Positionsklonierung eines neuen Gens für syndromale ... · 1 Kapitel 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung eines neuen Gens für

Aus dem Humangenetischen Institut des

Universitatsklinikums Erlangen

Friedrich-Alexander-Universitat Erlangen-Nurnberg

Direktor: Prof. Dr. med. A. Reis

Positionsklonierung eines neuen Gens fur syndromale

Mentale Retardierung

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwurde

an der Medizinischen Fakultat

der Friedrich-Alexander-Universitat

Erlangen-Nurnberg

vorgelegt von Ina Gohring

aus Neuhaus am Rennweg

Erlangen, im Oktober 2009

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultat der Friedrich-Alexander-Universitat

Erlangen-Nurnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schuttler

Referent: Prof. Dr. med. A. Rauch

Koreferent: Prof. Dr. med. A. Reis

Prof. Dr. rer. nat. M. Wegner

Prof. Dr. med. S. Mundlos

Tag der mundlichen Prufung: 10. November 2010

”What we know is a drop. What we don’t know is an ocean.”

(”Was wir wissen, ist ein Tropfen, was wir nicht wissen, ein Ozean.”)

Sir Isaac Newton

� 04.01.1643 - � 31.03.1727

englischer Physiker, Mathematiker, Astronom und Philosoph

i

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung 1

Conclusion 4

2 Einleitung 7

2.1 Mentale Retardierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.2 Chromosomenanomalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.2.1 Numerische Aberrationen der Chromosomen . . . . . . . . . . . . . 12

2.2.2 Strukturelle Aberrationen der Chromosomen . . . . . . . . . . . . . 13

2.3 Identifizierung von krankheitsverursachenden Genen mittels Positionsklo-

nierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.3.1 Positionsunabhangige Methoden zur Identifizierung von Krankheits-

genen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.3.2 Positionsklonierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.3.2.1 Kopplungsanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.3.2.2 Ausnutzen von Chromosomenanomalien . . . . . . . . . . . 17

2.3.3 Bestatigung eines positionellen Kandidatengens . . . . . . . . . . . . 19

2.4 Ziel der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

ii

3 Material und Methoden 21

3.1 Patienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.1.1 Patient mit de novo Translokation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.1.2 Patienten fur die Kandidatengenanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2.1 Sequenzierung des Kandidatengens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2.1.1 Grundlagen der PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2.1.2 Durchfuhrung der PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.2.1.3 Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.2.1.4 Aufreinigung des PCR-Produktes . . . . . . . . . . . . . . 30

3.2.1.5 Grundlagen der Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.2.1.6 Durchfuhrung der Sequenzierreaktion . . . . . . . . . . . . 33

3.2.2 Bruchpunktuberspannende-Long-Template-PCR . . . . . . . . . . . 34

3.2.2.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.2.2.2 Durchfuhrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.2.3 RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.2.3.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.2.3.2 Durchfuhrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

a) cDNA-Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

b) RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.2.4 Real-Time-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.2.4.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

iii

3.2.4.2 Durchfuhrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.2.4.3 Quantitative Bestimmung der qRT-PCR-Resultate . . . . . 39

3.2.5 Hybridisierungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.2.5.1 Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.2.5.2 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . 41

a) Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

b) Gewinnung der Sonden-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . 43

c) Durchfuhrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.2.5.3 Southern-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

a) Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

b) Auswahl der Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

c) Durchfuhrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.2.5.4 Tissue-in-situ-Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

a) Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

b) Sonden-Gewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

c) Durchfuhrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.3 Biologische Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.3.1 Bakterien: BAC-Klone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.3.2 Metaphasepraparate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.3.3 DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.3.4 RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.3.5 Mausembryonen und Mausgewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

iv

3.4 Gerate und Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

4 Ergebnisse 73

4.1 Bruchpunktfeinkartierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.1.1 Ausgangssituation vor Beginn der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.1.2 Bruchpunktkartierung mit FISH-Analysen . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.1.2.1 Chromosom 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.1.2.2 Chromosom 20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.1.3 Bruchpunktkartierung mit Mini-FISH-Sonden . . . . . . . . . . . . . 76

4.1.3.1 Chromosom 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

4.1.3.2 Chromosom 20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.1.4 Bruchpunktkartierung mit Southern Blot . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.1.5 Bruchpunktuberspannende PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.2 Kandidatengene in den Bruchpunktregionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.2.1 Kandidatengene auf Chromosom 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89


4.3 Expressionsanalysen des Kandidatengens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

4.3.1 Expressionsanalyse beim Patienten mit RT-PCR . . . . . . . . . . . 92

4.3.1.1 Expressionsanalyse der verschiedenen Isoformen des Kan-

didatengens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

4.3.2 Expressionsanalyse mit Real-Time-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . 92

4.3.3 Expressionsanalyse durch Maus-in-situ-Hybridisierung . . . . . . . . 95

4.4 Sequenzierung des Kandidatengens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

v

5 Diskussion 105

5.1 Phanotyp des untersuchten Patienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

5.2 Bruchpunktfeinkartierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

5.3 Kandidatengene in den Bruchpunktregionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107



5.4 Expressionsanalysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

5.4.1 Expressionsanalysen des ST5 -Gens mittels RT- und Real-Time-PCR 113

5.4.2 Expressionsanalyse des ST5 -Gens mittels Tissue-in-situ-

Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

a) St5 -Expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

b) Die cortikale Entwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

c) Auf gestorter neuronaler Migration beruhende Erkran-

kungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

5.5 Moglicher Einfluss von ST5 auf die Gehirnentwicklung und den Phanotypen

des Patienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

5.6 Mutationsscreening . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

Literaturverzeichnis 122

Abkuerzungsverzeichnis 133

Abbildungsverzeichnis 135

Tabellenverzeichnis 138

vi

Vorveroeffentlichungen 141

A Gerate und Chemikalien 142

A.1 Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

A.2 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

A.3 Gerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

A.4 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

B Cycler-Programme 155

C Primer 159

D Nachtrag Ergebnisse 167

Danksagung 170

Lebenslauf 172

1

Kapitel 1

Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele

Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung eines neuen Gens fur syndromale mentale

