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COURS BIOLOGIE CELLULAIRE M1
PREDISPOSITIONS GENETIQUES au CANCER du FOIE
Angela SUTTON Université Paris 13 – UFR SMBH
OH.
radical hydroxyle
.NO
monoxyde d’azote
O2
oxygène
O2.-
anion superoxyde
ROO.
radical peroxyl
H2O2
peroxyde d’hydrogène
OH.
radical hydroxyle
ON.OO-
peroxynitrite
RNH2
Réaction de Fenton
Fe2+,
Cu2+
Réaction
d’Haber-Weiss
H2O2
SOD
e-
NOS
H+
ON.OOH
.NO2
R.
O2
BIOCHIMIE DES ERO
MISE EN EVIDENCE des ERO
PAR FLUORIMETRIE Dihydroéthidine : réagit avec l’anion superoxyde pour former de l’éthidium l excitation = 480 nm l émission = 600 nm Dichlorofluorescéine diacétate : désestérifié par les estérases cellulaires. Réagit avec le peroxyde d’hydrogène l excitation = 488 nm l émission = 525 nm
Dosage au fluorimètre ou au cytomètre de flux
ETHANOL CH3CH2OH
Voie constitutive
(cytoplasmique)
ADH NAD+
NADH, H+
CYP 2E1,
NADPH CYP
réductase
Oxydation
spontanée
CH3.CH2OH
radical
hydroxyéthyl
CH3CHO
acétaldéhyde
CH3CHO
acétaldéhyde
NADPH + O2 + H+
NADP+ + H2O
CH3.CH2OH
radical hydroxyéthyl
CH3CHO
acétaldéhyde
O2
OH.
+
Voie inductible
(microsomale)
Réaction de Fenton,
SOD, GPx, catalase
Voie mineure
(peroxysomale)
catalase
H2O2
H2O + ½ O2
CH3CHO
acétaldéhyde
NAD+
NADH, H+
CH3COO-
acétate
ALDH XO / AO
CH3COO-
acétate
O2
Chaîne respiratoire
Métabolisme de l’alcool
Altérations oxydatives des molécules
Lésions cellulaires
Apoptose ou nécrose
Lésions hépatiques
ALCOOL
Métabolisme
- ADH
- ALDH
- CYP 2E1
ERO
NADH+H+
ERO
Mitochondrie et lésions hépatiques alcooliques
OH
O2 - H2O2
MnSOD
CR
e-
Fe2+ MPO ClO-
H2O2 CAT
H2O
MnSOD: Superoxyde Dismutase à Manganèse MPO: Myéloperoxydase
GPx1: Glutathion Peroxydase 1 CAT: Catalase
Système antioxydant mitochondrial
GPx1 H2O
MnSOD
O2
.- H2O2 H2O GPx 1
OH.
Toxicité cellulaire
ALCOOL
Fe2+, Cu2+
Alcool et enzymes antioxydantes mitochondriales
Foie normal
Cirrhose
Carcinome
hépatocellulaire
BUT DES ETUDES
Facteurs génétiques ?
-Stress oxydant
-Métabolisme du fer
ALCOOL
TOXICITE HEPATIQUE DE L’ALCOOL
Maladies alcooliques du foie
MEILLEUR IMPORT MITOCHONDRIAL
ACTIVITE ENZYMATIQUE ACCRUE
Sutton et al, Pharmacogenetics 2003
Sutton et al, Pharmacogenetics and Genomics, 2005
ARN
Protéine
Structure
x
Alanine Valine
Hélice α Feuillet β
Dimorphisme génétique Ala/Val de la MnSOD
Chromosome Nucléotides AA Génotypes Activité
MnSOD
6 1183 C/T Ala/Val
Ala/Ala
Val/Val
Ala/Val
Ala
>>>
Val
CONSEQUENCES FONCTIONNELLES du DIMORPHISME GENETIQUE Ala/Val de la MnSOD
Protéasome
ARNm dégradé
Val-MnSOD
(feuillet b)
Protéine
d’ancrage Ala-MnSOD (hélice a)
ARNm Ribosome attaché
Protéine
d’ancrage
Protéasome
SUTTON A*, IMBERT A*, IGOUDJIL A, ALBANO V, CAZANAVE S, PESSAYRE D, DEGOUL F. Pharmacogenetics and Genomics. 2005,
15:311-319.
SUTTON A, KHOURY H, PRIP-BUUS C, CEPANEC C, PESSAYRE D, DEGOUL F. Pharmacogenetics, 2003, 13:145-157.
Ala-MnSOD Val-MnSOD
50 ml sang non coagulé + Ficoll
(héparine ou EDTA)
Membrane Membrane
lymphocytes
sérum
centrifugation Globules rouges
Récupération et lavage
des lymphocytes
ADN ARN
ADN PCR RFLP
PCR en temps réel
Principe de la PCR Amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel. A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits. Cinétique de la réaction et donc la quantification de l’ADN alors que la PCR classique ne donne que la mesure finale.
