Practical Aspects of Diagnostic Electron Microscopy

8/13/2019 Practical Aspects of Diagnostic Electron Microscopy

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TH E YALE JOURNAL OF B I O L O G Y AND MEDICINE 5 3 1 9 8 0 ) , 5 - 1 8

P r a c t i c a l A s p e c t s o f D i a g n o s t i c E l e c t r o n M i c r o s c o p yJUNE D . ALMEIDA

T h e W e l l c o m e R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , L a n g l e y C o u r t , B e c k e n h a m , K e n t , E n g l a n dR e c e i v e d A u g u s t 1 1 , 1 9 7 9

T h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e t e c h n i q u e o f n e g a t i v e s t a i n i n g w a s f i r s t u s e d t o o b t a i n f u n d a m e n t a li n f o r m a t i o n a b o u t v i r u s m o r p h o l o g y , b u t i n r e c e n t y e a r s i t h a s d e v e l o p e d i n t o a p r a c t i c a l m e t h -o d f o r v i r u s d i a g n o s i s . T h e m e t h o d s e m p l o y e d a r e b o t h s i m p l e a n d r a p i d . T h e f o l l o wi n g r e v i e wd i s c u s s e s i n d e t a i l t h e s t e p s t h a t m u s t b e t a k e n t o o b t a i n g o o d e l e c t r o n m i c r o s c o p e p r e p a r a t i o n sa n d i l l u s t r a t e s s o m e o f t h e r e s u l t s t h a t c a n b e o b t a i n e d .

T h e l a s t d e c a d e h a s w i t n e s s e d p r o f o u n d c h a n g e s i n a f i e l d t h a t m i g h t b e d e s c r i b e da s p r a c t i c a l v i r o l o g y . I n t h i s c o n t e x t t h e w o r d p r a c t i c a l h a s t w o c o n n o t a t i o n s : f i r s ti t r e f e r s t o t h e t e c h n i q u e s t h a t a r e b e i n g e m p l o y e d f o r v i r u s d i a g n o s i s , a n d s e c o n d , i tr e f e r s t o t h e g r e a t e r d e g r e e o f a c t i o n t h a t c a n b e a p p l i e d i n c o n t r o l l i n g i n d i v i d u a le p i s o d e s o f v i r a l i n f e c t i o n a n d t h r e a t e n e d d i s s e m i n a t i o n . A s a n e x a m p l e , t h e n e w e rt e c h n i q u e s f o r d e t e c t i n g t h e p r e s e n c e o f h e p a t i t i s B s u r f a c e a n t i g e n H B s A g ) , s u c ha s r a d i o i m m u n o a s s a y a n d p a s s i v e h a e m a g g l u t i n a t i o n , a r e t e c h n i c a l l y s i m p l e a n ds t r a i g h t f o r w a r d b u t o f f e r a d e g r e e o f s e n s i t i v i t y f a r i n e x c e s s o f s u c h o l d e r t e c h n i q u e sa s i m m u n o d i f f u s i o n a n d c o m p l e m e n t f i x a t i o n . T h e s a m e e x a m p l e a l s o i l l u s t r a t e s t h eo t h e r a s p e c t o f t h e t e r m p r a c t i c a l , f o r t h e r e c o g n i t i o n o f a h e p a t i t i s B s u r f a c ea n t i g e n c a r r i e r t r i g g e r s o n e o r m o r e p r e c i s e a c t i o n s : t h e i n d i v i d u a l i s b a n n e d a s ab l o o d d o n o r , a n d , i f h o s p i t a l i s e d , h e w i l l b e h a n d l e d i n s u c h a w a y a s t o m i n i m i s ec o n t a c t w i t h h i s b l o o d . Y e t m o r e p r a c t i c a l i t y w i l l f o l l o w f r o m t h e f u r t h e r d e v e l o p -m e n t o f v i r a l c h e m o t h e r a p y [ 1 ] .