Retardierung. Die Grundlage der Arbeit stellte dabei ein Patient mit einer balancierten

Translokation t(11;20) dar. Bei diesem sollte eine Bruchpunktfeinkartierung erfolgen und

anschließend das dabei identifizierte Kandidatengen weiter charakterisiert werden.

Methoden

In dieser Arbeit wurde ein Junge mit mentaler Retardierung, epileptischen Anfallen,

multizystisch dysplastischen Nieren, submukoser Gaumenspalte, Innenohrschwerhorigkeit

und diversen facialen Dysmorphien untersucht. Eine hochauflosende Chromosomenanalyse

in Kombination mit einem Subtelomerscreening ergab bei dem Patienten eine balancierte

Translokation, der Karyotyp lautete 46,XY,t(11;20)(p15;q13.3).

Die Kartierung der Bruchpunkte erfolgte zunachst mit FISH-, Mini-FISH- und

Southern Blot-Analysen. In den so eingegrenzten Regionen wurden anschließend

bruchpunktuberspannende Fragmente mittels PCR generiert und sequenziert, um den

Bruchpunkt genau zu bestimmen.

In einem weiteren Schritt wurde mittels RT- und Real-Time-PCR-Analysen die Expres-

sion von ST5 an lymphoblastoiden Zelllinien und an verschiedenen fetalen und adulten

humanen Geweben untersucht. Um zu uberprufen, ob ST5 auch in der embryonalen

2

Gehirnentwicklung eine Rolle spielen konnte, wurden Tissue-in-situ-Hybridisierungen an

Mausembryonen verschiedener Embryonalstadien, sowie an Nieren- und Gehirngewebe

neugeborener und adulter Tiere durchgefuhrt.

Des Weiteren wurden 230 Patienten mit uberlappendem Phanotyp auf Sequenz-

veranderungen im ST5 -Gen untersucht.

Ergebnisse und Beobachtungen

Durch die FISH-, Mini-FISH- und Southern-Blot-Analysen konnte die Bruchpunktregion

so stark eingegrenzt werden, dass ein bruchpunktuberspannendes Fragment generiert

werden konnte. Durch Sequenzierung dieses Fragmentes wurde der Bruchpunkt auf

beiden derivativen Chromosomen auf die Base genau bestimmt. Auf Chromosom 20 liegt

im Bereich des Bruchpunktes kein bekanntes oder vorhergesagtes Gen. Der Bruchpunkt

auf Chromosom 11 hingegen liegt in der 5’-UTR des ST5 -Gens und trennt die nicht-

kodierenden von den kodierenden Exons.

Die RT-PCR und Real-Time-PCR Analysen zeigten, dass ST5 in lymphoblastoiden

Zelllinien nicht exprimiert wird. Da vom Translokationspatienten nur eine aus einer

lymphoblastioden Zelllinie gewonnene RNA fur die Analyse zur Verfugung stand, war

ein Nachweis der Haploinsuffienzienz nicht moglich. Des Weiteren konnte durch die

Real-Time-PCR eine ubiquitare Expression des ST5 -Gens in humanem fetalen Gewebe,

insbesondere eine starke Expression in der Niere nachgewiesen werden. Die Real-Time-

PCR Analyse an adultem humanen Gewebe zeigte eine sehr starke ST5 -Expression in

Gehirn, Niere und Skelettmuskel, wahrend die Expression in allen ubrigen Geweben unter

der von den fetalen Geweben lag.

Durch die Maus-in-situ-Hybridisierungen konnte gezeigt werden, dass St5 erst in den

spateren Embryonalstadien exprimiert wird, dann im frontalen Cortex, in der Niere und

im Gaumen der Embryonen. Die Expression im frontalen Cortex beschrankt sich dabei

auf die Ventrikular- und Marginalzone. Bei neugeborenen Mausen waren spezifische

St5 -Signale in den sich entwickelnden tubularen Strukturen der Niere nachweisbar. Bei

wenige Tage alten und adulten Tieren wurden Signale im gesamten Cortex, sowie in der

hippocampalen Region und im Kleinhirn gefunden.

Im Mutationsscreening fanden sich nur Veranderungen, die auch bei den gesunden

Eltern oder Geschwistern der untersuchten Patienten nachweisbar waren und somit als

Polymorphismen gewertet werden.

3

Praktische Schlussfolgerungen

Durch die Bestimmung der Bruchpunkte der Translokation t(11;20)(p15;q13.3) konnte

ST5 als Kandidatengen fur eine neue Form der syndromalen mentalen Retardierung

identifiziert werden. Die Beobachtungen aus der Maus-in-situ-Hybridisierung legen nahe,

dass ST5 eine Rolle wahrend der Gehirnentwicklung, insbesondere bei der Bildung der

verschiedenen Schichten des Cortex und der Migration der Neuronen zu spielen scheint.

