Positive and Negative Transcriptional Regulation of the …strbio.biochem.nchu.edu.tw/classes/lab seminar/frank/wu... · 2002. 11. 29. · Entner-Doudoroff Pathway (EDP) D-glucose

N. Peekhaus and T. Conway

Journal of Bacteriology 1998 180?1777-1785

中興大學生化所吳柏達

Positive and Negative Transcriptional Regulation of the Escherichia coli Gluconate Regulon Gene gntT by GntR and the Cyclic AMP (cAMP)-cAMP Receptor Protein Complex

Entner-Doudoroff Pathway (EDP)

D-glucoseglucose oxidase

D-gluconate

D-gluconategluconate kinase

6-phosphogluconate

phosphogluconate dehydratase(edd基因產物)

2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate

2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase

glyceraldehyde 3-phosphate Pyruvate

(gntT、gntU、gntW、gntP基因產物) cytosol

environment

EDP

? gluconate 的運輸及其代謝前的被磷酸化機制涉及兩組基因系統：(1) GntI system

gntT encoding high affinity gluconate transporter gntU encoding low affinity gluconate transportergntK encoding thermoresistant gluconokinase

(2) GntII system gntW encoding high affinity gluconate transporter gntV encoding thermosensitive gluconokinase

(eda基因產物)

? GntT、GntU、GntW、GntP、Dsdx、ORFo454、ORFf388組成一新的 transporter family。

permease

前言

? E. coli以 gluconate 專一性地誘導 gluconate transport 及 gluconate kinase 的活性，並經由

Entner? Doudoroff pathway代謝 gluconate 。實驗證實 E. coli 至少需要 eda gene 及 gntPgene 的表現，才能在老鼠大腸內形成菌落。

?在含有 gluconate 環境中，E. coli 生長至 early log phase 時，gntT 可被大量表現 ? 在 latelog phase 時，gntT表現降低。並發現可藉由 0.5 mM gluconate 誘導 gntT 最大量的表現，而 gntU 則需要 10 ~ 100 mM gluconate 才可被誘導最大量表現。

? 作者利用 PCR 方式所得到的 gntT promoter region DNA sequence及將 gnt operator 的高度保留 DNA序列進行定點突變來進一步了解 gluconate、GntR 及 cAMP-CRP complex 對 gntT的調控機制。

? 研究發現 GntI system、edd及 eda genes 可藉由 GntR 進行負調控作用，而 GntR 屬於GalR-LacI family 的調控蛋白，且 N 端具有 helix-turn-helix DNA binding motif，推測GntR 所扮演的負調控機制與 LacI 在 lac operon 進行負調控機制相似。

• GalR-LacI family：GalS、GalR、CytR、PurR、LacI、FruR、RafR、GntR

? 研究發現在含有 catabolite-repression sugar 環境中，細胞內 cAMP 及 CRP 的濃度降低，推測原因為 catabolite-repression sugar 抑制 adenylate cyclase的活性及 crp gene 的表現。

effect of gntR mutation on gntT expression

?目的：探討 gntT 在不同醣類環境下受 GntR 的影響。

(1) 將 PR201 (gntR mutant) 和 NP100 (wild type) 分別培養於 LB medium

[ (1) 0.4 % gluconate 、(2) 0.4 % glucose(3) 0.4 % (glucose + gluconate)]。

(2) 振震培養於 37 oC，培養至 late log phase，測 OD600 。

(3) 取 1 mL 菌液離心 (14000 rpm) 5分鐘，將菌體回溶，再加 120 ? L甲苯，震盪此懸浮液。

(4) 加入 0.25 mL ONPG test reagent。

(5) 37 oC下靜置 5 ~20 分鐘，直到菌液變成黃色後，加入 0.5 mL Na2CO3。

(6) 離心 (14000 rpm) 5分鐘。

(7) 取上清液測 OD420、OD550。

?實驗：

構築單套 gntT::lacZ融合基因

gntT promoter region

EcoR I site

5?? CGGAATTCTGAAAGGTGTGCGCGATCTCAC? 3? P231

5?? GCGGATCCCCGATAGCAACAATGACTAATG? 3? P230

BamH I site

∣∣∣

∣∣∣

5?? ? 3?

1. PCR

2. EcoR I / BamH I


5?? AATTCCCTAG? 5?

