SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V

NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

Evidenčné číslo: 2118054

NUTRIČNÁ A TECHNOLOGICKÁ KVALITA ZRNA

FAREBNÝCH GENOTYPOV PŠENICE LETNEJ FORMY

OZIMNEJ

2010 Dáša Čandová, Bc.

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

NUTRIČNÁ A TECHNOLOGICKÁ KVALITA FAREBNÝCH

GENOTYPOV PŠENICE LETNEJ F. OZIMNEJ

Diplomová práca

Študijný program: Biotechnológie

Študijný obor: 4.2.1 Biológia

Školiace pracovisko (katedra/ústav): Katedra biochémie a biotechnológie

Školiteľ: Ing. Milan Chňapek, PhD.

Nitra 2010 Dáša Čandová, Bc.

Čestné vyhláseniePodpísaná Dáša Čandová vyhlasujem, že som záverečnú prácu na tému „Nutričná a

technologická kvalita zrna farebných genotypov pšenice letnej f. ozimnej“ vypracovala

samostatne s použitím uvedenej literatúry.

Som si vedomá zákonných dôsledkov v prípade, ak hore uvedené údaje nie sú

pravdivé.

V Nitre 16. apríla 2010

PoďakovanieTouto cestou si dovoľujem poďakovať vedúcemu diplomovej práce Ing. Milanovi

Chňapekovi, PhD. za jeho všestrannú pomoc a odborné rady, ktoré mi poskytol pri

vypracovaní záverečnej práce.

V Nitre 16. apríla 2009

AbstraktTechnologické vlastnosti pšeničného zrna sú podmienené množstvom a zložením

zásobných bielkovín. Veľmi dôležitou vlastnosťou zásobných bielkovín pšeničného zrna je

schopnosť gliadínov a glutenínov tvoriť lepok. Elektroforetickou separáciou zásobných

bielkovín zrna pšenice pomocou SDS PAGE je možné identifikovať individuálne

vysokomolekulárne (HMW-GS) glutenínové podjednotky, na základe ktorých je možné

diferencovať jednotlivé genotypy a charakterizovať technologickú kvalitu zrna.

Cieľom našej práce bolo pomocou elektroforetickej separácie zásobných bielkovín zrna

pšenice v polyakrylamidovom gély, charakterizovať 4 genotypy konvenčnej pšenice letnej

(Triticum aestivum L.) v porovnaní so 4 farebnými (modré) genotypmi pšenice letnej. Z

dosiahnutých výsledkov vyplýva, že konvenčné odrody sa vyznačujú rozdielnym

zastúpením individuálnych HMW-GS. Najvyššiu technologickú kvalitu vykázala odroda

Astela, Samanta a Lívia.

Z elektroforeogramov farebných genotypov pšenice letnej formy ozimnej vyplýva, že 3

analyzované kultivary boli homogénne jednolíniové. V  kultivare Barevná 9 bola

detegovaná dvojlíniovosť. Táto odroda vykázala Glu-skóre 7 a 9, čo predikuje dobrú

pekársku kvalitu

Z výsledkov ďalej vyplýva, že z génov kódovaných lokusom Glu-Al bola najčastejšie

identifikovaná podjednotka 1. Lokus Glu-Bl bol najčastejšie reprezentovaný HMW -

gluténovými subjednotkami 7+8 a 7+9 Z dosiahnutých výsledkov ďalej vyplýva, že na

pekársku kvalitu múky kladne vplývajúca dvojica podjednotiek 5+10 bola identifikovaná v

8 genotypoch.

Kľúčové slová: farebné genotypy pšenice, zásobné bielkoviny, SDS-PAGE

AbstraktTechnological qualities of a wheat seed are conditioned by the quantity and composition of

the storage proteins. A very important quality of the wheat seed storage proteins is the

ability of the gliadins and glutenins to form gluten. By an electroforetic separation of the

storage proteins using SDS PAGE it is possible to identify individual high-molecular

weight glutenin subunits (HMW-GS). According to that, differentiation of the particular

genotypes and defining of the technological quality of wheat is possible.

The aim of our work was to characterise 4 genotypes of common summer wheat (Triticum

aestivum L.) in comparison with 4 coloured (blue) genotypes of summer wheat using the

electroforetic separation of storage proteins in a polyacrylamid gel.

The result of our research is the fact that the common varieties of wheat are specific in

containing individual HMW-GS. The highest technological quality possesses the Astela,

Samanta and Lívia variety.

From the electroforeogram of the summer wheat coloured genotypes it is clear, that the 3

analysed cultivars were homogenously mono-lined. In the cultivar Barevná 9 the attribute

of dual-line was detected. This variety showed Glu-score 7 and 9, which predicts a good

baking quality.

Secondly, from the Glu-Al locus coded genes the subunit 1 was the most frequently

identified unit. The Glu-Bl locus was the most represented by HMW-gluten subunits 7+8

and 7+9. Thirdly, regarding baking quality of wheat, a positively influential pair of

subunits 5+10 was identified in 8 genotypes.

Key words: color bread wheat, zásobné bielkoviny, SDS-PAGE

Obsah

Úvod.......................................................................................................................................9

1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ PROBLEMATIKY........................11

1.1 Všeobecná charakteristika obilnín.........................................................................11

1.2 Morfológia zrna pšenice........................................................................................13

1.3 Chemické a nutričné zloženie zrna pšenice...........................................................14

1.4 Hodnotenie technologickej kvality zrna pšenice...................................................17

1.5 Vplyv zásobných bielkovín na technologickú kvalitu zrna...................................19

1.5.1 Vplyv HMV – GS na pekársku kvalitu..........................................................20

1.5.2 Vplyv gliadínov na pekársku kvalitu.............................................................23

1.6 Zvyšovanie technologickej kvality pšenice...........................................................24

1.6.1 Flavonoidy ako bioaktívne zlúčeniny............................................................24

1.6.2 Modrá farba zrna............................................................................................25

1.6.3 Purpurová farba zrna......................................................................................26

1.6.4 Červená farba zrna.........................................................................................26

1.6.5 Biela farba zrna..............................................................................................27

1.7 Metódy identifikácie genotypov pšenice...............................................................27

1.7.1 Molekulárne markery u pšenice.....................................................................27

1.8 Identifikácia genotypov cereálií elektroforetickými metódami............................28

1.8.1 Elektroforéza bielkovín v polyakrylamidových géloch.................................29

1.8.2 SDS – PAGE..................................................................................................30

2 CIEĽ PRÁCE................................................................................................................32

3 Materiál a metodika......................................................................................................33

3.1 Biologický materiál...............................................................................................33

3.2 Biochemické rozbory.............................................................................................34

3.2.1 Extrakcia a elektroforetické delenie glutenínov zrna pšenice........................34

3.2.2 Extrakcia a elektroforetické delenie gliadínov zrna pšenice..........................36

3.2.3 Farbenie a vizualizácia bielkovín...................................................................37

3.2.4 Vyhodnotenie a genetická interpretácia elektroforetických profilov bielkovín37

3.2.5 Výpočet obsahu bielkovín a koeficienta nutričnej kvality.............................38

3.2.6 Metóda diskontinuálnej frakcionácie bielkovinového komplexu zrna podľa Osborna 38

3.3 Štatistické vyhodnotenie výsledkov......................................................................38

4 VÝSLEDKY A DISKUSIA.........................................................................................39

5 ZÁVER.........................................................................................................................44

6 Zoznam použitej literatúry............................................................................................45

Úvod

Rastlinná výroba predstavuje základ svetového hospodárstva. Pripadajú na ňu

minimálne 2/3 hodnoty produkcie svetového poľnohospodárstva. Obilniny tvoria kľúčovú

skupinu plodín rastlinnej výroby Slovenska. Ich pestovanie je dominantné, pretože sa

podieľajú 40 % na energetickej hodnote spotrebovaných potravín a 35 % energetickej

hodnoty vo výžive zvierat. Prioritné postavenie v pestovaní a produkcii obilnín

v podmienkach Slovenska patrí pšenici, ktorá zaberá takmer štvrtinu výmery ornej pôdy,

čo predstavuje cca 51 %-ný podiel z celkovej plochy obilnín. Pšenica patrí k

najvýznamnejším konzumným obilninám, je energeticky a nutrične hodnotná a jej

kultivácia je ekonomicky efektívna.

Pšenica patrí medzi náročné obilniny, hlavne čo sa týka kvality pôd (černozeme a

hnedozeme s dostatkom humusu a vápna), teplôt (optimálne 25 – 30 ºC, minimálne 6 ºC) a

množstva zrážok. Aj napriek vysokým nárokom, sú areály vyšľachtených odrôd pšenice

veľmi rozsiahle a zahŕňajú prakticky všetky kontinenty. Celková produkcia obilnín vo

svete v rokoch 2000 – 2005 sa pohybovala v rozmedzí od 2042 do 2268 mil. ton, z toho

produkcia pšenice dosiahla 561 až 629,5 mil. ton. Pšenica sa pestuje najmä na severnej

pologuli. Najväčšími producentmi sú Čína, USA, India, Kanada, Nemecko a Rusko.

Pre potravinárstvo sa využívajú najmä odrody ozimnej a jarnej formy letnej pšenice

a odrody tvrdej pšenice. Pšeničné zrno sa využíva na výrobu chleba, pečiva, cestovín, krúp

a cukrárenských výrobkov. Pšenica má i vysokú dietetickú hodnotu, najmä celozrnný

chlieb, pri ktorom sa pozitívne hodnotí vplyv vlákniny na zníženie cholesterolu v krvi

a činnosť čriev. Obilniny obsahujú významné množstvo antioxidantov predovšetkým

polyfenolickej povahy, karotenoidov, tokoferolov, čím pozitívne vplývajú na celý rad

srdcovo – cievnych ochorení. Konzumáciou pšenice získava ľudstvo približne 21 %

energie. Pšeničné šroty a otruby slúžia ako sacharidové krmivo pre hospodárske zvieratá.

Priemyselne sa využíva ako surovina na výrobu lepkových bielkovín, lepidiel, škrobu

s následným využitím v papiernickom a textilnom priemysle, na výrobu alkoholu

a plastických látok.

Trvalý rast životnej úrovne a uspokojovanie stále vyšších potrieb obyvateľstva sú

základné atribúty rozvinutej spoločnosti. V súčasnosti sa kladie hlavný dôraz na to, aby

naša výživa bola vyvážená nielen v množstve ale aj štruktúre. Proces zlepšovania

kvalitatívnych vlastností odrôd pšenice letnej formy ozimnej je náročný výskumno–

šľachtiteľský proces, ktorý sa stáva zvlášť obtiažnym pri tvorbe materiálov s vysokým

úrodovým potenciálom a zároveň s vysokou technologickou kvalitou.

Pšenica letná je hexaploid (2n-6x-42) a jednotlivé znaky kvality sú kódované na

rôznych chromozómoch. Napriek značnej zložitosti genomu je známa rada markerov pre

tieto znaky: sedimentácia, obsah bielkovín, gliadíny, HMW (High Molecular Weight –

vysokomolekulárne) a LMW (Low Molecular Weight – nízkomolekulárne) podjednotky

glutenínu, obsah škrobu a jeho vlastnosti. Gliadínové a glutenínové profily pšenice sú

dostatočne polymorfické pre diferenciáciu aj počtom veľkých súborov genotypov. Z tohto

dôvodu sa pri pšenici, pre účely identifikácie a diferenciácie genetických zdrojov

používajú v prevažnej miere metódy analýzy bielkovinových markerov.

1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ PROBLEMATIKY

1.1 Všeobecná charakteristika obilnín

Pšenica je najdôležitejšia chlebová obilnina s vysokým podielom bielkovín a

kvalitného lepku. Predstavuje základný zdroj ľudskej výživy. Zo všetkých druhov sa

pestuje najviac. Je to mnohozrný, morfologicky a ekologicky značne plastický druh

(Karabínová et al., 1999).

Za pravlasť pšenice považujeme územie Prednej a Malej Ázie. Začiatky pestovania

pšenice úzko súvisia so vznikom poľnohospodárstva v 10.-8. tisícročí pred n.l. (Gajdošová

et al., 2004).

Pšenica letná (Triticum aestivum L.) je najrozšírenejším druhom tak vo svete, ako aj v SR.

