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PRACTICAS DE FARMACOLOGÍA Y FARMACOTERAPIA I

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA

FACULTAD DE FARMACIA

UNIVERSIDAD DE SEVILLA

Prácticas de Farmacología y Farmacoterapia I

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VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD PSICOTROPA

DE FÁRMACOS


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1. VALORACIÓN DE FÁRMACOS PSICOTROPOS

1.1. INTRODUCCIÓN

Los psicofármacos son sustancias que deprimen, estimulan o alteran la naturaleza de la conducta y/o de las reacciones emocionales y por ello son empleados en el tratamiento de las enfermedades mentales.

Tanto en animales como en el hombre no existe un criterio único que permita clasificar un fármaco psicotrópico, siendo necesaria una verdadera batería de métodos de estudio. Los métodos de investigación básica, aunque presentan un valor provisional dada la dificultad en la extrapolación de resultados obtenidos desde el animal de experimentación hacia el hombre, permiten valorar moléculas seleccionadas con potencial aplicación terapéutica.

A continuación se describen los métodos principales.

1.2. Pruebas de Comportamiento general

Esquema de Irwin

En la valoración preliminar de nuevos fármacos posiblemente activos sobre SNC ocupa un lugar destacado el Esquema de Irwin. Su sencilla realización así como la suficiente validez de los datos aportados hacen que su práctica sea de gran utilidad antes de proseguir la investigación con pruebas de mayor complejidad. El desarrollo de esta batería de ensayos quedaría resumido en tres grandes apartados:

Estudio de comportamiento (alerta, aseo, irritabilidad)

Estudio neurológico (temblores, convulsiones, ataxia)

Estudios relacionados con el SNA (salivación, hipotermia, midriasis)

Efecto de “Doma”

Animales naturalmente hostiles como el mono rhesus, pueden adquirir un comportamiento normal, fáciles de manejar, cooperativos, por acción de fármacos con acción tranquilizante.

Facilitación de hipnóticos.

Un efecto común de los tranquilizantes mayores es la facilitación de los hipnóticos y de los anestésicos generales que se pone de relevancia por la prolongación de la actividad de los mismos.

Reacción emocional.

En determinado espacio especialmente indicado para este tipo de experimentación, caja de campos, se valora la mayor o menor sensibilidad y adaptación del animal ante las nuevas circunstancias ambientales. Además de observar la actividad motora desarrollada por el animal, es útil y sencillo anotar el número de defecaciones producidas.


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1.3. Actividad motora

La acción de fármacos tranquilizantes y relajantes musculares, activos a nivel central, puede ser estudiada ensayando las modificaciones inducidas en modelos relacionados con la actividad motora.

Actógrafos

La motilidad espontánea del animal se cuantifica mediante aparatos denominados actógrafos.

El más sencillo consistiría en una jaula ligera suspendida de un soporte cuyos movimientos son registrados. Existen sistemas más complejos compuestos de células fotoeléctricas sensibilizadas en relación con la actividad del animal.

Trastornos de la marcha

Se registran los cambios producidos en la marcha del animal previamente impregnado con determinado colorante en sus extremidades. Las marcas producidas presentarían ciertos cambios o irregularidades cuando el animal sufre ataxia.

Prueba del cilindro rotatorio (Rota-Rod)

Consiste en un cilindro con capacidad de giro según determinadas condiciones previamente establecidas. Se registra el tiempo que tarda en caer el animal.

Prueba de la chimenea

Se introduce el animal, ratón, en un tubo de vidrio con la cabeza hacia abajo, anotando el tiempo que tarda en recobrar la posición normal.

Estudio sobre cambios catatónico o catalépticos.

Moléculas con acción neuroléptica tienen la propiedad de producir en la animales un estado caracterizado por la permanencia de los mismos en posiciones anormales.

Excitación provocada

El estudio de agentes con posible acción anticonvulsivante puede realizarse estimulando previamente al animal con fármacos como estricnina, picrotoxina o cardiazol, productores de convulsiones de diferentes características, y ver la acción antagonista del fármaco en estudio.

Pruebas de tracción, evasión y curiosidad.