P231

P230

1. ligated into the pRS551 2. transformed to the DH5? strain

1. DH5? was infected with ? RS882. homologous recombination

1. P90C strain infected with recombinant ?RS882. integration

lacZ

?目的：藉由測定單套gntT::lacZ融合基因所表現的 ?-galactosidase活性大小來間接印證 gntT 被

gluconate、GntR、cAMP-CRP 正調控與負調控作用。

5?? ? 3?

NP100 strain chromosome (wild type)

check the copy number of the fusion in chromosome *

收集plaque

kanr

kanr

*


構築 gntR (Kanr) insertion mutant

?目的：探討 GntR 對 gntT表現的影響。

5? 3?Kanr---AGGCCT

---TCCGGAAGGCCT---TCCGGA---

Stu I siteStu I site

ligated into pTC221(含有 gntR gene, 而且 gntR gene 帶有 Stu I 的切位)

5?3?

digested with Pvu IICAGCTG---GTCGAC---

---CAGCTG---GTCGAC

1. run agarose gel 確認，進行 gel extraction 回收2. transformed into DPB271 strain3. specific recombination

transduction of the gntR mutation into NP100 strain

PR201 strain (null gntR mutant)

Kanr

null gntR Pvu II sitePvu II site

Pvu II site Pvu II site

Stu I siteStu I site

run agarose gel 確認，進行 gel extraction 回收

?目的：探討 gntT promoter region在不同醣類環境下受 GntR 的影響。

(1) 將 PR201 (gntR mutant) 和 NP100 (wild type) 分別培養於 LB medium

[ (1) 0.4 % gluconate 、(2) 0.4 % glucose(3) 0.4 % (glucose + gluconate)]。





(6) 離心 (14000 rpm) 5分鐘。


?實驗：

effect of gntR mutation on gntT expression

*

effect of the gntR mutation on gntT expression

?結果：

?NP100 (wild type)1. 加入 0.4 % gluconate2. 加入 0.4 % glucose 3. 加入 0.4 % (gln + glu)

gntT 被誘導表現

gntT 被誘導表現gntT 表現完全被抑制

?PR201 (gntR mutant)

1. 加入 0.4 % gluconate2. 加入 0.4 % glucose 3. 加入 0.4 % (gln + glu)

gntT 表現被抑制gntT 表現被抑制gntT 表現被抑制

1. gntR mutant 在沒有 gluconate 環境中所表現的 ?-galactosidase活性為 wild type 經 gluconate 所完全誘導 ?-galactosidase活性的 3 倍，以此結果可確定GntR 為 gntT負調控蛋白質。

2. 推測 gluconate 可能扮演 inducer及 repressor兩種角色來調控 gntT的表現。

1500

1200

900

600

300

0

?-g

alac

tosi

dase

none

gluc

onat

e

gluc

ose

gln

+ gl

uc

none

gluc

onat

e

gluc

ose

gln

+ gl

uc

NP100 PR201

(? ) (? )

(? )

外源性 cAMP 於含有不同醣類環境下對 gntT::lacZ 融合基因表現的影響?目的：探討 NP100 (wild type) 與 PR201 (gntR mutant) 培養於含有不同醣類培養基，外源性

cAMP 對 gntT::lacZ融合基因表現的影響。

1. 將 PR201(gntR mutant) 和 NP100 (wild type) 分別培養於 LB medium 包含(1) 0.4 % gluconate (2) 0.4 % glucose (3) 0.4 % (glucose + gluconate)(4) 0.4 % gluconate + 5 mM cAMP(5) 0.4 % glucose + 5 mM cAMP(6) 0.4 % (glucose + gluconate) + 5 mM cAMP

2.在不同時間點取出 1 mL 菌液測定 ?-galactosidase活性。

?實驗：

?結果：

1. 從可以發現 NP100 (wild type) 在沒有gluconate 環境下生長，

不管是否加入cAMP，都不會誘導 ?-galactosidase的產生。

證實加入 cAMP 不會去除 GntR 對 gntT的負調控作用

2000

1600

1200

800

400

0

?-g

alac

tosi

dase

0 1 2 3 4 5 6?

?