Zaberá 80 – 90 % z celkovej pestovateľskej plochy. Má ozimné a jarné formy a takmer

všetky povolené odrody patria k uvedenému druhu. Pšenica letná forma ozimná (Obrázok

1) patrí k najdôležitejším chlebovým obilninám vo svete a jej význam sa neustále zvyšuje.

Z botanického hľadiska rod Pšenica (Triticum L.) patrí do čeľade lipnicovitých

(Poaceae). Zahŕňa niekoľko druhov a veľký počet foriem a kultivarov. Hlavné sú dva

druhy: pšenica obyčajná (Triticum aestivum L.) a pšenica tvrdá (Triticum durum Defs.).

Podľa počtu chromozómov rozdeľujeme pšenicu na tri skupiny:

a) diploidné pšenice so 14 chromozómami (Triticum monococcum L.),

b) tetraploidné pšenice s 28 chromozómami (Triticum dicocoides L.),

c) hexaploidné pšenice so 42 chromozómami (Triticum aestivum L., Triticum spelta L.)

(Zimolka et al., 2005).

Podľa prítomnosti obalových vrstiev delíme pšenicu na tri typy:

a) bezplevnatá (nahá) pšenica,

b) plevnatá pšenica,

d) nekultúrna (divoká) pšenica.

Obrázok 1. Rastlina a zrno pšenice letnej (Gajdošová et al., 2004).

Podľa farby klasu a zrna, ostinatosti sa Triticum aestivum delí do variet:

1. lutescens – farba klasu biela bezostinatá až ostinkatá,

2. milturum – farba klasu červená, bezostinatá až ostinkatá,

3. erythrospermum – farba klasu biela ostinatá,

4. ferrugineum – farba klasu červená ostinatá (Kulík et al., 2002).

Súčasné odrody pšenice boli získané skrížením pšenice dvojzrnkovej – dvojzrnky

(Triticum dicoccum). Nové kultivary sa získavajú krížením druhu (T. aestivum) s inými

druhmi, ktoré disponujú vlastnosťami ako napríklad odolnosť voči chorobám a škodcom,

lepší výnos zrna, vyšší obsah bielkovín (Pospíšil et al., 2008).

1.2 Morfológia zrna pšenice

Plodom pšenice je zrno vajcovitého tvaru, ktoré dosahuje dĺžku 4 až 10 mm v

závislosti od odrody a pozície klásku v klase. Dobre vyvinuté zrno väčšiny odrôd pšenice

je na povrchu hladké, s oblými hranami, na báze perikarpu v mieste umiestnenia embrya

mierne vráskavé. Na ventrálnej strane zrna sa nachádza brázda, ktorá sa smerom do stredu

zrna rozširuje a rozdeľuje zrno na dve lícne časti. Na vrchole zrna sa nachádza kefka

pozostávajúca z viacerých chĺpkov. Podľa tvrdosti zrna rozdeľujeme odrody pšenice na

mäkké, polotvrdé a tvrdé (Morfológia pšenice, 2010).

Najvrchnejšia vrstva zrna (oplodie) chráni zrno pred mechanickým poškodením, je

tvorená celulózou. Oplodie sa skladá z niekoľkých vrstiev:

1. pokožky – epidermis,

2. podpokožky – hypodermis,

3. vrstvy stredných, priečnych, rúrkovitých, alebo vakových buniek (Hrabe et al., 2006).

Podpovrchové vrstvy (osemenie) obsahujú v bunkách farbivá a určujú tak farebný

vzhľad zrna. Ďalšie vrstvy obsahujú polysacharidové látky schopné do určitej miery viazať

vodu, čím prispievajú k udržovaniu stálej vlhkosti zrna (Príhoda et al., 2004).

Endosperm tvorí 84 – 86 % hmotnosti zrna. Endosperm z veľkej časti pozostáva zo

škrobových granúl uložených v bielkovinovom matrixe (Evers et al., 1999). Správne

vyvinuté zrno má jemný, priemerný alebo škrobovitý endosperm (Morfológie pšenice,

2010).

Na rozhraní medzi obalovými vrstvami a endospermom sa nachádza jednoduchá

vrstva zložená z veľkých buniek nazývaná aleurónová vrstva. Bunky aleurónovej vrstvy

obsahujú vysoký podiel bielkovín (asi 30 %), čo je takmer trojnásobok obsahu v

endosperme. Tieto bunky obsahujú taktiež najvyšší obsah minerálnych látok zo všetkých

buniek zrna, preto sa pri vymieľaní aleurónovej vrstvy výrazne zvýši obsah minerálií v

múke (Príhoda et al., 2004). Skladba jednotlivých vrstiev zrna je znázornená na obrázku č.

2.

Obrázok 2. Skladba jednotlivých vrstiev zrna pšenice (Gajdošová et al., 2004).

1.3 Chemické a nutričné zloženie zrna pšenice

Na chemické a nutričné zloženie pšeničného zrna vplýva mnoho faktorov, ako

napríklad oblasť pestovania, odroda, hnojenie, doba siatia, klimatické podmienky a celý

rad ďalších činiteľov (Frančáková et al., 2002).

Pšeničné zrno (Tabuľka 1) obsahuje približne 12 – 14 % vody a zvyšok tvorí

sušina. Základné živiny, ktoré sú zastúpené v sušine sú bezdusíkaté extraktívne látky (64

%), bielkoviny (10 – 16 %), tuky (2,2 %), vláknina (2,4 %) a popoloviny (2 %)

(Karabínová et al., 1999).

Celé pšeničné zrno obsahuje mnoho vitamínov (skupina B, najmä tiamín) a

minerálnych látok (vápnik, železo, fosfor), najmä v obalovej vrstve a klíčku.

Obsah škrobu v pšeničnom zrne sa pohybuje od 50 – 70 %. Škrob sa skladá z dvoch

polysacharidov (amylóza a amylopektín). Molekula amylopektínu má rozvetvený reťazec,

v ktorom sa okrem väzieb 1,4 medzi uhlíkmi, vyskytujú i väzby 1,6, preto ľahšie odoláva

amylolytickým enzýmom, než molekula amylózy (Prugar et al., 2008).

Tabuľka 1: Hlavné zložky jednotlivých častí zrna pšenice (Gajdošová et al., 2004).

Chemické

komponenty

Obsah jednotlivých zložiek v %

Celé zrnoAleurónová

vrstvaZárodok Endosperm

Proteíny 10-17 23-33 36-42 9-14

Škrob 60-70 0 0 78-84

Celulóza 2,5-3,3 12-20 3-5 0,13-0,18

Lipidy 2,0-2,5 7,0-8,5 12-16 0,5-0,7

Minerálne látky 1,4-2,3 9-11 5-6 0,3-0,5

Zo všetkých látok obsiahnutých v zrne pšenice majú najväčší význam bielkoviny

a to z hľadiska technologického, nutričného i kŕmnej hodnoty (Karabínová et al., 1999).

Bielkoviny sú heterogénne látky, zložené z viacerých frakcií, ktoré sa ďalej

rozčleňujú na subfrakcie s charakteristickými vlastnosťami a aminokyselinovým zložením

(Prugar et al., 1986).

Zrelé zrno obsahuje 10-15 % bielkovín, z toho 80-90 % všetkých bielkovín tvoria

zásobné bielkoviny.

Najvyšší obsah bielkovín je v aleurónovej vrstve a v klíčku, kde sa vyskytujú vo

forme metabolicky a geneticky dôležitých látok ako sú enzýmy a nukleoproteiny (Prugar et

al., 2008).

Bielkoviny sa ukladajú v obilninách vo forme bielkovinových teliesok v škrobovom

endosperme a v aleurónových bunkách.

Pšeničná bielkovina je bohatá na aminokyseliny, prolín a kyselinu glutámovú, je

však deficitná na arginín, histidín a má veľmi nízky obsah lyzínu a treonínu (Karabínová et

al., 1999).

Podľa Michalíka (2005) môžeme bielkoviny rozdeliť z hľadiska fyzikálno-

chemických alebo biologických vlastností do rôznych skupín, pričom z hľadiska výživnej a

technologickej kvality je dôležité delenie na albumíny, globulíny, prolamíny (gliadíny pre

pšenicu) a glutelíny (gluteníny pre pšenicu). Vzhľadom na svoju veľkú relatívnu

molekulovú hmotnosť majú bielkoviny niektoré vlastnosti makromolekúl. Ide

predovšetkým o schopnosť tvorby vláknitých a plošných anizotropných štruktúr (filmov),

schopnosť bobtnania a schopnosť tvorby silno viskóznych roztokov s fyzikálnymi

vlastnosťami podobnými anorganickým koloidom.

Najvýznamnejšou vlastnosťou pšeničných bielkovín je tvorba lepku. Lepok tvoria

bielkoviny nerozpustné vo vode (gliadín a glutenín), pričom gliadín je považovaný za

nositeľa ťažnosti, glutenín za nositeľa pružnosti a napučiavania lepku (Frančáková et al.,

2002).

Biologická hodnota bielkovín ( BHB ) je súčasťou výživnej hodnoty bielkovín. Pod

biologickou hodnotou bielkovín sa rozumie zhoda aminokyselinového zloženia daných

bielkovín s aminokyselinovým zložením tých bielkovín, ktoré sa využívajú na stavbu

organizmu človeka, resp. živočícha. Rastlinné (i živočíšne) bielkoviny sa skladajú z 20

proteinogénnych aminokyselín, z ktorých niektoré sú tzv. esenciálne, pretože v organizme

človeka nedochádza k ich syntéze. Nedostatok niektorej esenciálnej aminokyseliny

v potrave obmedzuje využitie všetkých ostatných aminokyselín v potrave (Prugar et al.,

2008).

Z nutričného hľadiska sú dôležité aj pšeničné klíčky, ktoré sú zdrojom biologicky

vysoko hodnotných látok a obsahujú všetky vitamíny skupiny B, vitamíny A, C, D a E. Sú

zložené zo sacharidov, lipidov a bielkovín vyznačujúcich sa vysokým podielom

esenciálnych aminokyselín. Olej z pšeničných klíčkov má vysoký obsah vitamínu E, ktorý

má antioxidačné vlastnosti a chráni bunkové membrány.

Fenolické látky obsiahnuté v rastline ovplyvňujú jej vzhľad, chuť, vôňu, vyznačujú

sa antioxidačnými vlastnosťami a slúžia ako prevencia voči civilizačným ochoreniam.

Z fenolových kyselín bola zistená najmä kyselina ferulová v množstve 50μg/g v

pšeničnej múke a 500 μg/g tejto kyseliny v celej pšenici. V extraktoch pšeničných otrúb

boli identifikované kyselina prokatechínová, kyselina gentisínová, kyselina kávová,

kyselina ferulová. V podmienkach gastrointestinálneho pH a enzýmovej hydrolýzy vzrástla

rozpustnosť a antioxidačná aktivita pšeničných polyfenolov, vďaka čomu možno

považovať pšenicu za dôležitý antioxidačný doplnok. V klíčkoch pšenice sa zistila

koncentrácia 1947-4082 μg/g tokoferolov (Gálová, 2002).

1.4 Hodnotenie technologickej kvality zrna pšenice

Technologická kvalita pšenice sa posudzuje predovšetkým z obsahu lepkových

bielkovín, ktoré sú tvorené frakciami gliadínov a glutenínov a sú spolu so škrobom

významné pri spracovaní pšenice pre pekárenské využitie (Zálešáková et al., 2004).

Z hľadiska spracovateľského priemyslu je veľmi dôležitá kvalita pšeničného zrna,

ktorá zahŕňa širokú škálu aspektov a jej hodnotenie by malo byť vždy komplexné. Kvalitu

môžeme merať kvalitatívnymi a kvantitatívnymi parametrami a na jej zlepšenie alebo

zhoršenie vplývajú rôzne faktory: šľachtenie a výber odrôd, mykotická kontaminácia,

priebeh počasia, technológia pestovania, zber, pozberová úprava, transport a skladovanie

(Frančáková et al., 1995).

