PRACTICA No. 1

RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS

OBJETIVO:

Distinguir y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el tejido vegetal por medio de pruebas químicas de coloración y precipitación.

MARCO TEÓRICO

Metabolitos Primarios:

Son los productos químicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo vital de todo ser vivo, son: los carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos.

Metabolitos Secundarios:

Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido presentando una distribución restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonomía. Su ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patógenos, predadores, cambios térmicos o l umínicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecíficos. El metabolismo secundario es una característica fundamental de la especialización, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante para la célula pero sí para el organismo como un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los procesos fisiológicos del organismo. Algunos metabolitos secundarios son “residuos bioquímicos”, es decir, productos de activ idad enzimática de substratos no apropiados o productos de destoxificación o desecho de importancia para la supervivencia y la buena condición de los organismos. Con pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de cinco grupos, de acuerdo con su base biosintética: fenilpropanos, acetogeninas, terpenoides, esteroides y alcaloides.

Reconocimientos de Metabolitos:

El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas fotoquímicas preliminares, las cuales son una prueba química de caracterización consistente en una reacción química que produce alteración rápida en la estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificación de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la formación de un ad ucto o un complejo, lo cual da por resultado una manifestación sensible como el cambio de un color, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dándonos indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular

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1. RECONOCIMIENTO DE ALCALOIDES.

Se desmenuzaron 10 g. de hojas de tabaco (Nicotiana tabacum) en un matraz Erlenmeyer con 100 mL. de HCL al 5%, este se calentó en baño María durante 5 minutos. Posteriormente este se enfrió y filtro.

De la muestra resultante se vertieron 2 mL. en 2 tubos de ensaye, a uno de ellos se le adicionaron 2 gotas de reactivo de Dragendoff, y al otro 4 gotas de reactivo de Mayer.

En ambos tubos se observó turbidez y precipitación de la muestra a analizar.

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HCl 5%

Hojasde

tabaco

HCl 5% + HojasDe tabaco

HCl 5% + HojasDe tabaco

MUESTRA CONREACTIVO

DE DRAGENDOFF

MUESTRASIN

REACTIVO

MUESTRA CONREACTIVODE MAYER

2. RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES, LEUCANTOCIANIDINAS Y CARDIOTÓNICOS.

3. ENSAYO DE FLAVONOIDES.

Para el reconocimiento de Flavonoides se colocaron 10 g. de pétalos de rosas amarillas (Meilland, Gioia) desmenuzada en un matraz Erlenmeyer con 100 mL. de alcohol etílico, con agitación y en calentamiento a baño María.

Posteriormente se enfrió y filtro, de este filtrado se obtuvieron 90 mL., como se detectó presencia de clorofilas al filtrado se le añadieron 90mL. de solución de acetato de plomo al 4% en ácido acético al 0.5%, , se agito y dejo reposar 15minutos.

Para el reconocimiento a esta muestra se le adicionaron limaduras de magnesio a un vaso de precipitados y 20 mL. del filtrado obtenido. Para después agregar por goteo HCl concentrado.

Con la aparición de colores naranja en la muestra se confirmó la presencia de Flavonoides.

3

EtOH

Pétalos de

rosas

EtOH + Pétalosde rosas

Acetato de plomo al 4% en ácido acético al 0.5%

EtOH + Pétalosde rosas

4. ENSAYO DE LEUCANTOCIANIDINAS

Para este ensayo, se utilizó la preparación del filtrado es la misma técnica que para el filtrado de Flavonoides.

La identificación se hizo por medio de añadir a un tubo de ensayo 2 mL. del filtrado , para después agregarle 1 m. de Ácido clorhídrico concentrado , calentar durante 15 minutos a baño María y observar la coloración de la muestra.

4

FiltradoHClconcentrado

5. ENSAYO DE CARDIOTÓNICOS.

Así mismo para la obtención de este filtrado la técnica de preparación es la misma filtrado de Flavonoides y Leucantocianidinas, la única diferencia es que se utilizaron 10 g. de hojas de azuceno de la Habana (Nerium oleander) para su preparación.

Para la identificación se colocó 1 mL. de filtrado en un tubo de ensayo, al cual se le añadió el reactivo de Kedde.

En la muestra aparecieron tonalidades más intensas al de la muestra original, lo cual indico una prueba positiva de cardiotónicos en la muestra.

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Reactivode

KeddeFiltrado

Filtradode

muestra

Muestracon

reactivo de Kedde

6. ENSAYO DE SAPONINAS.

En este ensayo se utilizaron hojas de penca de sábila (Aloe arborescens), la cual se desmenuzo con un mortero.

El resultante de esta muestra se filtró con agua.