ALCOOL
Stéatoses
(SMa, SMi)
Cirrhose
Carcinome
hépatocellulaire
Foie sain
Altération du métabolisme des
acides gras
Peroxydation lipidique
Inflammation Fibrose
Sélection clonale Prolifération cellulaire
Différents degrés de lésions hépatiques
DEGOUL F, SUTTON A, MANSOURI A, CEPANEC C, DEGOTT C, FROMENTY B, BEAUGRAND M, VALLA D, PESSAYRE
D. Gastroenterology, 2001, 120 : 1468-1474.
LE DIMORPHISME GENETIQUE Ala/Val de la MnSOD MODULE le RISQUE de
MALADIES ALCOOLIQUES DU FOIE
Contrôles SMa SMi HA C
*
*
19% 17%
43%
58%
69%
*
SMa = stéatose macrovacuolaire (n=10) Smi = stéatose microvésiculaire (n=28) HA = hépatite alcoolique aiguë (n=12) C = cirrhose (n=13) Contrôles (n=79)
% Ala/Ala * : p < 0.05
LE DIMORPHISME GENETIQUE Ala/Val de la MnSOD MODULE le RISQUE de CHC
NAHON P*, SUTTON A*, PESSAYRE D, RUFAT P, DEGOUL F, GANNE-CARRIE N, ZIOL M, CHARNAUX N, N’KONTCHOU G,
TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Clinical Gastroenterology Hepatology, 2005 ; 3 :292-298.
n=264 patients cirrhose alcoolique
50 0 100 150 200 250 (mois)
Ala/Ala (n=39)
Pat
ien
ts s
ans
CH
C
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Val/Val (n=40)
Ala/Val (n=83)
p = 0.014
Val/Val Ala/Val Ala/Ala p
Age (ans) 54 53 53 NS
Sexe Masculin (%) 61 63 71 NS
Alcool (g/j) 105 114 110 NS
Child-Pugh (score) 7,8 8,1 8,3 NS
Sevrage (%) 40 53 49 NS
Distribution n (%) 40 (25%) 83 (51%) 39 (24%)
MnSOD O2
.- H2O2 H2O GPx1
OH.
ALCOOL
Fe2+, Cu2+
Dimorphisme génétique
Ala/Val
Dimorphisme génétique
Pro/Leu
ARN
Protéine
x
Proline Leucine
ACTIVITE REDUITE
ALTERATION STRUCTURE
LIAISON AU SELENIUM
Dimorphisme Pro/Leu de la GPx1
Chromosome Nucléotides AA Génotypes Activité
GPx 1 3 593 C/T Pro/Leu Pro
>>>
Leu
Pro/Pro
Leu/Leu
Pro/Leu
MnSOD « Ala » = Ala/Ala + Ala/Val Forte activité MnSOD
GPx « Leu » = Leu/Leu + Pro/Leu Faible activité GPx
Association des dimorphismes de la MnSOD et de la GPx1
H202 H202
Faible activité MnSOD
Forte activité GPx1
Forte activité MnSOD
Faible activité GPx1
2 Val-MnSOD
2 Pro-GPx1
1 ou 2 Ala-MnSOD
1 ou 2 Leu-GPx1
2 Val-MnSOD
1 ou 2 Leu-GPx1
1 ou 2 Ala-MnSOD
2 Pro-GPx1
• 183 malades ayant une cirrhose alcoolique histologiquement prouvée, inclus au moment du diagnostic de cirrhose
• Détermination des génotypes MnSOD, GPx1 et HFE
• Recueil rétrospectif
- Données cliniques et para-cliniques : sévérité de la maladie hépatique
- Détermination de la teneur en fer intra-hépatique sur la première biopsie prouvant la cirrhose
• Recueil prospectif
- Incidence du CHC
- Délai de survenue du CHC
Influence des polymorphismes génétiques MnSOD / GPx1
2Val-MnSOD/
2Pro-GPx1
2Val-MnSOD/
1ou2Leu-GPx11ou2Ala-MnSOD/
2Pro-GPx1
1ou2Ala-MnSOD/
1ou2Leu-GPx1 P
Distribution
[N (%)]
Age (ans)
Sexe masculin
(%)
Child-Pugh
(score)
Alcool (g/j)
Sevrage (%)
8,4 7,5 8,0 7,8
53,2 51,1 53,4 54,4
113 114 116 108
87 63 71 68
24 (14) 22 (12) 67 (36) 70 (38)
54 59 46 58
NS
NS
NS
NS
NS
Caractéristiques initiales des 183 malades
MnSOD Val/Val Val/Val « Ala » « Ala »
GPx1 Pro/Pro « Leu » Pro/Pro « Leu » n 22 18 58 64
100
77
70
63
23
30
37
0
20
40
60
80
100
%
Cirrhose sans CHC
Cirrhose avec CHC
0
n=162 patients
cirrhotiques
Dimorphismes MnSOD / GPx1 et risque de CHC
2Val-MnSOD
2Pro-GPx1
2Val-MnSOD
“Leu”-GPx1
“Ala”-MnSOD
“Leu”-GPx1
“Ala”-MnSOD
“Pro”-GPx1
Mois
P = 0,0002
Mala
des s
an
s C
HC
H2O2
H2O2
Dimorphismes MnSOD / GPx1 et risque de CHC
L’ASSOCIATION des DIMORPHISMES de la MnSOD et de la GPx1 module le risque de CHC
2Val-MnSOD
2Pro-GPx1
2Val-MnSOD
“Leu”-GPx1
“Ala”-MnSOD
“Leu”-GPx1
“Ala”-MnSOD
“Pro”-GPx1
Mois
HR = 2,000
IC = 1,311 – 3,052
p = 0,001
Pat
ien
ts s
ans
CH
C
H2O2
H2O2
SUTTON A*, NAHON P*, PESSAYRE D, RUFAT P, POIRE A, ZIOL M, VIDAUD D, BARGET N, GANNE-CARRIE N, CHARNAUX
N, TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Cancer Research, 2006, 66:2844-2852.