Podľa účelu použitia delíme pšenicu na: tvrdú, potravinársku, kŕmnu a osivo

pšenice. Kvalita pšenice na potravinárske účely sa hodnotí z hľadiska :

1. obchodného (hodnotí sa stav obilnej masy),

2. mlynárskeho (štruktúrne - mechanická skladby, chemické zloženie pšeničného zrna),

3. pekárenského (koloidný komplex škrob - bielkoviny a aktivita enzýmového systému).

Pri hodnotení charakteristík pšenice letnej (Triticum aestivum L.) sa najčastejšie

hodnotí mlynárska a pekárska kvality pšenice. Mlynsko – pekársku kvalitu pšenice

podmieňuje hlavne komponentná skladby gluténových bielkovín (podiel

vysokomolekulárnych a nízkomolekulárnych komponentov gluténu) (Karabínová et al.,

1999).

Mlynárska hodnota (stanovenie HTZ, stanovenie prvej triedy, stanovenie

objemovej hmotnosti, stanovenie obsahu popolovín) pšenice je závislá od štruktúrno–

mechanickej skladby a od chemického zloženia zrna. Prejavuje sa pri mletí obilia a má

vplyv na celý rad ďalších vlastností finálneho výrobku.

Pekársku kvalitu pšenice (stanovenie sušiny, stanovenie pádového čísla, stanovenie

hrubého proteínu, stanovenie obsahu škrobu, stanovenie mokrého lepku (G0), stanovenie

ťažnosti lepku (t0), stanovenie napučiavania lepku (Q0), stanovenie Zelenyho testu)

charakterizujú vnútorné vlastnosti a znaky, ktoré sa prejavujú až pri spracovávaní múky na

finálny pekársky výrobok. K základným ukazovateľom pekárskej akosti pšenice patrí

množstvo a vlastnosti lepku. Lepok podmieňuje reologické vlastnosti cesta a charakterizuje

silu múky (Černý et al., 1996).

Podľa Muchovej et al. (2008), pekárska kvalita pšeničnej múky závisí

predovšetkým od nasledovných vlastností:

schopnosť vytvoriť pri kysnutí určité množstvo CO2 (plynotvorná schopnosť múky),

schopnosť vytvoriť cesto, ktoré dokáže udržať vytvorené množstvo CO2 (závisí od

množstva a vlastností bielkovín) – čo ovplyvňuje výsledok kysnutia, prejaví sa v

objeme a tvare výrobku,

schopnosť tmavnúť(farba múky) – vplyv na farbu striedky.

Pšenica na potravinárske účely sa posudzuje pri výkupe podľa nasledovných

hodnôt, ktoré sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2: Hodnoty potravinárskej pšenice (Frančáková, et al., 2002)

Akostné znaky JednotkaTrieda kvality

E A B P

Vlhkosť % 14 14 14 14

Objemová hmotnosť

min.g/l 800 780 760 750

Obsah dusíkatých

látok v sušine% 13,5 12,5 11,5 10

SDS-test min. ml 55 50 45 40

Prímesí spolu max. % 4 5 5 5

- najklíčené zrná

pšenice max.% 1 1 1 1

- zrnové prímesi max. % 1,5 2 2 2

Nečistoty max. % 0,5 0,5 0,5 0,5

Odporúčané znaky

kvality

Obsah mokrého lepku

v suš.min.% 30 27 25 22

Sedimentačný index

podľa Zelenyho min.ml 35 30 25 -

Podľa v súčasnosti platnej normy STN 46 1100-2 z roku 2003 sa potravinárska

pšenica letná zaraďuje do štyroch tried kvality:

E – elitná

A – vylepšujúca

B – štandardná

P – slabá pečivárenská (Frančáková, et al., 2002)

1.5 Vplyv zásobných bielkovín na technologickú kvalitu zrna

Rastlina akumuluje bielkoviny vo forme zásobných látok v špecializovaných

orgánoch a bunkách, nachádzajúcich sa hlavne v semenách a hľuzách. Tvoria zásobu

bielkovín využívanú pri vytváraní optimálnych podmienok pri vývoji nového rastlinného

jedinca. Tieto bielkoviny sa vďaka svojej funkcii nazývajú zásobné bielkoviny (Kraic,

2004). Zásobné bielkoviny slúžia ako zdroj dusíka pre rastúci organizmus a charakterizuje

ich vysoký obsah kyseliny glutámovej (často ako amid z glutamínu) a prolínu (Michalík,.

2008).

Na základe rozpustnosti, ktorá je determinovaná ich primárnou štruktúrou,

nekovalentnými väzbami (vodíkové väzby a hydrofóbne interakcie) a kovalentnými

(disulfidickými) väzbami, sa už niekoľko desaťročí používa ich klasifikácia na:

albumíny – rozpustné vo vode,

globulíny – rozpustné v roztokoch solí,

prolamíny – rozpustné v alkohole,

gluteníny – rozpustné v slabých kyselinách a zásadách (Kraic, 2004).

Zásobné bielkoviny v endosperme vytvárajú bielkovinový komplex, ktorý

z hľadiska chemickej skladby, fyzikálnych a biologických vlastností a lokalizácie v rámci

zrna tvorí komplex heterogénnych bielkovín (Michalík, 2008).

Zásobné bielkoviny pšenice (gliadíny a gluteníny) sú hlavnými komponentmi

lepku, ktorý je zodpovedný za reologické vlastnosti a chlebopekársku kvalitu pšeničnej

múky. Rozmanité kombinácie glutenínových podjednotiek ovplyvňujú technologickú

kvalitu odrôd pšenice rôznymi spôsobmi (Jomová et al., 2008).

Gluténové bielkoviny možno rozdeliť do troch skupín (Shewry et al., 1989):

na síru bohaté bielkoviny – tvoria 80 – 90 % všetkých gluténových bielkovín

(patria sem α-, β- a γ-gliadíny),

na síru chudobné bielkoviny (ω-gliadíny),

agregované bielkoviny s vysokou molekulovou hmotnosťou (HMW-GS) a s nízkou

molekulovou hmotnosťou (LMW-GS).

1.5.1 Vplyv HMV – GS na pekársku kvalitu

Pšeničný glutenín predstavuje vysokomolekulárnu frakciu lepku a predstavuje asi

40 % celkového obsahu bielkovín pšenice. Bola zistená nepriama úmernosť medzi

objemom pečiva a množstvom glutenínu rozpustnom v zriedenej kyseline octovej (0,05 M)

a priama úmernosť s glutenínmi nerozpustnými v zriedenej kyseline octovej, teda rozdiely

v akosti odrôd pšenice sú v značnej miere spôsobené rozdielmi v glutenínovej frakcii

pšeničných bielkovín (Frančáková, H. 2002).

Gluteníny sú heterogénnou zmesou polymérov, ktoré formujú disulfidové väzby

polypeptidov. Gluteníny sa podľa veľkosti molekúl delia na HMW-GS (glutenínové

podjednotky s vysokou molekulovou hmotnosťou) a LMW-GS (glutenínové podjednotky s

nízkou molekulovou hmotnosťou) (Zálešáková et al., 2004).

Štruktúra HMW glutenínovej podjednotky je zložená z alfa – helixu a beta špirály

(obrázok 3).

Obrázok 3. Molekulový model špirálnej štruktúry HMW podjednotiek glutenínu

(http://www.ars.usda.gov/Research/docs.htm?docid=12828&page=3&pf=1&cg_id=0)

Technologická akosť pšenice je podmienená radou génov kódujúcich syntézu

zásobných bielkovín zrna, z ktorých významnú úlohu majú vysokomolekulárne (HMW)

bielkovinové podjednotky, nachádzajúce sa na chromozómoch prvej (1A, 1B, 1D) a šiestej

(6A, 6B, 6D) homologickej skupiny. Medzi HMW podjednotky patria u pšenice gliadíny

a niektoré gluteíny, pričom zvlášť HMW gluteniny majú rozhodujúci význam. Takmer

všetky odrody pšenice s najlepšou pekárskou kvalitou (E a A) obsahujú na chromozóme

1D glutenínový lokus Glu-D1 s alelickým blokom d, ktorý kóduje vysokomolekulárne

(HMW) podjednotky 5+10. Podjednotky 5 a 10 sú vo veľmi tesnej genetickej väzbe

a fungujú ako jediný gén. Preto sa pre ne používa jeden genetický symbol Glu-D1d. Glu-

D1d významne prispievajú k dobrej pekárskej kvalite u pšenice (Martinek et al., 2006).

HMW-GS sú kódované lokusmi Glu-1, lokalizovanými na dlhých ramenách

chromozómov skupiny 1 (1A, 1B, 1D). Tieto gény sa označujú ako Glu-A1, Glu-B1 a Glu-

D1. Rôzne HMW-GS vplývajú rôzne na kvalitu lepku a pšenice ako celku (Zalesakova,

2004). Zo zastúpenia jednotlivých HMW-GS možno predigovať technologickú kvalitu

zrna pšenice vypočítaním Glu-hodnotenia (Vivodík et al., 2007).

Za zdroje vysokej pekárskej kvality sú označované odrody s HMW – Glu

komplexnými alelami 1 alebo 2* (lokus Glu-1A), 7+8, 17+18, 13+16 (lokus Glu–1B),

5+10 (lokus Glu-1D) (Gregová et al., 2001).

Payne et al. (1987) publikovali, aké sú príspevky HMW-GS na pekársku kvalitu vo

forme bodového hodnotenia (Tabuľka3), ktorého súčet pre jednotlivé genotypy pšenice sa

označuje ako tzv. Glu-skóre.

Tabuľka 3: Bodové predikčné hodnoty HMW-GS markerov pekárskej kvality.

Lokus Alela Body

1A

0 1

1 3

2* 3

1B

6+8 1

7 1

7+8 3

7+9 2

13+16 3

14+15 1

17+18 3

20 1

1D 2+12 2

3+13 2

4+12 1

5+10 4

Fyzikálno-chemické a biologické vlastnosti HMW-glutenínových podjednotiek

a tiež ich pomerné zastúpenie má významnejší vplyv na kvalitu múky ako celkový obsah

bielkovín (Holečková, Michalík, 1992). Vlastnosti cesta nie sú ovplyvnené len

glutenínovým zložením, významnú úlohu zohráva aj rovnováha medzi ďalšími jeho

zložkami, ako je škrob, gluténové proteíny, lipidy, voda a samozrejme interakcie medzi

týmito komponentmi (Tohver et al., 2001).

1.5.2 Vplyv gliadínov na pekársku kvalitu

Významnou frakciou zásobných bielkovín sú gliadíny, ktoré sú heterogénnou

zmesou jednovláknových polypeptidov. V zrne tvoria hlavnú časť bielkovín, pričom ich

obsah je rozličný a závisí od vonkajších podmienok, kultivaru a podmienok extrakcie

(Bajči et al., 1994).

Gliadíny majú značný vplyv na kvalitu múky. Počas formovania cesta netvoria

veľké kovalentne viazané siete, ale majú vplyv na plasticitu cesta, teda na extenzibilitu,

ktorá je dôležitou reologickou charakteristikou cesta (Zálešáková et al., 2004).

Pšeničné gliadíny (Gli) sú veľmi polymorfnou skupinou zásobných bielkovín

semien zložených zo sérií komplexných genetických lokusov nájdených na niekoľkých

ramenách chromozómov. Predstavujú gliadínové bielkoviny lepku, ktoré sa nachádzajú v

extrakte múky ako monomérne polypeptidy. V praxi boli gliadíny rozdelené podľa

pohyblivosti ku katóde v polyakrylamidovom géli pri nízkom pH (pH=3) do skupín

označených ako α-, β-, γ- a ω- gliadíny.

Existuje rozdelenie, podľa ktorého sa polypeptidy gliadínov vyskytujú v skupinách

(blokoch) podľa génov, ktoré ich kódujú. Hlavné bloky gliadínov sú umiestnené na

krátkych ramenách prvej a šiestej skupiny chromozómov (označené ako Gli-1 a Gli-2

lokusy) pre všetky tri genómy (A, B a D). Poloha génu zabezpečuje polypeptidmi

gliadínov a glutenínov a tiež komplementaritu, z ktorej vychádzajú názvy jednotlivých

gliadínových polypeptidov zodpovedajúcich ich špecifickým alelám na daných lokusoch

(napríklad Gli-A1a, Gli-A1b,...) (Branlard et al., 2003).