Para la identificación de esta muestra solo bastó con poner 4 mL. del destilado obtenido y agitarlo vigorosamente, Al hacerlo se formó una espuma, la cual denota la presencia de Saponinas en ella.

6

7. ENSAYO PARA TANINOS.

Se tomaron 10 g. de hojas de guayaba para desmenuzarlas en un mortero junto con 50 mL. de agua, para su filtrado después.

Se tomó 1 mL. del filtrado en un tubo de ensayo, al cual se le adiciono 1 Ml. de reactivo gelatina-sal. Se desechó el sobrenadante, el precipitado se redisolvió en 2 mL. de Urea 10M.

Finalmente se le adicionaron 4 gotas de cloruro férrico al 10%.

Ya que al agregar el reactivo de gelatina se formó un precipitado y al agregar el cloruro férrico se notaron unos tonos de azules a negros, se confirma la presencia de Taninos.

7

2 mL.de

Urea

Filtrado

ReactivoDe

Gelatina-sal

Sobrenadante

Hojas de guayaba

+Agua

8. ENSAYO DE TRITERPENOIDES Y / O ESTEROIDES

En un vaso de precipitado con 50 mL de Diclorometano se colocaron 10 g. de semilla de soya triturada previamente en un mortero, se agitó y se extrajo el líquido por medio de filtración.

Ya obtenido el filtrado, a 1 mL. de este se colocó en un tubo de ensayo, adicionándole 1 mL. de Anhídrido acético. Posteriormente para su identificación se le adicionaron 3 gotas de Ácido sulfúrico, se formo un color verde, por lo que la muestra es positiva a contener esteroides

8

50 mL.De

Diclorometano

Semillas de Soya

+Diclorometano

1 mLAnhídridoAcético

Filtrado

+AnhídridoAcético

ÁcidoSulfúrico

9. ENSAYO DE QUINONAS.

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Se colocó 1 g. de muestra seca y molida de Ruibarbo en un sistema a reflujo junto con 25 mL. de HCl al 5%, durante 5 minutos. Se dejó enfriar y se filtró, tomándose 5 mL de la fase acuosa en un tubo de ensayo.

En este tubo con 5 mL. de filtrado acuoso, se le añadió 1 mL de un a mezcla de Peróxido de hidrógeno al 20% y 1 mL. de Ácido Sulfúrico al 50%. Posteriormente se calentó durante 15 minutos a baño María. Pasado este tiempo se enfrió y se le añadió 5 mL. de Tolueno y se agito sin emulsionar.

Al terminar de agitar se le añade 1 mL. de mezcla de NAOH al 5% con Amoniaco al 2%, se vuelió a agitar.

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1 g. deRuibarbo

+25 ml. de HCl 5%

Reflujode

Ruibarbo

+HCl 5%

Peróxido de hidrógeno al 20%

+1 mL. de Ácido Sulfúrico al 50%

TOLUENO

FILTRADO

Ya que en la fase acuosa se tornó de una coloración rosada, se confirmó la presencia de Quinonas en la muestra

10. RECONOCIMIENTO DE ANTOCIANINAS

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NAOH al 5%

+Amoniaco al 2%,

En un matraz Erlenmeyer se colocaron 100 g. de Repollo morado (Brassica oleracea) junto con 200 mL. de agua, poniéndolos a calentar hasta la ebullición de 5 minutos, posteriormente se enfrió la muestra y se filtró.

Para la identificación, 2 mL. del filtrado se adicionaron a dos tubos de ensayo, a uno se le añadió 1 mL. de NaOH diluido y a otro Ácido Sulfúrico, se vieron las coloraciones en ambos tubos y se notó que fueron diferentes, esto es característica de los compuestos que contienen Antocianinas.

11. RECONOCIMIENTO DE CUMARINAS

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100 g.de

Brassica oleracea

Agua

NaOHDiluido

Ácido SulfúricoDiluido

En un tubo de ensayo, se colocó 1 g. de muestra macerada y 3 mL. de Etanol, se cubrió la muestra con un papel filtro, y una liga, posteriormente se le adiciono por el mismo papel filtro 3 gotas de NaOH diluido, para después calentarlo durante 5 minutos y al finalizar, enfriar la muestra.

