INDUSTRIJSKI ENZIMSKI INDUSTRIJSKI ENZIMSKI PROCESIPROCESI (3+3)(3+3)

Predmetni nastavnik – dr Zorica KnePredmetni nastavnik – dr Zorica KnežževićevićAsistent: mr Dejan BezbradicaAsistent: mr Dejan Bezbradica

INDUSTRIJSKI ENZIMSKI INDUSTRIJSKI ENZIMSKI PROCESIPROCESI (3+3)(3+3)

Predmetni nastavnik – dr Zorica KnePredmetni nastavnik – dr Zorica KnežževićevićAsistent: mr Dejan BezbradicaAsistent: mr Dejan Bezbradica

Literatura:Literatura:1.1. T. Godfrey& S.West, T. Godfrey& S.West, Industrial EnzimologyIndustrial Enzimology, ,

Macmillan Press LTD, 1996.Macmillan Press LTD, 1996.2.2. Z. Knežević, interni materijalZ. Knežević, interni materijal

Literatura:Literatura:1.1. T. Godfrey& S.West, T. Godfrey& S.West, Industrial EnzimologyIndustrial Enzimology, ,

Macmillan Press LTD, 1996.Macmillan Press LTD, 1996.2.2. Z. Knežević, interni materijalZ. Knežević, interni materijal

Prečišćavanje i izolovanje enzimaPrečišćavanje i izolovanje enzima Za industrijske i laboratorijske svrhe, kao i u slučaju primene enzima u analitici, dijagnostici i medicini neophodno je enzime izdvojiti od ostalih sastojaka i dobiti ih u što je moguće više čistom stanju.

Postoji jako veliki broj metoda prečišćavanja i u nekim slučajevima uspešno prečišćavanje zahteva primenu nekoliko metoda istovremeno

Pre nego što se pristupi prečišćavanju enzima, treba razmotriti mnogo pitanja. Krajni cilj prečišćavanja ima odlučujuću ulogu u razvoju šeme prečišćavanja.

Nepotrebno prečišćavanje se izbegava jer svaki novi korak prečišćavanja zahteva složenu opremu, dodatne troškove, radnu snagu i prouzrokuje novi rizik gubitka enzimske aktivnosti.

Uopšteno, prinos se smanjuje za 25% sa svakim kritičnim korakom prečišćavanja

Prečišćavanje i izolovanje enzimaPrečišćavanje i izolovanje enzima Tačna šema prečišćavanja zavisi od velikog broja faktora kao što su:

Tačan izvor i lokacija enzima

Koncentracija produkovanog enzima

Fizičko-hemijska svojstva enzima

Cilj prečišćavanja

Od porekla izvora enzima zavisi koncentracija i tip kontaminanata u polaznom materijalu

U zavisnosti da li je proizvedeni enzim ekstracelularan ili intracelularan, razlikovaće se početni postupci prečišćavanja. Isto tako, ukoliko je proizvedeni enzim intracelularan, način razaranja ćelije zavisiće od njenog porekla.

U slučaju male produktivnosti, koncentracija enzima je toliko mala da je potrebno ekstrahovati veliku količinu izvora, što kasnije zahteva značajno koncentrisanje pre hromatografskog prečišćavanja.

Fizičko-hemijska svojstva enzima značajno utiču na proces prečišćavanja i u velikoj meri ga određuju.

Dobijanje i preDobijanje i prečišćavanje enzimačišćavanje enzimaUticaj broja koraka prečišćavanja na prinos i cenu enzima. Realna pretpostavka je da pri svakom koraku stepen prečišćavanja je tri puta, prinos enzima je 75% i da se cena povećava za 10%.

Veoma je važno da enzim zadrži početnu aktivnost u toku postupka prečišćavanja

Inaktivacija enzima može biti prouzrokovana: Toplotom

Oksidacijom

Ekstremnim pH vrednostima

Denaturantima i inhibitorima

Dejstvom proteaza

Gubitkom kofaktora

Izolacija enzima iz tečne ili čvrste Izolacija enzima iz tečne ili čvrste podloge podloge

Prvi stadijum izolacije enzima razlikuje se u zavisnosti od tehnike kultivacije proizvodnog mikroorganizma i proizvodnje enzima Ako se enzim proizvodi na čvrstim podlogama, kultura se može usitniti i osušiti na 10-12% vlage. Takva kultura se može lakše transportovati i čuvati duže vremena bez znatnijeg gubitka aktivnosti

Sušenje do oko 38-55% već u uređajima za biosintezu enzima

Usitnjavanje kulture u cilju njenog bržeg daljeg sušenja i bolje ekstrakcije enzima u raznim DROBILICAMADROBILICAMA, GRANULATORIMAGRANULATORIMA i DEZINTEGRATORIMADEZINTEGRATORIMA

Sušenje u specijalnim sušnicama pomoću zagrejanog vazduha do oko 10-12% vlage

Ekstrakcija enzima iz vlažne ili suve kulture čime se uklanja 70-75% balastnih supstanci

ŠemaŠema pre prečišćavanja enzimačišćavanja enzima

Ekstracelularni ili intracelularni enzimiEkstracelularni ili intracelularni enzimi Ukoliko je enzim ekstracelularan to ima niz prednosti:

Nije potrebno da se razara ćelija

Termostabilniji su i često se produkuju u većim količinama

Poreba za prečišćavanjem je jako mala Nedostatak u slučaju produkcije ekstracelularnih enzima: procesi koncentrisanja su često potrebni u slučaju produkcije ekstracelularnih enzima.

Nedostaci kod dobijanja intracelularnih enzima su: Neminovnost narušavanja ćelijske strukture

Kontaminacija sa drugim intracelularnim enzimima

Gubitak proteina Prednost kod dobijanja intracelularnih enzima: radi se sa mnogo manjim početnim zapreminama

Veoma je važno znati lokaciju enzima unutar ćelije.

OpOpšta šema izolovanja i prečišćavanja intra-, ekstra-šta šema izolovanja i prečišćavanja intra-, ekstra-celularnih, i periplazmatičnih enzimacelularnih, i periplazmatičnih enzima

Postupci prečišćavanja intracelularnih Postupci prečišćavanja intracelularnih enzimaenzima

DEZINTEGRACIJA MIKROBNIH ĆELIJA

NEMEHANIČKI MEHANIČKI

Smicanje u čvrstom stanju

Smicanje u tečnosti

Liza ćelije Desikacija

Enzimska Hemijska

Fizička (osmotski šok, uzastopno

zamrzavanje i odmrzavanje i drugi)

Presa

Kuglični mlinovi Ultrazvuk

Visoko-pritisni

homoge-nziator

Postupci prečišćavanja intracelularnih Postupci prečišćavanja intracelularnih enzimaenzima

Da bi se izdvojili intracelularni proteini, struktura ćelije mora biti narušena. Postoji nekoliko metoda za narušavanje ćelija i to mogu biti:

Količina energije koja je potrebna za razaranje ćelije i oslobađanje unutarćelijskog sadržaja zavisi od tipa organizma i u izvesnoj meri od fiziologije organizma, lokacije enzima unutar ćelije, uslova kultivacije MO itd. Neki tipovi ćelija se razaraju već pod dejstvom povišenog osmotskog pritiska, dok su neke veoma otporne na razaranje.

Brzina oslobađanja proteina u slučaju mehaničkog razaranja ćelijske membrane proporcionalna je količini rastvornih proteina. Napisati formule i objasniti značenje.

Metod razaranja ćelije treba da bude takav da ne dovede do inaktivacije enzima.

Toplota

U toku skoro svih mehaničkih tretmana oslobađa se toplota koja se mora uklanjati. Prisustvo supstrata ili poliola može stabilizovati enzim

Sile smicanja Mogu inaktivirati enzim naročito u prisustvu jona

teških metala i granične površine

Proteaze

Dejstvo se smanjuje ako se poveća brzina procesa prečišćavanja sa što je više moguće hlađenja. Isti efekat se postiže dodatkom analognih supstrata (jeftinih proteina) ili inhibitora u ekstrakcioni medijum

pH Potrebno je koristiti puferisane rastvore. Isto, dodatak analognih supstrata, poliola...

Hemikalije

Štetno dejstvo deterdženata ili rastvarača. Isto, polifenoli iz biljnih materijala inhibiraju enzim. Problem se prevazilazi dodatkom adsorbenasa-polivinilpirolidona i upotrebom askorbinske kiseline da smanji dejstvo polifenoloksidaze.

Joni teških metala

Enzim se može zaštititi od ireverzibilne inhibicije upotrebom helatnih agenasa, EDTA

Mogući uzroci inaktivacije enzimaMogući uzroci inaktivacije enzima

Ultrazvučni dezintegratorUltrazvučni dezintegratorUsitnjavanje biološkog materijala i dobijanje suspenzije delova ćelije u vodi ili puferu može da se vrši pod dejstvom ultrazvuka u ULTRAZVUČNOM DEZINTEGRATORU. ULTRAZVUČNOM DEZINTEGRATORU. Naime, ukoliko se ćelije mikroorganizama izlože dejstvu ultrazvuka pri frekfenci većoj od 18 kHz, doći će do njenog razaranja i oslobađanja unutarćelijskog sadržaja.