Alely kódujúce gliadíny sú početné a ich frekvencia sa líši podľa oblastí. Pšeničné

odrody pochádzajúce z rôznych krajín sú ľahko rozlíšiteľné elektroforetickou analýzou na

základe gliadínových bielkovín, zatiaľ čo odrody pochádzajúce z rovnakej krajiny často

disponujú podobnými znakmi (Jomová et al., 2008).

Gliadíny sa vyznačujú vysokou dedivosťou a špecifickosťou. Elektroforetické

profily gliadínov sa vplyvom podmienok pestovania nemenia, preto je možné na ich

základe presne identifikovať a diferencovať jednotlivé odrody a línie pšenice (Černý a

Šašek, 1995, 1996).

1.6 Zvyšovanie technologickej kvality pšenice

V poslednom období sa mení prístup a pohľad poľnohospodárov k šľachteniu

poľnohospodárskych plodín. Kým v minulosti boli pri šľachtení hlavnými požiadavkami

hektárová výťažnosť, odolnosť proti chorobám spôsobených fytopatogénmi v súčasnosti

popri nich stále viac vstupujú do pozornosti aj kvalitatívne parametre ako je obsah

vlákniny vo forme β-glukánov , minerálov, vitamínov, proteínov, ale aj sekundárnych

metabolitov s biologickými účinkami. Vďaka obsahu týchto cenných zložiek sú

poľnohospodárske plodiny základom pre výrobu tzv. funkčných potravín a nutraceutík

(Pšenáková et al., 2006). Nutričnú hodnotu produktov je možné zlepšiť šľachtením, ale v

mnohých prípadoch si to vyžaduje náročnú dlhoročnú prácu (Brindza, 2007).

Šľachtitelia sú v dôsledku požiadaviek trhu nútení zvyšovať okrem úrody zrna aj

mlynársku a pekársku kvalitu. Za účelom zlepšenia pestovateľských vlastností pšenice a

zvýšenia kvality pšeničného zrna sa využívajú metódy molekulovej biológie, genetiky a

biotechnológií (Bežo et al., 2005). V súlade s tradičnými šľachtiteľskými postupmi,

biotechnológia prispieva k vyvíjaniu nových účinnejších metód pre genetické manipulácie

a kontrolu tvorby nových odrôd.

Kvalitatívne vlastnosti odrôd pšenice sú komplexné a nemôžu byť hodnotené

jediným laboratórnym postupom. Je na to potrebná séria testovacích metód, ktoré hodnotia

mnoho testovaných komponentov kvality všetkých odrôd pšenice.

Obilniny vzhľadom na funkčné zložky (vlákninový komplex, minerálne látky,

esenciálne tuky, bielkoviny) nachádzajúce sa v prirodzenej alebo koncentrovanej forme

predovšetkým v obalových častiach zrna a v zárodku, môžu zohrávať významnú úlohu pri

vytváraní základu úspechu výroby obohatených ale aj funkčných potravín (Pšenáková et

al., 2006).

1.6.1 Flavonoidy ako bioaktívne zlúčeniny

Poľnohospodárske plodiny a výrobky z nich majú pozitívne fyziologické účinky.

Okrem vysokého množstva vlákniny obsahujú látky s antioxidačnými účinkami, vrátane

fenolových zlúčenín (Pšenáková et al., 2006). Bolo zistené, že netradične sfarbené

genotypy pšenice letnej vykazujú zvýšenú prítomnosť biologicky aktívnych látok

patriacich do skupiny fenolických zlúčenín. Fenolické látky obsiahnuté v rastline

ovplyvňujú jej vzhľad, chuť, vôňu, vyznačujú sa antioxidačnými vlastnosťami a slúžia ako

prevencia voči civilizačným ochoreniam.

Antokyány sú zložky flavonoidov rozpustné vo vode, ktoré dávajú zrnu

charakteristické modré, červené alebo purpurové zafarbenie. Lokalizované sú hlavne

v perikarpe (červené a purpurové genotypy), alebo v aleuronovej vrstve (modré genotypy)

zrna. Obsah antokyánov v modro sfarbených genotypoch kolíše v rozsahu 106-153 μg.g-1,

kým v červených a purpurových genotypoch od 13 do 139 μg.g-1 (Chňapek et al., 2010).

Antokyány tvoria najväčšiu skupinu vo vode rozpustných rastlinných pigmentov. Z

chemického hľadiska sa zaraďujú medzi pyránové farbivá. Môžu byť uložené v bunkovej

šťave buniek voľne ako antokyanidíny alebo sú viazané glykozidicky so sacharidom vo

forme antokyanínov (Matuškovič, 1998).

Antokyány sú v prírode veľmi rozšírené pigmenty s modrou, fialovou alebo

červenou farbou, ktoré sú zodpovedné za charakteristickú farbu kvetov, ovocia, prípadne

listov danej rastliny (Šimko et al., 2007). Podľa chemickej štruktúry sa flavonoidy triedia

do podskupín, ktorými sú antokyanidíny, flavonoly, flavóny, flavonoly, flavanóny,

chalkóny, dihydrochalkóny, dihydroflavonoly, auróny a izoflavonoidy (Pšenáková et al.,

2006).

Stabilitu antokyánov ovplyvňuje chemická štruktúra, pH prostredia, teplota,

prítomnosť kyslíka, kyselina askorbová, sacharidy, kovy a enzýmy. Antokyány výrazne

menia farbu so zmenou pH, čo súvisí s ich štrukturálnou transformáciou. Všeobecne

môžeme povedať, že sa antokyaníny v kyslom prostredí sfarbujú do červena, v neutrálnom

prostredí do modra a v alkalickom do fialova (Paulovicsová et al., 2007).

Dlhodobé výskumy potvrdzujú pozitívny účinok antokyanínových pigmentov na

živé organizmy. Antokyány sa vyznačujú antioxidačným účinkom a sú schopné

vychytávať hydroxidové, peroxidové a hyperperoxidové radikály a spolu s oxidmi dusíka

aktívne pôsobiaproti deštrukcii látok v organizme (Šimko et al., 2007). Ďalej sú známe

napr. antialergické, protizápalové, antikancerogénne, antidiabetické, kardioprotektívne a

antivírusové účinky rôznych flavonoidov (Pšenáková et al., 2006).

1.6.2 Modrá farba zrna

Qualset et al. hovorí o existencii jarnej pšenice UC66049B s modrým zrnom.

Uvádza, že modrý aleuron je riadený kodominantne pôsobiacim génom Ba (blue aleurone).

Do pšenice sa gén Ba dostal prenesením celého ramena chromozómu z Elytrigia pontica.

Pri vzorke TRI 2401 (Triticum aestivum var. tschermakianum Mansf.) pochádzajúcej

z génovej banky v IPK Gatersleben v Nemecku, sa uvádza iný spôsob získania modrého

zrna. Modré zrno bolo získané disubmickou substitúciou chromozómu 4A iným

chromozómom neznámeho pôvodu. Podľa odchylok v spôsobe dedičnosti modrého zrna sa

uvažuje, že môže ísť o odlišný gén od génu Ba z Elytrigia pontica.

Pri pšenici s modrým zrnom obsahoval šrot 251 mg.kg-1 antokyánov a otruby 104 mg.kg-1

antokyánov (Martinek et al., 2006).

1.6.3 Purpurová farba zrna

Purpurová farba zrna bola prenesená z purpurových tatraploidných a hexaploidných

pšeníc, pochádzajúcich z Etiópie. Purpurové zrno obsahuje antokyány v povrchových

vrstách zrna (perikarp), najviac je zastúpený kyanidin-3-glycosid. V purpurových

pšeniciach sa uvádza priemerný obsah antokyánov v štore 157 mg.kg-1 a v otrubách 458

mg.kg-1.

Pre purpurovú farbu zrna, pochádzajúcu z austrálskej odrody Purple Feed

a kanadsej Purple, boli vytvorené takmer dve izogénne línie. Purpurová farba zrna je

podmienená génom Pb (purple pericarp). Pomocou monosomickej analýzy boli gény

z Purple Feed lokalizované na 7B(Pp1) a na 6A (Pp2).

1.6.4 Červená farba zrna

Červená farba zrna sa vyskytuje u väčšiny bežných odrôd. Červený perikarp je

podmienený dominantnými alelami lokusu R. Predpokladá sa, že R gény môžu byť

transkripčnými faktormi pre syntézu flavonoidov.

Fenolické látky obmedzujú výskyt voľných radikálov, inhibujú lipoxydgenázu

a fungujú ako nešpecifické inhibítory (Martinek et al., 2006).

1.6.5 Biela farba zrna

Biela farba zrna je riadena zostavou recesívnych alel r1, r2, r3. Pšenica s bielym

zrnom má nižší obsah fenolických žložiek, ktoré sú horké. Neobsahuje polyfenol oxidázu,

ktorá sa u červenorznej pšenice nachádza v povrchových vrstvách. Neprítomnosť horkých

látok spôsobuje, že je produkt prirodzene sladší (význam v cukrárstve) (Martinek et al.,

2006).

1.7 Metódy identifikácie genotypov pšenice

1.7.1 Molekulárne markery u pšenice

Pri rozlišovaní genotypov obilnín sú najčastejšie používanými markermi zásobné

bielkoviny. Pšenica je ideálnym príkladom pre využitie zásobných bielkovín, ako vysoko

polymorfných markerov. Bielkovinové frakcie rozpustné v alkohole a slabej kyseline, teda

gliadíny, resp. gluteníny endospermu pšeničného zrna, sú dostatočne polymorfné pre

rozlíšenie, počtom rozsiahlych súborov genotypov pšenice (Kraic, 2004).

Pšeničný genóm je zložený z troch samostatných genómov A, B a D, pričom každý

z nich obsahuje sedem párov chromozómov, je rôzneho pôvodu a prispieva k celkovej

variabilite bielkovín (Kraic, 2004).

Pre pšenicu letnú (Triticum aestivum L.) sa využívajú predovšetkým

vysokomolekulové podjednotky glutenínov (HMW-GS) ako bielkovinové markery

pekárskej kvality pšenice (Kraic, 2004).

Gliadínové bielkoviny spĺňajú základné požiadavky, ktoré sa vyžadujú od markérov

hospodársky dôležitých vlastností. Gliadínové spektrá sa vyznačujú výrazným

polymorfizmom, podmieneným genetickou variabilitou v biosyntéze gliadínu.

Polymorfizmus gliadínov umožňuje markérovať celý rad hospodársky významných znakov

a vlastností pšenice. Biosyntéza gliadínov má vysokú dedivosť. Zloženie gliadínových

spektier a koncentráciu gliadínov v jednotlivých zónach neovplyvňujú podmienky

prostredia (Prugar et al., 1986).

Identifikácia, charakteristika a diferenciácia genotypov pšenice je možná na úrovni

polymorfizmu bielkovín a DNA, pričom je dôležité, aby použitá metóda bola

jednoznačná, s vysokou rozlišovacou schopnosťou (Gregáňová, 2005)

Pšeničné gluteníny a gliadíny sú kódované génmi lokusov (Gálová, 2002) :

lokus Glu – 1: je lokalizovaný na dlhom ramene chromozómov A1, B1, D1 s génmi

kódujúcimi HMW glutenínové podjednotky,

lokus Gli – 1 a Glu – 3: sú lokalizované na krátkom ramene chromozómov A1, B1, D1

s génmi kódujúcimi LMW glutenínové podjednotky, γ-gliadíny a ω- gliadíny,

lokus Gli – 2: je lokalizovaný na krátkom ramene chromozómov A6, B6 a D6 s génmi

kódujúcimi α-gliadíny a β-gliadíny.

Pre prácu s genetickými zdrojmi rastlín sa využíva niekoľko typov molekulárnych

markerov. Bielkovinovými markermi sú frakcie zásobných bielkovín zrelého semena

(prolamíny a glutelíny) a izoenzýmy (endopeptidázy) (Vivodík et al., 2007).

1.8 Identifikácia genotypov cereálií elektroforetickými metódami

Identifikácia jednotlivých genotypov je nevyhnutná hlavne v období sejby a zberu.

Producenti potrebujú mať istotu, že rastliny, ktoré pestujú majú požadovaný genotyp a tiež,

spracovatelia musia byť presvedčení o tom, že zberané zrno dosahuje deklarované

kvalitatívne parametre (Wrigley et al. 1992).

