Colección de trabajo de variedades de cítricos libres

de CTV,EXOCORTIS, HLB

Diana Rodríguez Msc, Lizeth Palacios, Mauricio Martínez Msc., Nubia Murcia Riaño Ph.D

La Habana, 17 de Octubre de 2017

PRODUCCION DE CITRICOS EN COLOMBIA

Naranjas: 33.213 haPn: 25.104 ha2012: 519.941 TonRto: 21 Ton/ha

Limas ácidas: 15.214 haPn: 10.140 ha2012: 128.318 TonRto: 12,7 Ton/ha

Mandarinas: 10.498 haPn: 8.262 ha2012: 106.277 TonRto: 12,9 Ton/ha

Fuente: ENA – DANE, 2012

NACIONAL 2010 2011 2012 2013 2014* 2015* 2016* e

Área (ha) 65,004 66,311 70,255 73,641 79.419 83,576 86,596

Producción (t) 1´165,610 798,383 1´163,745 1,256,718 1´482,000 1´747,161 2´061,650

Rendimiento(t/ha)

17,2 12,04 17,2 17,2 18 19 23,04

En los últimos 6 años, el área de cítricos 18.572 hectáreas, con un promedio por año de 3,720 ha, que equivale a un crecimiento anual del 4,8%. Las limas es la de mayor crecimiento. Al 2015 el área productiva de cítricos fue de 63.621 hectáreas.

PRODUCCION DE CITRICOS EN COLOMBIA

* Cálculos realizados con la información de Naranjas, Mandarinas y Limas ácidas de la CNC, 2014, ENA, 2014 2015, SIOC, 2016

PROBLEMAS FITOSANITARIOS DE LOS

CÍTRICOS EN COLOMBIA

Exocortis

Tristeza de los Cítricos

Leprosis

Psorosis

(Resolución 2390, ICA 2015)

VIRUS DE LA TRISTEZA

Lima acida mejicana

Síntomas asociados a infecciones de CTV

VIROIDE DE LA EXOCORTIS CEVd

Naranja Valencia con síntomas en portainjerto

Fuente: Duran-Vila, 2009

Síntomas asociados a CEVd

•Viroide de la exocortis de los cítricos(CEVd)•Viroide del enanismo del lúpulo (HSVd)•Viroide del enanismo de los cítricos(CDVd)

Murcia et al., 2009.

Colección de germoplasma de Cítricos en Colombia

Cultivares Total Géneros Total

Naranjas 55 Citrus 238

Mandarinas y similares 47 Clausena 1

Limas acidas 10 Fortunella 2

Limones verdaderos 6 Poncirus 5

Pomelos 21 Trifasia 1

Criollos y otros 142 Hibridos 34

(Criollos…) (142)

Total 281 Total 281

Introducidos: 162 (59.6%)

Mejorados: 12 (4.4% ) V.

Agricultor: 27 (6.6% )

Nuevos Criollos: 80 (29.4%)

Fuente: Corpoica, 2009. Bancos de Germoplasma

Colección de trabajo de variedades de

cítricos

Número Especie Número Especie

1 Tangelo Orlando 10 Naranja Olinda Valencia

2 Tangelo Mineola 11 Naranja Valle Washington

3 Mandarina Oneco 12 Naranja Sweety

4 Mandarina ICA Bolo 13 Naranja Frost Washington

5 Mandarina Clemenules 14 Mandarina Arrayana

6 Naranja Salustiana 15 Lima ácida Tahití

7 Naranja Campbell Valencia 16 Lima acida Pajarito

8 Naranja Frost Valencia 17 Start Ruby

9 Naranja Garcia Valencia

Colección de trabajo de variedades de

cítricos

Se conserva en casa de malla 17 variedades de cítricos

comerciales y 4 replicas por cada una, en un ambiente protegido

por una malla antipulgón.

• Evaluar la sanidad de la colección de trabajo de 17

variedades de cítricos obtenidas por microinjerto de

ápices caulinares frente al virus de la tristeza

(CTV), Viroide de la exocortis (CEVd), y

Huanglongbing(HLB)

OBJETIVO GENERAL

Objetivos específicos:

• Evaluación frente al virus de la tristeza de los cítricos (CTV)

método serologico DAS – ELISA.

• Evaluación frente al viroide de la exocortis de los cítricos

(CEVd) método biológico y molecular.

• Evaluación frente a HLB, candidatus Liberibacter qPCR

Metodología

Analisis

Virus de la tristeza de los

cítricos

CTV

Das-ELISA

HuanglongbingHLB

Candidatusliberibacterasiaticus

PCR en Tiempo Real

Exocortis de los cítricos

Viroide de la exocortis de los

cítricos

RT-PCR

Hibridación de ácidos nucleicos

.

Evaluación frente a virus de la tristeza de los cítricos

Tejidos: Corteza- Hojas- Nervaduras- pecíolos.

Voller et al,1976, Clark y Adams,1977, Clark et al,1986.