1.4. Ensayos sobre aprendizaje y memoria

Además de los ensayos anteriormente citados, los estudios se pueden completar con otros test

neurofarmacológicos relacionados con los cambios en conducta exploratoria y emocional.

Prueba del laberinto.

Los laberintos pueden ser de distinta complejidad e incluso introducir determinada recompensa.

Anotaríamos el tiempo que tarda en encontrar la salida, así como el número de errores cometidos. Previamente el animal habrá sido sometido a un periodo de aprendizaje.


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Autoestimulación

Esta técnica consiste en implantar electrodos permanentes en determinados centros cerebrales del animal y conectados a un dispositivo por el cual reciben determinadas descargas eléctricas al presionar una palanca. Los animales curiosamente reciben satisfacción al autoestimularse. Algunos fármacos alteran la velocidad de esas estimulaciones en distintas zonas del cerebro, como es el caso del ratón y las anfetaminas o el gato y la morfina.

1.5. Reflejos condicionados

Respuesta de fuga y evitación El animal, normalmente rata, es colocado en una jaula cuya base recibe una descarga eléctrica de determinadas condiciones preestablecidas y algo dolorosas. Posteriormente, la rata es sometida a una fase de aprendizaje enseñándola a evitar la descarga pasando antes al compartimento próximo, concretamente al observar determinada señal de aviso como puede ser un timbre o una luz. Este tipo de ensayo son especialmente útiles en la valoración de fármacos antidepresivos. Los animales por tanto han de sufrir previamente determinada alteración neurológica que se aproxime a un posible cuadro depresivo. Es útil entonces utilizar el modelo de “shock inescapable” consistente en sesiones diarias de descargas eléctricas y que terminan generando en el animal un cuadro de estrés emocional.

Este conjunto de pruebas son algunas de las que podrían realizarse para valoración de fármacos activos sobre el SNC. No obstante el estudio completo, profundizando en su mecanismo de acción, necesitaría pruebas más concretas y sofisticadas de tipo electrofisiológico (EEG), bioquímico (actividad sobre determinados enzimas, binding en receptores cerebrales) o anatomopatológicos

2. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1. Animales y sustancias ensayadas

Se toman dos grupos de ratones (n=12)

1. Grupo Control (vehículo, solución salina fisiológica)

2. Grupo tratado con el fármaco psicodepresor- Diazepam (2mg/Kg)

A cada animal se le aplica, vía i.p. 0.25 ml de las soluciones de los fármacos en estudio. Mantendremos una secuencia de 15 min entre cada animal.

Pasados 30 min se procede a la valoración de los cambios inducidos según los tipos de test propuestos. Las pruebas han de hacerse en silencio máximo, siendo imprescindible que la manipulación se intente realizar en idénticas condiciones para todos los animales.

2.2. TEST

Test de la curiosidad (Test de Boisier-Simon)

En primer lugar, cada animal es colocado en el centro de la superficie con orificios, una secuencia total de aplicación de 5 min. El sistema de registro del equipo contabiliza el número de veces que introduce la cabeza de forma contundente en los orificios, mediante detección de células fotovoltaicas localizadas en la parte inferior. Los resultados se anotarán cada minuto, durante los cinco minutos que dura la prueba. Posteriormente, representamos el nº de veces por minuto que el animal introduce la cabeza en el orificio, obteniendo un total de 5 valores por cada animal.


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Test de la Actividad Motora Espontánea (Actímetro)

El actímetro mide la motilidad del animal a través de un sistema de sensores. Se contabilizará el número de movimientos del animal mediante un actímetro. Se contabilizarán intervalos de 5 minutos (0-5, 5-10 y 10-15) por un periodo total de 15 minutos.

Test de la Coordinación Motora (Rota-Rod)

Consiste en medir el tiempo que el animal es capaz de mantenerse sobre un cilindro que gira a una velocidad constante de 5 r.p.m. Un fármaco que afecte a la coordinación motora reducirá este tiempo.

Test de la Tracción (Julon-Courvoisier)

Utilizaremos un alambre horizontal del que colgaremos al ratón por las extremidades anteriores. Anotaremos el tiempo que tarda en caer dentro del tiempo asignado a la prueba (120 s).


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3. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

3.1. Representación gráfica

A partir de los resultados obtenidos en los distintos ensayos realizados, se calcula la media ± error standard para cada grupo.