Elektroforéza je analytická metóda chromatografie, je citlivá a umožňuje separáciu

elektricky nabitých molekúl v roztoku vplyvom pôsobenia elektrického poľa. Ako prvý ju

použil švédsky biochemik a fyzikálny chemik Arne Wilhelm Kauris Tiselius v 30-tych

rokoch 20-teho storočia, aby rozdelil proteíny ľudského séra na albumín, α-globulín, β-

globulín a γ-globulín. Za výskum v oblasti elektroforézy a za objasnenie vlastností

ľudských bielkovín dostal Nobelovu cenu v roku 1948 (Vrbová, 2006).

Elektroforetické metódy sú fyzikálno – chemické metódy, ktoré sa využívajú sa

separáciu látok nesúcich elektrické náboje. Ak sa zmes takýchto látok vystaví v určitom

prostredí pôsobeniu elektrického poľa, začnú sa molekuly látok (častice) pohybovať. Ich

pohyblivosť závisí od veľkosti náboja, veľkosti a tvaru molekúl, podmienok prostredia a

sily elektrického poľa. Veľkosť náboja molekuly alebo častice ovplyvňuje stupeň

ionizácie, pH a iónová sila prostredia (Bauerová et al., 2005).

Elektroforéza prebieha v prostredí voľného elektrolytu, alebo v pórovitých

nosičoch, ktoré sú nasýtené elektrolytom. Ako nosiče sa používajú škrob, dextran, agaróza

a polyakrylamidové gély. Koncentrácia akrylamidu býva v rozsahu od 3 do 30 %, čo

umožňuje separovať látky od 102 do 106 g/mol, čo odpovedá peptidom s veľkosťou rádovo

od jednej aminokyseliny do 102 prípadne až 103 aminokyselinových zvyškov.

V súčasnosti sa pri elektroforetickej separácii najviac používajú agarózové

(obrázok 4) a polyakrylamidové gély (Sedlák et al., 2007).

Obrázok 4. Jednoduchá agarózová elektroforéza (Oc – open circular, L – linear, Sc –

supercoiled DNA) (Sedlák et al., 2007).

Úsilie dosiahnuť čo najlepšie separácie viedla k vypracovaniu veľkého množstva

rôznych techník a ich modifikácií, ktoré sa môžu zhrnúť do štyroch základných skupín:

1. voľná elektroforéza – s pohyblivým rozhraním

2. elektroforéza na nosičoch – zonálna

3. rovnovážna elektroforéza reprezentovaná izoelektrickou fokusáciou

4. kapilárna elektroforéza (Vrbová, 2006).

1.8.1 Elektroforéza bielkovín v polyakrylamidových géloch

Elektroforéza v polyakrylamidovom géli (PAGE) patrí v súčasnosti k najviac

využívaným elektroforetickým technikám. PAGE sa veľmi často využíva predovšetkým

k analýze bielkovín, a to na zistenie homogenity preparátu v rôznych stupňoch izolačného

postupu a k čiastočne fyzikálo-chemickej charakterizácií bielkoviny (Brenkus, 2006).

Polyakrylamidový gél bol pri elektroforéze prvý krát použitý v roku 1959

Raimondom a Weintraubom (Sedlák et al., 2007).

Polyakrylamid vykazuje mnoho výhod oproti škrobovému gélu, ktorý sa používa

čoraz menej ako médium pre vysokorozlišovaciu elektroforézu. Kvôli jeho syntetickej

povahe a veľkosti pórov môže byť ľahšie kontrolovaný (Holme et al., 1998).

Polyakrylamidový gél má veľmi dobré mechanické vlastnosti, je priesvitný, pri

príprave sa dá zabezpečiť požadovaná veľkosť pórov a zo všetkých nosičov má najväčšiu

rozlišovaciu kapacitu (Bauerová et al., 2005).

Polyakrylamidový gél vzniká polymerizáciou základného monoméru akrylamidu

(a) a sieťovacieho monoméru N, N´- metylén-bis-akrylamidu (BIS)(b):

a) CH2= CH-CO-NH2

b) CH2= CH-CO-NH- CH2 – NH-CO- CH2 (Bauerová et al., 2005).

Zmes akrylamidu a bisakrylamidu polymerizuje pri izbovej teplote v pufre (0,5 x

TBE) pomocou voľných radikálov poskytovaných persulfátom amónnym (APS).

K urýchleniu polymerizácie sa používa voľná zásada TEMED (tetrametyléndiamin), ktorý

katalyzuje tvorbu voľných radikálov persulfátu amónneho. Iným používaným iniciátorom

polymerizácie je riboflavín, ktorý je účinný už pri veľmi nízkych koncentráciách 5-10 ng/l

(Knoll et al., 2002).

Polyakrylamidový gél sa pripravuje vo forme platní na sklách s rôznymi

veľkosťami alebo vo forme stĺpikov (valčekov) v sklených rúrkach.

Podľa štruktúry a zloženia gélu, vlastností tlmivých roztokov a podmienok delenia

sa rozlišujú viaceré typy PAGE (Lookhart, 1991) :

1.) Konvenčná PAGE

2.) PAGE, pri ktorej sa látky delia len podľa veľkosti svojich molekúl :

2.1.) Elektroforéza v gradientovom géli

2.2.) PAGE v prostredí dodecylsíranu sodného

3.) Disková elektroforéza

4.) Izoelektrická fokusácia

5.) Izotachoforéza

1.8.2 SDS – PAGE

Na separáciu proteínov podľa veľkosti molekúl sa využíva PAGE v prostredí

dodecylsíranu sodného (SDS). SDS je anionaktívny detergent, ktorý sa viaže na peptidové

väzby a zásadité skupiny proteínov, v dôsledku čoho všetky proteíny získajú skoro

rovnako veľký záporný náboj (počas elektroforézy sa pohybujú k anóde) a pri

elektroforéze sa potom delia len podľa veľkosti svojich molekúl – menšie molekuly sa

pohybujú rýchlejšie, veľké molekuly pomalšie (Bauerová et al., 2005).

Tento typ elektroforézy sa dá použiť aj na separáciu subjednotiek alebo

jednotlivých reťazcov z komplexnej molekuly proteínov, lebo zabraňuje ich opätovnej

asociácii. Polyakrylamidová elektroforéza v prostredí SDS sa používa najmä pri rýchlom a

jednoduchom určení relatívnych molekulových hmotností proteínov. Táto metóda je

vhodná hlavne pri identifikácii glutenínov pšenice (Cooke, 1995, Černý et al. 1996).

SDS elektroforéza má veľa praktických výhod:

SDS rozpúšťa takmer všetky bielkoviny

Proteíny oddeľované s SDS lepšie viažu farbivá

Proteínové komplexy majú vysokú elektrofotretickú mobilitu

Všetky frakcie putujú v jednom smere

Poskytuje vysoké rozlíšenie

Zóny sa ľahko fixujú

Separácia je založená iba na molekulovej hmotnosti

Pri elektroforéze proteínov pomocou SDS – PAGE sa pripravuje gél pozostávajúci

z dvoch koncentračne odlišných častí – koncentrovanejší deliaci gél ( v spodnej časti

platne) a menej koncentrovaný štartovací gél. Farbenie gélu sa uskutočňuje špecifickými

farbivami, napr. Coomassie Brilliant R-250 alebo farbením pomocou dusičnanu

strieborného (farbenie striebrom) (Bauerová et al., 2005).

Zásobné bielkoviny sa extrahujú zo zrna obilnín a elektroforeticky separujú,

najčastejšie pomocou SDS-PAGE, A-PAGE, následne sa  ich profily geneticky interpretujú

(Kraic et al, 1995).

2 CIEĽ PRÁCE

Cieľom diplomovej práce bolo analyzovať 4 konvenčné genotypy pšenice letnej a 5

farebných genotypov pšenice letnej f. ozimnej (Triticum aestivum L.).

V súvislosti s tým bolo potrebné:

1. Identifikovať, diferencovať a charakterizovať genotypy pšenice letnej f. ozimnej na

základe bielkovinových markerov.

2. Pomocou vysokomolekulárnych glutenínových podjednotiek (HMW-GS) identifikovať

a diferencovať jednotlivé analyzované druhy pšeníc.

3. Vypočítaním Glu-skóre pšeníc charakterizovať technologickú kvalitu zrna.

4. Zostrojením dendrogramov príbuznosti detegovať genetickú podobnosť resp.

rozdielnosť analyzovaných genotypov.

3 Materiál a metodika

3.1 Biologický materiálV práci bolo analyzovaných 5 farebných genotypov a 4 konvenčné odrody pšenice

letnej formy ozimnej (Triticum aestivum L.), ktoré boli získané z Génovej banky

semenných druhov SR CVRV VÚRV v Piešťanoch (Tabuľka 4) (Obrázok 5).

Pri analýzach zásobných bielkovín boli použité chemikálie dodávané firmami: 

Sigma, Serva, Fluka, Pharmacia-KLB, LCHM-Labochem, Gibco BRL.

 Tabuľka 4: Analyzované genotypy pšenice letnej (Triticum aestivum L.)

Názov Krajina pôvodu Farba zrna

Konvenčné genotypy pšenice letnej

Samanta SVK žltá

Lívia SVK žltá

Astela SVK žltá

Torysa SVK žltá

Farebné genotypy pšenice letnej

Modré zrno ČR modrá

UC 66094 USA modrá

Barevná 25 - modrá ČR modrá

UC 66049 - modré TC USA modrá

Barevná 9 ČR modrá

Obrázok 5. Genotypy pšenice letnej – A) konvenčné zrno, B) modré zrno

3.2 Biochemické rozbory

3.2.1 Extrakcia a elektroforetické delenie glutenínov zrna pšenice

              Zásobné bielkoviny  boli izolované z endospermu celých, suchých, zrelých zŕn. Z

každej odrody sa analyzovalo 20 zŕn. Zrno sa odvážilo, zhomogenizovalo mechanicky –

rozmliaždením, vložilo do Eppendorfovej skúmavky a bielkoviny boli extrahované

v extrakčnom roztoku.

 

Extrakcia glutenínov

              Extrakcia glutenínov sa realizovala podľa štandardnej referenčnej metódy ISTA

(Wrigley, 1992). Zloženie zásobného roztoku pre extrakciu glutenínov:

       0,125 mol.dm-3 Tris-HCl pH 6,8

     20 ml glycerolu

      4,1 ml destilovanej vody

       4 g SDS

       20 mg Pyronínu G

              Pred extrakciou bol pripravený vždy čerstvý extrakčný roztok nasledovne:

        zásobný roztok pre extrakciu

        2-merkaptoetanol

      redestilovaná voda (v pomere 17:3:40)

Na 1 mg rozdrveného zrna sa pridalo 8 µl takto pripraveného extrakčného roztoku.

Extrakcia bielkovín prebiehala 1 hodinu pri 25 oC za stáleho trepania v trepačke. Pred

nanesením do gélu bola vzorka zdenaturovaná vo vodnom kúpeli pri teplote 100 oC počas

10 minút. Po inkubácii sa vzorky vybrali z vodného kúpeľa, vychladili a odstredili v

odstredivke pri 12000 otáčkach za minútu po dobu 10 minút.

Elektroforetické delenie glutenínov v SDS-PAGE

Elektroforetická separácia gluténových bielkovín bola uskutočnená v systéme

diskontinuálnej SDS-PAGE podľa štandardnej metodiky ISTA (Wrigley, 1992) v

elektroforetickej separačnej jednotke Protean II (Bio-Rad). Vyextrahované bielkoviny boli

nanesené do gélu v množstve 5 µl na jednu aplikačnú dráhu gélu. Elektroforetické delenie

prebiehalo pri veľkosti prúdu 30 mA, 6-10 hodín, pri konštantnej teplote 10 oC, až pokiaľ

marker nedosiahol spodný okraj gélu. Prvých 15 minút delenie prebiehalo pri veľkosti

prúdu 5 mA, ďalších 25 minút pri 10 mA a zvyšný čas pri veľkosti prúdu 30 mA.

