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Praktikum IV, Frühlingssemester 10

Versuch C1; 29.04. bis 19.05.2010

Chemische Synthese eines Dipeptids

Autoren: Michael Schwarzenberger ([email protected])

Philippe Knüsel ([email protected])

Teilnehmer: Michael Schwarzenberger und Philippe Knüsel

Assistenz: Samuel Jakob, Csaba Szabados

Michael Schwarzenberger/Philippe Knüsel Chemische Synthese eines Dipeptids

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1. Abstract

In diesem Praktikum ging es um die chemische Synthese eines Dipeptides aus zwei Amino-

säuren. Namentlich wurde Aspartam aus Phenylalanin und Asparaginsäure hergestellt. In

einem ersten Schritt wurden die geschützten Edukte Z-Asp(OBzl)-OH und H-Phe-OMe zu ei-

ner geschützten Form von Aspartam synthetisiert. In einer Hydrogenolyse wurde die Schutz-

gruppen Z und Bzl dann entfernt. Die Methylgruppe blieb weiterhin am Dipeptid, da das ge-

wünschte Produkt Aspartam ein Methylester ist. Mittels verschiedener Analysemethoden

wurde die Reinheit des Zwischen- und Endproduktes weitestgehend bestätigt. Lediglich im

Endprodukt befand sich noch eine kleine Menge Methanol. Die Ausbeuten waren beim Zwi-

schenprodukt zufriedenstellend, bei einem Versuchsteilnehmer aber aufgrund eines Missge-

schickes etwas tiefer. Deshalb konnte keine Aussage darüber gemacht werden, ob die Ver-

wendung von Dichlormethan oder Chloroform einen Einfluss auf die Ausbeute hat. Beim

Endprodukt waren die Ausbeuten sehr unterschiedlich. Gründe dafür könnten verschiedene

Verunreinigungen sein.


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2. Einleitung

Aminosäuren sind organische Moleküle, die eine Carbonsäure- und

einer Aminogruppe enthalten. Diese sind über ein zentrales C-Atom

verbunden, an welches noch ein Wasserstoffatom sowie eine orga-

nische Restgruppe gebunden sind. Man unterscheidet die verschie-

denen Aminosäuren anhand ihres Rests (Abb. 1). Mit einer Ausnah-

me (Glycin, R = H) sind alle Aminosäuren chiral, da das zentrale C-

Atome asymmetrisch substituiert ist. In der Fischerprojektion legt

man jeweils die Carbonsäuregruppe nach oben und die Restgruppe

nach unten. Dann unterscheidet man zwischen L-Aminosäuren (Aminogruppe links) D-

Aminosäuren (Aminogruppe rechts). Die natürlich vorkommenden Aminosäuren sind jeweils

L-Aminosäuren. Aufgrund der sauren COOH-und der basischen NH2-Gruppe haben Amino-

säuren sowohl basische als auch saure Eigenschaften. Durch Betrachtung der pKa-Werte der

beiden funktionellen Gruppen (pKa≈2 für die Carboxygruppe und pKa≈10 für die Aminogrup-

pe) wird klar, dass Aminosäuren in neutraler Umgebung als Zwitterion vorliegen.

Aminosäuren sind die Grundbausteine des Lebens. Sie können sich unter Abspaltung von

Wasser zu Polypeptiden verbinden (Abb. 2). Die dabei entstehende CO-NH-Bindung nennt

man Peptidbindung. Sie ist planar, deshalb können Peptide nicht frei um die Achse dieser

Bindung gedreht werden. Ab einer Kette von ungefähr 100 Aminosäuren spricht man nicht

mehr von Peptiden, sondern von Proteinen. Die Nummerierung beginnt jeweils auf der Sei-

te, auf welcher die Aminogruppe liegt.

In diesem Versuch von Bedeutung war Aspartam, ein syn-

thetischer Süssstoff der 1965 entdeckt wurde. Es wird

auch H-Asp-Phe-OMe genannt. Diese Bezeichnung macht

deutlich, dass es sich bei Aspartam um ein Dipeptid von

Asparaginsäure und Phenylalanin handelt. Die Carbo-

xygruppe des Phenylalanin liegt dabei als Methylester vor.

Die Strukturformel von Aspartam ist in Abb. 3 gezeigt.