Defekte im ST5 -Gen konnten eine Migrationsstorung der Neuronen hervorrufen, die in

einer mentalen Retardierung oder Epilepsie resultieren. Diese Effekte ließen sich durch

die mogliche regulatorische Funktion des ST5 -Gens an der MAPK/ERK2-Signalkaskade

erklaren. Durch diesen Signalweg werden Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Zelltei-

lung sowie die Organisation des Zytoskeletts beeinflusst. Auch die Gaumenspalte und die

Nierenfehlbildung konnten durch die Fehlregulation dieser Signalkaskade erklart werden.

Fur andere Proteine mit DENN-Domanen, wie sie im ST5 -Gen enthalten sind, ist

eine Beteiligung an der Vesikelbildung und ∼freisetzung, insbesondere in Neuronen

beschrieben. ST5 konnte demzufolge auch an der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt

sein und Defekte im ST5 -Gen somit zu einer Storung der Signalubertragung fuhren. Ein

solcher Mechanismus konnte ebenfalls in neurologischen Symptomen, aber auch in einer

Innenohrschwerhorigkeit resultieren.

4

Conclusion

Setting and aims

The primary object of this study was the identification of a new gene for syndromic

mental retardation. Investigations were based on a patient with a balanced translocation

t(11;20). I therefore performed positional cloning with FISH-, mini-FISH- and Southern-

Blot analyses, as well as sequenzing of breakpoint-spanning fragments. This work was

followed by further characterisation of the identified candidate gene.

Methods

I investigated a boy with developmental delay and mental retardation, seizures, cy-

stic kidney dysplasia, bilateral sensorineural hearing loss, submucous cleft palate and

several dysmorphic facial features. High resolution GTG-banding in conclusion with

subtelomeric screening showed a balanced translocation, which was interpreted as

46,XY,t(11;20)(p15;q13.3).

Positional cloning was performed using FISH-, mini-FISH and Southern-Blot techniques.

In addition I was able to generate breakpoint-spanning fragments, which were sequenced

for exactly genomic mapping of the breakpoints.

Afterwards I analysed the expression of the identified candidate gene with RT- and

Real-Time-PCR on lymphoblastoid cell lines as well as in several human fetal and adult

tissue. In addition I have done tissue-in-situ-hybridization on mouse-embryos of different

age and kidney and brain sections of newborn and adult mice.

Furthermore I performed ST5 mutational analysis in a total of 230 patients with a

comparable phenotype to the translocation-patient.

5

Results

FISH-, mini-FISH- and Southern-Blot analyses narrowed down the breakpoint region to

fragments, usuable to generate breakpoint-spanning amplicons. These amplicons were

sequenced and therefore it was possible to exactly map the breakpoint on both derivative

chromosomes. The chromosomal break on chromosome 20 did not occur within any known

or putative genes. In contrast the breakpoint on chromosome 11 was located within the

5-prime UTR region of the ST5 -gene, separating the complete coding region from its

promoter region.

RT- and Real-Time-PCR analyses showed ST5 not expressed in lymphoblastoid cell

lines. Because I only had patient material from LCL, it was not possible to investigate

if disruption of ST5 results in haploinsufficiency. I also performed Real-Time-PCR on

human fetal and adult tissues. I saw a relatively uniform expression pattern in fetal

tissues. In contrast, expression in most adult tissues was lower than in the corresponding

fetal tissues, except adult brain, kidney and skeletal muscle with 2.5 to 3 times higher

expression levels compared to the respective fetal tissues.

In addition I found increased expression of St5 during development using tissue-in-situ-

hybridization on mouse-embryos of different age. St5 was expressed in the ventricular

and the marginal zone of the frontal cortex of E15 embryos. In newborn mice St5 specific

signals were also detectable in developing tubular structures of the kidney. In adult mice

St5 was expressed in the cortex, the hippocampal regions and the cerebellum.

ST5 mutational analysis only showed missense-mutations which alltogether were from

parents inherited variants.

Conclusions

Through narrowing down the breakpoints of the translocation t(11;20)(p15;q13.3), ST5

was identified as a candidate gene for syndromic mental retardation. RNA-in-situ-

hybridization in mouse suggest an important role for St5 during brain development,

especially in formation of cortex layers and neuron migration. Thus defects in ST5 could

lead to dysfunction of neuron migration and hence may result in mental retardation

or seizures. These effects could be explained by the possible regulatory function of the

ST5 gene in the MAPK/ERK2 signalling pathway. This pathway affects cell growth, cell

differentiation and cell devision as well as cytoskeletal organization. The cleft palate and

the kidney malformation could also be explained through regulation of these signalling

6

pathway.

Other proteins containing DENN-domains like ST5 are delineated to be involved in

vesicle formation and release, particularly in neurons. Therefore ST5 may regulate

neurotransmitter release and defects in this gene could result in disturbance of signal

transmission. Hence this mechanism is supposed to lead to neuronal symptoms as well as

to sensorineural hearing loss.