OD600

NP100 (wild type)

NP100 + 5 mM cAMP

PR201 (gntR mutant)

PR201 + 5 mM cAMPwt

gntR -

wt / cAMP

gntR - / cAMP

1400

外源性 cAMP於不同醣類環境下對 gntT::lacZ 融合基因表現的影響

2. 從可以發現 NP100 (wild type) 在有 gluconate及

cAMP 環境下生長時，?-galactosidase的活性有顯

著的提高。

證實加入 cAMP 可減緩 gntT 受 gluconate 代謝物的抑制作用

3. NP100 (wild type)在代謝物抑制環境下，cAMP 的加入仍然

無法使 ?-galactosidase的活性回復至PR201在只有 LB 環境

下所表現 ?-galactosidase的活性。

800

400

0

?-g

alac

tosi

dase

0 1 2 3 4 5 6

?

? ?

OD600

wt

wt / cAMP

800

400

0

?-g

alac

tosi

dase

0 1 2 3 4 5 6OD600

?結果：

4. 從發現 PR201 ( gntR mutant) 在 glucose 環境下生長，可藉

由 cAMP 的加入來誘導 ?-galactosidase的產生，但所表現的

?-galactosidase的活性仍然無法回復至 PR201 在只有 LB 環境

下所表現 ?-galactosidase的活性。

?

?

?

NP100

NP100 + 5 mM cAMP

PR201

PR201 + 5 mM cAMP

gntR -

gntR - / cAMP

外源性 cAMP於不同醣類環境下對 gntT::lacZ 融合基因表現的影響

600

400

350

200

0

?-g

alac

tosi

dase ?

?

?

5. 從發現 PR201 (gntR mutant) 在 glucose 及 gluconate 環境下生

長，仍可藉由 cAMP 的加入來誘導 ?-galactosidase的產生，但所

表現的 ?-galactosidase的活性仍然無法回復至PR201在只有 LB

環境下所表現 ?-galactosidase的活性。

從 3.4.5. 結果得知 cAMP 的加入無法完全去除 glucose 及 gluconate 對 gntT 的抑制，推測可能原因為：

‧其它因子參與 catabolite repression，使 gntT無法表現至最大量。

‧ catabolite-repression sugar 抑制 crp gene 的表現，無法形成 cAMP-CRP complex 來活化 gntT 的表現。

0 1 2 3 4 5 6OD600

gntR -

gntR - / cAMP

?目的：探討 CRP(crp基因產物) 和 adenylate cyclase( cya基因產物) 在 gntT 基因被 glucose 和gluconate 的代謝物抑制其表現時所扮演的角色。

1.將 NP100 (wild type)、RH112 (crp-)、HT110 (cya-)、RH114 (crp- cya-)、RH216 (crp- gntR-)、HT216 (cya- gntR-)分別培養於 LB medium 包含(1) 0.4 % gluconate 、(2) 0.4 % glucose、(3) 0.4 % (glucose + gluconate)(4) 0.4 % gluconate + 5 mM cAMP(5) 0.4 % glucose + 5 mM cAMP(6) 0.4 % (glucose + gluconate) + 5 mM cAMP

?實驗：

2.在不同時間點取出 1 mL 菌液測定 ?-galactosidase活性。

CRP 和 adenylate cyclase在不同醣類環境下對 gntT::lacZ 融合基因表現的影響

E. coli strain

Relevant genotype

? -Galactosidase activity (U) with indicated carbon sourceNone Gluconate Glucose

- cAMP + cAMP

NP100RH112HT110RH114RH216HT216

Wild typecrp-

cya-

crp- cya-

crp- gntR -

cya- gntR -

1020300

5075

1015251060

585

460105115904555

68070

6206035

380

0000

5060

0000

55290

- cAMP + cAMP - cAMP + cAMP

?結果：

1. 在有 gluconate 環境中，RH112 (crp-) 和HT110 (cya-) 個別的 ?-galactosidase的活性與NP100 (wild type) 所表現的 ?-galactosidase活性相差了四倍。

2. 在有 gluconate 及 cAMP 環境下，HT110 (cya-)所表現 ?-galactosidase的活性與 NP100 (wild type) 所表現 ?-galatosidase的活性相似，推測 CRP 可能與 cAMP 形成 cAMP-CRP complex 活化 gntT 的表現。