Colecta y procesamiento de muestra vegetales

Metodología

Metodología

Procesamiento de muestra vegetales

c

• Protocolo Bioreba AG.• Anticuerpo IgG CTV :1:1000• Conjugado 1:1000• Lecturas a 60-120 min

• Control positivo: Lima acidamexicana.

• Control negativo: Tejido deplanta de semilla.

Metodología

ELISA (DAS-ELISA)

Se procesaron 68 plantas de 17 especies de cítricos

microinjertadas. Por cada variedad se evaluaron cuatro plantas.

Código EspecieCTV

(DAS-ELISA)

1 T. Orlando Negativo

2 T. Mineola Negativo

3 M. Oneco Negativo

4 M. Ica-Bolo Negativo

5 M. Clemenules Negativo

6 N. Salustiana Negativo

7 N. V. Campbell Negativo

8 N. Frost V. Negativo

9 N. Garcia Val Negativo

10 N. V. Olinda Negativo

11 N. V. Washington Negativo

12 N. Sweety O Negativo

13 M. Arrayana Negativo

14 N. F. Washington Negativo

15 Lima Tahiti Negativo

16 Lima Pajarito Negativo

17 Star Ruby Negativo

Resultados

DAS-ELISA

Se realizaron 2 evaluaciones/año, frente al virus de la tristeza de los cítricos (CTV)

Evaluación frente al viroide de la Exocortis de los cítricos

Producción de patrones para multiplicación de

Cidro Etrog.

Siembra de semillas de los portainjertos

trifoliados CitrumelloCPB 4475 y Citrange

Troyer.

Portainjertos aproxdiámetro de 0.8 mm se

injerto con yemas de Cidro Etrog clon Arizona 861-S1.

Las plantas se conservaron a

temperatura promedio de 27°C y Humedad relativa promedio de

60.1%.

Cidro etrog alcanzó un desarrollo entre 10 y 15 cm, se inocularon

por injerto.

Metodología

Multiplicación de plantas indicadoras e inoculación para

evaluación de CEVd.

Multiplicación de plantas indicadoras (Cidro Etrog)

Semillero

Transplant

e

Injertación

Inoculación

•Selección de semillas de portainjertos• Siembra en germinadores (Turba, vermiculitay cascarilla de arroz en proporción 1:1)

•Preparación del sustrato•Trasplante a bolsas de polietileno de 5 kiloscalibre No 4

• injertacion en “T” invertida con yemaslimpias de Cidro etrog- Clon Arizona, 861 S1.

• Inoculación por tejido de parche paraevaluación de las copas comerciales

Manejo de malezas se realiza cada 15 días y riego tres veces por semana

Metodología

Metodología

Producción de portainjertos

• Citrumello CPB4475

• Citrange Troyer

Planta indicadora

• Cidro Etrog Clon Arizona 861-S1

para multiplicación de yemas

sanas.

Plantas de Cidro etrog con brotes entre 10 a

15 cm para inoculación con el viroide de la

exocortis de los cítricos (CEVd).

Inoculación en Cidro Etrog clon Arizona 861-S1

28-32ºC, 3 – 4 meses.

Metodología

Cidro

28-32 oC

Epinastia

Necrosis de pecíolos y nervadura central

(Duran-Vila et al., 1988

Metodología

Metodología

Evaluación de síntomas

Síntomas de Epinastia,

necrosis de pecíolos y

nervadura central.

Control Sano

de Cidro Etrog

Control positivo CEVd

(1238-IVIA)Control negativo

Resultados

N. Valle W. (11-2-2) T. Mineola (2-1-2) Especies de la colección de

cítricos sin síntomas

Control positivo Control negativo

Código EspecieCEVd

(Biológico)

1 T. Orlando Negativo

2 T. Mineola (1Positiva/3 Negativas)

3 M. Oneco Negativo

4 M. Ica-Bolo Negativo

5 M. Clemenules Negativo

6 N. Salustiana Negativo

7 N. V. Campbell Negativo

8 N. Frost V. Negativo

9 N. Garcia Val Negativo

10 N. V. Olinda Negativo

11 N. V. Washington (1Positiva/3 Negativas)

12 N. Sweety O Negativo

13 M. Arrayana Negativo

14 N. F. Washington Negativo

15 Lima Tahiti Negativo

16 Lima Pajarito Negativo

17 Star Ruby Negativo

Control Positivo 1238 (IVIA) Positivo

Control Negativo Cidro Etrog Negativo

De cada variedad de cítrico. Se evaluaron cuatro repeticiones y las inoculaciones

en Cidro Etrog se realizaron por duplicado, para un total de 136 plantas evaluadas

Resultados

Evaluación molecular de Cevd de la colección de trabajo de cítricos

Dot-Blot

Hibridación Molecular

RT-PCR

sPAGE

Análisis de ácidos nucleicos

Metodología

Exocortis

Colecta y procesamiento de muestra

Se procesaron 120 plantas correspondientes a la colección de

trabajo de 16 especies de cítricos microinjertadas.