D u r i n g t h e l a s t d e c a d e , a s v i r o l o g y h a s moved f r o m t h e o r e t i c a l i n t e r e s t t o w a r dc l i n i c a l a p p l i c a t i o n , t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e E M ) h a s b e e n a n i m p o r t a n t t o o l f o r t h eb a s i c u n d e r s t a n d i n g o f v i r u s e s a n d , p e r h a p s more i m p o r t a n t , f o r t h e r a p i d a n du n e q u i v o c a l r e c o g n i t i o n o f t h e i r p r e s e n c e . T h e a c h i e v e m e n t s o f t h e e l e c t r o n m i c r o -s c o p e i n t h i s e r a h a v e b e e n many a n d v a r i e d , a n d r a n g e f r o m d e s c r i b i n g a new v i r u sf o r t h e f i r s t t i m e [ 2 ] t o r e c o g n i s i n g t h e p r e s e n c e o f s m a l l p o x v i r u s i n u n e x p e c t e dc i r c u m s t a n c e s [ 3 ] . U n f o r t u n a t e l y , h o w e v e r , a n i m p r e s s i o n h a s d e v e l o p e d t h a t d i a g -n o s t i c e l e c t r o n m i c r o s c o p y i s a c a p r i c i o u s t e c h n i q u e t h a t w o r k s w e l l o n l y i n t h e h a n d so f e x p e r t s . W h i l e t h i s i s n o t t r u e , t h e r e a r e a f e w e s s e n t i a l p o i n t s o f t e c h n i q u e t h a t d on o t s e e m t o b e w i d e l y a p p r e c i a t e d ; h e n c e , t h e l a r g e n u m b e r s o f t e c h n i c a l l y p o o rm i c r o g r a p h s t h a t a p p e a r i n t h e l i t e r a t u r e . T h i s c o n t r i b u t i o n w i l l b e c o n c e r n e d w i t h ad i s c u s s i o n o f t h e p r a c t i c a l s t e p s t h a t m u s t b e t a k e n i n o r d e r t o p r o d u c e a s p e c i m e nt h a t w i l l y i e l d g o o d r e s u l t s i n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e a n d a c o n s i d e r a t i o n o f t h em e a n s b y w h i c h t h e s e r e s u l t s may b e i n t e r p r e t e d .

O n l y o n e m e t h o d o f p r e p a r i n g s p e c i m e n s f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y i s s u i t a b l e f o rIA d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o : J u n e D . A l m e i d a , T h e W e l l c o m e R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , B e c k e n h a m , K e n tBR3 3 BS , E n g l a n dC o p y r i g h t i 1 9 8 0 b y T h e Y a l e J o u r n a l o f B i o l o g y a n d M e d i c i n e , I n c .A l l r i g h t s o f r e p r o d u c t i o n i n a n y f o r m r e s e r v e d .


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PRACTICAL ASPECTS OF DIAGNOSTIC ELECTRON MICROSCOPYT y p e s o f S p e c i m e n sA d i s t i n c t i o n s h o u l d f i r s t b e m a d e b e t w e e n s p e c i m e n s t h a t c a n b e h a n d l e d a n d

t h o s e t h a t s h o u l d b e h a n d l e d . S i n c e t h e t i m e i n v e s t m e n t f o r a s i n g l e s p e c i m e n i ss m a l l , a n y u n i q u e o r u n u s u a l s p e c i m e n s h o u l d b e e x a m i n e d b y n e g a t i v e s t a i n i n g .S i n c e t h e a m o u n t o f m a t e r i a l r e q u i r e d f o r t h e t e c h n i q u e i s a l s o s m a l l , i t i s r a r e l y , i fe v e r , n e c e s s a r y t o u s e a l l o f a s p e c i m e n f o r m i c r o s c o p y . On t h e o t h e r h a n d , l a r g en u m b e r s o f s p e c i m e n s o f a r o u t i n e o r s e m i - r o u t i n e n a t u r e c a n b e e x a m i n e d b u t a r et i m e - c o n s u m i n g a n d f r e q u e n t l y u n n e c e s s a r y . I n t h e p a s t o n l y EM e x a m i n a t i o n w a sa v a i l a b l e f o r i d e n t i f i c a t i o n o f c e r t a i n t y p e s o f s p e c i m e n s , b u t n e w e r t e c h n i q u e s h a v eb e e n d e v e l o p e d w h i c h a r e b e t t e r s u i t e d f o r d e a l i n g w i t h l a r g e n u m b e r s o f s p e c i m e n s .A g o o d e x a m p l e o f t h i s s i t u a t i o n i s s e e n i n t h e h e p a t i t i s f i e l d . A t o n e t i m e , d i a g n o s i so f t h e h e p a t i t i s B a n t i g e n c a r r i e r s t a t e w a s a l w a y s c o n f i r m e d , i f n o t i n d e e d e s t a b -l i s h e d , b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . N o w , r a d i o i m m u n o a s s a y a n d p a s s i v e h a e m a g g l u t i -n a t i o n a r e t h e t e c h n i q u e s o f c h o i c e i n r e a c h i n g a d i a g n o s i s .

