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UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
SSííntesisntesis de de MIPsMIPs selectivosselectivos a a antibiantibióóticosticos ββ--lactlactáámicosmicos parapara susu empleoempleoen en sistemassistemas miniaturizadosminiaturizados de de medidamedida (CREAM, Ref QLK(CREAM, Ref QLK--19991999--0000--00902) 00902)
DesarrolloDesarrollo de de inmunoensayosinmunoensayos en en fasefase heterogheterogééneanea y de MIAs y de MIAs parapara la la determinacideterminacióónn de de antibiantibióóticosticos, , micotoxinasmicotoxinas y y pesticidaspesticidas en en alimentosalimentos, , muestrasmuestras mediombientalesmediombientales y y farmacefarmaceúúticasticas (NASCENT, Ref (NASCENT, Ref MRTNMRTN--CTCT--20062006--033873033873))
DiseDiseññoo de de sondassondas fluorescentesfluorescentes parapara el el desarrollodesarrollo de de inmunoensayosinmunoensayos y y MIAs (MIAs (molecularly imprinted assaysmolecularly imprinted assays). ). DesarrolloDesarrollo de de biosensoresbiosensores sobresobrefibrafibra óópticaptica ((FutursenFutursen, Ref , Ref SS--0505/AMB/03740505/AMB/0374)
SSííntesisntesis de de MIPsMIPs compatibles con compatibles con muestrasmuestras acuosasacuosas parapara la la determinacideterminacióónn de de contaminantescontaminantes en en alimentosalimentos y y aguasaguas
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
DERIVADOS DEL PIRENODERIVADOS DEL PIRENO
N
S
COOH
CH3
CH3
NH
O
H HO
PAAPPAAP ( )3
N
S
COOH
CH3
CH3
NH
O
H HO
PBAPPBAP
N
S
COOH
CH3
CH3
NH
O
H H
NH
O
OPAAMPAAM
N
S
COOH
CH3
CH3
NH
O
H H
NH
O
O
( )3
PBAMPBAM
N
S
COOH
CH3
CH3
NH
OH
O
H H
NH
O
OPAAXPAAX
DERIVADOS DEL DANSILODERIVADOS DEL DANSILO
G. Orellana et al. Patente ES 2197811
DAPDAP
N
S
COOH
CH3
CH3O
H HNH
SO O
N
DAMDAM
N
S
COOH
CH3
CH3
NH
O
H H
NH
O
SOO
N
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
ABC
DE
H
FG
ABC
DE
H
FG
ABC
DE
H
FG
portadorportador
ABC
DE
H
FG
desorbentedesorbente
anticuerpo anticuerpo ((AbAb))
antantíígeno marcado geno marcado ((AgAg*)*)
desechodesecho
aireaire
bomba de jeringabomba de jeringa++
vváálvula de distribucilvula de distribucióónn
vváálvula de lvula de distribucidistribucióónn
mue
stra
s
immunoreactorimmunoreactor
anticuerpos inmovilizadosanticuerpos inmovilizadosen parten partíículas de culas de
inmunoadsorbenteinmunoadsorbente
ABC
DE
H
FG
ABC
DE
H
FG
ABC
DE
H
FG
portadorportador
ABC
DE
H
FG
desorbentedesorbente
anticuerpo anticuerpo ((AbAb))
antantíígeno marcado geno marcado ((AgAg*)*)
desechodesecho
aireaire
bomba de jeringabomba de jeringa++
vváálvula de distribucilvula de distribucióónn
vváálvula de lvula de distribucidistribucióónn
mue
stra
s
immunoreactorimmunoreactor
anticuerpos inmovilizadosanticuerpos inmovilizadosen parten partíículas de culas de
inmunoadsorbenteinmunoadsorbente
E. Benito Pena et al. Anal Chem. 2006, 78, 2019-2027 ; J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 6635-6642
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007MIPsMIPs
MIPs Antibodies
Binding sites Binding sites homogeneityhomogeneity
PolyclonalityMost non-covalently imprinted MIPs have
heterogeneous binding sites
The use of monoclonal antibodies yields very high
selective assays
PreparationPreparation Simple and easy to prepare Complicated manufacture and handling
AffinityAffinitySynthesis conditions may compromise final affinity
103 a 109 L mol-1High affinity to the target(s)
5·104 a 1012 L mol-1
CostCost Inexpensive ◄◄►►
Expensive biosynthesis but cost effective
StabilityStabilityRobust, resistant to a wide range of pH, humidity and
temperature
Non usable in harsh environments:limited lifetime
SelectivitySelectivity ◄◄►► High-medium High
Aqueous Aqueous mediamedia
◄◄►► Limited water compatibility Optimal performance in
aqueous solutions
Organic Organic mediamedia Excellence performance Poor performance. Antibody
denaturalization
SolventSolvent
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
Analytical characteristics
IC50 19.7 µg mL-1
LD 100 µg mL-1
DR (1120 – 3330x102) µg L-1
r 0.990 (n = 9)
log [PENG]-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
Seña
l nor
mal
izad
a (S
N)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0
log [PENG]-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
Seña
l nor
mal
izad
a (S
N)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
00
CalibrationCalibration plotplot MIAMIA
Analytical characteristics
IC50 30 ng mL-1
LD 2.4 ng mL-1