Zloženie deliaceho gélu:

                0,381 mol.dm-3 Tris-HCl, pH 8,8

                17,48ml bis-akrylamidu (AA-bis), (12,7g akrylamid + 0,168g N,N´-

Metylénbisakrylamid v objeme 58,27ml)

                 0,3ml 10% SDS

                 0,76ml 1% APS

               60µl TEMED

Zloženie štartovacieho gélu:

                 0,247 mol.dm-3  Tris-HCl, pH 6,8

                8,3ml AA-Bis (1,21g akrylamid + 20,8mg N,N´-Metylénbisakrylamid v

objeme 16,6 ml)

                 0,1 ml 10% SDS

                 0,8ml 1% APS

                 30µl TEMED

Zloženie elektródového roztoku:

                  3g Tris-HCl

                  14,1g glycínu

                  1g SDS, v objeme 1000 ml, pH = 8,3

 

3.2.2 Extrakcia a elektroforetické delenie gliadínov zrna pšeniceZásobné bielkoviny  sme izolovali z endospermu celých, suchých, zrelých zŕn. Z

každej odrody sme analyzovali 20 zŕn. Zrno sme odvážili, zhomogenizovali mechanicky –

rozmliaždením, vložili do Eppendorfovej skúmavky a uskutočnili extrakciu bielkovín.

 

Extrakcia gliadínov

  Extrakciu gliadínov sme realizovali podľa štandardnej referenčnej metódy ISTA v

kyslom prostredí (Draper, 1987). Zloženie extrakčného roztoku:

                  25% 2-chlóretanol

                  0,05% Pyronín G

Na 1mg zhomogenizovaného zrna sme pridali 5 µl extrakčného roztoku. Vzorky

sme premiešali a nechali extrahovať cez noc pri laboratórnej teplote.  Pred nanesením

vzorky do gélu sme extrakt odstredili v odstredivke pri 12000 otáčkach za minútu počas 10

minút.

Elektroforetické delenie gliadínov v A-PAGE

              Štandardná referenčná metóda schválená medzinárodnou organizáciou (ISTA,

Draper 1987) využíva pri elektroforetickom delení gliadínov elektrolyt, ktorý je pripravený

zmiešaním glycínu a kyseliny octovej s hodnotou pH 3,2. Separáciu gliadínov sme

uskutočnili v kontinuálnych polyakrylamidových géloch v kyslom prostredí s pH 3,2 

(Draper, 1987).

             

Zloženie gélového tlmivého roztoku:

                  2% ľadová kyselina octová

                  0,1% glycín

                  pH 3,2

 

Príprava 100 ml separačného gélu:

                  60ml gélového tlmivého roztoku

                  10g akrylamidu

                 6g močoviny

                  0,4g N,N´- Metylénbisakrylamidu

                  0,1g kyseliny askorbovej

                  0,005g síranu železnatého

                 doplniť gélovým tlmivým roztokom do 100 ml

                 pridať 10% APS (0,2-0,3 ml)

                  0,3 ml TEMED

 

Zloženie elektródového tlmivého roztoku:

                0,4g ľadová kyselina octová

                4ml glycín

                v objeme 1000 ml destilovanej vody, pH 3,2

Elektroforéza prebiehala pri konštantnom napätí 500 V počas trojnásobku behu markera

Pyronínu G, pri teplote 3oC v elektroforetickej jednotke SE 600 (Hoefer Pharmacia

Biotech).

3.2.3 Farbenie a vizualizácia bielkovín              Všetky frakcie zásobných bielkovín separované v SDS-PAGE a A-PAGE sme

zafarbili v roztoku pripravenom zmiešaním 95 ml 10% kyseliny trichlóroctovej a 5 ml

0,5% roztoku Coomassie Brilliant Blue R250 v etanole. Prebytočné farbivo sme z gélu

odstránili premývaním gélu v destilovanej vode 12-24 hodín.

   

3.2.4 Vyhodnotenie a genetická interpretácia elektroforetických profilov bielkovín              Elektorforetické profily sme načítali pomocou čierno-bielej CCD kamery UVP s

filtrom a šošovkami H6x8-II 8-48 mm. Vyhodnocovací systém ďalej pozostáva z UV/VIS

tmavej komory, transiluminátora a termocitlivej tlačiarne. Načítané bielkovinové gély  sme

vyhodnotili pomocou dokumentačného a vyhodnocovacieho systému Grab-It a GelWorks

1D pre Windows.

              Ako štandardy sme použili odrody pšenice letnej (Triticum aestivum L.) Chinese

Spring a Marquis. Genetickú interpretáciu alelickej zostavy v lokusoch Glu – 1A, Glu – 1B

a Glu – 1D a následný výpočet Glu – hodnotenia sme uskutočnili podľa katalógu alel

Payne et. al. (1987).

3.2.5 Výpočet obsahu bielkovín a koeficienta nutričnej kvalityPercentuálne zastúpenie hrubých bielkovín bolo vypočítané prepočtom z obsahu

dusíka stanoveného podľa Kjeldahla (Michalík et al., 2006), ktorý bol vynásobený

prepočítacím koeficientom (%N x 5,7). Koeficient nutričnej kvality bol vypočítaný zo

zastúpenia bielkovinových frakcií: (Albumíny + Globulíny + Zvyšok/gliadíny)x100

3.2.6 Metóda diskontinuálnej frakcionácie bielkovinového komplexu zrna podľa Osborna

Bielkovinové frakcie (albumíny, globulíny, gliadíny, gluteníny) boli determinované

extrakciou v príslušných rozpúšťadlách podľa unifikovanej Golenkovej metódy - ICC

metóda podľa Michalíka (2002).

3.3 Štatistické vyhodnotenie výsledkov  Základné štatistické údaje boli vypočítané v programe Stagraphics 5.1.

 

4 VÝSLEDKY A DISKUSIA

Pre technologickú kvalitu pšenice majú najväčší význam bielkoviny. Dôležitou

frakciou zásobných bielkovín sú gliadíny, ktoré majú značný vplyv na kvalitu múky

a plasticitu cesta. Druhou významnou frakciou sú gluteníny, ktoré sa podľa veľkosti delia

na na HMW-GS (glutenínové podjednotky s vysokou molekulovou hmotnosťou) a LMW-

GS (glutenínové podjednotky s nízkou molekulovou hmotnosťou).

Zloženie zásobných bielkovín endospermu zrna, ktoré tvoria komplex nazývaný lepok

vyznačujúci sa viskoelastickými vlastnosťami, je genotypovou záležitosťou a determinuje

spracovanie a využitie múky (Novotný a Jureček, 2000). Predikciu chlebopekárskej kvality

je možné uskutočniť na základe hodnotenia biochemickej skladby lepkového komplexu,

analýzou gliadínov a podjednotiek glutenínov s vysokou molekulovou hmotnosťou, s čím

sa stotožňujú viacerí autori (GREGOVÁ et al., 2001; ŠAŠEK, ČERNÝ, 1996).

Na základe viacerých výskumov bolo zistené, že čím je vyššie Glu-skóre, tým je

väčšia pravdepodobnosť, že odroda bude mať chlebopekársku kvalitu. Pravdepodobnosť

výskytu odrôd s lepšou chlebopekárskou kvalitou pri nízkom Glu-skóre je minimálna.

Naopak, pri odrodách s vysokým Glu-skóre môžeme s veľkou pravdepodobnosťou

predpokladať vyššiu chlebopekársku kvalitu, môžu sa však vyskytnúť aj prípady, kde

pekárska akosť nebude zodpovedať vysokej predikčnej hodnote. Za zdroje vysokej

chlebopekárskej kvality sú označované odrody s HMW – Glu komplexnými alelami 1

alebo 2* (lokus Glu-1A), 7+8, 17+18, 13+16 (lokus Glu–1B), 5+10 (lokus Glu-1D)

(Gregová et al., 2001). Od percentuálneho zastúpenia jednotlivých frakcií bielkovín závisí

smer využitia zrna (pšenica na mlynsko – pekárske spracovanie, pšenica kŕmna, pšenica na

špeciálne potravinárske využitie).

V súlade s STN 461100-1 bol stanovený celkový obsah dusíka a bielkovín

(Tabuľka 5). Zvýšený obsah celkového dusíka bol zistený pri odrode Barevná 9, ostatné

odrody spĺňali STN normu. 2 genotypy vykazovali nižší obsah bielkovín, čo mohlo byť

zapríčinené nevhodnými agro-klimatickými podmienkami počas vegetácie.

Tabuľka 5: Stanovenie celkového dusíka a bielkovín

Názov vzorky Celk.N % Obsah bielkovín

(Celk.N*5,7 %)

MODRÉ ZRNO 1,964 11,195

UC 66094 2,076 11,833

BAREVNA 25 1,936 11,035

BAREVNA 9 2,104 11,993

Priemer 2,02 11,514

STN 461100 - 1 2,018 11,500

Tabuľka 6: Obsah a frakčná skladba bielkovín (%)

Názov vzorky Alb+Glob Gliadíny Gluteníny Zvyšok

Konvenčné genotypy pšenice letnej

Samanta 29,01 33,00 28,01 8,98

Lívia 22,24 43,67 27,16 6,42

Astela 25,10 36,67 31,34 6,80

Torysa 24,45 39,93 29,93 5,69

Priemer 25,20 38,32 29.11 6.97

Farebné genotypy pšenice letnej

Modré zrno 25,41 43,13 21,74 8,55

UC 66094 25,67 42,97 22,30 8,38

Barevná 25 -

modrá

23,19 39,15 30,01 7,54

Barevná 9 24,00 41,35 25,33 8,27

Priemer 24,57 41,65 24,85 8,19

Vysvetlivky: Alb+Glob – albumíny a globulíny

Obsah bielkovín v zrne pšenice je dôležitý kvalitatívny ukazovateľ. Z našich

výsledkov vyplýva (Tabuľka 5), že priemerný obsah bielkovín v konvenčných odrodách

bol 11,11%. Najvyšší obsah bielkovín dosiahla odroda Torysa (13,75%) a najnižší odroda

Samanta (7,99%). Pri hodnotení farebných genotypov pšenice letnej, možno konštatovať,

že priemerný obsah bielkovín bol 11,51%, pričom pri jednotlivých kultivaroch varíroval

v rozsahu od 11,04% do 11,99%.

Uvedené výsledky potvrdzujú závery viacerých autorov (Shewry et al., 2002;

Skylas et al., 2005; Michalík et al., 2006; Šramková et al., 2009), ktorí v sledovaných

kolekciách pšenice letnej stanovili obsah celkových bielkovín v rozsahu 10-18%.

Nutričná kvalita zrna pšenice je ovplyvnená hlavne zastúpením albumínov

a globulínov, ktoré sa vyznačujú najvhodnejším aminokyselinovým zložením, nakoľko sa

v nich nachádza najviac esenciálnych aminokyselín (Michalík et al., 2006). Z našich

výsledkov (Tabuľka 6) vyplýva, že najvyššie zastúpenie albumínov a globulínov

v konvenčných odrodách vykázala odroda Samanta (29,1%), najnižšie Lívia (22,24%),

s priemerom ostatných odrôd 25,20%, z čoho vyplýva, že z hľadiska nutričného je

najlepšia odroda Samanta. Obsah nutrične najvýznamnejších bielkovín vo farebných

pšeniciach bol v priemere 24,57%, s najvyšším zastúpením v genotype UC 66094 (25,67

%). Najnižší obsah albumínov a globulínov bol zistený v genotype Barevná 25 - modrá

(23,19%).

Zo zastúpenia jednotlivých bielkovinových frakcií je možné vypočítať koeficient

nutričnej kvality zrna (KNK), ktorý je dôležitým znakom pre posúdenie výživnej kvality

zrna. Hodnota KNK sa v konvenčných vzorkách pohybovala v rozpätí od 65,63 – 115,12%

s priemerom 85,81%, kým vo farebných pšeniciach od 78,04% do 79,24%, s priemernou

hodnotou 78,63%, z čoho vyplýva, že z hľadiska hodnoty koeficienta nutričnej kvality sa

ako lepšie ukázali konvenčné pšenice. Dosiahnuté výsledky potvrdzujú práce viacerých

autorov (Bojňanská, 1995; Gálová et al., 2003; Michalík et al., 2006), ktorí uvádzajú, že

pomer jednotlivých zložiek bielkovinového komplexu zrna a ich množstvo je veľmi

variabilné, mení sa v značných rozmeroch so zmenou obsahu celkových bielkovín,

v závislosti od podmienok pestovania, genetických zvláštností a tiež v procese dozrievania

zrna.