7

Kapitel 2

Einleitung

2.1 Mentale Retardierung

Unter mentaler Retardierung (MR) versteht man eine Storung der geistigen Entwicklung

eines Kindes, welche sich in einem Ruckstand der kognitiven, sprachlichen und sozialen

Fahigkeiten zeigt. Zusatzlich sind die Kontaktfahigkeit, die Konzentration und Aufmerk-

samkeit, das Gedachtnis sowie die emotional-affektiven Emotionen und damit die soziale

Kompetenz der Kinder beeintrachtigt (International Classification of Disease, ICD). An-

hand des Intelligenzquotienten (IQ), welcher durch standardisierte alters-abhangige Tests

ermittelt wird, lassen sich bei den Patienten mit mentaler Retardierung verschiedene

Schweregrade unterscheiden (siehe auch Tabelle 2.1 auf der nachsten Seite) [78]. Dabei

ist die mentale Retardierung als eine primare Storung der geistigen Entwicklung deutlich

von der Demenz, bei der durch einen Krankheitsprozess bereits erworbene kognitive und

soziale Fahigkeiten verloren gehen, abzugrenzen.

Man geht heute von einer Pravalenz der mentalen Retardierung von etwa 2-3% in den

Industrielandern aus [74]. Je nach Studie variieren diese Angaben jedoch stark (1-10%)

[16, 23, 7, 57, 62]. Die mentale Retardierung stellt sowohl einen großen Kostenfaktor fur

die Gesundheitssysteme [62], als auch eine enorme Herausforderung fur die Familien der

Betroffenen dar. Dabei schrankt die starke Abhangigkeit der Kinder und die haufig notige

8

Tabelle 2.1: Einteilung der mentalen Retardierung anhand des IQs

IQ Grad der Behinderung

70-85 Lernbehinderung

50-69 leicht

35-49 maßig

20-34 schwer

<20 sehr schwer

intensive Pflege die personlichen Freiheiten sowie die sozialen Kontakte der Angehorigen

stark ein. Ein weiter bestehender Kinderwunsch wird durch die Eltern aus Angst vor einem

moglichen Wiederholungsrisiko haufig nicht verwirklicht. Daher ist es fur viele Familien mit

betroffenen Kindern sehr wichtig, dass die der mentalen Retardierung zugrunde liegende

Veranderung gefunden wird und somit eine genaue Angabe des Wiederholungsrisikos oder

eine pranatale Diagnostik in einer erneuten Schwangerschaft ermoglicht wird. Zudem wird

durch die Erforschung der genetischen Ursachen der mentalen Retardierung die Grundlage

fur die langerfristige Entwicklung ursachlicher therapeutischer Strategien ermoglicht.

Leider stellt die ursachliche Klarung einer mentalen Retardierung auch heute noch eine

Herausforderung fur die behandelnden Arzte dar, weil die Anzahl der zugrunde liegen-

den Erkrankungen enorm und die Moglichkeiten einer Diagnostik zahlreich sind. Die Lis-

te reicht von genetischen Ursachen, wie Chromosomenanomalien (z.B. Trisomie 21) und

Stoffwechselerkrankungen (z.B. Phenylketonurie, Galaktosamie), bis hin zu Folgen von

pra- und perinatalen Infektionskrankheiten oder hypoxischen Ereignissen wahrend der

Geburt (siehe auch Tabelle 2.2 auf der nachsten Seite). Alleine in der OMIM-Datenbank

(Online Mendelian Inheritance in Man; NCBI) existieren mittlerweile 1602 Eintrage, die

in Zusammenhang mit einer mentalen Retardierung stehen. Allerdings gelang bisher erst

die Identifizierung von 636 Genen (Stand Oktober 2009).

Den Angaben der American Psychiatric Association zufolge, liegt in den meisten Fallen

einer geistigen Behinderung (ca. 85%) eine milde mentale Retardierung vor. Haufig bleibt

jedoch gerade in diesen Fallen die Diagnose unklar. Wahrend bei maßiger und schwerer

mentaler Retardierung in fast 65% der Falle die Ursache geklart werden kann, bleiben fast

9

Tabelle 2.2: Ursachen der mentalen Retardierung nach Curry et al. [16]

Ursache der mentalen Retardierung Haufigkeit in %

Chromosomenanomalien 4-28

Syndromale Erkrankungen 3-7

Monogene Erkrankungen 4-14

Komplikationen von Fruhgeburtlichkeit 2-10

Umwelteinflusse und Teratogene 5-13

metabolische/endokrine Ursachen 1-5

unbekannt Ursache 30-50

80% der Falle mit milder Retardierung ohne fassbare Diagnose [38, 23]. Mit der Starke der

Retardierung variiert auch der Anteil an bekannten genetischen Ursachen fur eine mentale

Retardierung. Bei einer milden Form betragt der Anteil etwa 10%, bei schweren Formen

hingegen macht er bis zu 47% der Falle aus [13, 23]. Die zehn haufigsten genetischen

Ursachen fur eine mentale Retardierung nach Moser et al. werden in Tabelle 2.3 zusam-

mengefasst [57]. Die Frequenz der bei 670 Patienten mit mentaler Retardierung gestellten

Diagnosen nach Rauch et al. werden in Tabelle 2.4 auf der nachsten Seite gezeigt.

Tabelle 2.3: Die 10 haufigsten genetischen Ursachen fur MR nach Moser et al.

