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Práctica No 6

Tinción de Gram

11/12/2015

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INTRODUCCIÓN

La tinción de Gram, también conocida como coloración de Gram, es una técnica

de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de

las bacterias. Fue diseñada por Christian Gram, un científico danés, en el año

1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible

diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y

clasificarlas. La prueba resultó todo un éxito y pronto se convirtió en una técnica

muy útil no solo para el estudio de las bacterias, sino también para poder

identificarlas rápidamente en una infección y seleccionar el antibiótico más

adecuado para tratarla.

La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de

cualquier origen que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los

colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos,

se realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el colorante

permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido. En el primer caso

permanecería el color morado, y se trataría de bacterias Gram positivas y, en el

segundo, la pared tendría un color rosado, y serían Gram negativas.

La tinción de Gram también tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no

tienen pared, como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrán identificar, al

igual que los virus. En esos casos la tinción no coloreará ningún germen. Otro

aspecto negativo de la prueba es que no puede identificar el tipo exacto de

bacteria responsable de la infección. Para ello es necesario realizar un cultivo

microbiológico que se acompaña siempre de un antibiograma para estudiar de

forma exacta el antibiótico más efectivo.

Materiales y reactivos

Material

Microscopio.

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Portaobjetos y cubreobjetos.

Asa bacteriológica.

Mechero.

Reactivos

Colorantes de Gram.

Cultivo de la práctica anterior.

Aceite de inmersión.

Metodología

Preparación del portaobjeto

Limpiar y desengrasar los portaobjetos.

Marcar cada portaobjetos para identificar la tinción, microorganismo y

autor: rotular (rotulador resistente al agua) por el lado opuesto al de la

preparación; pasar lápiz graso sobre el rótulo.

Preparación de la muestra

Disposición de una alícuota de la muestra sobre el portaobjetos (manejar

los cultivos en condiciones de esterilidad.)

Si se parte de cultivos en medio sólido, una pequeña cantidad de

células será suspendida en una gota de agua.

Extensión de las bacterias sobre la superficie del portaobjetos

(aproximadamente un centímetro cuadrado). La extensión no contendrá

demasiadas células.

Desecación de la muestra al aire o con un calentamiento suave

Fijación: adhesión de las bacterias a la superficie del portaobjetos:

Ayudarse de unas pinzas para pasar la cara inferior del portaobjetos por

la llama del mechero. Son suficientes dos o tres pases rápidos.

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Tinción de Gram

PASOS GRANPOSITIVAS GRAMNEGATIVAS

Colorante principal

cristal violeta

Violeta Violeta

Mordiente: lugol Violeta Violeta

Decolorante: alcohol

cetona

Violeta Transparente

Colorante de contraste:

safranina

Violeta rojo

1. Hacer frotis de cada uno de los cultivos, dejar secar al aire.

2. Fijar el frotis al color.

3. Cubrir el frotis con cristal violeta, dejarlos 1 min. Escurrir el colorante y lavar

con agua.

4. Cubrir el frotis con lugol, dejarlo 1 min, escurrir y lavar con agua.

5. Decolorar el frotis con alcohol – acetona, de 5 a 15 seg. Escurrir y lavar con

agua.

6. Cubrir con safranina y dejarlo por 30 seg, escurrir y lavar con agua.

7. Dejar secar el frotis al aire y observar.

Observación microscópica de los frotis.

Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con

el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para la observación con el

objetivo de 100X, colocar previamente una pequeña gota de aceite de

inmersión sobre la preparación.

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Resultados, discusión y observaciones

Las bacterias Gram positivas se verán violetas debido al cristal violeta atrapado

en sus gruesas paredes celulares. Las bacterias Gram negativas se verán

rosadas o rojas, ya que el violeta se enjuagó a través de las delgadas paredes

celulares y luego ingresó a ellas el colorante secundario rosado.

E. coli (bacilos rosa) y S., aureus (cocos violeta).

Identifica bacterias Gram positivas por su forma. Las bacterias se clasifican

más a fondo por su forma bajo el microscopio, más comúnmente como cocos

(esféricas) o varas (cilíndricas). Estas son algunas bacterias Gram positivas

(teñidas de violeta) comunes clasificadas por forma:

Los cocos Gram positivos generalmente son ya sea estafilococos (que

significa cocos en grupos) o estreptococos (que significa cocos en cadenas).

Las varas Gram positivas incluyen los bacilos y las bacterias Clostridium,

Corynebacterium y Listeria. Las varas de la especie Actinomyces a menudo

tienen ramas o filamentos.

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Identifica bacterias Gram negativas. Las bacterias Gram negativas (teñidas

de rosado) a menudo se clasifican en tres grupos. Los cocos son las bacterias

esféricas, las varas son las bacterias largas y delgadas, y las varas cocoides

están en un punto intermedio. •Los cocos Gram negativos son más

comúnmente la especie Neisseria.

•Las varas Gram negativas incluyen las bacterias E. coli, Enterobacter,

Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas y

muchas otras. La bacteria Vibrio cholerae puede aparecer como varas normales

o varas curvas

•Las varas Gram negativas "cocoides" (o "cocobacilos") incluyen la Bordetella,

Brucella, Haemophilus y Pasteurella.

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CUESTIONARIO.

1. ¿Por qué es importante fijar la flama?

Por qué lo que esta operación pretende es que los microorganismos se

adhieran al portaobjetos por coagulación de sus proteínas plasmáticas

mediante calor.

2. Investiga cuáles son las estructuras celulares o moléculas responsables de la

tinción simple realizada. Da ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.

Las estructuras responsables de la tinción simple son: Cloroplastos colorantes:

Clorofila a y c, Carotenos, Xantófilas, (fucoxantina), Ficobilinas

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen

con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de

lactofenol).

3. ¿Qué es el aceite de inmersión? ¿Por qué se utiliza?

La función del aceite de inmersión es restringir el movimiento de la muestra,

además de evitar el rozamiento entre el cubreobjetos y el objetivo,

generalmente se utiliza cuando se observa con el objetivo de 100X. otra función

del aceite de inmersión es evitar que la luz se desvié, al contrario lo que se

pretende es que la luz llegue concentrada hacia la muestra.

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4. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?

La tinción de Gram también tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no

tienen pared, como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrán identificar, al

igual que los virus. En esos casos la tinción no coloreará ningún germen. Otro

aspecto negativo de la prueba es que no puede identificar el tipo exacto de

bacteria responsable de la infección.

5. ¿En que se basa la tinción de Gram?

La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de

cualquier origen que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los

colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos,

se realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el colorante

permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido.

6. ¿De qué color se tiñen los Gram positivos y los Gram negativos?

Las bacterias Gram positivas se verán violetas debido al cristal violeta atrapado

en sus gruesas paredes celulares. Las bacterias Gram negativas se verán

rosadas o rojas, ya que el violeta se enjuagó a través de las delgadas paredes

celulares y luego ingresó a ellas el colorante secundario rosado.

CONCLUSIONES:

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REFERENCIAS:

Microbiología clínica aplicada; Pedro García Martos, María Teresa Fernández del Barrio, et

al.,1996.

Pruebas médicas tinción de Gram (http://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/tincion-

de-gram-13399)

http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones/

metodos_tincion#__doku_preparacion_del_portaobjetos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8385/

http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2

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