Para su identificación se retiró el papel filtro y se vio bajo luz ultravioleta, se notó una coloración azul, la cual identifica Cumarinas en la muestra.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

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NaOHDiluido

Etanol

1. RECONOCIMIENTO DE ALCALOIDES

Como se pudo observar en el procedimiento experimental al agregar los la muestra si precipito como lo menciona Alfonso R (2003)“…Estas sustancias precipitan por el agregado de una o más de los siguientes reactivos (con algunos forman algunos compuestos químicos definidos que se utilizan para su identificación): yoduro de mercurio y potasio (reactivo de Mayer)…yoduro de potasio y bismuto(reactivo de Dragendorff…”1

2. RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES, LEUCANTOCIANIDINAS Y CARDIOTÓNICOS.

3. ENSAYO DE FLAVONOIDES

Posterior a las reacciones realizadas a ña muestra empleada, se notó la aparición de colores naranja en la muestra se confirmó la presencia de Flavonoides, como lo menciona Vejarano et.al (2005) “…La aparición de colores naranja, rosado, rojo, o violeta es prueba positiva para la existencia de flavonoides en la muestra…”2

4. ENSAYO DE LEUCOANTOCIANIDINAS

Al observar la coloración de la muestra después de los procesos a los cuales fue sometida, tomo una tonalidad roja, lo cual nos indica que la muestra si fue positiva a Leucoantiocianidinas, ya que Ruíz Reyes (2010), menciona que”… En la reacción de Rosenheim, el ácido clorhídrico produce una deshidratación del grupo hidroxilo de la posición 3 de la Leucoantiocianidina y catequina, que es favorecida por la temperatura (100ºC), además se produce la ruptura del anillo heterocíclico. La deslocalización de 12 e- y 2 e- n, por todo el metabolito, produce la coloración roja3

5. ENSAYO DE CARDIOTÓNICOS.

1 ALFONSO R; “Remington Farmacia”, Volumen1 Edit. Medica Panamericana, 20 edición, Montevideo, Uruguay, 2000, pp 488-

2 Vejarano G.T. et.al., Tamizaje fotoquímico y cuantificación de flavonoides totales de conservas de esparrago blanco asparagus officinalis, Universidad Nacional Agraria De La Selva, Perú, 2005, pp 43 Ruíz S et. al., Identificación preliminar de los metabolitos secundarios de los extractos acuosos y etanólicos del fruto y hojas de Morinda citrifolia L. “noni” y cuantificación espectrofotométrica de los flavonoides totales, UCV SCIENTIA 2(2), pp 20,2010

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Para la prueba de la muestra para Cardiotónicos, se pudo comprobar al agregar el reactivo de Kedde, la existencia de estas como lo menciona Martínez et.al., (2008) “…La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es prueba positiva de la existencia de cardiotónicos en la muestra…”4

6. ENSAYO PARA SAPONINAS.

En el ensayo para saponinas los resultados de la muestra fueron positivos a este metabolito, ya que al agitar se formó bastante espuma como lo menciona Martínez et.al. (2008) “Agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml de filtrado acuoso, vigorosamente durante un minuto. La formación de una espuma abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra. …”5

7. ENSAYO PARA TANINOS.

En esta detección de taninos en la muestra preparada a partir de hojas de guayaba, se detectaron Taninos, ya que al usar el reactivo gelatina-sal, se obtuvo el precipitado blanco que menciona Carvajal (2009), “…la prueba más empleada para la detección de este grupo de metabolitos secundarios emplea el reactivo de gelatina-sal, el cual produce un precipitado blanco en presencia de taninos…”6

8. ENSAYO DE TRITERPENOIDES Y / O ESTEROIDES

A la muestra en cuestión adicionada con Anhídrido acético. para su identificación y Ácido sulfúrico, así como la formación de un color verde, en las muestras que contienen esteroides, se le conoce como Reacción de Liebermann–Burchard. “…THE Liebermann–Burchard reaction for steroids, which consists in adding a few drops of acetic anhydride and concentrated sulphuric acid to the chloroform solution of the sterol, is not only used as a qualitative test for it but also for its quantitative estimation in blood, etc. Formation of coloured halochromic sulphate of ketone was

suggested by Wieland and Weil in explaining this reaction …”7

9. ENSAYO DE QUINONAS

4 Martínez M. A., Manual de prácticas de laboratorio de farmacognosia y fotoquímica 2008, Universidad De Antioquia, Medellín, 2008, pp 11

5 Idem.

6Carvajal R., Análisis fotoquímico preliminar de hojas, tallos y semillas de Cupatá (strych nos schultesiana krukoff), REVISTA COLOMBIA FORESTAL, Vol. 12, pp 165, Diciembre 20097 NATH M. C.; “Liebermann-Burchard Reaction for Steroids”, NATURE, 157, PP 103, (1946)

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Ya que en la fase acuosa se tornó de una coloración rosada, se confirmó la presencia de Quinonas en la muestra, como lo menciona Martínez (2008), “…Añadirle 1 ml de una solución de NaOH al 5% con amoniaco al 2%. Agitar sin emulsionar. Si la capa acuosa toma una coloración rosada a roja intensa es prueba positiva de la presencia de quinonas en la muestra.…”8