[57]

Ursache der mentalen Retardierung Inzidenz pro 1000

Trisomie 21 1,3

47 XXX 1,0

47 XXY 0,8

Fragiles-X-Syndrom 0,6

Neurofibromatose 0,3

kongenitale Hypothyreose 0,25

Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangel 0,17

Muskeldystrophie Duchenne 0,15

Trisomie 18 0,15

Trisomie 13 0,13

10

Tabelle 2.4: Haufige Diagnosen bei MR nach Rauch et al. [60]

Diagnose Frequenz in 670

untersuchten Fallen

Trisomie 21 (Down-Syndrom) 9,2%

Mikrodeletion 22q11.2 (typisch 3Mb) 2,4%

Williams-Beuren-Syndrom 1,3%

Fragiles-X-Syndrom 1,2%

Cohen-Syndrom 0,7%

Monosomie 1p36.3 0,6%

Angelman-Syndrom 0,4%

Coffin-Lowry-Syndrom 0,4%

Neurofibromatose Typ 1 0,4%

Prader-Willi-Syndrom 0,4%

Atypische distale Mikrodeletionen 22q11.2 0,3%

Coffin-Siris-Syndrom 0,3%

Kabuki-Syndrom 0,3%

Mukopolysaccharidosen 0,3%

Pallister-Killian-Syndrom 0,3%

Smith-Lemli-Opitz-Syndrom 0,3%

Sotos-Syndrom 0,3%

Smith-Magenis-Syndrom 0,3%

Trisomie 13 (Pateau-Syndrom) 0,3%

In einer Studie an 670 Patienten mit mentaler Retardierung bzw. Entwicklungsverzogerung

zeigte Rauch et al. [60], dass mit 9,2% das Down-Syndrom die haufigste Ursache einer men-

talen Retardierung ist. Bei bis zu 18% der Patienten konnten durch ein konventionelles

Karyogramm sichtbare chromosomale Aberrationen als Ursache fur die geistige Behinde-

rung nachgewiesen werden. Mittels molekularer Karyotypisierung konnten bei weiteren

7% der Patienten sichtbare kryptische Chromosomenveranderungen, bei etwa 5% mono-

gene Erkrankungen, bei 0,3% uniparenterale Disomien und bei etwa 0,6% chromosomale

Mosaike als der geistigen Behinderung zugrunde liegende Veranderung nachgewiesen wer-

den. Mit 5,2% konnten als eine der haufigsten Ursachen fur MR Mikrodeletionssyndrome,

11

Array Technik 6,6%

Mikrodeletionssyndrome 5,3%

Monogene Erkrankungen 4,8%

Segmentale Chromosomen-Aneusomien 4,7%

Unbekannte Ursache 59,3%

Numerische Chromosomenanomalien 11,3%

UPD 0,3%Mosaik-Trisomien 0,6%

Balancierte Aberrationen 0,6%

Mendelnde Erbgaenge 2,7%Syndromale Erkankungen 1,3%

Exogene Ursachen 1,3%Subtelomerische Rearrangements 1,3%

Abbildung 2.1: Ursachen der mentalen Retardierung nach Rauch et al. [60]

wie z.B. eine Deletion 22q11.2 oder ein Williams-Beuren Syndrom nachgewiesen werden.

Diese wurden in alteren Studien, wie z.B. bei Curry et al. [16], nicht gefunden, da die

Patienten nicht auf diese Veranderungen hin untersucht wurden. Zusammenfassend muss

gemaß dieser Studie davon ausgegangen werden, dass ca. 29% der Patienten mit mentaler

Retardierung oder Entwicklungsverzogerung eine chromosomale Imbalance aufweisen. Nur

etwa die Halfte davon ist zytogenetisch nachweisbar, die andere Halfte stellen kryptische

Veranderungen dar. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Abbildung 2.1 dargestellt und

unterscheiden sich deutlich von den alteren Studien wie z.B. Curry et al. [60, 16]. Diese

Diskrepanz lasst sich durch die Entwicklung neuer molekular-zytogenetischer Analyseme-

thoden wie der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und der molekularen Karyoty-

pisierung erklaren, welche bei den alteren Studien noch nicht zur Verfugung standen.

2.2 Chromosomenanomalien

Unter Chromosomenanomalien versteht man zytogenetisch sichtbare Veranderungen der

Chromosomen [76, S. 51]. Wie hoch dabei die Auflosung ist, also letztlich welche Große

einer Veranderung noch nachweisbar ist, hangt dabei stark von der verwendeten Tech-

nik ab. Grundsatzlich kann man zwei Arten der Chromosomenanomalien unterscheiden.

Zum einen finden sich Veranderungen der Chromosomenzahl (numerische Anomalien) und

zum anderen Veranderungen der Gestalt der Chromosomen (strukturelle Anomalien). Zu-

dem ist es wichtig zu unterscheiden, ob sich eine Chromosomenanomalie in allen Zellen

12

des Korpers findet (konstitutionelle Anomalie), oder ob nur einige Zellen oder Gewebe

die Veranderung tragen (somatische Anomalie). Individuen mit somatischen Aberrationen

werden als Mosaik-Individuen bezeichnet. Sie bestehen aus Zellen mit unterschiedlichen

Chromosomensatzen, obwohl diese Zellen alle aus der gleichen Zygote entstanden sind.

2.2.1 Numerische Aberrationen der Chromosomen

Die haufigste Ursache fur Anomalien der Chromosomenzahl stellt die Non-Disjunction

dar. Darunter versteht man die Nicht-Trennung homologer Chromosomen bzw. Schwes-

terchromatiden wahrend der ersten oder zweiten Reifeteilung der Meiose. Somit kommt es

bei den entstehenden Keimzellen (Gameten) zu einer veranderten Chromosomenanzahl,

was meist gravierende, in der Regel sogar letale Auswirkungen hat. Man unterscheidet

drei verschiedene Klassen von numerischen Aberrationen: Polyploidien, Aneuploidien und

Mixoploidien. Als Polyploidie bezeichnet man eine Vervielfachung des kompletten Chro-

mosomensatzes. Bei etwa 1-3% der Schwangerschaften liegt ein triploider, also dreifacher

Chromosomensatz vor. In der Regel entstehen Triploidien durch die Befruchtung einer Ei-

zelle mit zwei Spermien. Auch Tetraploidien werden gelegentlich beobachtet. Polyploidien

sind meist nicht mit dem Leben vereinbar und enden letal.