A l m o s t a n y b i o l o g i c a l m a t e r i a l w i l l y i e l d a s p e c i m e n t h a t c a n b e e x a m i n e d b y EM.T h e l i m i t a t i o n s o f t h e t e c h n i q u e a r e s e t b y t w o m a i n f a c t o r s : t h e a b s o l u t e a m o u n t o fv i r u s p r e s e n t i n a s p e c i m e n a n i d t h e r a t i o o f t h i s v i r u s t o c o n t a m i n a t i n g , o rb a c k g r o u n d , m a t e r i a l . A c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 5 v i r u s p a r t i c l e s i n u r i n e w i l l y i e l d a g o o ds p e c i m e n a s t h e r e i s l i t t l e c o n t a m i n a t i n g m a t e r i a i p r e s e n t ; h o w e v e r , t h e s a m ec o n c e n t r a t i o n o f v i r u s i n s p u t u m w o u l d a l m o s t c e r t a i n l y n o t b e s u i t a b l e b e c a u s e o fb a c k g r o u n d m a t e r i a l . T h e a b s o l u t e a m o u n t o f v i r u s r e q u i r e d f o r s u c c e s s a l s o v a r i e sw i t h t h e v i r u s t y p e . F o r e x a m p l e , 1 0 5 p a r t i c l e s o f a s m a l l c u b i c v i r u s w o u l d n o t b ev i s u a l i s e d , u n l e s s t h e m o r e s e n s i t i v e t e c h n i q u e o f i m m u n e e l e c t r o n m i c r o s c o p y I E M )i s u s e d . T h i s e n t a i l s a d d i n g s p e c i f i c a n t i s e r u m t o t h e v i r u s - c o n t a i n i n g s p e c i m e n s ot h a t a n t i g e n - a n t i b o d y a g g r e g a t e s a r e f o r m e d [ 6 ] . T h e s m a l l c u b i c v i r u s p r e s e n t i n t h ef o r m o f i m m u n e c o m p l e x e s i s much m o r e r e a d i l y v i s u a l i s e d t h a n i t s u n a g g r e g a t e dc o u n t e r p a r t . I n d e e d , i n a n e x p e r i m e n t c a r r i e d o u t o n l o w - g r a d e h e p a t i t i s B a n t i g e np o s i t i v e c a r r i e r s , i m m u n e e l e c t r o n m i c r o s c o p y h a d a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e s e n s i t i v -i t y a s r a d i o i m m u n o a s s a y . N e v e r t h e l e s s , f o r t h e m a j o r i t y o f v i r u s e s , a c o n c e n t r a t i o n o f1 0 6 v i r i o n s / m l o f s t a r t i n g m a t e r i a l i s n e e d e d i f t h e p a r t i c l e s a r e t o b e v i s u a l i s e d b yn e g a t i v e s t a i n i n g . F o r t u n a t e l y , b o t h v i a b l e a n d n o n - v i a b l e p a r t i c l e s a r e v i s u a l i s e d i nt h e EM a n d a s p e c i m e n c o n t a i n i n g 1 0 6 / m l p h y s i c a l p a r t i c l e s m ay c o n t a i n a s f e w a s1 0 3 i n f e c t i o u s v i r i o n s p e r m l .