?實驗：

gntT promoter region DNA 序列的改變對 gnT::lacZ表現的影響

?目的：檢驗 GntR 及 cAMP-CRP complex 是否分別結合在 putative gntT operator sites 及 putative

CRP binding site 來調控 gntT，並進一步確定在 gntT promoter region 是否有額外的調控

區域。

(1) 將 NP100 、NP102、NP103、NP104、NP105、NP106、NP206、NP211、NP208、NP212、

NP220、NP221、NP1256、NP400、NP401、NP404 strains分別培養於 LB medium

[ (1) 0.4 % gluconate LB、(2) 0.4 % glucose(3) 0.4 % (glucose + gluconate)]。





(6) 離心 (14000 rpm) 5分鐘。


*

構築 putative gntT operator sites and CRP binding site mutants

?目的：進一步將 putative gntT operator sites 及 putative CRP binding sites 的 DNA 序列改變，檢驗

是否分別為 GntR 和 cAMP-CRP complex 結合位。

?mutation within the internal gnt operator (OI)

∣∣∣

∣∣∣

5?? ? 3?

P231

P102

P102 5’— GCGGATCCCATTTGTTATGCAGGTAACGTCAATTT— 3’

P103 5’— GCGGATCCCATTTGTTATGAGGTAACGTCAATTT— 3’

P104 5’— GCGGATCCCATTTGTTATGGGCGACGTCAATTT— 3’

P105 5’— GCGGATCCTTTCATTTGCGCTGGGTAACGTCAA— 3’

P106 5’— GCGGATCCATTTGTTCTGGGTAACGTCAATTT— 3’

forward primer

P231 5’— CGGAATTCTGAAAGGTGTGCGCGATCTCAC— 3’

reverse primer

EcoR I site

BamH I site

1. PCR2. EcoR I / BamH I

5?? AATTCCCTAG? 5?

1. cloned into the pRS551 2. transformed to the DH5? strain



lacZ5?? ? 3?

check the copy number of the fusion in chromosome

收集plaque

kanr

kanr

NP102 strain

依此實驗方法建構 NP103、NP104、NP105、NP106




?mutation within the external gnt operator (OE) and the CRP binding site

P206B 5’— AAACGCCAGATGTCGACCGTATCATTCA— 3’P206 5’— TGAATGATACGGTCGACATCTGGCGTTT— 3’

P208B 5’— TTCTCAAACGCCATGGGGTACCCGTATCAT— 3’P208 5’— ATGATACGGGTACCCCATGGCGTTTGAGAA— 3’

P211B 5’— GCCAGATGTTACCCGGGTCATTCACATG— 3’P211 5’— CATGTGA ATGACCCGGGTAACATCTGGC— 3’

P212B 5’— TGTGA ATGATACCATGGTAACATCTGG— 3’P212 5’— CCAGATGTTACCATGGTATCATTCACA— 3’

P220B 5’— TCCCCGCGATAAGTCGACCAACCTCTCA— 3’P220s 5’— TGAGAGGTTGGTCGACTTATCGCGGGGA — 3’

P221B 5’— ATATGACCAACCATCGATAATTTAAA— 3’P221 5’— TTTAAATTATCGATGGTTGGTCATAT— 3’

P231 5’— CGGAATTCTGAAAGGTGTGCGCGATCTCAC— 3’P230 5’— GCGGATCCCCGATAGCAACAATGACTAATG— 3’

outside primer

OE primer

CRP binding site primer

∣∣

∣∣

5?? ? 3?

P230

1. three-step recombinant PCR2. EcoR I / BamH I

∣∣

∣∣

5?? AATTCCCTAG? 5?

1. cloned into the pRS551 2. transformed to the DH5? strain



lacZ5?? ? 3?

收集plaque

kanr

kanr

check the copy number of the fusion in chromosome

構築 putative gntT operator sites 及 putative CRP binding site mutants

P231 P206B

P206

依此實驗方法建構 NP208、NP211、NP212、NP220、NP221

NP206 strain

*




gntT promoter region DNA 序列的改變對 gntT::lacZ 表現的影響

?實驗：

?目的：檢驗 GntR 及 cAMP-CRP complex 是否分別結合在 putative gntT operator sites 及 CRP

binding site 來調控 gntT，並進一步確定在 gntT promoter region 是否有額外的調控區域。

(1) 將 NP100 、NP102、NP103、NP104、NP105、NP106、NP206、NP211、NP208、NP212、

NP220、NP221、NP1256、NP400、NP401、NP404 strains分別培養於 LB medium

[ (1) 0.4 % gluconate (2) 0.4 % glucose (3) 0.4 % (glucose + gluconate)]。





(6) 離心 (14000 rpm) 5分鐘。


lacZ

lacZ

lacZ

NP400

NP404

NP401

CRP OE OI-100 -60 -20 -10 +60 +120

+1

?M

aeIII

?K

pnI

?M

aeIII

?H

infI

gntT


?結果一：( gntT operator sites 改變)