Abb. 1: Fischerprojektion

einer Aminosäure

-H2O

Abb. 2: Reaktion von zwei Aminosäuren unter Abspaltung von Wasser zu einem Dipeptid

Abb. 3: Strukturformel von Aspartam


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Für die Synthese wurden geschützte Edukte ver-

wendet, damit nur die gewünschten Gruppen rea-

gieren. Die Stukturformeln der Edukte Z-Asp(OBzl)-

H und H-Phe-OMe mit den markierten Schutzgrup-

pen sind in Abb. 4 gezeigt.

In Abb. 5, Abb. 6 und Abb. 7 sind drei verschiedene

mögliche Reaktionswege zur Synthese von Dipeptiden

dargestellt.

Beim Reaktionsweg A lagert sich die Carboxykomponente der Asparaginsäure am DCCD an es ent-

steht Acyl-ureid (1). Bei der weiteren Reaktion mit dem Katalysator Hydroxybenzotriazol (HOBT) fällt

ein Harnstoffderivat (2) aus und es entsteht letztendlich das Dipeptid (3).

Abb. 5: Mögliche Reaktion zur Synthese eines Dipeptids (A).

Abb. 4: Stukturformeln der Edukte. Grün und rot

markiert sind die Schutzgruppe. [1]


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Reaktionsweg B zeigt die Reak-

tion des Acy-ureids mit Aspara-

ginsäure. Dabei entsteht ein

Carbonsäureanhydrid, das mit

Phenylalanin zum Dipeptid rea-

giert.

Die dritte Möglichkeit ist der Reaktionsweg C, bei der Acyl-ureid direkt mit Phenylalanin zum Dipep-

tid reagiert. Als Nebenprodukt entsteht ein Harnstoffderivat.

Abb. 7: Reaktionsweg B zur Dipeptid-

synthese.

Abb. 6: Reaktionsweg C zur Dipeptidsynthese.


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3. Materialien und Methoden

Aspartam (H-Asp-Phe-OMe) wurde in zwei Reaktionsschritten hergestellt. Im ersten Teilschritt wurde

Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe synthetisiert. Anschliessend wurde das Zwischenprodukt zu Aspartam hydro-

genolysiert.

3.1. Synthese von Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe

Zuerst wurden zwei Lösungen hergestellt. Für die Lösung A wurde 1.62 g (4.53 mmol) (Philip-

pe/Michael) Asparaginsäure (Z-Asp(OBzl)-OH) in einen 250 ml Rundkolben eingewogen. Es wurde

30 ml Chloroform (Philippe) bzw. Dichlormethan (Michael) hinzugegeben. Die Lösung wurde mit Hilfe

eines Kochsalzeisbades unter ständigem Rühren auf -12 °C gekühlt. Für die Lösung B wurden 0.969 g

(4.46 mmol)(P)/0.968 g (4.49 mmol)(M) Phenylalanin und THF/CHCl3 (P) bzw. THF/CH2Cl2 (M)

(30 ml/40 ml) in einem 100 ml Rundkolben gelöst. Mit einer Spritze wurde zusätzlich 0.7 ml Hünigba-

se (N,N-Diisopropylethylamin). Das ganze wurde mit einem Kochsalzeisbad auf -12 °C gekühlt und

anschliessend in einen Tropftrichter überführt. Dabei wurde Lösung B verschüttet, weil der Tropf-

trichter nicht ganz dicht war (P) – ca 20 ml – bzw. weil der Tropftrichter überlief (M) – wenig.

Die Lösung B wurde dann sehr langsam während 15 min zu A hinzugetropft (M) bzw. direkt hinzu-

gegeben (P). Anschliessend wurde die Lösung 30 min bei -12 °C gerührt. Als dann die Mischung klar

war, wurde 0.972 g (4.71 mmol)(P)/0.984 g (4.77 mmol)(M) DCCD und 188 mg (1.38

mmol)(P)/184 mg (1.36 mmol)(M) dazugegeben. Die Mischung wurde weitergerührt bei -12°C und

über Nacht auf RT aufgewärmt (Kältebad wurde nicht entfernt).

Die unlöslichen Anteile wurden mit einer Glasfritte abgenutscht. Anschliessend wurde der Filterku-

chen in 25 ml Chloroform (P)/Dichlormethan (M) erneut abgenutscht. Die Chloroform-

/Dichlormethanphasen wurden vereinigt. Die gelbliche Lösung wurde danach insgesamt drei Mal

mittels Scheidetrichter ausgeschüttelt, wobei die jeweils organische Phase weiterverwendet wurde.

Zuerst wurde mit 50 ml 0.5 M HCl (aq), dann mit 50 ml 5 % NaHCO3 und zuletzt mit 50 ml H2O ausge-

schüttelt.