TEST DE LA CURIOSIDAD realizaremos un gráfico en el cual representamos en abscisas los minutos (de 1 a 5) que ha durado la prueba y en ordenadas los valores de las medias (± error estándar) de los resultados obtenidos en cada minuto. Obtendremos dos tipos de respuesta relacionados con los dos tratamientos a los que hemos sometido a los animales (grupo control y grupo diazepam).

TEST DE LA TRACCIÓN calcularemos la media de los valores obtenidos con los dos grupos (± error estándar) y los resultados los representamos en un gráfico tipo histograma (gráfico de barras).

0

2

4

6

8

10

12

14

1´ 2´ 3´ 4´ 5´

curi

osi

dad

(n

ºve

ces)

tiempo (min)

Test curiosidad

Control

Diazepam 2mg/kg

0

40

80

120

tie

mp

o (

seg)

Test de tracción

ControlDiazepam 2mg/kg

*

*

**


8

TEST DE LA ACTIVIDAD MOTORA ESPONTÁNEA

Realizaremos un gráfico en el cual representamos en abscisas los intervalos en minutos (0-5, 5-10, 10-15 min.) que ha durado la prueba y en ordenadas los valores de las medias (±error estándar) de los resultados obtenidos en cada intervalo.

TEST DE LA COORDINACION MOTORA calcularemos la media de los valores obtenidos en la prueba del Rota-Rod con los dos grupos (± error estándar) y los resultados los representamos en un gráfico tipo histograma (gráfico de barras)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

5´ 10´ 15´

Nº

mo

vim

ien

tos

tiempo (min)

Test de la Actividad Motora Expontánea

Control

Diazepam 2mg/Kg

0

20

40

60

80

tie

mp

o (

seg)

Test de la Coordinación Motora

Control

Diazepam 2mg/kg

**


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3.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis estadístico nos permite conocer si las diferencias observadas entre los resultados de los dos grupos de animales son significativas o no. Si las diferencias fueran efectivamente significativas podríamos afirmar que diazepam disminuye la curiosidad y tracción de los animales. Asimismo podríamos asegurar que diazepam disminuye la actividad motora, ya que estas pruebas evalúan dicha capacidad.

Las diferencias que observemos a simple vista no tienen porqué ser significativas, es necesario la realización de pruebas matemático-estadísticas que nos confirmen que todos los resultados de un grupo se parecen entre sí y que son distintos de los de otro grupo.

Los conceptos que vamos a manejar para ello son los siguientes:

Media: ̅= ⁄

Error estándar: ES= n-1 / n

Desviación estándar: n-1 = ( – ⁄ )

Grado de libertad: g.l.= n-1

Debemos elegir correctamente la prueba de significación más adecuada para nuestro experimento. El test adecuado para este tipo de prueba es el de la t de Student (seudónimo que utilizaba el matemático que describió por primera vez este tratamiento de los datos). Es muy útil para comparar dos grupos de datos, como en nuestro caso, en el que tenemos un grupo control y un tratamiento. Mediante la siguiente fórmula, comparamos dos medias y las dos desviaciones standard:

Obtendremos una t calculada que comparamos en una tabla con la t teórica para los mismos grados de libertad. Al valor teórico que se le asemeja, le corresponde un valor de probabilidad, p. Esta p, nos da la probabilidad de que nuestros valores no sean diferentes, es decir, que mientras más pequeña sea mayor será la probabilidad de que nuestra afirmación sea correcta.

Generalmente no se da el valor exacto de p, sino que se agrupa de la siguiente manera:

p > 0.05: valores no significativos

p<0.05: *

p<0.01: ** valores significativos

p<0.001: ***


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GASTROENTEROPATÍA POR ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS (AINE)


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1. EVALUACIÓN DEL DAÑO DE LA MUCOSA GÁSTRICA POR IBUPROFENO

Los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) son un grupo de fármacos ampliamente utilizados en clínica con interesantes propiedades analgésicas, antiinflamatorias y antipiréticas. Sin embargo, su efecto indeseable más significativo es el daño que provocan sobre la mucosa gástrica.

Para poder evaluar este efecto lesivo se ha seleccionado el AINE Ibuprofeno (IB).