? -galactosidase activity (U) with indicated carbon sources

E. coli strain

NP100 (wild type) 10 510 0 280

NP102 780 520 100 320NP103 280 490 60 260 NP104 840 490 100 330NP105 920 500 90 310NP106 110 610 40 300

NP206 1320 560 190 190NP208 1260 460 170 210 NP212 1180 480 160 190

NP1256 1460 640 190 280

None Gluconate Glucose Gluconate + Glucose

1. 在沒有 gluconate 環境下，NP104、NP105、NP106、NP102、NP103 strains 能夠持續表現?-galactosidase活性。

internal operator (OI) site

AAATTGACGTTACCCATAACAAATNP102 TG (insertion)NP103 T (insertion)

NP104 CGNP105 GCGNP106 G

3. 在 gluconate 及 gluconate + gluconse環境中，所有 OE mutants 所表現的 ?-galactosidase與 wild type 相似，在 glucose 環境中， OE mutants 所表現的 ?-galactosidase為OI mutants 的兩倍。

推測 OI的 DNA 序列為調控 gntT 表現的重要序列，改變或插入OI site 上任何一鹼基足以影響GntR 結合在 DNA 的能力。

external operator (OE) site

CCAGATGTTACCCGTATCATTCACA

NP206 CGA

NP208 TGGGGNP212 AT (insertion)

NP211 GG

2. 在沒有 gluconate 環境下，NP206、NP208、NP212 所表現的 ?-galactosidase活性為 OI mutants兩倍以上，且與 gntR mutant (PR201) 所表現的 ?-galactosidase活性相似(~ 1400)。

4. NP1256 (OI/OE mutant) 在沒有任何醣類環境下，所表現 ?-galactosidase的活性與 gntRmutant 相似。

依據 1 ~ 4 結果，作者推測?當 GntR 對 gntT 進行負調控作用，OI site 與

OE site 是必需的。?OE site 對 GntR 而言是較重要的結合位。

?-galactosidase activity (U) with indicated carbon sources

E. coli strain

NP100 (wild type) 10 510 0 280

NP206 1320 560 190 190NP208 1260 460 170 210

NP220 0 130 60 60NP221 0 110 50 70

None Gluconate Glucose Gluconate + Glucose


?結果二：(cAMP-CRP binding site 的改變)

cAMP-CRP binding site (-71)

CGCGATAATATGACCAACCTCTCATAATTT

NP220 GTCNP221 ATCG

cAMP-CRP binding site (-13)


NP206 CGA

NP208 TGGGG

1. NP206 與 NP208 DNA序列的改變並不影響cAMP-CRP complex 活化 gntT 的表現。

2. NP220 與 NP221 所改變的 DNA序列強烈影響 cAMP-CRP complex 活化 gntT 的表現。

證實 cAMP-CRP binding site (-71) 是 cAMP-CRP主要活化 gntT 表現的結合位置。

NP100 (wild type) 10 510 0 280

NP400 0 590 0 290NP404 0 140 40 60 NP401 10 10 0 0

?-galactosidase activity (U) with indicated carbon sources

E. coli strain None Gluconate Glucose Gluconate + Glucose

?結果三：( deletion 實驗)

-100 -60 -20 -10 +60 +120 gntT

lacZ

lacZ

lacZ

NP400

NP404

NP401

CRP OE +1 OI

3. NP400 在左表各種生長環境所表現的 ?-galactosidase活性與 NP100 (wild type) 相似。

4. NP404 仍可經由 gluconate 誘導而表現 ?-galactosidase活性。

5. NP401 在左表各種生長環境下，幾乎沒有表現 ?-galactosidase活性。

依據 3. ~ 5. 結果，推測 gntT promoter region 沒有額外的調控區域。

GntR 與 CRP 在 gntT promoter region 的結合

?目的：再次利用純化的 GntR 及 CRP 來確定是否個別地結合在 putative gntT operator sites

及 putative cAMP-CRP binding site 。

?實驗：

?純化 GntR 及 CRPP701 5’— GCGGATCCATGAAAAAGAAAAGACCCGTAC— 3’

P702 5’— GGGGTACCGTGCCCCCACAATACAAGAA— 3’

GntR forward primer

GntR reverse primer

BamH I site

Kpn I site

CRP forward primer

CRP reverse primer

PCRP1 5’— GCGGATCCATGGTGCTTGGCAAACCGCAAA— 3’

BamH I site

PCRP3 5’— GGGGTACCACGGGATTAACGAGTGCCGTAA— 3’

Kpn I site

GntR∣∣∣

∣∣∣5??