Ovaj postupak se puno koristi u svetu naročito u slučaju razaranja biomase MO. Količina enzima koja se oslobađa sonikacijom može se odrediti na osnovu jednačine (1). Konstanta k ne zavisi od koncentracije ćelija i približno je proporcionalna jačini ultrazvuka u dosta širokom intervalu.

Ovim postupkom se može razoriti 1-500 g ćelija i postupak nije ekonomičan za razaranje veće količine ćelija od 500 g. Ćelije treba suspendovati u 2-3 ml pufera/g težine za sonifikaciju i ne treba da se sonificira više od 300 ml istovremeno.

Nekada treba hladiti homogenizat.

Nekada se uvodi vazduh što povećava mogučnost inaktivacije enzima

Za E. Coli potrebno je 3-15 min za potpuno razaranje ćelije 300 ml homogenata sonifikacijom

Metoda još uvek nije našla veliku primenu za proizvodnju enzima u velikim razmerama. Osnovni razlozi su inaktivacija velikog broja enzima usled uticaja ultrazvuka, kao i slobodnih radikala koji mogu da nastanu. Bez obzira, sonikacija ostaje popularna, korisna i veoma podesna metoda za razaranje ćelija u malim razmerama.

Tehnika razaranja ćelije primenom Tehnika razaranja ćelije primenom visokog pritiskavisokog pritiska

Struktura ćelije se može razoriti i pritiskom

Osnovni faktori koji deluju su primenjeni pritisak i kao posledica pad pritiska kroz ventil.

Brzina oslobađanja proteina može se opisati jednačinom (1) pri čemu se promenljiva vreme može zameniti brojem prolaza kroz uređaj pod visokim pritiskom (N)

Presek uređaja (Presek uređaja (Manton-GaulinManton-Gaulin APV tip APV tip homogenizatora)homogenizatora)

Presek Manton-Gaulin homogenizatora pri čemu se vidi protok materijala. Suspenzija ćelija se pumpa kroz ventil u cilindar pumpe (150 MPa) i ćelije pod pritiskom pucaju pri prolazu kroz sitne otvore.

Ventil

Suspenzija ćelija

Razorene ćelije

Ležište ventila

Udarni prsten

Presek uređaja (Presek uređaja (Manton-GaulinManton-Gaulin APV tip APV tip homogenizatora)homogenizatora)

U slučaju primene najvećeg broja uređaja koji rade pri pritiscima manjim od 75 MPa, konstanta k je eksponencijalna funkcija primenjenog pritiska pri čemu eksponent zavisi od tipa MO, npr. u slučaju Saccharomyces cerevisiae

Druga konstanta k’ zavisi od temperature i razaranje je veće na višim temperaturama. U toku ovog postupka temperatura homogenizata može da se poveća i do 18-200C.

Uslovi zavise od tipa mikroorganizama, lokacije enzima. G- organizmi su osetljiviji na dejstvo pritiska od G+. E. Coli se brzo razori u toku jednog prolaza dok vrste Bacillus zahtevaju 3-4 prolaza. Kvasci se teže razaraju. Isto tako, važna je lokacija enzima unutar ćelije.

Više prolaza treba izbegavati jer se smanjuje produktivnost, s jedne strane, i dolazi do stvaranja finih čestica ćelijskih ostataka, sa druge, što otežava kasniju separaciju proizvoda.

Ova metoda je podesna za razaranje jednoćelijkih organizama i kada enzimi nisu termolabilni. Neki autori su objavili da ovaj proces nije podesan za filamentozne organizme.

Usitnjavanje ćelijskog materijala uz dodatak Usitnjavanje ćelijskog materijala uz dodatak stakla ili kvarcnog peskastakla ili kvarcnog peska

Usitnjavanje ćelijskog materijala i dezintegracija ćelije mođe da se Usitnjavanje ćelijskog materijala i dezintegracija ćelije mođe da se vrši mešanjem u prisustvu malih čestica stakla ili kvarcnog peska (0vrši mešanjem u prisustvu malih čestica stakla ili kvarcnog peska (0,,2-2-11,,0 mm) u specijalnim uređajima-mlinovima. 0 mm) u specijalnim uređajima-mlinovima.

Postupak se sastoji u tome da se dobro isprana biomasa bakterija, micelija, plesnih gljivica ili biljna i životinjska tkiva suspenduju u puferu i tretiraju mlevenju sa česticama koje su izgrađene od različitih materijala uz intezivno mešanje.

Brzina i efikasnost oslobađanja proteina zavise od BRZINE BRZINE MEŠANJAMEŠANJA, VELIČINE VELIČINE I KOLIČINE I KOLIČINE ČESTICAČESTICA, DIMENZIJA DIMENZIJA UREĐAJAUREĐAJA, TIPA I KONCENTRACIJE ĆELIJE i od TIPA I KONCENTRACIJE ĆELIJE i od TEMPERATURETEMPERATURE

Čestice prečnika 1mm su dovoljne da se oslobode enzimi rastvorni u citoplazmi kvasca, dok je potrebno tretiranje česticama manjim od 0.25 mm u toku dužeg vremena da bi se oslobodili neki enzimi koji su vezani za membrane kod bakterija

Usitnjavanje ćelijskog materijala uz Usitnjavanje ćelijskog materijala uz dodatak stakla ili kvarcnog peskadodatak stakla ili kvarcnog peska

Ukoliko se koristi ista zapremina čestica, veći efekat se postiže Ukoliko se koristi ista zapremina čestica, veći efekat se postiže primenom većeg broja manjih čestica nego obrnuto zbog veće primenom većeg broja manjih čestica nego obrnuto zbog veće frekfence sudara čestica i ćelijafrekfence sudara čestica i ćelija

PPrimena veće količine čestica povećava efikasnost dezintegracije ali rimena veće količine čestica povećava efikasnost dezintegracije ali ujedno se povećava količina oslobođene toplote i veća je potrošnja ujedno se povećava količina oslobođene toplote i veća je potrošnja energije za mešanje.energije za mešanje.

Povećanje brzine mešanja ima pozitivan uticaj sve dok se ne Povećanje brzine mešanja ima pozitivan uticaj sve dok se ne oslobode značajne količine toplote koja može inaktivirati enzimoslobode značajne količine toplote koja može inaktivirati enzim

KKinetika oslobađanja enzima data je sledećom jednačinom:inetika oslobađanja enzima data je sledećom jednačinom:

i

ik

PP

P

rm

m

1lnln

Problem adsorpcija enzima na staklu što se može minimizirati Problem adsorpcija enzima na staklu što se može minimizirati primenom rastvora veće jonske jačine za ekstrakciju. primenom rastvora veće jonske jačine za ekstrakciju.

Usitnjavanje ćelijskog materijala uz Usitnjavanje ćelijskog materijala uz dodatak stakla ili kvarcnog peskadodatak stakla ili kvarcnog peska

Ovi uređaji su dostupni u različitim veličinama i konfiguracijama od Ovi uređaji su dostupni u različitim veličinama i konfiguracijama od MickleMickle--ovog šejkera čija je maksimalna zapremina 40 ml, pa do ovog šejkera čija je maksimalna zapremina 40 ml, pa do opreme za kontinualne procese u kojima se može dezintegrisati 200 kg opreme za kontinualne procese u kojima se može dezintegrisati 200 kg vlažne mase kvasca ili 20 kg vlažne mase bakterija. Uređaji koji su vlažne mase kvasca ili 20 kg vlažne mase bakterija. Uređaji koji su najviše korišćeni su najviše korišćeni su Dyno-MillDyno-Mill i i Netsch-MolinexNetsch-Molinex agitator. agitator.

Dobijena kaša naziva se Dobijena kaša naziva se HOMOGENATHOMOGENAT. U ovoj masi nalaze se i . U ovoj masi nalaze se i jedra ćelija, hloroplasti biljaka i druge protoplazmatične strukture jedra ćelija, hloroplasti biljaka i druge protoplazmatične strukture (mitohondrije, mikrosomi, lizosomi i dr.), pigmenti, različite (mitohondrije, mikrosomi, lizosomi i dr.), pigmenti, različite rastvorljive belančevine itd.rastvorljive belančevine itd.

Metode smicanja u čvrstom stanjuMetode smicanja u čvrstom stanju HugovHugovee (Hughes) i X (Hughes) i X preseprese. Ovi postupci se zasnivaju na ekstruziji . Ovi postupci se zasnivaju na ekstruziji smrznute paste ćelija pod visokim pritiskom (150-230 MPa) kroz uske smrznute paste ćelija pod visokim pritiskom (150-230 MPa) kroz uske otvore. Do razaranja ćelije dolazi usled promene faza i zapremine, kao otvore. Do razaranja ćelije dolazi usled promene faza i zapremine, kao i smicanja pod dejstvom kristala. i smicanja pod dejstvom kristala.