1.1 Animales de experimentación

Este estudio ha sido realizado con ratas Wistar de ambos sexos y de peso medio comprendido entre 180-220 g, suministrados por el Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla, mantenidos en condiciones estándares de estabulización a 24-25 ºC, a 70-75% de humedad y sometidas a un régimen de luz de doce horas al día y alimentación controlada.

Veinticuatro horas antes de comenzar los ensayos, los animales fueron mantenidos en ayunas, pero con libre acceso al agua, y se dispusieron en jaulas individuales, con rejillas altas en el fondo para evitar la coprofagia.

El número de animales utilizado en el estudio ha sido de 8 por grupo.

Todos los protocolos llevados a cabo siguieron las recomendaciones del Real Decreto 53/2013 por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación animal (Directiva del Consejo de Europa 2010/63/UE).

1.2. Fármacos ensayados y tratamiento

Se han ensayado tres dosis de ibuprofeno (IB) de 200 mg, 400 mg y 600 mg/ kg de animal, en forma de solución acuosa de preparación extemporánea en agua destilada y administrada vía oral (v.o.) por sonda intragástrica (1 mL/ 100 g de animal).

Las lesiones gástricas inducidas, son valoradas tras finalizar el periodo establecido (3 h).

1.3. Valoración macroscópica del daño gástrico

Los animales son sacrificados con ketamina (80 mg/kg animal) y xilacina (10 mg/kg animal) i.p. y posteriormente decapitados con guillotina. Los estómagos son extraídos, abiertos por la curvatura mayor y lavados con solución salina fisiológica, procediéndose a valorar el daño gástrico. Las úlceras son medidas y el resultado final expresado como superficie de estómago lesionada (mm

2). La magnitud del daño también se evaluó de acuerdo con la siguiente escala,

0: No lesión.

1: Presencia de hiperemia y/o petequias.

2: 1-5 úlceras pequeñas menores de 3 mm.

3: Más de 5 úlceras pequeñas menores de 3 mm o una úlcera mayor de 3 mm.

4: Varias úlceras mayores de 3 mm.

5: Úlceras perforadas.


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Expresándose la media ± error estándar como Índice de Ulceración (I.U.). Los resultados obtenidos se compararon con los de un grupo control que sólo recibió el vehículo, 1 mL de agua destilada/ 100 g de animal.

1.4. Valoración microscópica del daño gástrico. Estudio Histológico de las lesiones

En el estómago sano encontramos la morfología típica con glándulas tubulares simples en las que se observan los elementos mucosos y las células oxínticas o parietales distribuidas hasta el fondo, distinguiéndose también, en regiones profundas, las células pepsinógenas (Figura 2). La mucosa gástrica queda limitada de la capa subyacente por la muscularis mucosae. La submucosa, constituida por tejido conjuntivo se presenta muy vascularizada. La muscular externa está formada por haces de fibras musculares lisas orientadas en las tres direcciones del espacio. Por último, el órgano se ve envuelto por una fina capa de tejido conjuntivo laxo constituyendo la serosa.


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Figura 2. Aspecto de la mucosa de rata control distinguiéndose la morfología tubular simple de las glándulas y la distribución de sus principales elementos (H-E 20X). Corte histológico de un estómago de rata, teñido de hematoxilina y eosina. A) 4x y B) 10 X (Atlas de histología vegetal y animal).

Técnica de procedimiento

Para llevar a cabo el análisis microscópico del daño gástrico, las muestras gástricas se someten a un proceso de deshidratación en alcoholes de graduación creciente. Posteriormente, se procede a la inclusión en parafina y se realizan los cortes en un micrótomo (10 micras).

Las muestras, una vez en los portas se someten a un proceso de hidratación (con alcoholes de graduación decreciente hasta xilol) para ser teñidas con hematoxilina/eosina.

Dichas preparaciones son examinadas al microscopio con un objetivo de 20X.

La escala empleada para la valoración de las lesiones en mucosa gástrica sería la siguiente:

GRADO 0 Células superficiales intactas, de aspecto, localización y densidad normales. Glándulas profundas y estrechas, con células mucosas del cuello, parietales, principales y endocrinas intactas.