Die resultierende organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet (5-10 min) und anschliessend filt-

riert und das Lösemittel im Rotationsverdampfer abgezogen. Der Rückstand im Kolben (mit aufge-

setzter Vigreuxkolonne) wurde in einem Wasserbad auf 83 °C erwärmt und soviel 2-Propanol hinzu-

getropft bis sich alles gelöst hatte (50-70 ml). Die Lösung wurde danach im Eisbad gekühlt und abge-

nutscht. Die Nutschte wurde zusammen mit dem Zwischenprodukt über Nacht in den Trocken-

schrank gelegt worauf dann die Ausbeute bestimmt werden konnte.

Zur Analyse des Zwischenprodukts wurde eine Probe fürs 1H-NMR, 10 mg in ein mit CDCl3 gefülltes (4

cm hoch) NMR-Röhrchen, und fürs IR, 10 mg mit Achatmörser zerrieben in Eppendorfhüttchen, vor-

bereitet. Zudem wurde der Schmelzpunkt durch Variation der Menge und der Partikelgrösse be-

stimmt.


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3.2. Hydrogenolyse von Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe zu Aspartam

In einen 250 ml Zweihalsrundkolben wurden 0.400 g (0.77 mmol) (P&M) des Zwischenprodukts Z-

Asp(OBzl)-Phe-OMe in 70 ml Methanol gelöst. Zusätzlich wurde 70 mg einer Mischung von 10 % Pal-

ladium auf Aktivkohle hinzugegeben. Danach wurde ein 3-Weghahn mit einem Wasserstoff gefüllten

Ballon aufgesetzt. Zuerst wurde ein paar Minuten mit Stickstoff gespült, worauf der 3-Weghahn kurz

ein wenig geöffnet wurde, damit die „Luft“ im Rundkolben durch Wasserstoff ersetzt wurde (hörbar

durch Änderung des Ausflussgeräusches). Danach wurde das Ausflussventil zugedreht. Bei Philippe

könnte möglicherweise zu viel Wasserstoff aus dem Ballon abgelassen worden sein (eventuell gerin-

gere Ausbeute).

Unter der Wasserstoffatmosphäre wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur

gerührt. Im nächsten Schritt wurde die Lösung abgenutscht, wobei in der Nutsche in der Reihenfolge

Filterpapier-Celite-Filterpapier geschichtet wurde. Die Celite wurde dabei über dem Filterpapier di-

rekt in der Nutsche mit Methanol aufgeschlämmt. Dann wurde vorsichtig Methanol abgezogen und

das zweite Filterpapier draufgelegt. Die Suspension wurde mittig auf das Filterpapier geleert. Das

klare Filtrat wurde in einen tarierten Kolben gegeben. Mit Hilfe des Rotationsverdampfers wurde das

Lösungsmittel entfernt und das erhaltene Endprodukt Aspartam im Trockenschrank über Nacht gela-

gert.

Probleme tauchten bei der grösseren Nutsche auf. Irgendwie dichtete das Filterpapier nicht genü-

gend ab. Bei beiden Versuchen (P&M) wurde erst beim zweiten Anlauf, Wechsel zur kleineren Nut-

sche, ein klares Filtrat erzielt. Zudem wurde bei Michael ein bisschen zu viel nachgewaschen, worauf

ein 500 ml Rundkolben beim Rotationsverdampfer verwendet werden musste.

Zur Analyse des Endprodukts wurde eine Dünnschichtchromatographie durchgeführt, wobei als

Laufmittel eine CHCl3/CH3OH-Mischung im Verhältnis 20:1 verwendet wurde. Ausserdem wurde für

ein DSC etwa 30 mg des Aspartams in ein Eppendorfhüttchen abgefüllt und für ein 1H-NMR ca. 10 mg

in ein NMR-Röhrchen mit DMSO-d6 (ca. 4 cm hoch) gegeben.


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4. Resultate

4.1. Ausbeute

Ausbeute Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe [g] Ausbeute Aspartam [g]

Michael 1.58 (64.57 %) 0.130 (57.26 %)

Philippe 1.21 (49.45 %) 0.243 (107.04 %) Tab. 1: Ausbeuten an geschützten Produkt und nach der Entfernung der Schutzgruppen

4.2. Analytik

4.2.1. Zwischenprodukt Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe

1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ=2.77 (m, 2H, CH2-CO(OBzl)), 3.05 (d, J=2.1 Hz, 2H, Ar-CH2-CH-CO-OMe),

3.10 (t, J=5.7 Hz, 1H, CO-NH-CH-OMe), 3.72 (s, 3H, O-CH3), 4.63 (s, 1H, NH-CH-CO), 4.84 (m, 1H, CH-

CO-OMe), 5.14 (m, 4H, Ar-CH2-CO), 5.96 (d, 1H, O-CO-NH-CH), 6.94 (d, 1H, CH-CO-NH-CH), 7.15

(CHCl3, Lösungsmittel), 7.52 ppm (s, 10H, Ar-CH2-CO).