Hugove prese rade diskontinualno i koriste se samo u malim Hugove prese rade diskontinualno i koriste se samo u malim razmerama. Takozvane X prese mogu da se korste semikontinualno i u razmerama. Takozvane X prese mogu da se korste semikontinualno i u većim razmerama, međutim, iako su podesne za razaranje ćelija većeg većim razmerama, međutim, iako su podesne za razaranje ćelija većeg broja mikroorganizama i termolabilnih enzima, ova metoda se još broja mikroorganizama i termolabilnih enzima, ova metoda se još uvek ne koristi u većim razmerama.uvek ne koristi u većim razmerama.

Dezintegracija ćelije primenom nemehaničkih metoda može da ima Dezintegracija ćelije primenom nemehaničkih metoda može da ima određenih prednosti jer su uslovi dezintegracije blagi (enzimi nisu određenih prednosti jer su uslovi dezintegracije blagi (enzimi nisu izloženi silama smicanja i zagrevanju) i ove metode mogu da budu izloženi silama smicanja i zagrevanju) i ove metode mogu da budu veoma jeftineveoma jeftine

Primena ostalih metodaPrimena ostalih metoda

U ove nemehaničke metode spadaju: U ove nemehaničke metode spadaju:

Osmotski šok Naizmenično smrzavanje i odmrzavanje

Enzimska liza Hemijska liza (deterdženti, antibiotici, rastvarači, alkalije, haotropni agensi)

Desikacija

Dezintegracija ćelija pod uticajem povišenog osmotskog pritiska je je jeftina, blaga i konvencionalna metoda za dobijanje velikog broja jeftina, blaga i konvencionalna metoda za dobijanje velikog broja intracelularnih enzima. intracelularnih enzima.

Autoliza ćelije je spor proces u odnosu na mehaničke metode, tako ćelije je spor proces u odnosu na mehaničke metode, tako da može da dođe do mikrobiološke kontaminacije u toku procesa, ali da može da dođe do mikrobiološke kontaminacije u toku procesa, ali to nije prepreka da se ona koristi i u industrijskim razmerama. to nije prepreka da se ona koristi i u industrijskim razmerama. Kvaščeva Kvaščeva INVERTAZA se industrijski proizvodi na ovaj način. se industrijski proizvodi na ovaj način. Problem: spor proces, rizik od kontaminacijaProblem: spor proces, rizik od kontaminacija

Dezintegracija ćelija pod uticajem povišenog osmotskog pritiska je je jeftina, blaga i konvencionalna metoda za dobijanje velikog broja jeftina, blaga i konvencionalna metoda za dobijanje velikog broja intracelularnih enzima. intracelularnih enzima.

Autoliza ćelije je spor proces u odnosu na mehaničke metode, tako ćelije je spor proces u odnosu na mehaničke metode, tako da može da dođe do mikrobiološke kontaminacije u toku procesa, ali da može da dođe do mikrobiološke kontaminacije u toku procesa, ali to nije prepreka da se ona koristi i u industrijskim razmerama. to nije prepreka da se ona koristi i u industrijskim razmerama. Kvaščeva Kvaščeva INVERTAZA se industrijski proizvodi na ovaj način. se industrijski proizvodi na ovaj način. Problem: spor proces, rizik od kontaminacijaProblem: spor proces, rizik od kontaminacija

Hemijska liza Primena samih deterdženata, ili uz dodatak Primena samih deterdženata, ili uz dodatak haotropnih agenasa, može da bude veoma efikasan postupak za haotropnih agenasa, može da bude veoma efikasan postupak za rastvaranje ćelijske membrane. Pri tome, jonski deterdženti kao što je rastvaranje ćelijske membrane. Pri tome, jonski deterdženti kao što je natrijumlaurilsulfat su efikasniji od nejonskih. natrijumlaurilsulfat su efikasniji od nejonskih. Njihova primena kao i Njihova primena kao i primenaprimena ostalih hemikalija kao što su organski rastvarači ili alkalije je ostalih hemikalija kao što su organski rastvarači ili alkalije je ograničena ograničena zbog inaktivacije enzima i njhovo prisustvo je nepoželjno u zbog inaktivacije enzima i njhovo prisustvo je nepoželjno u finalnom proizvodu jer otežava kasnije postupke prečišćavanja finalnom proizvodu jer otežava kasnije postupke prečišćavanja enzima. U enzima. U postupku izolacije holesteroloksidaza koristi se Triton X-postupku izolacije holesteroloksidaza koristi se Triton X-100 za razaranje ćelija 100 za razaranje ćelija NocardiaNocardia u industrijskim razmerama (enzim u industrijskim razmerama (enzim vezan za membranu)vezan za membranu) ..

Hemijska liza Primena samih deterdženata, ili uz dodatak Primena samih deterdženata, ili uz dodatak haotropnih agenasa, može da bude veoma efikasan postupak za haotropnih agenasa, može da bude veoma efikasan postupak za rastvaranje ćelijske membrane. Pri tome, jonski deterdženti kao što je rastvaranje ćelijske membrane. Pri tome, jonski deterdženti kao što je natrijumlaurilsulfat su efikasniji od nejonskih. natrijumlaurilsulfat su efikasniji od nejonskih. Njihova primena kao i Njihova primena kao i primenaprimena ostalih hemikalija kao što su organski rastvarači ili alkalije je ostalih hemikalija kao što su organski rastvarači ili alkalije je ograničena ograničena zbog inaktivacije enzima i njhovo prisustvo je nepoželjno u zbog inaktivacije enzima i njhovo prisustvo je nepoželjno u finalnom proizvodu jer otežava kasnije postupke prečišćavanja finalnom proizvodu jer otežava kasnije postupke prečišćavanja enzima. U enzima. U postupku izolacije holesteroloksidaza koristi se Triton X-postupku izolacije holesteroloksidaza koristi se Triton X-100 za razaranje ćelija 100 za razaranje ćelija NocardiaNocardia u industrijskim razmerama (enzim u industrijskim razmerama (enzim vezan za membranu)vezan za membranu) ..

Desikacija (sušenje smrzavanjem) može takođe da se koristi za (sušenje smrzavanjem) može takođe da se koristi za dobijanje nekih enzima u industrijskim razmerama. U tom slučaju, dobijanje nekih enzima u industrijskim razmerama. U tom slučaju, brzina sušenja je jedan od najvažnijih faktora procesa. Sporo sušenje brzina sušenja je jedan od najvažnijih faktora procesa. Sporo sušenje ima prednost u odnosu na brza sušenja, kao što je liofilizacija. ima prednost u odnosu na brza sušenja, kao što je liofilizacija.

ENZIMSKA LIZA se puno koristi na laboratorijskom nivou i retko se puno koristi na laboratorijskom nivou i retko na industrijskom. LIZOZIM je jedini litički enzim koji se komercijalno na industrijskom. LIZOZIM je jedini litički enzim koji se komercijalno proizvodi i služi za lizu proizvodi i služi za lizu GG++ bakterija. Problem: cena i nepostojanje bakterija. Problem: cena i nepostojanje komercijalnih litičkih enzima na svetskom tržištu.komercijalnih litičkih enzima na svetskom tržištu.

Desikacija (sušenje smrzavanjem) može takođe da se koristi za (sušenje smrzavanjem) može takođe da se koristi za dobijanje nekih enzima u industrijskim razmerama. U tom slučaju, dobijanje nekih enzima u industrijskim razmerama. U tom slučaju, brzina sušenja je jedan od najvažnijih faktora procesa. Sporo sušenje brzina sušenja je jedan od najvažnijih faktora procesa. Sporo sušenje ima prednost u odnosu na brza sušenja, kao što je liofilizacija. ima prednost u odnosu na brza sušenja, kao što je liofilizacija.

ENZIMSKA LIZA se puno koristi na laboratorijskom nivou i retko se puno koristi na laboratorijskom nivou i retko na industrijskom. LIZOZIM je jedini litički enzim koji se komercijalno na industrijskom. LIZOZIM je jedini litički enzim koji se komercijalno proizvodi i služi za lizu proizvodi i služi za lizu GG++ bakterija. Problem: cena i nepostojanje bakterija. Problem: cena i nepostojanje komercijalnih litičkih enzima na svetskom tržištu.komercijalnih litičkih enzima na svetskom tržištu.

Uklanjanje nukleinskih kiselinaUklanjanje nukleinskih kiselina Visok sadržaj nukleinskih kiselina može znatno povećati viskoznost Visok sadržaj nukleinskih kiselina može znatno povećati viskoznost rastvora, što može da predstavlja problem pri centrifugiranju, filtraciji, rastvora, što može da predstavlja problem pri centrifugiranju, filtraciji, ultrafiltraciji i drugim separacionim procesima, naročito ako se oni ultrafiltraciji i drugim separacionim procesima, naročito ako se oni izvode u industrijskim uslovima.izvode u industrijskim uslovima.