Základnú charakteristiku analyzovaných genotypov pšenice letnej je možné

dokresliť elektroforetickými analýzami na PAGE v prítomnosti SDS, pomocou ktorých sa

gluténové bielkoviny rozdelia na monomérne gliadíny (alfa-, beta-, gama- a omega-

gliadíny) a agregované gluteníny tvorené vysokomolekulárnymi (HMW-GS)

a nízkomolekulárnymi glutenínovými podjednotkami (LMW-GS). HMW-GS vystupujú

ako molekulárne markery, ktoré predikujú technologickú kvalitu pšenice. Poznanie

genetického pozadia jednotlivých genotypov pomáha šľachtiteľom v procese kríženia

získavať potomstvá s požadovanými akostnými parametrami (Bushuk a Bekes, 2002).

V nadväznosti na uvedené, sa realizovala detekcia individuálnych

vysokomolekulárnych glutenínových podjednotiek (HMW-GS), pričom sa sledovala

variabilita elektroforetického spektra HMW-GS vo vzťahu k technologickej kvalite zrna v

analyzovaných konvenčných a farebných genotypoch pšenice.

Z dosiahnutých výsledkov vyplýva (Tabuľka 7, Príloha B a C), že konvenčné

odrody sa vyznačujú rozdielnym zastúpením individuálnych HMW-GS, čo sa odzrkadlilo

aj na hodnote Glu-skóre, z ktorého vyplýva, že najvyššiu technologickú kvalitu vykázala

odroda Astela, potom Samanta, Lívia a najnižšiu hodnotu dosiahla Torysa, v ktorej bola

detegovaná podjednotka 2+12 (11,11 %), ktorá vystupuje ako marker nevhodnej

technologickej kvality zrna pšenice. Z elektroforeogramov farebných genotypov pšenice

letnej formy ozimnej vyplýva, že 3 analyzované kultivary boli homogénne jednolíniové.

V  kultivare Barevná 9 bola detegovaná dvojlíniovosť. Táto odroda vykázala Glu-skóre 7

a 9, čo predikuje dobrú pekársku kvalitu.

Tabuľka 7: Zastúpenie glutenínových podjednotiek a Glu-skóre v pšenici letnej.

Názov

HMW-GSGlu-

skóre

Blok

Gld 1B3Ražné

skóreGlu-A1 Glu-B1 Glu-D1

Konvenčné genotypy pšenice letnej

Samanta 0 7+8 5+10 8 NIE -

Lívia 0 7+9 5+10 7 NIE -

Astela 2* 7+9 5+10 9 NIE -

Torysa 0 7+8 2+12 6 NIE -

Farebné genotypy pšenice letnej

Modré zrno 1 20 5+10 8 ÁNO 6

UC 66094 1 7+8 5+10 10 NIE -

Barevná 25 - modrá 0 20 5+10 6 NIE -

UC 66049 - modré TC 1 7+8 5+10 10 NIE -

Barevná 9 1 7+9 5+10 9 NIE -

Barevna 9 1 7+9 2+12 7 NIE -

Z analyzovaných vzoriek sa najčastejšie vyskytovali genotypy s komponentnou

vskladbou HMW-GS 1, 7+9, 5+10 (22,22 %). Kolekcia bola taká polymorfná, že všetky

ostatné elektroforetické profily sa vyskytovali vždy iba v jednom opakovaní. Uvedené je v

súlade s výsledkami zistenými inými autormi, ktorí analyzovali domáci sortiment pšeníc

ako Gregová et al. (1995), Kraic et al. (1999), Gálova et al. (2002, 2003) a ďalšími, ktorí

svojimi analýzami potvrdili jednolíniovosť pšenice letnej formy ozimnej a teda aj

vhodnosť glutenínových bielkovín pri identifikácii, charakteristike a diferenciácii

jednotlivých genotypov. Elektroforetický profil individuálnych genotypov pšenice letnej

formy ozimnej (Príloha C) môžeme považovať za tzv. „fingerprinting“.

Z výsledkov ďalej vyplýva (Tabuľka 7) (Príloha A), že z génov kódovaných

lokusom Glu-Al bola najčastejšie identifikovaná podjednotka 1 v 5 kultivaroch (55,6%).

V 4 kultivaroch sa vyskytovala nulová alela (44%) a podjednotka 2* v jednej línií (Astela)

(11,1%).

Lokus Glu-Bl bol reprezentovaný HMW - gluténovými subjednotkami 7+8 (11,11 %) a

podjednotky 7+9 (11,11 %). Podjednotka 20 bola detegovaná v 2 genotypoch Modré zrno

a Barevná 25 – modrá.

Alely lokalizované na lokuse Glu-Dl, majú najvyšší vplyv na technologickú kvalitu

múky zrna pšenice. Pozitívne sa však prejavia len v kombinácii s vysokokvalitnými

HMW-GS kódovanými lokusmi Glu-Al a Glu-B1 (Kolster et al., 1993). Z dosiahnutých

výsledkov vyplýva, že na pekársku kvalitu múky kladne vplývajúca dvojica podjednotiek

5+10 bola identifikovaná v 8 genotypoch. Uvedené výsledky sú v súlade s inými autormi,

ktorí variabilitu HMW-GS kódovaných jednotlivými lokusmi pripisujú predovšetkým

agroklimatickým podmienkam pestovania v danom geografickom území (Branlard et al.,

2003, Demir et al., 2004).

Zo zastúpenia jednotlivých HMW glutenínových podjednotiek možno predigovať

technologickú kvalitu zrna pšenice vypočítaním Glu-hodnotenia (Payne et al. 1987),

ktorého najvyššia hodnota môže byť 10. V tomto smere najvyššie bodové Glu-hodnotenie

(10) dosiahli genotypy UC 66049 a UC 66094, kým najnižšiu hodnotu (6) dosiahli

genotypy Torysa a Barevná 25 - modrá (Tabuľka 7). Uvedené je v zhode s rozsiahlymi

prácami venovanými vplyvu bielkovín na technologickú kvalitu realizované

Veraverbekom et al. (2002) a Laszititym (2003) a ďalšími.

Ďalšou dobre preštudovanou frakciou zásobných bielkovín pšenice sú gliadíny,

ktoré zároveň spĺňajú kritéria vhodných genetických markerov. Gliadíny sú významnou

súčasťou lepkového komplexu, a pôsobia preto výrazne na akosť múky. Niektoré

gliadínové bloky zvyšujú akosť muky, iné ju naopak znižujú alebo pôsobia neutrálne. Je

známy inhibičný účinok sekalínového bloku Gld 1B3 translokovaného z ražného

chromozómu 1R do genómu pšenice na 1B chromozóm, ktorý slúži ako marker akosti,

avšak súčasne aj ako marker odolnosti k hrdzi trávovej. Z jeho prítomnosti vyplýva, že

génom pšenice je obohatený o sekalínové gény, ktoré majú za následok výrazné

zhoršovanie kvality pšeničného lepku a gény odolnosti voči hrdzi trávovej Sr31 (Gálová et

al., 2003).

V našej práci sme sa zamerali na detekciu sekalínového bloku analýzou gliadínovej

frakcie zásobných bielkovín pomocou A-PAGE v zrne pšenice letnej formy ozimnej, ktorá

je dominantným druhom pšenice, ktorý aj svojimi technologickými parametrami najlepšie

spĺňa podmienky pre využitie v potravinárskom priemysle.

Z analyzovaných materiálov (Tabuľka 7) ( Príloha D) vyplýva, že sekalínový blok

Gld 1B3 bol detegovaný v gliadínovom spektre 1 hodnoteného genotypu pšenice letnej

(Modré zrno), čo má za následok zníženie Glu-hodnotenia o dva body. Z uvedeného tiež

vyplýva, že daný genotyp sa síce vyznačuje nízkou technologickou kvalitou avšak dobrou

odolnosťou voči hrdzi trávovej.

5 ZÁVER

Obilniny predstavujú základnú a nepostrádateľnú zložku ľudskej výživy a výživy

hospodárskych zvierat. Vhodne spracované obilniny sú v celosvetovom meradle

najvýznamnejším donorom energie formou sacharidov. Okrem toho sú  bohatým zdrojom 

cukrov   a  plnohodnotných  bielkovín, vitamínov, minerálnych látok, vlákniny.

V podmienkach trhovej ekonomiky sa okrem ekonomickej efektívnosti výroby

obilnín pre ľudskú výživu zvyšujú aj požiadavky na rast technologickej, nutričnej a

hygienickej kvality produkcie. Za účelom dosiahnutia požadovanej kvality širokého

sortimentu cereálnych potravín je potrebné pestovať obilniny podľa predpokladaných

úžitkových smerov. Jednou z dôležitých informácií pri šľachtení pšenice na kvalitu je

obsah a kvalita zásobných bielkovín pšeničného zrna, medzi ktoré patria gliadíny a

gluteníny. Zásobné bielkoviny pšenice (gliadíny, gluteníny) sú hlavnou zložkou lepku,

ktorý významne ovplyvňuje chlebopekárske vlastnosti pšeničnej múky. 

Na základe našich výsledkov môžme skonštatovať, že využitie farebných genotypov

pšenice letnej formy ozimnej (Triticum aestivum, L.) je aj napriek nižšiemu obsahu

hrubých bielkovín veľmi perspektívne v procese kríženia. Technologická kvalita

hodnotených genotypov pšenice letnej na základe elektroforetických analýz HMW-GS

a Glu-skóre vykázala dobrú až veľmi dobrú kvalitu, pričom boli detekované HMW-GS,

ktoré sa bežne nevyskytujú v sortimente slovenských pšeníc (20, 7, 14+15), a ktoré môžu

slúžiť ako donory pri šľachtení na vyššiu technologickú kvalitu zrna.

Farebné pšenice letnej sú významné aj z hľadiska zvýšeného obsahu fenolických

látok, hlavne antokyánov, ktoré sa v modrých pšeniciach vyskytujú v aleurónovej vrstve.

Antokyány sú bioaktívne látky, ktoré pozitívne vplývajú pri prevencii kardiovaskulárnych

a karcinogénnych ochorení. V súčasnosti sa do popredia dostávajú funkčné potraviny, kde

majú farebné pšenice svoj opodstatnený význam. Vzhľadom k tomu, že úloha antokyánov

je zo zdravotného hľadiska prospešná, netradične sfarbené pšenice môžu byť zdrojom

nových látok. Strava bohatá na antioxidanty typu antokyány, flavonoidy a karotenoidy

pôsobia preventívne na výskyt aterosklerózy, ischemické choroby srdca, zlepšujú funkcie

zraku a pozitívne ovplyvňujú ochranné procesy v organizme. Vďaka pokroku v oblasti

metabolického a génového inžinierstva predstavujú v súčasnosti biotechnologické metódy

veľmi perspektívnu možnosť produkcie funkčných potravín.

6 Zoznam použitej literatúry

BAJČI, P. – BOJŇANSKÁ, T. – FRANČÁKOVÁ, H. 1994. Hodnotenie surovín

rastlinného pôvodu. Nitra: VŠP – VES, 224 s. ISBN 80-8069-483-4

BAUEROVÁ, M. – OMELKA, R. – BAUER, M. 2005 Návody na laboratórne cvičenia

z molekulárnej biológie. Nitra : FPV UKF, 2005. 54-56 s. ISBN 80-8050-898-4

BEŽO, M. et al. 2005. Biotechnologické metódy v šľachtení rastlín. In BIOS 2005

[Zborník]. Nitra, 2005. ISBN 80-8069-586-5

BRANLARD, G. - DARDEVET, M. - AMIOUR, N. - IGREJAS, G. 2003. Allelic

diversity of HMW and LMW glutenin subunits and omega-gliadins in French bread wheat

(Triticum aestivum L.). In Genet. Resour. And Crop Evolution 50, 2003, s. 669-679

BRENKUS, M. 2006. Analýza proteínového profilu buniek MDCK a HeLa za rozdielnych

fyziologických podmienok pomocou elektroforetických metód: diplomová práca. Bratislava:

UK, 2006. 83 s.