Metodología

Fase l

Fase ll

Fase lll

(Rodríguez, 2015)

Extracción de ácidos nucleicos

Semancik et al.,1975

• Cebadores F1/R1 y F2/R1

Metodología

RT-PCR

Bernad y Duran-Vila (2006)

Los productos amplificados por PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1.5%,

Resultados

RT- PCR

Dot blot

Metodología

HLB

Colecta y procesamiento de muestra

Extracción de DNA: Purificación de DNA total de tejido del kit deextracción Dneasy Plant Kit de Qiagen.

PCR en Tiempo Real: Iniciadores 298-295 especifico para Ca. L.asiaticus, iniciadores 315-317 específicos para gen cox, Sonda paraCa. L. asiaticus 409-FAM, Sonda para control interno de insectos316-CY3.

Control positivo: Plásmido con región 16S de Candidatus L.asiaticus.

Control negativo: ADN de adulto de Diaphorina citri no infectado yADN de cítricos no infectados.

Análisis realizado por el Laboratorio de diagnóstico fitosanitario ICA.

Código EspecieAnalisis a Candidatus

liberibacter asiaticus (qPCR)

1 T. Orlando Negativo

2 T. Mineola Negativo

3 M. Oneco Negativo

4 M. Ica-Bolo Negativo

5 M. Clemenules Negativo

6 N. Salustiana Negativo

7 N. V. Campbell Negativo

8 N. Frost V. Negativo

9 N. Garcia Val Negativo

10 N. V. Olinda Negativo

11 N. V. Washington Negativo

12 N. Sweety O Negativo

13 M. Arrayana Negativo

14 N. F. Washington Negativo

15 Lima Tahiti Negativo

16 Lima Pajarito Negativo

17 Star Ruby Negativo

Resultados

Se realizó 1 monitoreo para Candidatus liberibacter asiaticus por el método PCR

Cuantitativa (ICA)

Código EspecieCTV

DAS-ELISA

HLB

(qPCR)

CEVd

Biológico RT-PCR Dot blot

1 T. Orlando - - - - -

2 T. Mineola - - 1 (+), 3 (-) 1 (+), 3 (-) 1 (+), 3 (-)

3 M. Oneco - - - - -

4 M. Ica-Bolo - - - - -

5 M. Clemenules - - - - -

6 N. Salustiana - - - - -

7 N. V. Campbell - - - - -

8 N. V. Frost - - - - -

9 N. Garcia Val - - - - -

10 N. V. Olinda - - - - -

11 N. V. Washington - - 1 (+), 3 (-) 1 (+), 3 (-) 1 (+), 3 (-)

12 N. Sweety - - - - -

13 M. Arrayana - - - - -

14 N. F. Washington - - - - -

15 Lima Tahiti - - - - -

16 Lima Pajarito - - - - -

17 Star Ruby - - - - -

Control + + + + + +

Control - - - - - -

RESUMEN

CONCLUSIONES

La colección de 17 variedades de cítricos: Tangelo Orlando, T.

Mineola, Mandarina Oneco, M. Ica Bolo, M. Clemenules. M.

Arrayana,N. salustiana,N.Campbell,N.frost Valencia,N.Garcia

Valencia,N.Olinda,N.valle Washington,N. Frost

Washington,N.Sweety,Lima Acida tahiti y Lima Pajarito y Star

Ruby, se encontraron libres de CTV.

El análisis por los métodos biológico y molecular de CEVd

determinó que la colección de 17 variedades de cítricos, T.

Orlando,M.Oneco,M.Ica bolo

M,Clemenules,M.arrayana,N.Salustiana,N.Campbell,V.Frost

V. Garcia, libres de CEVd. Dos de las variedades; T.Mineola

y N. Valle W resultaron positivas a CEVd.

CONCLUSIONES

El diagnóstico de C. Liberibacter asiaticus realizado por

el Laboratorio de diagnóstico del ICA en las 17

variedades correspondientes a 68 muestras de cítricos

dieron reacción negativa, utilizando la técnica qPCR.

Las técnicas diagnóstico biológico y molecular pueden

utilizarse para fortalecer el Programa de Certificación de

cítricos para Colombia.

EQUIPO DE TRABAJO

Corpoica

• Mauricio Martínez- Diana Rodríguez-Nubia Murcia

• Profesionales de Apoyo: Andrea Barreto, Lizeth

Palacios, Hover Beltrán López.

• Asistente de Investigación: Gustavo Acosta, Luz

Marina Acosta.

ICA- Laboratorio Nacional de Diagnostico

• Adriana Castañeda

CENTRO DE INVESTIGACION CORPOICA-PALMIRA Valle del Cauca-Colombia

TEL 2758161-66pagina web www.corpoica.org.co

nmurcia@Corpoica.org.co

GRACIAS POR SU ATENCIÓN