Uklanjanje nukleinskih kiselina nije obavezan postupak Uklanjanje nukleinskih kiselina nije obavezan postupak prečišćavanja, već se primenjuje samo kada je viskoznost prečišćavanja, već se primenjuje samo kada je viskoznost homogenizata značajno povećana i kad dobijeni proizvod ne sme da homogenizata značajno povećana i kad dobijeni proizvod ne sme da sadrži nukleinske kiseline ni u tragovima. sadrži nukleinske kiseline ni u tragovima.

Visok sadržaj nukleinskih kiselina može znatno povećati viskoznost Visok sadržaj nukleinskih kiselina može znatno povećati viskoznost rastvora, što može da predstavlja problem pri centrifugiranju, filtraciji, rastvora, što može da predstavlja problem pri centrifugiranju, filtraciji, ultrafiltraciji i drugim separacionim procesima, naročito ako se oni ultrafiltraciji i drugim separacionim procesima, naročito ako se oni izvode u industrijskim uslovima.izvode u industrijskim uslovima.

Uklanjanje nukleinskih kiselina nije obavezan postupak Uklanjanje nukleinskih kiselina nije obavezan postupak prečišćavanja, već se primenjuje samo kada je viskoznost prečišćavanja, već se primenjuje samo kada je viskoznost homogenizata značajno povećana i kad dobijeni proizvod ne sme da homogenizata značajno povećana i kad dobijeni proizvod ne sme da sadrži nukleinske kiseline ni u tragovima. sadrži nukleinske kiseline ni u tragovima.

Nukleinske kiseline se efikasno uklanjaju taloženjem pri čemu se koriste sledeća taložna sredstva:

(NH(NH44))22SOSO44 (može da taloži i enzime)(može da taloži i enzime)

Katjonski polimeriKatjonski polimeri –polietilenimin (ne može se koristiti za –polietilenimin (ne može se koristiti za proizvodnju terapeutskih enzima) proizvodnju terapeutskih enzima)

cetiltrimetilamonijum-bromid (cetiltrimetilamonijum-bromid (CMABCMAB), streptomicin), streptomicin--sulfat, i sulfat, i protaminprotamin--sulfat. Njihova primena je ograničena jer su dosta skupi, sulfat. Njihova primena je ograničena jer su dosta skupi, toksični, a u nekim slučajevima mogu da grade komplekse sa samim toksični, a u nekim slučajevima mogu da grade komplekse sa samim enzimimaenzimima

NNukleazeukleaze. Ovaj postupak nije skup, efikasan je i, za razliku od . Ovaj postupak nije skup, efikasan je i, za razliku od hemijskih taloga, prisustvo nukleaza u talogu nije štetno i ne otežava hemijskih taloga, prisustvo nukleaza u talogu nije štetno i ne otežava dalju proizvodnju enzima.dalju proizvodnju enzima.

Nukleinske kiseline se efikasno uklanjaju taloženjem pri čemu se koriste sledeća taložna sredstva:

(NH(NH44))22SOSO44 (može da taloži i enzime)(može da taloži i enzime)

Katjonski polimeriKatjonski polimeri –polietilenimin (ne može se koristiti za –polietilenimin (ne može se koristiti za proizvodnju terapeutskih enzima) proizvodnju terapeutskih enzima)

cetiltrimetilamonijum-bromid (cetiltrimetilamonijum-bromid (CMABCMAB), streptomicin), streptomicin--sulfat, i sulfat, i protaminprotamin--sulfat. Njihova primena je ograničena jer su dosta skupi, sulfat. Njihova primena je ograničena jer su dosta skupi, toksični, a u nekim slučajevima mogu da grade komplekse sa samim toksični, a u nekim slučajevima mogu da grade komplekse sa samim enzimimaenzimima

NNukleazeukleaze. Ovaj postupak nije skup, efikasan je i, za razliku od . Ovaj postupak nije skup, efikasan je i, za razliku od hemijskih taloga, prisustvo nukleaza u talogu nije štetno i ne otežava hemijskih taloga, prisustvo nukleaza u talogu nije štetno i ne otežava dalju proizvodnju enzima.dalju proizvodnju enzima.

(CH2-CH2-NH)

Separacija mikrobne biomase i ćelijskih Separacija mikrobne biomase i ćelijskih ostatakaostataka

Mirobna biomasa kao i ostaci ćelije se izdvajaju iz fermentacionog medijuma iili iz homogenizata ćelije filtracijom, centrifugovanjem ili primenom dvofaznih sistema. Izbor separacione metode zavisi od vrste MO (veličine njegovih ćelija), sastava hranljive podloge i prisustva suspendovanih čestica.

U slučaju malih ćelija (bakterija) i male relativne gustine (oko 1.03), fermentaciona tečnost se prethodno priprema zagrevanjem ili dodavanjem sredstva za flokulaciju. Ovaj problem je manje izražen u slučaju kvaščeve i fungalne biomase.

Fizičke osobine fermentacione tečnosti otežavaju filtraciju zbog pH, morfološki oblik i veličina MO, viskozitet, nenjutnovsko ponašanje itd.

Filtracija kroz filtracionu pogaču i unakrsna filtracija

Unakrsna filtracija je efikasnija i postižu se brzine filtracije 100 do 1000 puta veće nego pri klasičnoj filtraciji kroz filtracionu pogaču

Separacija mikrobne biomase i ćelijskih Separacija mikrobne biomase i ćelijskih ostatakaostataka

Specijalni slučajevi unakrsne filtracije su mikrofiltracija i ultrafiltracija. Postrojenja rade na istom principu, razlika je samo u veličini pora membrane. Mikrofiltracijom se izdvajaju čestice > 50 nm (bakterije, kvasci, plesni, ćelije tkiva), dok membrane ultrafiltera imaju fine pore (20 nm) pa se na njima zadržavaju enzimi, proteini i drugi makromolekuli.

Membrane se proizvode u nekoliko različitih oblika:

Ravne membraneRavne membrane

Membrana u obliku vlakanaMembrana u obliku vlakanaCilindrična Cilindrična membranamembrana

Separacija mikrobne biomase i ćelijskih Separacija mikrobne biomase i ćelijskih ostatakaostataka

Mikrobna biomasa izdaja se iz fermentacione tečnosti centrifugovanjem kad je filtracija spora i kad ne obezbeđuje zadovoljavajuću separaciju, a pomoćno sredstvo se ne može koristiti. Mana: visoka cena.

Brzina taloženja ćelija zavisi od prečnika čestica, razlike u gustini biomase i fermentacione tečnosti, ugaone brzine doboša centrifuge itd.

Lizat ćelije se može podvrgnuti frakcionom centrifugovanju, odnosno centrifugovanju pri različitim brzinama koje se postepeno povećavaju. Tako centrifugovanje može da počne sa brzinom koja odgovara radijalnom ubrzanju od 1500 G odnosno 1500 x veće od ubrzanja zemljine teže (u talog padaju hloroplasti). Posle izdvajanja struktura, akumuliranih na dnu kivete, centrifugovanje se vrši na 15000 G (u talog padaju mitohondrije u kojima su locirani oksido-redukcioni enzimi), a zatim sa 30000 x G (subcelularne strukture nukleusa, ćelijske membrane, endoplazmatični retikulum) itd.

Raspodela u dvofaznim sistemimaRaspodela u dvofaznim sistemima Ova tehnika može da posluži za razdvajanje celih ćelija ili ćelijskih ostataka od rastvornog enzima. Proučavana je na laboratorijskom i poluindustrijskom nivou, ali još uvek nije zaživela u industriji. Razlog je što još uvek nije objašnjen mehanizam razdvajanja.

Princip metode: veliki broj polimera su međusobno nekompatibilni ili

sa rastvorima soli kada se pomešaju, formiraju se dvofazni sistemi

Donja faza-polarnija, veća gustina, tu se izdvajaju ćelije

Gornja faza-manje polarna, lakša, enzim

Najčešće se koristi polietilenglikol i dekstran.

Najpoznatiji sistem: PEG-rastvor fosfatnih soli ili PEG-dekstran (gornja faza sa enzimom). Separacija se može ubrzati primenom centrifugalne sile.

Enzim se može zadržati u jednoj od faza afinitativnom raspodelom

Prednosti primene dvofaznih sistema su:

- blagi uslovi, očuvanje enzimske aktivnosti

- veliki broj polimera čak stabilizuje enzime

- prinos prečišćenih enzima je visok

- relativno jednostavan scale-up

Osnovni nedostatak:

-nerazumevanje mehanizma procesa

-uglavnom empirijska iskustva

- tehnički čist dekstran je skup (mogu se koristiti PVA, PVP i drugi)

Koncentrisanje proizvoda Koncentrisanjem tečnosti smanjuju se troškovi hemikalija zbog obrade manjih zapremina kao i operativni troškovi zbog manjih kapaciteta. Da bi se postupak proizvodnje enzima učinio još ekonomičnijim nastoji se da faza koncentrisanja bude ujedno i prva faza u prečišćavanju enzima.