P701

P702

? 3? CRP∣∣∣

∣∣∣5??

PCRP1

PCRP3

? 3?

1. PCR2. BamH I / Kpn I

5?? GATCC GGTAC? 3?GntR

1. cloned into the pQE30 2. transformed to the M15 strain

1. OD600 = 0.8 or 1.5 2. 1 ~ 2 mM IPTG (2 ~ 4 h)

1. 離心取菌體，以 cold buffer 回溶2. sonication / 取上清液

1. mixed with nickel-nitrilotriacetate2. washed three times with buffer and eluted

SDS-PAGE 分析 (結果一)

5?? GATCC GGTAC? 3?CRP

GntR 在putative gntT operator site 的結合

?DNA band migration retardation

?製備 gntT DNA 序列以 [? - 32P]dATP 及 PCR 方法將 gntT promoter region DNA 序列進行合成及 radiolabeled

一. •將 radiolabeled gntT fragment 和不同濃度的 GntR 加至 20 ? L reaction mixtures•將 radiolabeled gntT fragment 、28.8 nM GntR 和不同濃度的 gluconate 加至 20 ? L reaction mixtures二. •以 Mae III 處理過的 radiolabeled gntT fragment 和不同濃度的 GntR 加至 20 ? L reaction mixtures•以 Kpn I 處理過的 radiolabeled gntT fragment 和不同濃度的 GntR 加至 20 ? L reaction mixtures•以 Hinf I 處理過的 radiolabeled gntT fragment 和不同濃度的 GntR 加至 20 ? L reaction mixtures三. •將 radiolabeled gntT fragments (來自於 NP105、NP206、NP1256、NP220) 和不同濃度的 GntR 加至 20 ? L reaction mixtures

室溫下培養 10 分鐘

5 or 6 % PAGE 分析

將膠體烘乾，以 Kodak BIOMAX MS film 成像

? reaction mixtures 含有 the radiolabeled DNA fragment , 2 ? g of sonicated herring sperm DNA, 4mM Tris-HCL (pH7.0), 5 mM sodium chloride, 2 mM magnesium chloride, 7.5% glycerol, 2 mM dithiothreitol, and 0.1 mM phenylmethylsulfonylfluoride.

-100 -60 -20 -10 +60 +120 +1

?M

aeIII

?K

pnI

?M

aeIII

?H

infI

gntTCRP OE OI

GntR 在 putative gntT operator site 的結合

?結果二：

F：free DNA ( gntT promoter region DNA)R1：complexes of the DNA fragment with one GntRR2：complexes of the DNA fragment with two GntR

1. lane a 至 lane f可得知當 GntR 濃度逐漸提高時，可形成 DNA-GntR complex 及 DNA-2GntR complex。

2. lane g 至 lane m 可得知當 gluconate 濃度逐漸提高可減少 DNA-2GntRcomplex 及 DNA-GntR complex 的形成。

gluconate 減低 GntR 對 gntT operator sites DNA 序列的結合能力與 gluconate 濃度成比例，推測藉由 gluconate 減低 GntR 對 operator sites 結合能力

lane A / F：molecular weight standards

lane B / E：cell extracts of M15 (pNT41) and M15 (pNT52)

lane C / D：purified GntR and CRP

GntR 分子量大約為 36.8 kDa，而 CRP 分子量大約為 24.3 kDa

?結果一：

GntR (nM) 0 0.9 1.8 3.6 7.2 14.4 28.8 28.8 28.8 28.8 28.8 28.8 28.8

GLN (nM) 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 20.0

a b c d e f g h i j k l m

A B C D E F

97 ?68 ?

43 ?

29 ?

18 ?

kDa

R2 ?

R1 ?

F ?