SPECIMEN PREPARATIONG e n e r a l C o n s i d e r a t i o n s

T h e f i n a l s t e p i n p r e p a r i n g a n e g a t i v e l y s t a i n e d g r i d i s t o a l l o w s p e c i m e n a n d s t a i n ,e i t h e r t o g e t h e r o r c o n s e c u t i v e l y , t o d r y d o w n o n t o t h e g r i d . H o w e v e r t h i n , t h e l a y e rh a s a t h i r d d i m e n s i o n a n d c o n c e n t r a t i o n o f m a t e r i a l o c c u r s i n t h e d r y i n g d o w n p h a s e .I t i s t h e r e f o r e o f t h e g r e a t e s t i m p o r t a n c e t o m i n i m i s e o r e l i m i n a t e a n y l o w m o l e c u l a rw e i g h t p r o t e i n s a n d o r g a n i c s a l t s p r e s e n t . O r g a n i c s a l t s a p p e a r a s c r y s t a l l i n es t r u c t u r e s w h i c h r u i n a s p e c i m e n b u t a r e e a s i l y r e c o g n i s e d ; l o w m o l e c u l a r w e i g h tm a t e r i a l d r i e s down t o a n a m o r p h o u s l a y e r t h a t c a n o b s c u r e a p o s i t i v e s a m p l ew i t h o u t t h e r e c o g n i t i o n t h a t t h i s h a s h a p p e n e d . B e c a u s e o f t h e s e c o n s i d e r a t i o n s t h e r ea r e t h r e e b a s i c r u l e s t h a t a p p l y t o t h e p r e p a r a t i o n o f a l l s p e c i m e n s f o r n e g a t i v es t a i n i n g .

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n o t a d i r e c t c l i n i c a l s p e c i m e n b u t r e p r e s e n t s o n e g r o w t h c y c l e i n t h e l a b o r a t o r y .Simple c e n t r i f u g a t i o n o f t h e a l l a n t o i c f l u i d f o r o n e h o u r a t 1 5 , 0 0 0 g f o l l o w e d b y t h estandard method o f s t a i n i n g i s a l l t h a t i s r e q u i r e d f o r p r e p a r a t i o n P l a t e 7 .

S o l i d T i s s u e . T h i s w i l l vary f r o m v e r y s o f t t i s s u e s u c h as b r a i n t o v e r y h a r dspecimens suchaswarts tis besttopreparethesedifferent tissue typesby s e p a r a t et e c h n i q u e s .

S o f t T i s s u e . Ma k e a 1 0 p e r c e n t s u s p e n s i o n o f t h e t i s s u e i n d i s t i l l e d w a t e r u s i n g aglass-teflo n Tenbroek-type h o m og e nis e r . Forvery soft tissue such brain afe wstrokesofthepestle willsuffice whilefirmertissue suchasiver willneedmoree f f o r t .orreasonsofefficiencyandsafety, scabsfromskinlesions arebesthandled by t h i st e c h n i q u e P l a t e 8 ) .

H a r d T i s s u e . C u t t h e t i s s u e i n t o s m a l l f r a g m e n t s a n d p l a c e i n a g l a s s o r p o r c e l a i nmortarwithaittlesilversand. amallamountfdistilledwaterandgrind withthe p e s t l e u n t i l t h e t i s s u e i s f u r t h e r f r a g m e n t e d , a d d more wa t er a n d c o n t i n u eg r i n d i n g u n t i l a r e l a t i v e l y s m o o t h s u s p e n s i o n i s a c h i e v e d P l a t e 9 ) .othtypes ofhomogenatecannowehandledin thes mem a n n e r . Clarify fo ra p p r o x i m a t e l y 1 0 m i n u t e s i n a b e n c h c e n t r i f u g e , t h e n c e n t r i f u g e t h e s u p e r n a t a n t f o ro n e h o u r a t 1 5 , 0 0 0 g . P r o c e e d b y t h e t e c h n i q u e f o r s t a n d a r d s t a i n i n g .