Metode koncentrisanja su:

- taloženje (solima, rastvaračima, polimerima, promenom pH)

- ultrafiltracija

- vakuum uparavanje

- sušenje zamrzavanjem

- jonoizmenjivačka hromatografija

- dodatak Sephadex-a G-25

Taloženje enzima

Taloženje enzima bilo solima ili organskim rastvaračima je ujedno i dobar metod prečišćavanja tako da je taloženje naročito podesno koristiti kao I korak u prečišćavanju enzima

Taloženje enzima neutralnim solima zove se “isoljavanje”. Pažljivim isoljavanjem enzim se ne denaturiše i može ponovo da se rastvori, pošto se soli uklone dijalizom.

Dodatak malih količina neutralnih soli u rastvor enzima često povećava njihovu rastvorljivost. Međutim, povećavanjem koncentracije soli iznad neke određene kritične vrednosti, dolazi do destabilizacije proteina i njihovog eventualnog taloženja

Svaki enzim se taloži pri odgovarajućoj koncentraciji soli i pH rastvora pa se mogu frakciono izdvajati enzimi. Hidrofobni enzimi se talože pri nižoj jonskoj jačini od hidrofilnih

Najveću primenu ima (NH4)2SO4

Prednosti:

-velika rastvorljivost u vodi (760 g kg-1 vode na 20 oC),

- niska cena,

- netoksičnosti i

- sposobnost da stabilizuje veliki broj enzima tako da nije potrebno koristiti jako niske temperature pri isoljavanju.

Nedostaci:

- korozivne osobine,

- velika gustina rastvora što je smetanja pri izdvajanju taloga centrifigacijom i

- u alkalnoj sredini stvara amonijak.

Za taloženje se mogu koristiti i druge neutralne soli kao što su magnezijum-sulfat i natrijum-hlorid. U suštini, veoma je važno koristiti one soli koje stabilizuju nativnu konformaciju enzima.

Na ovaj način se mogu frakciono izdvojiti enzimi jer svaki enzim se taloži pri odgovarajućoj koncentraciji soli i pH rastvora. Koncentracija soli koja je potrebna da se istaloži određeni enzim zavisi naravno od njegovih fizičko-hemijskih svojstava, ali i od koncentracije.

Između rastvorljivosti enzima, S i jonske jačine rastvora, I postoji sledeća zavisnost:

IKKS SL 1ln

Anjoni SO42->H2PO4

->CH3COO->Cl->Br->I->ClO4->SCN

Katjoni NH4+,Cs+,K+,Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+ > guanidinium

> urea

Stabilnost enzima u funkciji vrste katjona i anjonaStabilnost enzima u funkciji vrste katjona i anjona

Postupak isoljavanja je jednostavan i sastoji se u dodavanju soli (u čvrstom stanju ili u obliku koncentrovanih rastvora) u porcijama. Opisati postupak

Taloženje organskim rastvaračima

Organski rastvarači smanjuju dialektričnu konstantu sredine, zbog čega dolazi do povećanja elektrostatičkih privlačenja među suprotno naelektrisanim ostacima aminokiselina.

Najčešće se koriste organski rastvarači koji se mešaju sa vodom kao što su etanol, izopropanol, aceton, dietiletar i drugi.

Problem: inaktivacija enzima organskim rastvaračima, mora se raditi na niskim temperaturama, skupa oprema

Ovaj postupak se često primenjuje u praksi, naročito pri izolovanju amilaza iz plesnih gljivica.Taloženje organskim polimerima

Taloženje enzima može se postići i dodatkom organskih polimera kao što je polietilenglikol, mana: povećanje viskoznosti rastvora

Generalno prednosti taloženja kao postupka koncentrisanja su:

postupci koncentrisanja rastvora taloženjem su veoma jednostavni i ne zahtevaju primenu složene opreme. Često su blagi i omogućavaju očuvanje enzimske aktivnosti ukoliko se izvode pravilno. Nažalost, njihova primena je ograničena u industrijskim razmerama iz sledećih razloga:

mnogi od taložnih sredstava su često korozivni agensi, pa mogu oštetiti rotore centrifuga koji su izgrađeni od nerđajućeg čelika,

metoda nije dovoljno efikasna za koncentrisanje jako razblaženih rastvora enzima,

neki organski rastvarači kao što su aceton ili dietiletar su lako zapaljivi ili veoma skupi,

ostaci taložnog sredstva u talogu moraju se ukloniti pre primene narednih postupaka prečišćavanja (NH4)2SO4 se uklanja dijalizom

Koncentrisanje adsorpcijom enzima na jonoizmenjivačima

Izmena jona može biti efikasna i reletivno jeftina metoda za koncentrisanje i prečišćavanje rastvora enzima.

Različiti enzimi mogu se izdvajati iz rastvora vezivanjem za jonoizmenjivače pri određenoj pH i jonskoj jačini. Pozitivno naelektrisani enzimi vezivaće se za katjonske polimere, dok će se negativno naelektrisani vezivati za anjonske.

Eluacija vezanog enzima može se postići ispiranjem rastvorima soli (0.5 M puferni rastvori soli kao što su natrijum-hlorid ili kalijum-hlorid).

Koncentracija soli i pH moraju biti pažljivo odabrani tako da omoguće što je moguće veću razliku u naelektrisanju nosača i enzima, a da se pri tome molekuli soli ne vezuju za nosač.

Šaržna adsorpcija enzima na jonoizmenjivačima u razblaženim rastvorima lako se postiže jednostavnim suspendovanjem polimera u rastvor datog enzima.

Naziv grupe Struktura grupeTip

jonoizmenjivača

O (CH2)2 N+ (CH2-CH3)2

HDietilaminoetil(DEAE)

anjonski

CH2 N+ (CH3)3

Kvaterarni amonijum

(Q)anjonski

O (CH2)2 N+ CH2-CH-CH3

(C2H5)2 OHKvaterarni aminoetil

(QAE)

anjonski

CH2 COO-OKarboksimetil(CM)

katjonski

Metil sulfonat(S)

CH2 SO3- katjonski

CH2 SO3-CH2 CH2

katjonskiSulfopropil(SP)

Funkcionalne grupe koje se najčešće vezuju za porozne čestice Funkcionalne grupe koje se najčešće vezuju za porozne čestice nosača u cilju izmene katjonanosača u cilju izmene katjona ili anjonaili anjona

Naziv grupe Struktura grupeTip

jonoizmenjivača

Dietilaminoetil

(DEAE)Anjonski

Kvaterarni amonijum (Q)

Anjonski

Kvaterarni aminoetil (QAE)

Anjonski

Karboksimetil (C)

Katjonski

Metil sulfonat (S)

Katjonski

Sulfopropil (SP) Katjonski

O (CH2)2 N+ (CH2-CH3)2

H

CH2 N+ (CH3)3

O (CH2)2 N+ CH2-CH-CH3

(C2H5)2 OH

CH2 COO-O

CH2 SO3-

CH2 SO3-CH2 CH2

Razblaženi rastvori koji se koncentrišu mogu biti fermentacione tečnosti iz kojih su izdvojene ćelije biomase ili ćelijski homogenizati iz kojih su izdvojeni ćelijski ostaci i suspendovane čestice.

Ova tehnika se često koristi za koncentrisanje rastvora jer je reletivno jeftina, jonoizmenjivači se mogu regenerisati i ujedno je metoda za prečišćavanje enzima. Na ovaj način se mogu odvojiti supstance, koje se ili neće vezivati za polimer pod datim uslovima, ili se neće eluirati pod uslovima kada se ispira enzim. To su različiti lipidi, ugljeni hidrati ili delimično aglomerirani i denaturisani proteini. Može se postići i delimično međusobno odvajanje enzima.

Koncentrisanje vakuum uparavanjem

Vakuum uparavanjem se uklanja voda pri sniženom pritisku i temperaturi. Najčešće se koriste vakuum uparivači s kratkim vremenom zadržavanja proizvoda u njima, na primer, različiti tipovi filmskih vakuum uparivača.

Oslobađanje enzima koji su vezani za Oslobađanje enzima koji su vezani za membranumembranu

Periferne enzime

Integralne enzime

Enzimi koji su vezani za intracelularnu ili plazmatičnu membranu ne mogu se ekstrahovati na načine koje smo opisali. Pored toga, neki enzimi su labovo, a neki čvrsto vezani za membranu. Ne postoje opšta pravila za njihovo izdvajanje.

Prema načinu kako su vezani enzimi za membranu dele se na:

Periferni proteini su vezani elektrostatičkim ili vodoničnim vezama za polarnu glavu membrane i mogu lako da se desorbuju sa membrane, tretiranjem membrane sa rastvorima velike jonske jačine kao što je 1 M NaCl, zamrzavanjem i odmrzavanjem ili sonikacijom.

Integralni proteini mogu biti jedino ekstrahovani kada se razore hidrofobne interakcije između lipida i integralnih proteina. Pri tome, uslovi treba da budu takvi da ne dođe do inaktivacije enzima.