GRADO I Pérdida de células superficiales de revestimiento y células regenerativas. En superficie aparecen células del istmo.

GRADO II Primera porción del cuello afectada. Con frecuencia se presentan células parietales en superficie.

GRADO III Afectada la parte final del cuello. En ningún momento el daño alcanza la base de la glándula gástrica.

El tratamiento con Ibuprofeno provoca lesiones que afectan a toda la mucosa con pérdida de la estructura histológica y profunda alteración del epitelio glandular. Se aprecia un daño profundo y


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extenso que afecta a las criptas, istmo y cuello de las glándulas, observándose células oxínticas en superficie y puede apreciarse pérdida de la orientación de la glándula gástrica, no siendo perpendicular respecto al plano. La base de la úlcera se caracteriza por abundante tejido de granulación, rico en fibroblastos, existe una intensa reacción inflamatoria, con importante infiltración de elementos leucocitarios, así como presencia de hematíes.

2. Valoración del infiltrado inflamatorio gástrico asociado al tratamiento con ibuprofeno. Actividad Mieloperoxidasa (MPO)

Los neutrófilos están involucrados en una serie de desórdenes gastrointestinales, entre los que se incluyen las lesiones gástricas. Estos leucocitos migran al área inflamada y se transforman en células secretoras, liberando RLO, enzimas lisosomales, etc., y originando la reacción tisular que coadyuvará a la producción del daño macroscópico (Bjarnason y col.,1993).

La determinación de la actividad mieloperoxidasa (MPO), proteína constitutiva de los neutrófilos, es un método para cuantificar el grado de infiltración leucocitaria inflamatoria. Esta enzima es liberada a los fluídos extracelulares, donde oxida a haluros y tiocianatos a los correspondientes ácidos hipohalurosos (Klebanoff, 1988). Estos ácidos reaccionan con los substratos disponibles, disminuyendo así su reactividad y además, participan en la génesis de potentes oxidantes como las cloraminas.

Para la medida de esta actividad enzimática hemos seguido el método propuesto por Bradley y col. (1982), basado en la oxidación, dependiente de H2O2, usado como donador de hidrógeno, de un donador artificial de electrones, orto-dianisidina, con producción de un cromógeno amarillo anaranjado cuya absorbancia se mide espectrofotométricamente.

ORTO- DIANISIDINA COMPUESTO CROMOGENO

El tiempo máximo para la determinación de dicha enzima es de 2 semanas (-40 ºC), período en el que se mantiene inalterada su actividad.

2.1. Protocolo de la determinación de la Actividad de la Mieloperoxidasa (MPO) (Bradley y cols., Journal Investigative Dermatology 1982;78: 206-209)

2.2.1 Procedimiento de obtención y conservación de las muestras

Tras la evaluación del daño macroscópico, y para llevar a cabo los estudios mecanísticos, los estómagos fueron depositados en una placa sobre hielo y sometidos a un raspado con ayuda de un porta objetos.

Las muestras son congeladas a -80ºC hasta las determinaciones bioquímicas posteriores.

H2O2

H2O

MPO =450 nm


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2.2.2 Preparación de las muestras para el estudio bioquímico

1. Descongelar el tejido 2. Pesar 100 mg de tejido aprox. 3. Homogenizar en tampón pH 7.4 (dilución 1/10), en frio 4. Agitar 5. Centrifugar 13.200 rpm, 20 min, 4ºC. 6. Nos quedamos con el sobrenadante donde determinaremos la actividad MPO y

niveles de NO por Reacción de Griess.

2.2.3 Determinación espectrofotométrica

Para la determinación espectrofotométrica, se realiza una dilución previa (1:25) de las distintas muestras en tampón fosfato potásico 50 mM pH 6.0. Una alícuota de 50 µl de cada una de ellas, se colocará en los respectivos pocillos de la microplaca. Posteriormente, se añaden 50 µl de cada uno de los reactivos: O-dianisidina (0.067%), HETAB (0.5%) y agua oxigenada al 0.003%, consecutivamente.