IR-Spektrum: Wellenzahl=3307.73 (N-H st.), 1716.54 (C=O), 1647.86, (Ar-H skel.), 1533.10 (Ar-H

skel.), 1444.38 (Ar-H skel.), 700.19 cm-1 (Ar-H def.).

Wenig Substanz, gemörsert

[°C]

Viel Substanz, gemörsert

[°C]

Viel Substanz, ungemörsert

[°C]

Michael 116-118 116-119 117-119

Philippe 115-123 119-123 117-123 Tab. 2: Resultate der Schmelzpunktbestimmung des Zwischenproduktes

4.2.2. Endprodukt Aspartam

1H-NMR (300 MHz, [D6]-DMSO): δ=2.52 (DMSO, Lösungsmittel), 3.00 (m, 2H, Ar-CH2), 3.18 (s, 3H,

CH3), 3.62 (s, 3H, CH3OH, Verunreinigung), 3.92 (m, 1H, NH2CH), 4.20 (m, 1H, Ar-CH2CH), 4.52 (d,

J=6.9 Hz, 1H, NH), 7.23 (m, 5H, Ar-CH2), 7.98 ppm (d, 2H, NH2).

IR-Spektrum: Wellenzahl=3307.41 (N-H st.), 1716.40 (C=O), 1648.20 (Ar-H skel.), 1534.85 (Ar-H skel.),

1444.80 (Ar-H skel.), 698.72 cm-1 (Ar-H def.).

Bei der Schmelzpunktbestimmung des Endprodukts Aspartam wurde die Probe zuerst bei 170 °C

braun, worauf sie dann bei 210 °C schwarz und flüssig war.

Dünnschichtchromatographie:

Substanz Retensionsfaktor Rf

Zwischenprodukt 0.95

Endprodukt 0.07

St 1 (H-Phe-OMe) 0.75

St 2 (Z-Asp(OBzl)-OH) 0.51 Tab. 3: Retensionsfaktoren, die basierend auf der DC-Messung berechnet wurden.


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Abb. 1: DSC des Endprodukts Aspartam

156.39 °C


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5. Diskussion

5.1. Zwischenprodukt Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe

Die höhere Ausbeute des Zwischenprodukts Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe bei Michael ist durch das Aus-

schütten einer grossen Menge (20 ml) von Lösung B bei Philippe zu erklären. Es kann daher aus die-

sen beiden Resultaten nicht gesagt werden, ob mit Dichlormethan (M) oder Choloroform (P) eine

höhere Ausbeute erzielt werden kann. Es kann zudem sein, dass zusätzlich Zwischenprodukt in der

Vigreuxkolonne verblieben ist.

Die 1H-NMR-Analyse des Zwischenproduktes bestätigte die erfolgreiche Durchführung des ersten Teil

des Praktikum. Alle wichtigen Peaks waren vorhanden. Lediglich die Integrale waren teilweise nicht

eindeutig, was daran liegen könnte, dass Austauschreaktionen mit den Deuterium-Isotopen stattge-

funden haben könnten. Das IR-Spektrum hatte die wichtigsten Peaks, namentlich die N-H-Bindung

sowie die Signale der C=O-Doppelbindung und des Benzolrings.

Ein Literaturwert zum Schmelzpunkt konnte nicht gefunden werden. Der gemessene variiert aber

trotz unterschiedlicher Menge und Partikelgrösse kaum (116-123°C).

5.2. Endprodukt Aspartam

Bei der Dünnschichtchromatographie ist erkennbar, dass das Endprodukt Aspartam weder Edukte

noch das Zwischenprodukt enthält. Somit kann man die Hydrogenolyse als erfolgreich und das End-

produkt als rein bezeichnen. Da das Lösemittel apolar und die stationäre Phase polar war, kann man

bezüglich der Rf-Werte sagen, dass diese umso grösser sind, je apolarer die Substanz ist. Folglich hat

Aspartam einen niedrigen Rf-Wert, da es sehr polar ist. Im Gegensatz dazu weist das Zwischenpro-

dukt wegen seiner Apolarität einen hohen Rf-Wert auf.