Oslobađanje enzima koji su vezani za Oslobađanje enzima koji su vezani za membranumembranu

Neke protein-lipid interakcije se mogu narušiti acetonom ili dejstvom specifičnih enzima. Npr. fosfolipaza i lipaza se koriste za oslobađanje alkalne fosfataze.

Mogu se koristiti deterdženti da se naruši struktura membrane i ekstrahuju lipoprotein fragmenti u vodeni medijum kao micele. Deterdženti koji se koriste: nejonski Triton X-100, jonski kao što je natrijum-dodecilsulfat (kiseli) i CTAB (bazni). Za ekstrakciju enzima u aktivnom obliku poželjni su nejonski deterdženti.

Enzimi mogu takođe biti ekstrahovani primenom organskog rastvarača. Koristi se n-butanol jer ima hidrofilni i hidrofobni deo.

Veliki broj proteina membrane je pronađeno u vodenoj fazi voda/butanol dvofaznog sistema pri čemu je lipidna komponenta nađena u butanolu. Tako se mogu ekstrahovati alkalna fosfataza, glutamiltransferaza i urat oksidaza.

Neke protein-lipid interakcije se mogu narušiti acetonom ili dejstvom specifičnih enzima. Npr. fosfolipaza i lipaza se koriste za oslobađanje alkalne fosfataze.

Mogu se koristiti deterdženti da se naruši struktura membrane i ekstrahuju lipoprotein fragmenti u vodeni medijum kao micele. Deterdženti koji se koriste: nejonski Triton X-100, jonski kao što je natrijum-dodecilsulfat (kiseli) i CTAB (bazni). Za ekstrakciju enzima u aktivnom obliku poželjni su nejonski deterdženti.

Enzimi mogu takođe biti ekstrahovani primenom organskog rastvarača. Koristi se n-butanol jer ima hidrofilni i hidrofobni deo.

Veliki broj proteina membrane je pronađeno u vodenoj fazi voda/butanol dvofaznog sistema pri čemu je lipidna komponenta nađena u butanolu. Tako se mogu ekstrahovati alkalna fosfataza, glutamiltransferaza i urat oksidaza.

Hromatografske metode za prečišćavanje enzima u klonama

Finije prečišćavanje enzima postiže se hromatografskim metodama.

Ova metoda se zasniva na različitom zadržavanju enzima pri prolazu rastvora kroz kolonu sa nepokretnim slojem čvrstih čestica (mobilna faza) i eluiranju zadržanih molekula nekim rastvaračem (mobilna faza). Svakako da će se molekuli enzima koji su bili slabije vezani kretati brže kroz kolonu i obratno, tako da će doći do razdvajanja enzima na frakcije. Pojedine faze enzima se skupljaju u kolektoru za frakcije, koji se postavlja ispod kolone.

Zatim se u pojedinim frakcijama određuje katalitička aktivnost pojedinih enzima.

U zavisnosti od mehanizma vezivanja enzima za čvrstu fazu razlikuje se više vrsta hromatografskih metoda. Sve ove metode se zasnivaju na razlikama u nekim fizičko-hemijskim osobinama proteina kao što su:

Samim tim razlikuju se i sledeće hromatografske metode:

Razlika u površinskom naelektrisanju

Razlika u molekulskoj masi i obliku molekula

Razlika u specifičnim interakcijama sa drugim molekulima (supstartima, inhibitorima) Razlika u hidrofobnosti površine

Izoelektrična tačka

Hromatografske metodeHromatografske metode Jonoizmenjivačka hromatografija

Gel filtraciona hromatografija

Afinitetna hromatografija

Adsorpciona hromatografija (hidrofobna)

Hromatofokusiranje

Jonoizmenjivačka hromatografijaJonoizmenjivačka hromatografija U zavisnosti od aminokiselinskog sastava, enzimi imaju različitu količinu i vrstu ukupnog naelektrisanja pri određenoj pH vrednosti. Izoelektrična tačka enzima, pI

Jonoizmenjivačka hromatografija zasniva se na reverzibilnom elektrostatičkom vezivanju enzima za suprotno naelektrisane čestice nosača. Zasniva se na razlici u naelektisanju proteina pri određenoj pH vrednosti u zavisnosti od pI enzima.

Na ovaj način mogu se odvojiti enzimi sa sličnim fizičko-hemijskim osobinama.

pH i koncentracija soli moraju biti pažljivo odabrani tako da budu dovoljno naelektrisani i nosač i enzim, a da pri tome se molekuli soli ne takmiče sa molekulima enzima u vezivanju za nosač.

Postupak se obično izvodi pri neutralnim pH vrednostima i pri niskoj jonskoj jačini rastvora, pa se regeneracija nosača i spiranje enzima postiže eluiranjem sa rastvorima soli visoke jonske jačine.

Jonoizmenjivačka hromatografijaJonoizmenjivačka hromatografijaJonoizmenjivači su u vodi nerastvorni polimeri koji sadrže kovalentno vezane katjonske ili anjonske grupe. Slabi i jaki jonoizmenjivači

Kako je veliki broj enzima pri neutralnim pH vrednostima naelektrisano negativno, veći značaj imaju anjonski jonoizmenjivači.

Nosač treba da zadovolji više zahteva: da je inertan, da ima dobre mehaničke osobine i da je makroporozan.

Kao nosači koriste se celuloza, sephadex, agaroze (Bio Gel A) i drugi.

U novije vreme koriste se nosači za koje su kovalentno vezane duge razgranate grupe. Efikasnost razdvajanja može se podešavati na osnovu dužine “nožice”.

Polistiren-mali kapacitet prema proteinima zbog malih pora

Celuloza ima velike pore, uvode se različite grupe, anjonske ili katjonske. Ne sme više od mol po kg.

Jonoizmenjivačka hromatografijaJonoizmenjivačka hromatografija

Hromatografija na jonskim izmenjivačimaHromatografija na jonskim izmenjivačima

Katjonski izmenjivač Anjonski izmenjivač

Odvajanje se vrši pri neutralnim pH vrednostima i niskoj jonskoj jačini, tako da se vezani proteini mogu eluirati rastvorima soli

AfinitetnaAfinitetna hromatografija hromatografija Ova tehnika zasniva se na mogućnosti enzima da se specifično i reverzibilno vezuje za neka jedinjenja, najčešće ligande. Često veoma efikasna metoda za razdvajanje enzima veoma sličnih fizičko-hemijskih osobina. Ponekad se enzimi mogu dobiti u homogenom stanju primenom samo afinitivne hromatografije. Pri propuštanju datog rastvora, samo onaj enzim koji se selektivno vezuje za imobilisani ligand biće zadržan u koloni, dok će ostali proteini i primese prolaziti kroz kolonu bez vezivanja. Nakon razdvajanja i uklanjanja svih ostalih molekula, ciljni enzim se može isprati sa nosača propuštanjem rastvora nekog kompetitivnog liganda, kao što je rastvor supstrata. Jako veliki broj različitih liganada može se kovalentno vezati za inertne čvrste nosače i ovako pripremljen matriks koristi se za punjenje hromatografske kolone. Na osnovu stepena specifičnosti, ligandi se mogu podeliti na SPECIFIČNE ligande i ZAJEDNIČKE ligande.

Afinitetna hromatografija koja se zasniva Afinitetna hromatografija koja se zasniva na primeni zajedničkih liganadana primeni zajedničkih liganada

Primena kofaktora kao što su ATP ili NAD kao liganada za dizajn afinitetnog sistema ili LEUCINA za prečišćavanje glikoproteina predstavlja primere afinitetne hromatografije koja se zasniva na zajedničkim ligandima. Prednost ovih sistema je što se isti matriks može koristiti za prečišćavanje velikog broja različitih enzima, ali je efikasnost prečišćavanja manja nego u slučaju primene specifičnih liganada. Primena sintetičkih boja na bazi triazina kao zajedničkih liganada ima sve veću primenu za prečišćavanje enzima zbog znatno niže cene liganada, lakše pripreme matriksa, smanjenog spiranja liganda. Ukoliko i dođe do spiranja liganada u toku rada, to se lako uočava. Hlortriazinske boje se direktno vezuju za čvrste nosače kao što je agaroza pod alkalnim uslovima.

Vezivanje liganda za matriks je znatno olakšano i ne primenjuju se toksične hemikalije, već je dovoljna samo alkalna sredina. Hidroksilna grupa matriksa brzo i lako reguje sa hloridnim atomom iz boje. Ovako pripremljeni matriks koristi se za prečišćavanje dehidrogenaza koje koriste NAD i NADP kao koenzime, kao i neke druge enzime. Tačan mehanizam vezivanja nije poznat, ali neke triazinske boje imaju veliku strukturnu sličnost sa navedenim koenzimima što može objasniti mehanizam vezivanja velikog broja dehidrogenaza. Mogu se prečistiti i drugi enzimi što se pripusuje jonskim interakcijama sa negativno naelektrisanim sulfonatnim grupama, hidrofobnim interakcijama sa benzolovim prstenom i na duge načine.