A. Colocar en la microplaca las distintas muestras, según el siguiente esquema (Fig.1):

1. En los pocillos de la columna 1, se colocan 50 μL de las distintas MUESTRAS CONTROL.

2. En los pocillos de la columna 2-4, se colocan 50 μL de las distintas MUESTRAS DE IBUPROFENO 200, 400 y 600.

1 2 3 4

A Blanco Blanco Blanco Blanco

B CS1 IB1 200 IB1 400 IB1 600

C CS2 IB2 200 IB2 400 IB2 600

D CS3 IB3 200 IB3 400 IB3 600

E CS4 IB4 200 IB4 400 IB4 600

F CS5 IB5 200 IB5 400 IB5 600

G CS6 IB6 200 IB6 400 IB6 600

Figura. 1: Esquema de la colocación de las distintas muestras en la microplaca

B. Posteriormente se añade sobre las muestras los siguientes reactivos

1. 50 µL de O-Dianisidina

2. 50 µL de HETAB

3. 50 µL de agua oxigenada (H2O2)

C. Lectura de la Absorbancia: después de 10 min. se mide la absorbancia a 450 nm de longitud de onda en el lector de placa


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2.2.4 Reactivos

Preparar en el momento de usar, mantener en frío y en oscuridad.

En un matraz aforado preparar 25 ml de o-Dianisidina al 0.067 % p/v en agua destilada (16.75 mg/25 mL). Posteriormente, se divide dicho volumen en dos tubos falcon.

En un matraz aforado preparar 25 ml de HETAB 0,5 % p/v en tampón fosfato pH 6.0 (125 mg/ 25 mL). Posteriormente, se divide dicho volumen en dos tubos falcon.

En un matraz aforado preparar agua oxigenada 0.003% v/v (20 μL /50 mL agua destilada). Posteriormente, se divide dicho volumen en dos tubos falcon.

2.2.5 Expresión de los resultados

Los resultados finales de la práctica se expresan en Unidades de MPO/ mg tejido. Las unidades (U) de actividad enzimática son obtenidas por el incremento de la Absorbancia

( Abs450nm) producido por unidad de tiempo (1 minuto). Por tanto, para determinar las Unidades de MPO/ mg tejido hay que realizar el siguiente

cálculo:

Cálculo de mg tejido: 100 mg tejido x 1µl x 50 l = 0,2 mg tejido

1000 µl 25 µl

Unidades de MPO / mg tejido: Abs450nm

Se expresarán los resultados como la media de los valores obtenidos de las unidades de MPO

(media error) para los dos grupos: SC: control sano y IB: tratados con ibuprofeno.

Dilución de

la muestra

Volumen

final

añadido al

pocillo

Cantidad

de tejido

pesado

0,2 mg tejido x Tiempo (5 min)


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3. Evaluación de la producción de óxido nítrico (NO)

3.1. NO en la inflamación.

En el tracto gastrointestinal, el NO participa en la modulación del tono de las células musculares lisas, tanto en la regulación del peristaltismo intestinal como en el vaciado gástrico. En condiciones fisiológicas, el NO actúa como un mediador endógeno en la reparación y el mantenimiento de la integridad de los tejidos, presentando propiedades gastroprotectoras contra diferentes tipos de agentes agresivos. Sin embargo, altas concentraciones de NO están relacionadas con numerosos procesos patológicos, incluyendo todas las enfermedades gastro-intestinales inflamatorias crónicas, como la úlcera péptica y la gastritis crónica, entre otras.

El NO es un radical libre gaseoso que en los mamíferos se sintetiza a partir del aminoácido L-arginina por acción de la enzima NO sintasa (NOS). Se trata de una reacción molecular compleja que necesita oxígeno molecular y coenzimas como la tetrahidrobiopterina, NADPH, FAD y FMN. Como productos de la reacción aparecen el NO y L-citrulina. En condiciones aerobias, el NO se oxida espontáneamente formando metabolitos más estables como son nitratos y nitritos. Este radical libre gaseoso difunde fácilmente desde las células donde se produce a las células musculares lisas.

Fig. 1. Papel de la NOS en la generación de NO

Existen tres isoenzimas de NOS: inducible (iNOS), neuronal constitutiva (nNOS) y endotelial constitutiva (eNOS). Las isoenzimas constitutivas generan pequeñas cantidades de NO (del orden de nM), mientras que la isoforma iNOS produce cantidades mucho mayores (del orden de µM) que caracterizan algunos estados patológicos en los que se induce la expresión de esta enzima. La iNOS se expresa en macrófagos, hepatocitos, neutrófilos, musculatura lisa y células endoteliales en

respuesta a diversos estímulos inmunológicos como el IF- o el TNF-α. También es inducido por el

propio lipopolisacárido bacteriano a través de la activación del NF-κβ.