BRINDZA, J. 2007. Základy šľachtenia rastlín. 4 vyd. Nitra: SPU, 2007. ISBN 978-80-

8069-918-5

ČERNÝ, J. – ŠAŠEK, A. 1995. Common wheat marking by determination of approximate

depence frequency of allelic gliadin quality grade agronomic charackter. In Scientia

Agriculture Bohemoslovaca, vol. 26, 1995, no.4.p.245-258

ČERNÝ, J. - ŠAŠEK, A. 1996. Bílkovinné signální gény pšenice obecné, UZPI Praha,

1996

EVERS, A.D. – BLANKEY, A.B. – BRIEN, L. O. 1999. Cereal structure and composition.

In Australian Journal of Agricultural Research. vol.50, 1999, no.5, p 629-650

FRANČÁKOVÁ, H. et al. 2002. Hodnotenie poľnohospodárskych produktov. 1. vyd.

Nitra: SPU, 2002. ISBN 80-7137-980-8

FRANČÁKOVÁ, H.– MUCHOVÁ, Z. – HORČIN, V. 1995. Požiadavky na kvalitu

rastlinných produktov pri nákupe. Nitra 1995. ISBN 80-85330-24-5

GAJDOŠOVÁ, A. – ŠTURDÍK, E. 2004. Biologické, chemické a nutrično-zdravotné

charakterisktiky pekárskych cereálií. In Nova Biotechnologica, 2004, 136-138 s.

GÁLOVÁ, Z. 2002. Genetické markéry technologickej kvality zrna pšenice a jačmeňa. In

Mapovanie genómu zrna pšenice pre účely determinácie genetickej diverzity obilnín,

VEGA projekt. Č 1/7648/20: Záverečná správa, 2002. s. 1-3

GÁLOVÁ, Z. – STAROVIČOVÁ, M. – KNOBLOCHOVÁ, H. 2003. Identification of

glutenin markers in cultivars of three wheat species. In Czech journal of genetics and plant

breeding, 39, 2003, p. 51-57

GREGÁŇOVÁ, Ž. 2005. Molekulárne markery v identifikovaní a charakteristike pšenice

letnej: dizertačná práca. Nitra: SPU, 2005, 2-4 s.

GREGOVÁ, E. - HERMUTH, J. - KRAIC, J. - DOTLAČIL, L. 2006. Protein geterogenity

in European wheat landraces and obsolete cultivars: Additional information II. In Genetic

Resources of Crop Evolution, 53, 2006, p. 876-871

HANKOVÁ, A. – GREGOVÁ, E. 2006. Kvalitatívne ukazovatele ako selekčné kritérium

pri tvorbe genetických zdrojov pšenice. In Nové poznatky z genetiky a šľachtenia

poľnohospodárskych rastlín [Zborník]. Piešťany, 2006, s. 89, 90. ISBN 80-88872-57-X

HOLEČKOVÁ, J. - MICHALÍK, I. 1993. Elektrofoterická analýza gluténových bielkovín

zrna pšenice. In Agriculture 39, č. 11, 1993, s. 866-876

HOLME, D. - PECK, H. 1998. Analytical biochemistry. 3 vyd. London : Longman, 1998,

481 s. ISBN 0-582-29438-X.

HRABE, J. – ROP, O. – HOZA, I. 2006. Technológie výroby potravin rostlinného puvodu.

Praha: UTB, 1.vyd., 2006, 178s. ISBN 80-7318-372-2

CHŇAPEK, M. – GÁLOVÁ, Z. – TOMKA, M. 2010. Nutričná a technologická kvalita

farebných genotypov pšenice letnej formy ozimnej (Triticum aestivum L.). In

Potravinárstvo. roč. 4, 2010, č. 1, s. 20

JOMOVÁ, K. – MEDVECKÁ, E. 2008. Zásobné bielkoviny ako markery technologickej

kvality zrna pšenice. In Chemické listy. roč. 102 , 2008, 758 s.

KARABINOVÁ, M. – KULÍK, D. – PROCHÁDZKOVÁ, M.1999. Obilniny I. Nitra 1999,

ISBN 80-85330-63-6 str. 5, 101, 104

KOLSTER P. - VEREIJKEN, J. M. 1993. Evaluating HMW glutenin subunits to improve

bread-making quality of wheat. Cereal Food World, 2, 1993, p. 76-83

KRAIC, J. Genetické markéry rastlín, 2004, SPU v Nitre, ISBN 80-8069-381-1 str. 40

KULÍK, D. et al. 2004. Technológia rastlinnej výroby. 1 vyd. Nitra : SPU, 2004. 41-43 s.

ISBN 80-8069-089-8

LOOKHART, G. T. – HAGMAN, K. – KASARDA, D. D. 1993. High-molecular-weight

glutenin subunits of the most commonly grown wheat cultivars in the U. S. Plant Breeding,

12, 1993, p. 48 – 62

MARTINEK, P. et al. 2006. Netradiční barva obilek pšenice (Triticum aestivum L.), její

genetická podmínenosť a možnost využití v potravinárstvi. In Nové poznatky z genetiky

a šľachtenia poľnohospodárskych rastlín [Zborník]. Piešťany, 2006, s. 95-98. ISBN 80-

88872-57-X

MARTINEK, P. et al. 2006. Identifikace zdroju tritikale se sníženou aktivitou

amylasových enzymu a vhodnejším složením bílkovín pro zlepšení pekarské kvality. In

Nové poznatky z genetiky a šľachtenia poľnohospodárskych rastlín [Zborník]. Piešťany,

2006, s. 95-98. ISBN 80-88872-57-X

MATÚŠKOVÁ, K. – HANKOVÁ, A. – RUCKSCHLOSS, Ľ. 2009. Pokrok v šľachtení

pšenice letnej f. ozimnej na výšku úrod na VŠS Vígľaš – Pstruša. In Acta fytotechnica et

zootechnica. Nitra, 2009, s. 424

MEDVECKÁ, E. et al. 2009. Molekulárna charakteristika pšenice tvrdej pomocou MHW

glutenínových podjednotiek. In Acta fytotechnica et zootechnical. Nitra, 2009, s. 429, 430

MICHALÍK, I. 2005. Nové poznatky v oblasti štúdia molekulárnych mechanizmov

klíčenia a prerastania zrna pšenice. In Nové poznatky z genetiky a šľachtenia

poľnohospodárskych rastlín, 2005, s. 12-15

MICHALÍK, I. 2008. Biochémia. 6 vyd. Nitra: SPU, 2008. ISBN 978-80-552-0020-0

MOLNÁROVÁ, J. – ŽEMBERY, J. – ILÉŠ, L. 2009 Rastlinná výroba I, Nitra 2009, 2

vyd., ISBN 978-80-552-0194-8

Morfológia pšenice, [online] [cit. 2010-01-15]. Dostupné na:

http://www.plantprotection.hu/modulok/szlovak/wheat/morf_wheat.htm

MUCHOVÁ, Z. et al. 2008. Hodnotenie surovín a potravín rastlinného pôvodu. 5 vyd.

Nitra, 2008. ISBN 978-80-552-0127-6

PAULOVICSOVÁ, B. – BOLOGHOVÁ, M. – POKORNÁ-JURÍKOVÁ, T. 2007.

Dôležité postavenie drobného a kôstkového ovocia vo výžive ľudí, 8. vedecká konferencia

doktorantov a mladých vedeckých pracovníkov, Nitra : FPV UKF, s. 77, 78

PAYNE, P. I. 1987. Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic vairation

on bread-making quality. Ann. Rev. Plant Physiol. 38, 1987, p. 141 - 153

POSPÍŠIL, R. et al. 2008. Integrovaná rastlinná výroba. 1 vyd. Nitra, 2008. ISBN 978-80-

552-0141-2

PŘÍHODA, J. – SKŘIVAN, P. – HRUŠKOVÁ, M. 1986. Cereální chemie a technologie I:

cereální chemie mlýnská technologie, technologie výroby těstovin. 1. Vyd. Vysoká škola

chemicko – technologická v Praze, Praha 2004. ISBN 80-7080-530-7

PRUGAR, J. 2008. Kvalita rostlinných produktu na prahu 3. tisiciletí. Praha 2008. 75-77 s.

ISBN 978-80-86576-28-2

PRUGAR, J.– HRAŠKA, Š. 1986. Kvalita pšenice. Bratislava 1986. 8, 37-38 s. ISBN 64-

133-86

PŠENÁKOVÁ, I. – FARAGÓ, J. 2006. Rastlinné flavonoidy a ich potenciál pre funkčné

potraviny a nutraceutiká. In Nové poznatky z genetiky a šľachtenia poľnohospodárskych

rastlín [Zborník]. Piešťany, 2006, s. 27,28

SEDLÁK, D. et al. 2007. Praktikum z biochémie. 2 vyd.

SHEWRY, P.R. - TATHAM, A.S. 2002. New light on an old technology: the structure of

wheat gluten and its role in bredmaking. Outlook Agric., 18, 1989 p.65-71

SOLNICOVÁ, S. 2006. Transformácia funkčných zložiek cereálií v potravinách nového

typu: dizertačná práca. Nitra: SPU, 2006, 18 s.

STN 46 1100-2: 2003 Potravinárske obilniny. Časť 2: Zrno potravinárskej pšenice letnej.

Bratislava: vyd. SÚTN, 2003, pub. 90367

ŠIMKO, J.– MATUŠKOVIČ, J. – POKORNÁ-JURÍKOVÁ, T. 2007. Jedlé zemolezy –

nový hodnotný zdroj antokyanínov, 8. vedecká konferencia doktorantov a mladých

vedeckých pracovníkov, Nitra : FPV UKF, s. 107-109

VRBOVÁ, B. 2006. Analýza obrazů z gelové elektroforézy: bakalárska práca. Praha:

ČVÚT, 2006, 3 s.

VIVODÍK, M. et al. 2007. Využitie molekulárnych markérov na identifikáciu genotypov

pšenice, 8. vedecká konferencia doktorantov a mladých vedeckých pracovníkov, Nitra :

FPV UKF, s. 194, 195

ZÁLEŠÁKOVÁ, A. – BIELIKOVA, S. – GREGOVÁ, E. – KRAIC, J. 2004.

Vyhľadávanie zdrojov kvality v kolekcii genetických zdrojov pšenice. In Nova

Biotechnologica, 2004, 235, 236 s.

ZIMOLKA, J. et al. 2005. Pšenice : pěstování, hodnocení a užití zrna. 1. vyd. Praha, 2005.

9 s. ISBN 80-86726-09-6

Prílohy

Príloha A Grafické znázornenie percentuálneho zastúpenia alelickej zostavy na GLU-A1, GLU-

B1 a GLU-D1

40%

10%

50%

Glu - A1

02*1

40%

40%

20%

Glu - B1

7+87+920

80%

20%Glu - D1

5+102+12

Príloha B Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody Modré zrno

Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody UC66094

1 5

20

10

1

5

7

810

Denzitometrický záznam elektroforetického profilu Modré zrno a UC66094

Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody Barevná 9

1

1 5

20

10

5

7

8

1

7 1

9

10

Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody UC 66049 - modré TC

Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody Barevná 25

1

5

7 1

810 1

5

1

10

20

Príloha C Elektroforetické profily zásobných bielkovín zrna farebných genotypov pšenice letnej

v SDS - PAGE

1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 5 M Ch

Legenda k   prílohe

1 – Modré zrno2 – UC660943 – Barevná 25 – modrá4 – UC 66049

5 – Barevná 9Marquis - štandardChinese spring - štandard

HMW-GS

LMW-GS+

gliadíny

Albumíny+

globulíny

Príloha DElektroforetické profily zásobných bielkovín zrna pšenice letnej v A - PAGE

1 1 2 2 3 4 5 6 7 8 8 8 9 10 11 10 11 11 12 13

Legenda k prílohe

1 – Modré zrno2 – Barevná modrá 253 – Samanta4 – Astela5 – Lívia6 – Torysa7 – Astela

8 – Barevná 99 – UC 66094 – modrá10 – ILAVA11 – UC 6604912 – ORMIL13 - ISTAR

GlD 1b3

Príloha EElektronický nosič