Metal helatna afinitetna hromatografijaMetal helatna afinitetna hromatografija Metal helatna afinitetna hromatografija se zasniva na formiranju kordinativnih veza između grupa u molekulu enzima i metalnog jona imobilisanog za hromatografske čestice Najčešće se koriste Zn2+, Ni2+, Cu2+ koji se vezuju kordinativnim vezama za histidin

Metal helatna afinitetna hromatografijaMetal helatna afinitetna hromatografija

Biospecifična afinitetna hromatografijaBiospecifična afinitetna hromatografija Specifični ligandi koji se koriste su inhibitori i supstrati enzima ili njihovi analozi. Primer specifične afinitetne hromatografije je prečišćavanje laktat dehidrogenaze (LDH) primenom oksamatne afinitetne kolone

Princip afinitetne hromatografijePrincip afinitetne hromatografije

NH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

NH

C O

CO O-

Čvrst nosač

Imobilisani oksamat

CH3

C O

CO O-

Piruvat

NH3+

C O

CO O-

Oksamat

Umetnuti agens

Princip afinitetne hromatografijePrincip afinitetne hromatografije

Struktura supstrata LDH (piruvat), njegovog analoga (oksamat) i Struktura supstrata LDH (piruvat), njegovog analoga (oksamat) i imobilisanog oksamata koji se koristi kao matriks za afinitetnu imobilisanog oksamata koji se koristi kao matriks za afinitetnu

hromatografijuhromatografiju

Razvoj i dizajn afinitetnog sistemaRazvoj i dizajn afinitetnog sistema Razvoj i dizajn afinitetne kolone za prečišćavanje nekog enzima sastoji se iz sledećih faza:

Izbora liganda,

Izbora čvrstog nosača i

Izbora hemijske metode vezivanja liganda za čvrst nosač. Ligand treba da ima veliki afinitet prema datom enzimu i vezivanje treba da bude reverzibilno. On takođe treba da bude stabilan jer uslovi njegovog hemijskog vezivanja za nosač mogu biti oštri. Primena velikog broja jedinjenja ograničena zbog visoke cene i male stabilnosti. Primenom sintetičkih boja kao liganada za prečišćavanje velikog broja enzima mogu se prevazići ovi nedostaci. Čvsti nosač treba da bude hemijski stabilan, hemijski inertan, makroporozan, mehanički čvrst, jeftin i da se lako regeneriše. Kao nosači najčešće se koriste agaroza, celuloza i različiti sintetski polimeri.

Razvoj i dizajn afinitetnog sistemaRazvoj i dizajn afinitetnog sistema Veliki broj različitih imobilizacionih metoda može da se koristi pri vezivanju liganda za čvrst nosač. Nosač se prethodno aktivira na različite načine, najčešće cianogenbromidom ukoliko ligand sadrži amino grupe. U većini slučajeva, ligand se ne vezuje direktno za nosač, već preko nekog agensa da bi se olakšalo vezivanje enzima tako što se smanjuju sterne smetnje. Najčešći agensi su oni koji se sastoje od velikog broja metilenskih grupa. Spiranje vezanog enzima sa kolone se može promenom uslova. tako da se značajno smanji afinitet vezanog enzima prema ligandu. To može biti promena pH, jonske jačine, dodatak deterdženta, PEG itd. Tako, -galaktozidaza koja se izdvojila na afinitativnoj koloni sa imobilisanim p-aminofenil -D-galaktozidom kao ligandom, spira se 0,1 M boratnim puferom pri pH 10,0. Najčešće se kolona ispira puferom koji sadrži kompetitivni ligand

Prednosti afinitetne hromatografije:Prednosti afinitetne hromatografije:

omogućava međusobno razdvajanje enzima veoma sličnih fizičko-hemijskih karakteristika. Veoma velika efikasnost razdvajanja. Enzim se može prečistiti i do 1000 puta sa prinosom od 100%. Uvođenje afinitetne hromatografije u šemu prečišćavanja može značajno smanjiti broj narednih koraka prečišćavanja.

Nedostaci afinitetne hromatografije:Nedostaci afinitetne hromatografije: Visoka cena specifičnih liganada, Zametne i skupe imobilizacione metode Mogućnost spiranja liganda sa matriksa što dovodi do smanjenja stepena efikasnosti razdvajanja kolone i do kontaminacije već skoro finalnih proizvoda toksičnim hemikalijama. Problemi se donekle prevazilaze primenom sintetičkih boja kao liganada, ali se smanjuje efikasnost razdvajanja

Kada se koristi afinitetna hromatografijaKada se koristi afinitetna hromatografija?? Svakako da se ova hromatografija koristi u poslednjim fazama prečišćavanja enzima, nikako u početnim, jer prisustvo primesa pri velikim koncentracijama može dovesti modifikacije, pa čak i degradacije skupih matriksa.

Hidrofobna Hidrofobna hromatografija hromatografija Svaki enzim ima karakterističan stepen hidrofobnosti na čemu se zasniva njegovo razdvjanje od ostalih enzima

Jačina hidrofobnih interakcija je proporcionalna jonskoj jačini rastvora

Način izvođenja: propuštanje rastvora enzima kroz klonu sa adsorbensom pri visokoj jonskoj jačini. Enzim se sa adsorbensa uklanja eluiranjem prosto promenom uslova, dakle dodatkom sredstva koji narušava hidrofobne interakcije (deterdženti, etanol, etilenglikol)

Koristi se umrežene agaroze-sefaroze za koju su vezane hemijskom vezom hidrofobne grupe

Hidrofobna Hidrofobna hromatografija hromatografija Oktil- i fenil- sefaroze su najvažniji primeri nosača koji se koriste za afinitetnu hromatografiju

Treba voditi računa kada se prečišćavaju enzimi velikog stepena hidrofobnosti-ne treba koristiti oktil-sefrazu da se ne bi stvarale jako hidrofobne interkcije

Reversnofazna hromatografija na obrnutim fazama –koriste se izuzetno hidrofobni nosači za koje se vezuje veliki broj enzima koji se eluiraju sa opadajućim gradijentom rastvora soli ili rastvorima opadajuće polarnosti

Hemijska struktura oktil-sefarozeHemijska struktura oktil-sefaroze

Gel-filtracija ili hromatografija na Gel-filtracija ili hromatografija na molekulskim sitimamolekulskim sitima

Razdvajanje enzima zasniva se na razlici u obliku i veličini njihovih molekula.

Pri propuštanju rastvora kroz hromatografsku kolonu sa poroznim česticama gela suviše veliki molekuli nesmetano prolaze, dok oni čija veličina molekula odgovara veličini pora zadržavaju se u koloni. Molekuli unutar čestica gela ne zadržavaju se isto vreme, manji molekuli imaju na raspolaganju za kretanje znatno veću unutrašnju površinu i duže će se zadržavati u česticama gela.

Pri eluaciji jedinjenja će se spirati onim redom u pravcu smanjenja veličine molekula.

Koristi se veliki broj nosača: umreženi dekstrani (Sefadeksi G-serije), alil dekstrani, poliakrilamidi, umreženi derivati agaroze (Sefaroze) za enzime veće molekulske mase i kopolimeri etilenglikolmetakrilati.

Veličina pora gela kontroliše se stepenom umrežavanja. Gelovi od istog polimernog materijala sortirani su na osnovu veličine pora, odnosno molekulske težine jedinjenja koja mogu da razdvajaju.

Sephadex G-25 ili Bio Gel P2 imaju jako male pore, značajno manje od veličine bilo kog enzima. Ovi gelovi koriste se za razdvajanje enzima od soli, deterdženata i drugih malih molekula jedinjenja.

Ukoliko se upotrebi gel sa većim prečnikom pora, mogu da se odvoje enzimi na osnovu razlike u veličini molekula. Takve gel supstance zovu se MOLEKULSKA SITAMOLEKULSKA SITA. U tu svrhu koriste se Sefadeksi G-75, G-100, G-200. Za razliku od Sephadexa G-25, koji je mahanički čvrst, ovi sefadeksi su stišljivi, pa se mogu koristiti samo u manjim razmerama.

Geli na bazi alil dekstrana, dobijeni njegovim umrežavanjem sa N-N-metilen bisakrilamidom (Sephacryl) imaju nešto bolje mehaničke karakteristike, pa su podesniji za industrjsku primenu.

Iako su geli na bazi agaroze (Sepharose) podesni za razdvajanje enzima velike molekulske težine, oni imaju loše mehaničke i termalne osobine zbog čega se ne koriste u većim razmerama.

Geli na bazi umreženog akrilamida (Bio-Gel) su podesni za prečišćavanje enzima jer se ne mogu degradirati pod njegovim uticajem, za razliku od dekstrana.

Pored razlika u veličini pora, dostupni su geli sa različitim veličinama čestica. Iako manje čestice omogućavaju efikasnije razdvajanje, razdvajanje se mora izvoditi pri nižim protocima.