Aneuploidie bezeichnet den Zugewinn (Trisomie) oder Verlust (Monosomie) einzelner

Chromosomen. Wie bereits in Abschnitt 2.1 auf Seite 7 beschrieben, stellt die Trisomie 21,

bei der das Chromosom 21 drei Mal vorhanden ist, die haufigste genetische Ursache fur

eine mentale Retardierung dar. Monosomien sind, wenn sie die Autosomen betreffen, meist

bereits in der Embryonalphase letal. Unter Mixoploidie versteht man das Vorhandensein

mehrerer, genetisch differenter Zelllinien in einem Individuum. Diese verschiedenen Zellpo-

pulationen konnen zum einen aus der gleichen Zygote entstanden sein (Mosaik) oder aber

aus unterschiedlichen Zygoten stammen (Chimare). Es kann sich bei den Veranderungen

sowohl um Aneuploidien, als auch um Polyploidien handeln. Oft sind numerische Aber-

rationen in reiner Form letal, als Mosaik jedoch, mit starken Einschrankungen, mit dem

Leben vereinbar.

13

2.2.2 Strukturelle Aberrationen der Chromosomen

Bei strukturellen Aberrationen wird durch Bruche innerhalb der Chromosomen deren Ge-

stalt verandert. Diese Bruche enstehen zum einen durch schadigende Einflusse auf die

DNA (z.B. Strahlung, Chemikalien), zum anderen aber auch durch die Rekombinationser-

eignisse wahrend der Meiose. Normalerweise werden diese Chromosomenbruche repariert

und falls dies nicht gelingt, die Apoptose der Zelle eingeleitet. Strukturelle Anomalien

entstehen, wenn dieser Reparaturmechanismus nicht richtig funktioniert. An den Kon-

trollpunkten des Zell-Zyklus wird nur uberpruft, ob freie Chromosomenenden vorhanden

sind. Haben sich solche freien Enden jedoch vorher mit anderen verbunden, entgeht dieser

Defekt den Reparaturmechanismen. In der Regel sind azentrische Chromosomen (ohne

Zentromer) oder dizentrische Chromosomen (mit zwei Zentromeren) instabil, segregieren

nicht und gehen irgendwann verloren. Monozentrische Chromosomen jedoch konnen uber

zahlreiche Mitosen bestehen bleiben. Abhangig von der Anzahl der Chromosomenbruche

und der beteiligten Chromosomen, ist eine Vielzahl an Rearrangements denkbar (siehe

auch Tabelle 2.5).

Tabelle 2.5: Strukturelle Chromosomenaberrationen nach Strachan und Read

[76]

Anzahl der

Bruche

Ein beteiligtes Chromosom Zwei beteiligte Chromosomen

1 terminale Deletion -

2 interstitielle Deletion

Inversion

Ringchromosom

Duplikation oder Deletion durch

ungleichen

Schwesterchromatid-Austausch

reziproke Translokation

Robertson´sche Translokation

Duplikation oder Deletion durch

ungleiche Rekombination

3 verschiedene Rearrangements

(Inversion mit Deletion

intrachromosomale Insertion)

interchromosomale Insertion

Man unterscheidet balancierte strukturelle Veranderungen, bei denen es zu keinerlei Zu-

14

(a) Reziproke Translokation (b) Terminale Deletion (c) Parazentrische In-

version

(d) Duplikation (e) Insertion

Abbildung 2.2: Schema struktureller Chromosomenaberrationen

gewinn oder Verlust von Chromosomenmaterial kommt (z.B. Translokationen, Inversio-

nen) von unbalancierten Anomalien, bei denen Chromosomenmaterial verloren geht oder

zusatzlich vorhanden ist (z.B. Deletionen, Duplikationen) (siehe Abbildung 2.2). Dabei

haben normalerweise die balancierten Chromosomenanomalien keine Auswirkung auf den

Phanotypen, es sei denn, es wird durch den Bruch ein wichtiges Gen unterbrochen, die

Expression eines Gens durch den Bruch beeinflusst oder aber durch eine Translokation

mit einem X-Chromosom die X-Inaktivierung beeinflusst.

2.3 Identifizierung von krankheitsverursachenden Genen

mittels Positionsklonierung

Wenige Gebiete haben sich so schnell weiterentwickelt wie die Identifizierung menschlicher

Krankheitsgene. Vor 1980 waren nur sehr wenige Gene, und diese unter enormen Aufwand,

als eine bestimmte Krankheit verursachend identifiziert. Seit dem wurde durch die Ent-

deckung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), die Einfuhrung von Linkage-Analysen

und die Moglichkeit eines Mutationsscreenings die Aufdeckung krankheitsverursachender

Gene erleichtert und es konnten zahlreiche Gene identifiziert werden [76, S. 416]. Da nun

15

das Humane Genomprojekt und weitere Genomprojekte eine große Zahl von Resourcen

zur Verfugung stellen, hangt die Fahigkeit ein mendelndes Krankeitsgen identifizieren zu

konnen heute fast vollstandig davon ab, dass man geeignete Familien oder Patienten-

kohorten zur Verfugung hat [46]. Die Identifizierung von Faktoren, die eine Anfalligkeit

(Suszeptibilitat) gegenuber verbreiteten komplexen Erkrankungen verursacht, bleibt aber

auch weiterhin schwierig.