T i s s u e S c r a p i n g s e . g . , c o n j u n c t i v a l c e l l s ) . S p e c i m e n s s u c h a s t h i s u s u a l l y c o n t a i nverylittlematerialandtheyarebesthandledby diluting withsufficient distilled watertodisrupt any cellspresent andthenstaining by the rapid method. It might beremarkedherethattheelectronmicroscopist is frequently in direct competition w i t hthebiologically orientedvirologistwhos anxioustomakeansolate fromthesamematerialWhenhespecimenamounts p l e n t i f u l , noonflict o c c u r s, separatesamplescanbehandledindividually butaproblem arises whenonly smallamountsareavailableThemostpractical solutionistopersuade thevirologist interested incellculturetechniques undertakehispartoftheprocedure using sterile precautionsa n d t h e n t o h a n d over t h e r e m a i n d e r t o t h e m i c r o s c o p i s t .

C e r e b r o s p i n a l F l u i d C S F ) . D i l u t e w i t h e q u a l p a r t s d i s t i l l e d wa t er a n d s t a i n b yt h e d i r e c t , o n t h e g r i d , r a p i d p r o c e d u r e .Sputum. T h i s i s p r o b a b l y t h e m o s t d i f f i c u l t o f s p e c i m e n s f o r t h e e l e c t r o n

microscopist. It is very difficulttoget rid ofassociatedmucousandthis results introublesomebackground materialthatcanobscureanyvirus presentandreducestheresolutionthatcanbeobtained Inspite oft h i s , suchspecimensmustoccasionally behandled thefollowing technique is r e c o m m e n d e d . Dilutespecimenoneparttofourwithphosphate-buffered saline PBS)andproduceashomogeneousasuspensionaspossible usingaTenbroek-type h o m o g e n i s e r . Clarify thesuspension using thebenchcentrifuge andthenpellet virus foronehourat1 5 , 0 0 0 g . Stainby the standardm e t h o d .ImmuneE k e c t r o n Microscopy IEM . ofthepreviouslymentionedspecimenscanbeusedforimmuneelectronmicroscopy byadding specific antiserabetweenthesteps ofclarification c e n t r i f u g a t i o n . Insomei n s t a n c e s , where there isclarificationstep, t antiserum is addeddirectlytothecrudev i r u s - C e l l s u s p e n s i o n .hemostimportantfactortobeconsideredin producingaspecimenforimmuneelectronmicroscopy theproportion ofv i r u s , orvirus a n t i g e n , toantibody in themixtureThefinalmixtureshouldbe in the equivalence rangesothat reasonablysizedcomplexes will formed Toomuchortooittle antibodyleadstoconditionso f a n t i g e n o r a n t i b o d y exc ess w i t h r e s u l t i n g l o s s o f complex f o r m a t i o n [ 6 ] .Sinceclinicalsamples willcontainanunknownuantity ofvirus theantiserum

1 0 JUNE D. LMEI


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PLATE 4 . S e r a r e q u i r ea w a s h i n g s t e p b e f o r e t h e ya r e e x a m i n e d s i n c e t h e yc o n t a i n l a r g e amou nt s o fl o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o -t e i n s . A f t e r w a s h i n g ,HBsAg c a n b e s e e n a g a i n s ta n a l m o s t s t r u c t u r e - f r e e

~ b a c k g r o u n d . x 2 2 0 , 0 0 0 .

PLATE 5 . V e s i c l e f l u i d c o n t a i n s a c o n s i d -e r a b l e amount o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o -t e i n . T h i s l e a d s t o a l o s s o f c o n t r a s t b u t d o e sn o t p r e v e n t v i s u a l i s a t i o n o f t h e v i r u s . T h i sm i c r o g r a p h s h o w s t w o v a r i c e l l a v i r u s p a r t i -c l e s o n e i n t a c t a n d o n e b r o k e n , i n v e s i c l ef l u i d . x 1 6 5 , 0 0 0 .

6PLATE 6 . T h e m e t h o d o f p r o -c e s s i n g t i s s u e c u l t u r e c e l l s i s s i m p l e

b u t c a n y i e l d p r e p a r a t i o n s a l l o w i n gg o o d r e s o l u t i o n o f p a r t i c l e s . T h ei c o s a h e d r a l c o n s t r u c t i o n o f t h e i n n e rc a p s i d c a n b e s e e n i n t h e h e r p e ss i m p l e x p a r t i c l e s h o w n h e r e .x 1 6 5 , 0 0 0 .


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