Frakcionisanje enzima zahteva primenu jako dugačkih hromatografskih kolona (visina treba da bude 25-40 puta veća od prečnika). Industrijske gel-filtracione kolone mogu biti dugačke nekoliko metara. Zbog toga, da ne bi dolazilo do značajnijeg pada pritiska kroz kolonu, gel mora imati veliku mehaničku čvrstoću. Drugi pristup je da se koriste veći broj kraćih identičnih kolona povezanih na red, pri čemu rastojanje između kolona treba da bude minimalno. Ovaj sistem ima prednosti.

Gel-filtracija ili hromatografija na Gel-filtracija ili hromatografija na molekulskim sitimamolekulskim sitima

Gel-filtracija ili hromatografija na Gel-filtracija ili hromatografija na molekulskim sitimamolekulskim sitima

Nedostaci gel-filtracione hromatografije:Nedostaci gel-filtracione hromatografije: Radi se sa malim zapreminama uzorka (2-4% od zapremine kolone) Primenjuju se mali radni protoci pa je metoda vremenski zahtevna Nije podesna u industrijskim razmerama

Kada se koristi gel-filtraciona hromatografijaKada se koristi gel-filtraciona hromatografija??

Svakako da se ova hromatografija koristi u poslednjim fazama prečišćavanja enzima, nikako u početnim, jer prisustvo primesa pri velikim koncentracijama može dovesti do začepljenja kolona. Moraju se prečišćavati manje zapremine da bi se postiglo efikasno razdvajanje. Zapremina rastvora koji se prečišćava je 2-5% od zapremine kolone

Postoji niz metoda za određivanje stepena čistoće i homogenosti enzima

Određivanje čistoće i homogenosti Određivanje čistoće i homogenosti enzimskog preparataenzimskog preparata

• ElektroforezaElektroforeza

• UltracentrifugiranjeUltracentrifugiranje

• Postupci hromatografijePostupci hromatografije

Elektroforeza je jedna od najboljih metoda za utvrđivanje čistoće nekog enzimsog preparata.

Pod elektroforezom se podrazumeva kretanje nekih naelektrisanih čestica u električnom polju prema suprotno naelektrisanoj elektrodi. Pokretljivost molekula enzima u električnom polju zavisi od njihovog ukupnog naelektrisanja i biće veća što je veća razlika između njihove izoelektrične tačke i pH sredine u kojoj se čestice kreću.

Postoji više elektroforetskih metoda:

Jednodimenzionalna poliakrilamid gel elektroforeza u prisustvu negativno naelektrisanog deterdženta, natrijumdodecil-sulfata (SDS-PAGE),

Jednodimenzionalna poliakrilamid gel elektroforeza (PAGE),

Izoelektrično fokusiranje,

Dvodimenzionalna elektroforeza i

Kapilarna elektroforeza

U slučaju PAGE, molekuli enzima se kreću kroz poliakrilamidni gel, čija veličina pora zavisi od koncentracije poliakrilamida. Tako, razdvajanju enzima doprinosi i zadržavanje molekula u porama gela i u tom slučaju brzina kretanja enzima zavisi od veličine, oblika i naelektrisanja njegovih molekula.

Inkubacija molekula enzima sa SDS ima dvostruki efekat: enzimi postaju sličnog oblika i dobijaju približno isto negativno naelektrisanje i sada se kreću ka anodi brzinom koja zavisi samo od veličine molekula: manji molekuli će se kretati brže.

SDS-PAGE se koristi za određivanje stepena čistoće enzima i za određivanje njegove molekulske težine.

Može se koristiti i jednodimenziona PAGE enzima koji nisu denaturisani-ČISTOĆA SE DOKAZUJE PRISUSTVOM SAMO JEDNE PROTEINSKE TRAKE (dve u slučaju dimera)

Izoelektrično fokusiranje se koristi za određivanje čistoće i homogenosti enzimskog preparata i za određivanje IZOELEKTRIČNE TAČKE ENZIMA

Čistoća se dokazuje prisustvom samo jedne mrlje u slučaju enzima sa jednim polipeptidnim lancem. Dimeri sa dve različite subjedinice pokazaće dve ili više mrlja na gelu. Proteinske mrlje se vizualizuju sa proteinskim bojama kao što je Coomassie blue.

standardstandardPrečišćeni Prečišćeni

enzimenzimSmeša Smeša

proteinaproteina

Log molekulske težineLog molekulske težinePok

retl

jivo

st k

roz

gel,m

mP

okre

tlji

vost

kro

z ge

l,mm

Može se koristiti i jednodimenzionalna PAGE enzima koji nisu podvrgnuti denaturaciji. I u ovom slučaju, nakon bojenja, pojaviće se jedna mrlja ukoliko je enzim homogen.

Izoelektrično fokusiranje je takođe elektroforetska metoda koja se koristi za analizu ili ponekad mikroprečišćavanje enzima. U ovom slučaju ponovo se koristi poliakrilamidni gel, ali u prisustvu organskih kiselina male molekulske težine i baza. Amfoliti će se distribuirati unutar gela pod uticajem električnog polja, gradeći pH gradijent.

Kada se rastvor enzima izloži dejstvu električnog polja, enzimi će se kretati do one pH vrednosti koja odgovara njihovoj izoelektričnoj tački. Primenom smeše standarda enzima poznatih pI vrednosti, može se odrediti standardna kriva koja predstavlja zavisnost rastojanja od pI vrdnosti. Na taj način može se odrediti pI ispitivanog enzima.

Savremeni pristup određivanja čistoće enzimskog preparata je istovremena primena SDS-PAGE i izoelektričnog fokusiranja, u tzv. dvodimenzionalnoj elektroforetskoj analizi. Ova tehnika se može koristiti za analizu kompleksnih smeša.

Kapilarna elektroforeza se zasniva na razlici u naelektrisanju enzima i u ovom slučaju, umesto na poliakrilamidnom gelu, separacija se odvija duž uske kalibrisane kapilarne cevi obično napunjene silicijumom.

KRITERIJUMI KOJI SE PRATE PRI SVAKOM KORAKU PREČIŠĆAVANJA

• Zapremina rastvora enzima (cmZapremina rastvora enzima (cm33) )

• Aktivnost enzimskog rastvora (U Aktivnost enzimskog rastvora (U

cmcm-3-3))

• Koncentracija proteina (mg cmKoncentracija proteina (mg cm-3-3))

• Ukupna aktivnost rastvora (U)Ukupna aktivnost rastvora (U)

• Specifična aktivnost (U mgSpecifična aktivnost (U mg-1-1))

• Prinos enzima (%)Prinos enzima (%)

• Stepen prečišćavanja (odnos specifične aktivnosti enzima posle Stepen prečišćavanja (odnos specifične aktivnosti enzima posle

prečišćavanja i pre prečišćavanja)prečišćavanja i pre prečišćavanja)

Regulative, klasifikacija i označavanje enzimskih preparata podležu istim pravilima kao i ostale hemikalije

Proizvođači enzima moraju imati sertifikate kojima se garantuje pouzdana primena enzima bez opasnosti po ljudsko zdravlje ili okolinu

Enzimski preparati ne smeju da izazivaju alergijske reakcije, niti da sadrže patogene mikroorganizme ili toksične supstance

Za enzime koji se dobijaju iz jestivih biljaka i životinja, kao i mikroorganizama iz klase I (GRAS status) nisu potrebne toksikološke studije

U slučaju proizvodnje iz nepatogenih MO-nemaju GRAS status-kratkotrajne toksikološke studije

Enzimi iz genetički manipulisanih MO-dugotrajna i zametna ispitivanja

Standardi kvaliteta enzimskih preparataStandardi kvaliteta enzimskih preparata

Šta treba kontrolisati:

• Sadržaj arsena, olova i teških Sadržaj arsena, olova i teških

metalametala

• MikotoksiniMikotoksini

• Broj koliformnih bakterijaBroj koliformnih bakterija

• Prisustvo Prisustvo E. coliE. coli i i Salmonelle Salmonelle ne ne

sme da bude detektovanu u 25 g sme da bude detektovanu u 25 g

preparatpreparataa

• Ukupan broj živih bakterijaUkupan broj živih bakterija

Standardi kvaliteta enzimskih preparataStandardi kvaliteta enzimskih preparata

Enzimski preparati ne smeju izazivati alergijske reakcije

Standardi kvaliteta i čistoće enzimskih preparata zavise od krajnje primene enzima

Nekada je veoma važno da enzimski preparati ne sadrže primese drugih enzima

Kada se koristi imobilisani enzim-treba specificirati metod imobilizacije kao i toksičnost nosača

Standardi kvaliteta enzimskih preparataStandardi kvaliteta enzimskih preparata

Tipičan sastav velikog broja komercijalnih tehničkih enzimaTipičan sastav velikog broja komercijalnih tehničkih enzima

Sastav enzimskih preparata za analitičke, dijagnostičke i Sastav enzimskih preparata za analitičke, dijagnostičke i terapeutske svrhe je drugačijiterapeutske svrhe je drugačiji