2.3.1 Positionsunabhangige Methoden zur Identifizierung von Krank-

heitsgenen

Fur die Suche nach einem krankheitsverursachenden Gen kommen mehrere Methoden in

Frage. Zum einen eine positionsunabhangige Suche, bei der das Gen z.B. uber ein be-

kanntes Proteinprodukt identifiziert werden kann. Auf diese Weise war es z.B. moglich,

dass fur die Sichelzell-Anamie verantwortliche Gen durch das Wissen uber das entspre-

chende Genprodukt β-Globulin zu finden [21, 56, 22, 77]. Krankheitsverursachende Gene

lassen sich jedoch auch uber die Verwendung von Tiermodellen identifizieren. So konn-

te beispielsweise bei Mitf -Gen-Maus-Mutanten ein Waardenburg-Syndrom vom Typ 2

beobachtet werden. Daraufhin wurde das homologe Gen beim Menschen bei Patien-

ten mit Waardenburg-Syndrom vom Typ 2 untersucht und dort krankheitsverursachen-

de Veranderungen nachgewiesen [37]. Als weitere Methode der Gen-Identifizierung gibt

es die Verwendung positionsunabhangiger DNA-Sequenz-Informationen. Eine interessante

Anwendung positionsunabhangiger DNA-Sequenzinformationen ist der Versuch, Gene zu

klonieren, die neue verlangerte Trinukleotidwiederholungen enthalten. Solche Trinukleotid-

wiederholungen verursachen verschiedene neurologische Storungen, die haufig im Laufe der

Generationen in einer immer fruheren Lebensphase auftreten und einen schwereren Ver-

lauf zeigen (Antizipation). Durch Klonierungsverfahren oder den Nachweis verlangerter

repetitiver Triplettsequenzen lassen sich diese Trinukleotidwiederholungen in genomischer

Gesamt-DNA von Patienten nachweisen [68, 43]. Durch dieses Verfahren gelang es z.B.

das der Spinocerebellaren Ataxie Typ 8 (SCA8) zugrundeliegende Gen zu identifizieren

[44].

16

2.3.2 Positionsklonierung

Eine weitere Moglichkeit der Suche nach einem Krankheitsgen ist die Positionsklonierung,

bei der ein krankheitsverursachendes Gen nur uber seine chromosomale Lage identifiziert

wird [76, S. 418]. Das erste auf diese Weise identifizierte Gen war das fur die X-gebundene

chronische Granulomatose verantwortliche Gen [64]. Der Erfolg der Positionsklonierung

hangt sehr stark von der Große der Kandidatenregion ab. Bevor durch das Humane Ge-

nomprojekt das menschliche Genom komplett sequenziert wurde und Genkarten erstellt

werden konnten, war es notig, dass die Kandidatenregion eng eingegrenzt wurde. Durch die

Fortschritte in den letzten Jahren und die Entwicklung neuer Analysemethoden konnen

nun auch großere Abschnitte erfolgreich bearbeitet werden. Fur die Eingrenzung der Kan-

didatenregion kommen verschiedene Methoden in Frage, z.B. Kopplungsanalysen oder aber

die Analyse von Chromosomenanomalien.

2.3.2.1 Kopplungsanalyse

Bei einer Kopplungsanalyse werden moglichst viele genetischen Marker eines Chromosoms

untersucht und analysiert, wie haufig sich diese bei Rekombinationsereignissen getrennt

haben. Gene auf verschiedenen Chromosomen segregieren unabhangig voneinander so dass

am Ende der Meiose 50% rekombinate und 50% nicht-rekombinante Gameten entstehen.

Liegen zwei Gene auf dem gleichen Chromosom, so werden sie nur durch Crossing-Over

voneinander getrennt. Je naher die Gene aneinander liegen, desto unwahrscheinlicher ist

die Trennung bei einem Rekombinationsereignis. Man spricht in diesem Fall von Genkopp-

lung. Kleine Gruppen von Allelen bilden dabei Blocke, die als solche auch vererbt werden.

Diese Allelblocke werden als Haplotypen bezeichnet [76, S. 398]. Die Kopplungsanalyse

ist die Analyse dieser Haplotypen, wobei mit Hilfe von polymorphen Markern die Ver-

erbung eines chromosomalen Bereichs innerhalb einer Familie verfolgt werden kann. Auf

diese Weise konnen fur eine Erkrankung in Frage kommende chromosomale Bereiche ein-

gegrenzt werden und in diesen nach Kandidatengenen gesucht werden. Allerdings hangt

die Auflosung der Kopplungsanalyse stark von der Anzahl der untersuchten Meiosen ab.

Je mehr Meiosen untersucht werden konnen, desto großer ist die Chance, dass Rekombina-

tionsereignisse aufgetreten sind, welche den chromosomalen Bereich weiter eingrenzen [76,

17

S. 408]. Somit sind fur eine gute Auflosung von Kopplungsanalysen in der Regel großere

Familien notig. Als Beispiel fur den Erfolg einer Kopplungsanalyse sei hier die Identifi-

zierung des der cystischen Fibrose zugrunde liegenden CFTR-Gens in der chromosomalen

Region 7q31.2 genannt [39].