GntR 在 putative gntT operator sites 的結合?結果三：

M240

M142

M67

GntR (nM) 0 0.9 7.2 28.8

a b c d

GntR (nM) 1.8 3.6 7.2 14.4 28.8

K274RK182R

K274

K182

e f g h i

1.8 3.6 7.2 14.4 28.8 H233R2

H233R

H233H223

j k l m n

A. B.

圖 A： gntT 經由 Mae III enzyme 作用後，再與不同濃度的 GntR 進行 DNA bandmigration retardation

圖 B： gntT 經由 Kpn I enzyme / Hinf I作用後，再與不同濃度的 GntR 進行 DNA band migration retardation。

1. gntT promoter region 經 Mae III enzyme 作用後，沒有出現 DNA band retardation 現象，可知 GntRbinding sites 已被 Mae III enzyme 破壞。

2. gntT promoter region 經 Kpn I enzyme 作用後，出現兩個 Kpn I fragments 的 DNA band retardation現象，可知兩個 Kpn I fragments 個別包含 GntR binding site。

3. gntT promoter region 經 Hinf I enzyme 作用後，出現一個 Hinf I fragment 的DNA band retardation現象，可知 Hinf I fragment (H233) 包含兩個 GntR binding sites。

從 1.2.3. 的結果可得知 Kpn I enzyme 辨識位置位於兩個 gntT operator sites 之間，Hinf I enzyme 辨視位置位於兩個 gntT operator sites 上游位置。

CRP OE OI-100 -60 -20 -10 +60 +120

+1

?M

aeIII

?K

pnI

?M

aeIII

?H

infI

gntT

GntR 在 putative gntT operator sites 的結合

?結果四：

GntR (nM) ? 7.2 28.8 ? 7.2 28.8 ? 7.2 28.8 ? 7.2 28.8

NP105 NP206 NP1256 NP220

R2 ?

R1 ?

F ?

1. 從 NP105 、 NP206 及 NP1256 的 DNA retardation 結果，可知 gntT operator sites DNA 序列的改變，會影響 GntR 對 gntT operator sites DNA 序列的結合能力。

2. NP220 的 DNA retardation 結果，可知 CRP binding site DNA 序列的改變，不會影響GntR 對 gntT operator sites 的結合。

3. NP103、NP106 和 NP211需要更高濃度的GntR，才能使 GntR 結合在 gntT operator sites 。(data not shown)


AAATTGACGTTACCCATAACAAAT

NP105 GCG



NP206 CGA

cAMP-CRP binding site


NP220 GTC

從 1.2.3.結果得知，在 gntT operator sites 經由 DNA 鹼基的插入及替換會影響GntR 對 gntT operator sites的結合能力，也間接證實 GntR 確實結合在putative gntT operator sites。

CRP (nM) 46.5 93.0

a b c d e f g h i j k l m n

CRP 在 putative CRP binding site 的結合

?DNA band migration retardation

•以 Mae III 處理過的 radiolabeled gntT fragments 和不同濃度的 CRP 加至 20 ?L reaction mixtures•以 KpnI處理過的 radiolabeled gntT fragments 和不同濃度的 CRP 加至 20 ? L reaction mixtures



將膠體烘乾，以 Kodak BIOMAX MS film 成像?結果：CRP (nM) ? 4.1 8.2 16.4 ? 4.1 8.2 16.4

M246C ?

M246 ?

M142 ?

M67 ?

? K274C

? K274

? K182

1. gntT promoter region 經 Mae III enzyme 作用後，出現一個 Mae III fragment 的 DNA bandretardation 現象。

2. gntT promoter region 經 Kpn I enzyme 作用後，出現一個 Kpn I fragments 的 DNA band retardation 現象。

從 1.2. 的結果可得知 Mae III enzyme 及 Kpn I enzyme 辨識位置位於 CRP binding site 下游位置，並發現cAMP-CRP只能與含有 ? 71 位置的 CRP binding site 結合。

CRP OE OI-100 -60 -20 -10 +60 +120

+1

?M

aeIII

?K

pnI

?M

aeIII

?H

infI

gntT

GntR 與 CRP 在 gntT promoter region 的結合

•將 radiolabeled gntT fragments 和不同濃度的 GntR 及 CRP 加至 20 ? L reaction mixtures?DNA band migration retardation



將膠體烘乾，以 Kodak BIOMAX MS film 成像

?結果： GntR (nM) 3.6 7.2 14.4 28.8 28.8 28.8 28.8 28.8CRP (nM) 8.2 16.4 32.8 32.8 32.8 32.8 32.8 32.8 32.8 32.8

FCR2 ?FCR1 ?

FC ?

F ?