L-Arginina+ O2

NADPH

Óxido

Nítrico

Sintasa L-Citrulina+ NO

NO-

3

NO-

2

FAD

FMN

BH4


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Fig 2. Inducción de iNOS en leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos y macrófagos)

3.1. Detección de la concentración de NO. (Matthew y cols. Quantitation of Nitrate and Nitrite in Extracellular Fluids. Methods in Enzymology 1996; 268:237)-246)

La determinación del radical NO por sí sólo, es difícil debido a su naturaleza como radical y su corta vida media. Por lo tanto, la medida de la producción del radical NO se realiza mediante la determinación de productos finales del NO, nitratos y nitritos. Estas medidas se llevan a cabo con la Reacción de Griess, basada en la determinación de nitritos.

Una alícuota de 10 µl de muestra se adiciona a cada pocillo de una placa de ELISA. A continuación, se añaden 5 µl de nitrato reductasa (10 U/ml), 5 µl de tampón HEPES (0,5 M), 5 µl de FAD (0,05 mM), 5 µl de NADPH (1 mM) y 60 µl de agua destilada. Incubamos a 37 ºC durante 15 minutos.

Posteriormente se incorpora 5 µl de láctico deshidrogenada (1500 U/ml) y 5 µl de ácido pirúvico (100 mM), con objeto de consumir el NADPH no utilizado por la nitrato reductasa, y se incuba a 37 ºC durante 5 min.

Se colocan 100 µl de cada una de las muestras de la curva patrón en la columna 1.

Finalmente se añaden 100 µl de Reactivo de Griess, y se incuba 5 minutos a temperatura ambiente, realizando la determinación espectrofotométrica a 490 nm, en el lector de placas.

Los valores de nitritos se interpolan en la pendiente de la curva patrón elaborado y se expresan como concentración (µM) de nitritos en plasma.


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Ejemplo distribución de las muestras en la placa:

1 2 3 4 5

A Blanco Blanco Blanco Blanco Blanco

B P200 CS1 IB1 200 IB1 400 IB1 600

C P100 CS2 IB2 200 IB2 400 IB2 600

D P50 CS3 IB3 200 IB3 400 IB3 600

E P25 CS4 IB4 200 IB4 400 IB4 600

F P10 CS5 IB5 200 IB5 400 IB5 600

G P5 CS6 IB6 200 IB6 400 IB6 600

H P2,5

3.2. Resumen del Protocolo

1. Se añaden 10 µl del blanco y 10 µl las muestras 2. Sobre las muestras se añaden: 5 µl de nitratro reductasa, 5 µl de tampón HEPES, 5 µl de la

solución de FAD, 5 µl de solución de NADPH y 60 µl de agua destilada. 3. Se incuba a 37 ºC durante 5 minutos. 4. Se añaden sobre las muestras: 5 µl de lactato deshidrogenasa y 5 µl de solución de ácido

pirúvico. 5. Se incuba a 37 ºC durante 5 minutos. 6. Se añaden 100 µl de cada una de las muestras de la curva patrón: P200, P100, P50, P25,

P10, P5, P2.5 7. Se añade sobre todos los pocillos 100 µl del Reactivo de Griess 8. Se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos 9. Determinación espectrofotométrica a 490 nm.

3.3. Expresión de los resultados

Los valores de nitritos se obtuvieron de una recta patrón previamente elaborada por regresión lineal. Se expresan como concentración (µM) de nitritos en plasma.


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ESQUEMA CURVA DE PATRÓN PARA NITRITOS

200 µL NaNO2

+

4800 µL PBS

200 µM

100 µM

50 µM

25 µM

10 µM

2.5 µM

5 µM

1000 µL+1000 µL PBS

125 µL+1125 µL PBS

125 µL+1125 µL PBS

125 µL+1125 µL PBS

750 µL+750 µL PBS

375 µL+375 µL PBS

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