Xcell SureLock
(Invitrogen).Analisis Western blot dilakukan dengan menggunakan
kelinci poliklonal anti CAV-2 antibodi primer. 32 Protein yang
didapatkan melalui BCIP / NBT substrat (Pierce) setelah inkubasi
dengan alkaline phosphatase terkonjugasi anti kelinci antibodi
sekunder (Sigma Aldrich).
Size and electrodynamics measurements of CAVGFPUkuran dan zeta
potensial partikel virus ditentukan oleh scatering cahaya dinamis
menggunakan Zetasizer Nano-ZS Series ZEN3600 dilengkapi dengan
633nm laser He-Ne (Malvern, Worcestershire, Inggris). Potensial
zeta diukur dengan menggunakan 40 l sampel pada 660 l dapar fosfat
10mM (Sigma-Aldrich) dengan pH berkisar antara 3-10 pada kuvet
plastik 10x10mm (Sarstedt, USA) dengan menggunakan dip-cell
(Malvern). Ukuran partikel ditentukan dengan menggunakan sampel dan
volume buffer yang sama pada pH 8.
Bioreactor culture and CAVGFP productionSel MDCK-E1 yang
dibudidayakan di tangki bioreaktor siliconized 2-l stirrer (Biostat
Q-Plus, Sartorius Stedim Biotech) dilengkapi dengan tiga impeler
pisau, dalam kondisi :(volume : 1,5 l ; pH: 7,4 ; suhu: 37 C ;
permukaan aerasi pada 40% pO2 ; kecepatan pengadukan: 50-60 rpm).
Sel (2x10 sel/ml) yang diunggulkan di 3mg/ml dari Cytodex 1
microcarriers ditempatkan di dalam botol kaca dan dipindahkan ke
wadah bioreaktor.Medium kultur OptiPro telah dilengkapi dengan 5%
FBS (V/V) selama inokulasi (12 jam). Penggantian media dilakukan
dengan menghentikan agitasi dan membiarkan microcarriers menetap.
Setelah 2 hari budidaya (1x10 sel/ml), medium ditukar ke OptiPro
biasa (tanpa FBS) dan sel-sel yang terinfeksi MOI 5.
56Harvest and clarificationPemanenan dilakukan pada akhir
bioreaction (approx pada 42 HPI). Untuk mempromosikan sel lisis,
0,1% Triton X-100 (Merck) ditambahkan dan diinkubasi selama 30
menit pada 37 C dengan Benzonase (50 U/ml).Selanjutnya,
microcarriers dibiarkan menetap, dan supernatan yang dihasilkan
digunakan untuk diproses lebih lanjut. Klarifikasi pertama kali
dilakukan oleh mikrofiltrasi menggunakan kapsul penyaring
Sartobrand P 0,45 m (Sartorius Stedim Biotech) pada 70
ml/min.Sentrifugasi dilakukan pada 10000 g, 15 menit pada 4C.
Sebuah Sartopure 2 membran kapsul yang terbuat dari polietersulfon
(Sartorius Stedim Biotech) dengan prefilter 0,8 m + 0.45 m retensi
filter dengan luas daerah filtrasi 50 cm2ChromatographyAKTAexplorer
100 dan 10 sistem (GE Healthcare) yang digunakan untuk melakukan
pemurnian kromatografi cair; sistem ini dilengkapi dengan UV,
konduktivitas dan pH meter dan dikendalikan secara online dengan
ditambah software UNICORN (GE Healthcare). Buffer Tris-HCl (10mm,
pH 8,0) ditambah dengan 2mM dari MgCl2 buffer digunakan untuk
equilibrium semua kolom.
Anion exchange chromatographyDua perangkat kromatografi anion
exchange kuat,menggunakan Tabung Kolom Monolithic CIM QA-8f
(mengandung ligan amina kuartener) dan Sartobind Q 75. Tris-HCl
(10mM, pH 8,0) ditambah dengan 2mM dari MgCl2 ditambah 1M NaCl
digunakan sebagai pencampuran buffer untuk langkah-langkah
elusi.Kolom monolitik dipelajari sebagai langkah untuk pemurnian
CAV-2. Empat macam kecepatan aliran dievaluasi : 5, 10, 20 dan 40
ml/min ; 8 Volume kolom garam linear dients elusi dilakukan;
langkah isokratik garam elusi diuji menggunakan 75, 200, 300 dan
500mM NaCl pada kec 40ml/ minSize exclusion chromatography(gel
filtration)Prepacked Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare)
diameter 1 cm dan panjang 30 cm. Ini memiliki rentang resolusi
optimal 5-200 kDa pemisahan. Buffer Tris-HCl (10mM, pH 8,0)
ditambah dengan 2mM MgCl2 digunakan pada kecepatan 1 ml/min (76
cm/h).
Core bead prototype chromatographySebuah inti prototipe matriks
(GE Healthcare) digunakan untuk langkah studi. Manik-manik
mengandung gugus fungsional (ligan) dalam matriks bola sehingga
memungkinkan pengikatan terfragmentasi DNA sel inang dan protein
tuan rumah sel kotoran dengan pertukaran ion dan interaksi
hidrofobik sementara membiarkan partikel virus mengalir bebas di
ruang antar-manik. Salah satu prepacked kolom Hiscreen pencampuran
berbagai jenis kromatografi cair digunakan. Kolom ini diseimbangkan
dengan 10mM Tris-HCl pH 8,0 dilengkapi dengan 2mM MgCl2 dan sampel
dimuat pada 10mS/cm dan 150 atau 300 cm/h
RESULTFikry Dwi Anjani, Nurul Eka, Mega WattyProduktivitas-sel
tertentu yang sama dan amplifikasi IP yang diperoleh untuk kedua
sel (Tabel 1). Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ukuran
partikel, biaya atau protein profil SDS terdeteksi untuk virus yang
dihasilkan dengan DKZeo dan MDCK-E1.Hasil penelitian menunjukkan
bahwa sel-sel MDCK-E1 cocok untuk produksi CAV-2.