從上圖結果可得知當 gntT promoter region fragment 與 GntR 和 CRP-cAMP 一起培養，可得到：(1) one GntR and one cAMP-CRP complex(2) two GntR and one cAMP-CRP complex 並確定 cAMP-CRP 可專一性地結合在 ? 71 位置的 CRP binding site 且不受 GntR 的影響。

GLN (nM) 2 8 10

討論

研究發現 gnt regulon可藉由 gluconate 及 cAMP 的環境或者將 gntR gene 剔除而造成去抑制作用，並發現此去抑制作用會造成菌體內 methylglyoxal堆積而抑制菌體的生長。在本文發現 gntR mutant 在含有 gluconate 及外源性 cAMP 環境中，抑制此突變株生長的現象更加明顯，推測可能原因為 gluconate 過度分解代謝而導致大量 methylglyoxal產生而抑制菌體生長。

在含有 gluconate 環境中(1) gntR mutant strain 的 gntT表現為在 wild type strain 的一半。(2) crp gntR mutant strain 的 gntT表現為 crp mutant strain 的一半。(3) cya gntR mutant strain 的 gntT表現為 cya mutant strain 的一半。(4) NP1256 strain (operator sites mutant) 的 gntT表現與 gntR mutant 在沒有任何醣類環境下相似。

從 (1) (2) (3) (4) 結果，可得知在含有 gluconate 環境中，gntR mutant strain 的 gntT 表現減少兩倍與 catabolite repression 及 GntR 結合在 gntT operator sites 無關。推測 GntR 可能對調控gntT 表現的某一個activator 是必需的，所以才在導致在 gntR mutant strain 的 gntT 表現減少兩倍。從 DNA retardation assays 可發現 GntR 結合在 gntT promoter region 的兩個不同位置以及gluconate 可抑制 GntR? DNA complexes 的形成，推測調控 gntT 的機制可能為：(1) gluconate (inducer) 不存在藉由 GntR (repressor) 結合在 gntT operator sites 形成 DNA looping ，抑制 gntT的表現。

(2) gluconate (inducer) 存在減緩 GntR (repressor) 對 gntT operator sites DNA 序列的親和力，活化 gntT的表現。

*

?

?

*

Rapid confirmation of single copy lambda prophageintegration by PCR

primer to the left of E. coli attB :

5?? GAGGTACCAGCGCGGTTGATC? 3 ?

primer to the left of ? attP :

5?? TTTAATATATTGATATTTATATCATTTTACGTTTCTCGTTC? 3 ?

no band

?A strain with two or more prophages

primer within the ? int gene :

5?? ACTCGTCGCGAACCGCTTTC? 3?

?A strain without a prophage

?gal bioattB

?A strain with a integrated single prophage

?gal attL int? 1 ? bio one band

attR

?gal attL int? 1 ? attP int

? 2 two or more bands

?

?

?

? ?

?

? -galactosidase activity assay

? -galactosidase

?OD420 and OD550 are read from the reaction mixture.

? light scattering at 420nm = 1.75 x OD550.

?OD600 reflects cell density in the washed cell suspension.

?T = time of the reaction in minutes

?V = volume of culture used in the assay in mL

yellow

Miller Units = 1000 x [(OD420 – 1.75 x OD550) ] / (T x V x OD600)

lactose analogue

CRP OE OI-100 -60 -20 -10 +60 +120

+1

?M

aeIII

?K

pnI

?M

aeIII

?H

infI

gntT

lacZ

lacZ

lacZ

PN400

PN404

PN401



NP206 CGA

NP208 TGGGGNP211 GGNP212 AT (insertion)


AAATTGACGTTACCCATAACAAATNP102 TG (insertion)NP103 T (insertion)NP104 CGNP105 GCGNP106 G

cAMP-CRP binding site


NP220 GTCNP221 ATCG

the site-directed mutations within the two operator sites and the cAMP-CRP binding site

*

three-step recombinant PCR method

<

region of overlap

<<

<<

<<

<<

<

mix, denature & anneal

<<

<

<

<<

extension

<<

mismatched base

corrected mismatch

5’to 3’

newly made DNA

Step 1

Step 2

Step 3

*

Documents

Positive and Negative Transcriptional Regulation of the …strbio.biochem.nchu.edu.tw/classes/lab seminar/frank/wu... · 2002. 11. 29. · Entner-Doudoroff Pathway (EDP) D-glucose