n=162 patients cirrhose alcoolique
(n=22)
(n=14)
(n=64)
(n=58)
0
20
40
60
2Val-MnSOD
2Pro-GPx1
2Val-MnSOD
“Leu”-GPx1
“Ala”-MnSOD
“Leu”-GPx1
“Ala”-MnSOD
“Pro”-GPx1
22% 28%
50% 53%
* *
1ère biopsie hépatique Coloration de Perls
L’ASSOCIATION des DIMORPHISMES de la MnSOD et de la GPx1 MODULE LE TAUX DE FER HEPATIQUE
n=162 patients cirrhose alcoolique
Fer
SUTTON A*, NAHON P*, PESSAYRE D, RUFAT P, POIRE A, ZIOL M, VIDAUD D, BARGET N, GANNE-CARRIE N, CHARNAUX
N, TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Cancer Research, 2006, 66:2844-2852.
n=22 (14%) n=18 (12%) n=58 (35%) n=64 (39%) * : p < 0.05
LE DIMORPHISME Ala/Val de la MnSOD MODULE l’ACCUMULATION CELLULAIRE de FER
Val/Val-MnSOD (n=40)
Ala/Val-MnSOD (n=83)
Ala/Ala-MnSOD (n=39)
x 400
Patients cirrhose alcoolique
(n=162)
x 400
Cellules d’hépatome humain (Huh7) transfectées
Plasmide vide Val-MnSOD Ala-MnSOD
NAHON P, CHARNAUX N, FRIAND V, PROST-SQUARCIONI C, ZIOL M, BARGET N, LIEVRE N, TRINCHET JC, BEAUGRAND
M, GATTEGNO L, PESSAYRE D, SUTTON A. Free Radical Biology Medicine, en révision, 2008.
x21000
x6000
x28500
x6600
Val-MnSOD
Ala-MnSOD Ala-MnSOD
Plasmide vide
LE DIMORPHISME Ala/Val de la MnSOD MODULE l’ACCUMULATION CELLULAIRE de FER
Microscopie électronique
x21000
0
100
200
300*
Plasmide
vide Val-MnSOD Ala-MnSOD
To
tal
iro
n
(ng
/µg
of
pro
tein
)
Dosage colorimétrique
* : p < 0.05
Le DIMORPHISME Ala/Val-MnSOD MODULE-T-IL l’EXPRESSION DE PROTEINES IMPLIQUEES DANS
l’HOMEOSTASIE MARTIALE ?
TfR1
Ferritine cytosolique Ferritine mt
Frataxine
HEPATOCYTE
FER
STOCKAGE
ENTREE
FER FONCTIONNEL
Mitochondrial Cytosolique
Hepcidine
TfR2
Le DIMORPHISME Ala/Val-MnSOD MODULE-T-IL l’EXPRESSION DE GENES IMPLIQUES DANS
l’HOMEOSTASIE MARTIALE ?
RT-PCR semi-quantitative
MnSOD
Le DIMORPHISME Ala/Val-MnSOD MODULE-T-IL l’EXPRESSION DE PROTEINES IMPLIQUEES DANS
l’HOMEOSTASIE MARTIALE ?
Western-blot
Immunocytochimie
MnSOD
X 400
TfR1
Ferritine cytosolique Ferritine mt
Frataxine
HEPATOCYTE
FER
STOCKAGE
ENTREE
FER FONCTIONNEL
Mitochondrial Cytosolique
Hepcidine
TfR2
TRANSFECTION
MnSOD
O2.- H2O2 H2O
OH.
Fe2+, Cu2+
ALCOOL
MnSOD GPx
Ala-MnSOD Leu-GPx
Effets des dimorphismes sur l’activité des enzymes antioxydantes mitochondriales
STRATEGIES ANTIOXYDANTES ENVISAGEES
N-Acétyl Cystéine : précurseur du glutathion (utilisé en routine dans le cadre des hépatites fulminantes d’origine médicamenteuse) Augmenter les pools cytosolique et mitochondrial de GSH Accroître l’activité enzymatique de la GPx Sélénium Accroître l’activité enzymatique de la GPx Deferroxamine Chélateur du fer