DR (6.0 – 191) ng mL-1
r 0.998 (n = 5)
CalibrationCalibration plotplot immunoassayimmunoassay
[PENG], μg mL-1
0.000001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100
Seña
l nor
mal
izad
a (S
N)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0.0
[PENG], μg mL-1
0.000001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100
Seña
l nor
mal
izad
a (S
N)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0.0
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
AA BBDD
CC
OptodeOptode responseresponse
log [PENG]-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
Seña
l nor
mal
izad
a (S
N)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0
log [PENG]-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
Seña
l nor
mal
izad
a (S
N)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
00
MIAOptode
●●
CC
DDAA
BB
Optical fiber
Sensitive tip
MIP
longitud de onda, nm380 400 420 440
Seña
l de
fluor
esce
ncia
, cps
10000
20000
30000
40000
50000
[PENG]
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
Características analíticas
IC50 1.81x10-6 M
LD 1.97x10-7 M
ID 6.80x10-7-7.21x10-6 M
a
b
Análisis de Penicilina G en orina
Concentration (M)
1e-8 1e-7 1e-6 1e-5 1e-4 1e-3
B / B
o
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Nor
mal
ized
sign
al,S
N
a
b
J. L. Urraca et al., Angew. Chem. 2006, 45, 5158-5161; Anal Chem. 2007, 79, 695-701
Curvas de calibrado (n = 3) para PENG en acetonitrilo:buffer HEPES (0.1 M, pH 7) (60/40, v/v)`: NIP ( ), MIP( ) en muestras de orina; trazador (PAAP) 25 nM.
N N
H H
CF3
CF3
Urea-δO
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
O
O
O
OH
HO
ZON
OOH
HO
O
CDHB
J. L. Urraca et al., Anal. Bioanal. Chem. 2006, 385, 1155-1161; J. Chrom. A 2006, 1116, 127-134
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
Monómeros funcionales
N4-vinilpiridina
(4-VPY)
NO
O2-(dietilamino)etil
metacrilato(2-DAEM)
1-alilpiperazina (1-ALPP)
NH
N HOO
OMetacrilato de 2-hidroxietilo
(HEMA)
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Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
t / s
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
LU260
280
300
320
340
360
380
5 10-4 M 3 10-4 M 2 10-4 M 10-4 M 5 10-5 M 2.5 10-5 M 1.7 10-5 M
HN
O
OOH
HOO
Signal
[Analyte]
Ensayodesplazamiento
Analito
Análogo fluorescente
AnálogoFluorescente (PA-RA)
Navarro et al. Sens.& Act. B (in press)
λexc/em = 345/400 nm
IC50 MIP (ZON)= 0.60 mML.D. MIP (ZON)= 30 µM
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
Características analíticas
Valor (ng mL-1)
RSD %
LD 0.007 2.3 IC50 0.124 4.1
Intervalo dinámico 0.021-0.833
Concentration (ng mL-1)
0.001 0.01 0.1 1 10 100
resp
uest
a no
rmal
izad
a
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Concentration (ng mL-1)
0.001 0.01 0.1 1 10 100
resp
uest
a no
rmal
izad
a
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Calibrados de ZON en PB y en MatrizPBExtractoPB + 2%
(MeOH/AcN)
J. L. Urraca et al., j. Agric. Food Chem. 2005, 53, 3338-3344
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
MatrizCantidad
adicionada(ng g-1)
Inmunoensayong g-1 (RSD)
HPLC-FLDng g-1 (RSD)
Maíz* 133 130 (6) 138 (6)
Trigo 126 132 (6) 119 (5)
Pienso cerdos 126 132 (8) 133 (7)
* Material de referencia certificado
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
J. Golden et al. Methods 2005, 37, 65–72; Moreno-Bondi et al. Biosens. Bioelect. 2006, 21, 1880-1886
BufferBuffer1:200 Patient 21:200 Patient 21:50 Patient 21:50 Patient 21:200 Patient 11:200 Patient 11:50 Patient 11:50 Patient 1BufferBuffer
HBsAg HBsAgControl B adw ayw TNF Control
10 10 5 10 5 1 10 (µg mL-1)
UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry
Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007
Funding sourcesFunding sources
• Spanish Ministry of Education & Science(AMB92-0092-C03, AMB95-0689-C02, AMB98-1043-C02, BQU2002-04515-CO2,
PROFIT, CTQ2006-15610-C02)
• Madrid Community Regional Government(07M/0082/2000, GR/MAT/00512004, S-0505/AMB/0374)
• Spanish Ministry of Education and Science(Doctoral grants)
• European Union (IV, V, VI FP)• Universidad Complutense de Madrid
• Spanish Ministry of Education & Science(AMB92-0092-C03, AMB95-0689-C02, AMB98-1043-C02, BQU2002-04515-CO2,
PROFIT, CTQ2006-15610-C02)
• Madrid Community Regional Government(07M/0082/2000, GR/MAT/00512004, S-0505/AMB/0374)
• Spanish Ministry of Education and Science(Doctoral grants)
• European Union (IV, V, VI FP)• Universidad Complutense de Madrid