10. RECONOCIMIENTO DE ANTOCIANINAS

En el reconocimiento de la Antocianinas, se identificaron los cambios de color con la base y el ácido según el pH de la muestra como lo enuncia Guerrero (2008), “…Añadir 1 ml de NaOH diluido. Observar el color formado. En otro tubo de ensayo colocar 2 ml de filtrado. Añadir unas gotas de acido mineral diluido. Observar el color formado. Las antocianinas se reconocen por formar diferentes colores a diferentes pH.…”9

11. RECONOCIMIENTO DE CUMARINAS

Para su identificación se retiró el papel filtro y se vio bajo luz ultravioleta, se notó una coloración amarilla, la cual identifica Cumarinas en la muestra, como lo menciona Martínez (2008) “…Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparición de una coloración fluorescente que puede ser: verde, amarilla, roja en el papel filtro. …”10

CONCLUSIONES

8 Ibidem Martínez M. A, pp. 12

9 Guerrero V.T., Paredes S. T., Tamizaje fotoquímico de hojas y semillas de (bixa orellana), Universidad Nacional Agraria de La Selva, 2008, pp.13

10 Ibidem Martínez M. A, pp. 13

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De acuerdo con los ensayos de reconocimiento realizados y a la vista de los resultados obtenidos se pueden llegar a las siguientes conclusiones:

1) Los reactivos de Dragendorff y Mayer son ideales para Para la determinación de si un compuesto posee Alcaloides o no. Así como reconocer que la planta de tabaco contiene este metabolito secundario su molécula.

2) Para comprobar si en un producto natural están presentes Flavonoides, se pueden usar limaduras de magnesio y HCl, y así ver los cambios de coloración en la muestra, previa su preparación con alcohol etílico.

3) En una muestra vegetal tratada con alcohol etílico, al añadir ácido clorhídrico se puede valorar si hay Leucoantiocianidinas en dicha muestra, como en el caso de pétalos de rosas amarillas.

4) El reactivo de Kedde, es un buen ayudante para precisar la existencia de Cardiotónicos en una muestra vegetal

5) Se puede declarar que en una muestra hay presencia de Saponinas, con solo poner una cantidad de esta con agua en un recipiente tapado y agitar vigorosamente, hasta que se forme una espuma.

6) La formación de precipitados verdes, azules o negros en una muestra vegetal, tras someterla a la técnica de determinación de taninos con gelatina-sal, es positiva para la identificación de este metabolito.

7) Para precisar la presencia de esteroides en una muestra de origen vegetal, se puede utilizar la reacción de Liebermann–Burchard.

8) Si en una muestra de origen vegetal se observa una coloración rosada a roja intensa

posterior a ser tratada por la técnica de determinación de quinonas a base de NaOH junto con amoniaco, se puede decir que es positiva a este metabolito secundario.

9) Las Antocianinas se reconocen por producir diferentes colores a diferentes pH , al ser tratadas por la técnica a base de NaOH.

10) Para el reconocimiento de Cumarinas en una muestra de origen vegetal , se puede utilizar la Técnica de luz ultravioleta posterior a ser tratada con etanol y NaOH.

BIBLIOGRAFÍA

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ALFONSO R; “Remington Farmacia”, Volumen1 Edit. Medica Panamericana, 20 edición, Montevideo, Uruguay, 2000, pp 488-

Carvajal R., Análisis fotoquímico preliminar de hojas, tallos y semillas de Cupatá (strych nos schultesiana krukoff), REVISTA COLOMBIA FORESTAL, Vol. 12, pp 165, Diciembre 2009

Guerrero V.T., Paredes S. T., Tamizaje fotoquímico de hojas y semillas de (bixa orellana), Universidad Nacional Agraria de La Selva, 2008, pp.13

Martínez M. A., Manual de prácticas de laboratorio de farmacognosia y fotoquímica 2008, Universidad De Antioquia, Medellín, 2008, pp 11

NATH M. C.; “Liebermann-Burchard Reaction for Steroids”, NATURE, 157, PP 103, (1946)

Ruíz S et. al., Identificación preliminar de los metabolitos secundarios de los extractos acuosos y etanólicos del fruto y hojas de Morinda citrifolia L. “noni” y cuantificación espectrofotométrica de los flavonoides totales, UCV SCIENTIA 2(2), pp 20,2010

Vejarano G.T. et.al., Tamizaje fotoquímico y cuantificación de flavonoides totales de conservas de esparrago blanco asparagus officinalis, Universidad Nacional Agraria De La Selva, Perú, 2005, pp 4

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