1. Kemampuan sel MDCK-E1 untuk menghasilkan CAV-2 partikel yang
benarukuran, biaya dengan profil SDS dievaluasi dibandingkan
denganproduksi vektor virus pada sel DKZeo.2. Pengaruh media free
serum (SF) OptiPro terhadap pertumbuhan sel dan produksi virus
dinilai dengan membandingkan hasil yang diperoleh dengan
serumsupplemented (SS) Minimum Esensial Medium Elang (MEM).3. Untuk
mengembangkan proses scalable, Strategi dengan inokulasi terbaik
(konsentrasi sel inokulum dan jenis microcarrier) untukpertumbuhan
sel ditingkatkan dan pemanen pada waktu terbaik panen.4. hasil
produksi virus dalam kondisi pengadukan dievaluasi dandikonfirmasi
dalam 2-l bioreaktor. Akhirnya, pendekatan untuk vektorklarifikasi,
pemurnian dan polishing diselidiki32Pengaruh media kultur terhadap
pertumbuhan sel dan produksi vektor dalam kondisi statisPertumbuhan
sel dan produksi virus pada medium Free serum SF (OptiPro)
dibandingkan dengan media SS (MEM).Nilai yang diperoleh setengah
dari, bila menggunakan media SS. konsentrasi sel maksimum dicapai
adalah 3,5 kali lipat lebih tinggi (1,9x 106 sel /ml)Produksi-sel
spesifik 2223 IP per sel dan 391 IP per sel diperoleh dari SF dan
SS, dengan amplifikasi rasio 445 dan 78 IP
Result #2Nurul ekaOptimasi produksi pada kondisi
pengadukanPengaruh inokulum sel dan jenis microcarrier pada
pertumbuhanselinokulum pada kultur yang diaduk, dan telah
dievaluasi menggunakan medium SS dan SF pada konsentrasi: 1x10-5sel
ml-1dan 2x10-5sel ml-1Cytodex 1 dan Cytodex 3 digunakan dalam
pertumbuhan sel pada media SFNurul Eka Putri-1106002242Hasil
Konsentrasi sel maksimum yang diperoleh pada kedua media yang diuji
pada konsentrasi inokulum 2x10-5sel ml-1.
Pengaruh waktu pada virus yang dihasilkan.Setelah sel
menginfeksi, jumlah maksimum IP dicapai antara 24 dan 36 HPI(time)
, sebagian berada di fraksi intraseluler.
Proses Purifikasi CAVGFPMega Watty 1206260091Pengaruh strategi
klarifikasi atas hasil vector virus. Setelah lisis sel dipromosikan
oleh triton, sebagian besar bioreactor diperlakukan dengan 50 Uml-1
dari benzonase untuk mencerna asam nukleat. Dua metode dievaluasi
untuk klarifikasi massal: filtrasi menggunakan filter kedalaman dan
sentrifugasi. Kedalaman filter dengan pori-pori 0,45 mm menyebabkan
pemulihan dari B30%. Satu filter mendalam dengan lapisan ganda
(0.80.45 mm) diperkenalkan dengan langkah sentrifugasi, dan hasil
dari IP meningkat menjadi 90% (2%; n3).Pengaruh tingkat dan elusi
metode aliran selama capture/pemurnian menengah E1 CAV-2. Untuk
menentukan penangkapan terbaik /menengah tahap pemurnian, dua
strategi dibandingkan:pengadsorpsi membran (Sartobind Q, Sartorius
Stedim Biotech,Goettingen, Jerman) dan penukar anion monolitik Q
(CIM Q)Rasio amplifikasi IP bersama saat setelah menginfeksi sel
MDCKE1 dalam tabung pemutar dengan medium SS dan medium SF. Antara
24 dan 36 hpi sebagian besar sel-sel yang layak dicapai melekat
pada pembawa mikro. Bar kesalahan mewakili s.d. pengukuran rangkap
tiga
Produktivitas volumetric (IP ml-1) diperoleh dengan MDCK-E1
dikulturkan pada kultur statis (Tabung T) dan bioreactor (dalam
Cytodex 1) menggunakan medium yang disuplementasi menggunakan serum
dan medium SF. Vektor virus dikumpulkan pada 40 dan 36 hpi dalam
kultur statis dan bioreactor, masing-masing. Bar kesalahan mewakili
s.d. pengukuran rangkap tigaProfil kromatogram yang sama diperoleh
dengan menggunakan kedua strategi, dimana tiga puncak ditemukan.
Gambar 5a menunjukkan diperolehnya kromatogram yang khas. Namun,
resolusi yang lebih baik dan hasil vektor yang lebih tinggi dicapai
menggunakan CIM Q (82%2% recovery,n3) bila dibandingkan dengan
Sartobind Q (42%5% recovery, n3). Menggunakan kolom monolitik,
sebagian besar vector virus yang dielusi pada puncak pertama pada
21mScm-1 seperti yang telah dikonfirmasi dengan real-time PCR,
analisis elektroforesis dan western blot. Jumlah vektor di puncak
lainnya