Die hohe Ausbeute des Endprodukts Aspartam bei Philippe könnte durch das Durchsickern der Celite

ins Filtrat zustande gekommen sein. Das Filtrat war jedoch nach dem Abnutschen klar, womit nicht

mit viel durchgesickerter Celite gerechnet werden muss. Zusätzlich könnten noch Rückstände von

Aktivkohle und Palladium vorhanden sein. Bei Michael könnte ein wenig vom Endprodukt in der Celi-

te zurückgeblieben sein, was die niedrigere Ausbeute erklären könnte. Es wurde jedoch grosszügig

nachgespült.

Bei der DSC-Messung ist erkennbar, dass zwischen 40-100 °C Flüssigkeit abgedampft wurde. An-

schliessend kam es zu einer exothermen Reaktion von etwa 130-156°C gefolgt von einer endother-

men bis 167 °C. In diesem Bereich zersetzt sich Aspartam in seine Einzelkomponente (L-

Asparaginsäure, L-Phenylalanin und Methanol) oder es zyklisiert sich unter Methanolabspaltung zu

einem 2,5-Dioxopiperazin, welcher Vorgang auch beim Kochen und Backen unter Verlust der Süss-

kraft abläuft [2]. Welche der beiden Reaktionen abgelaufen ist kann man anhand der DSC-Analyse

nicht bestimmen. Der Schmelzbereich des zersetzten Produkts befindet sich dann zwischen 200-235

°C, wobei der Schmelzpunkt bei 228 °C gemessen wurde.

Der Literaturwert des Schmelzpunkts von Aspartam liegt bei 248−250 °C [2]. Der Wert der DSC-

Messung (228 °C) sowie der mittels Schmelzpunktapparatur bestimmte (210 °C) liegen leicht darun-

ter, stimmen jedoch gut überein.


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Auch hier bestätigten die Analysen (IR und 1H-NMR) des Produktes im Wesentlichen die er-

warteten Resultate. Allerdings war beim NMR-Spektrum zu erkennen, dass noch Methanol

im Produkt sein musste. Dieses könnte sich beim Spülen eingelagert haben. Wie beim Zwi-

schenprodukt war es schwierig, die Anzahl der H-Atome anhand der Integrale zu bestimmen.

Der hohe Lösungsmittelpeak bei 2.52 ppm weist auf Austauschreaktionen zwischen dem

Produkt und dem Lösungsmittel hin.


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6. Referenzen

Abb. 1 : Selber erstellt mit ChemSketch 11.0

Abb. 2 : Selber erstellt mit ChemSketch 11.0

Abb. 3 : http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/ Asparta-

me.svg/500px-Aspartame.svg.png

[1]: Praktikumsanleitung “Versuch 9: Chemische und enzymathische Synthesen eines Dipep-

tids“, Frühlingssemester 10, Materialwissenschaft BSc, ETH Zürich.

[2]: Wikipedia, Aspartam, 01.06.2010, http://de.wikipedia.org/wiki/Aspartam

7. Anhang

7.1. Fragen

Frage 9. 1. Was scheint Ihnen die unangenehmste Eigenschaft der verwendeten Edukte bzw. Löse-

mittel zu sein?

Chloroform hat eine toxische Wirkung auf Herz, Leber und andere innere Organe und ist

eventuell krebserregend. DCCD ist krebserregend und die Hünig-Base ätzend. Zudem kann

HOBT auf ein heranwachsendes Kind im Mutterleib schädigend wirken. Deswegen ist wie

immer während des ganzen Versuchs das Tragen von Handschuhen sehr wichtig.

Frage 9. 2. Welche Stoffe werden bei den einzelnen drei Abtrennungen aus der organischen Phase

entfernt? Welcher Stoff verbleibt evtl. am Schluss zusammen mit dem Produkt in der organischen

Phase?

Im ersten Schritt werden mit HCl die polaren Reagenzien DCCD, Phe-NH2 und die Hünig-Base

entfernt. Die unpolaren Stoffe HOBT und Asp-OH werden anschliessend mit NaHCO3 ent-

fernt. Wasser werden schlussendlich Rückstände aus den ersten beiden Schritten entfernt.

Mit dem Produkt verbleibt schlussendlich das Lösungsmittel.


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7.2. Spektren

Abb. 8: IR-Spektrum des Zwischenprodukts

Abb. 9: IR-Spektrum des Endproduktes


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Abb. 10: 1H-NMR-Spektrum des Zwischenproduktes von Michael

Abb. 11: 1H-NMR-Spektrum des Endproduktes von Michael

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