2.3.2.2 Ausnutzen von Chromosomenanomalien

Außerdem ist es moglich, krankheitsverursachende Gene uber Chromosomenanomalien zu

identifizieren. Dieses Verfahren macht man sich insbesondere zur Aufklarung seltener do-

minanter Erkrankungen, bei denen es nur wenige Betroffene innerhelb einer Familie gibt,

zunutze. Dabei kann man sowohl große, zytogenetisch sichtbare Veranderungen, wie z.B.

balancierte Translokationen oder Insertionen, aber auch submikroskopische Deletionen und

kryptische Translokationen fur weitere Analysen heranziehen [76, S. 423]. Großere Dele-

tionen sind in der Regel schwer zu beurteilen, da die komplette Deletionsregion fur den

Phanotypen ursachlich sein kann. Mikrodeletionen hingegen sind sehr gut fur die Identifi-

zierung krankheitsverursachender Gene geeignet, da die deletierten Regionen in der Regel

sehr klein sind und somit wenige Gene enthalten und Mikrodeletionen zudem als Ursache

fur zahlreiche Syndrome vermutet werden. Durch die weitere Analyse einer Mikrodeleti-

on konnte z.B. das dem Pitt-Hopkins-Syndrom zugrunde liegende TCF4 -Gen identifiziert

werden [80]. Interessant fur die Suche nach Kandidatengenen fur eine geistige Behinderung

sind kryptische Chromosomenanomalien. Unter einer kryptischen Chromosomenanomalie

versteht man kleine balancierte und unbalancierte Rearrangements insbesondere der Sub-

telomerregionen der Chromosomen, welche mit der konventionellen Chromosomenanalyse

nicht erfasst werden konnen. Wie bereits in Abschnitt 2.1 auf Seite 7 beschrieben, werden

nur bei 15% der Betroffenen in der konventionellen Chromosomenanalyse chromosoma-

le Aberrationen nachgewiesen [60]. Aus diesem Grund wird bei Patienten mit mentaler

Retardierung und normalem Karyotyp heute in der Regel ein sog. Subtelomerscreening

durchgefuhrt. Das ist eine FISH- oder MLPA-Analyse der Subtelomerbereiche aller Chro-

mosomen, mit Ausnahme der klinisch nicht bedeutsamen kurzen Arme der akrozentrischen

Chromosomen.

18

Von besonderem Interesse sind dabei balancierte Veranderungen, welche bei 0,6% der MR-

Patienten nachgewiesen werden konnen [60], bei denen normalerweise kein Zugewinn oder

Verlust von Chromosomenmaterial auftritt und somit auch kein pathologischer Phanotyp

zu vermuten ware. Dennoch zeigen ca. 6% der Trager solcher balancierten Veranderungen

einen krankhaften Phanotyp [11]. Fur diese Beobachtung gibt es drei Erklarungen. Zum

einen kann das Auftreten der Chromosomenanomalie und des Phanotypen coinzident sein,

also der Erkrankung noch eine andere Ursache zugrunde liegen als die chromosomale Aber-

ration. Zum anderen kann es aber auch sein, dass das chromosomale Rearrangement nicht

balanciert ist, sondern es zu einem zytogenetisch nicht sichtbaren Zugewinn oder Verlust

von Chromosomenmaterial gekommen ist [10]. Eine weitere denkbare Erklarung ist, dass

durch den Bruchpunkt selbst die Erkrankung verursacht wird. Durch einen Bruch in der

codierenden Sequenz eines Gens oder durch die Separation eines Gens von seinen regu-

latorischen Sequenzen durch den Bruch kann es z.B. zu einem loss-of-function Phanotyp

kommen. Durch das Zusammenspleißen von Exons zweier verschiedener Gene kann es zu

Fusionsproteinen und moglicherweise zu einem gain-of-function Phanotyp kommen [76,

S. 424]. Zudem ist es moglich, dass durch eine Bruchstelle die Chromatin-Struktur oder

die DNA-Kondensation verandert wird und damit Gene mehrere hundert Kilobasen vom

Bruchpunkt entfernt noch beeinflusst werden.

Bei Nutzung solcher Chromosomenanomalien zur Identifizierung von Genen muss immer

berucksichtigt werden, dass nur ein Allel pathologisch verandert ist, das zweite Allel ist in

der Regel normal. Somit kommt es nur dann zu einem phanotypischen Effekt, wenn die

Verminderung der Genfunktion mindestens 50% betragt, man spricht in diesem Fall von

Haploinsuffizienz [76, S. 425]. Die einfachste Methode zur Bruchpunktkartierung stellt die

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) dar. Damit konnte z.B. das krankheitsverursa-

chende Gen beim Sotos-Syndrom anhand eines Patienten mit typischem Phanotyp und

einer balancierten Translokation aufgeklart werden [45]. Ein weiteres Beispiel ist die die

Identifizierung des SUMO1 -Gens bei einem Patienten mit Lippen- und Gaumenspalte und

einer balancierten Translokation zwischen den Chromosomen 8 und 2 (siehe Abbildung 2.3

auf der nachsten Seite) [2].

19

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Abbildung 2.3: Positionsklonierung des SUMO1 -Gens nach Alkuraya et al. [2]

Gezeigt sind die durch die Autoren verwendeten BAC-Klone und Long-Range-PCR-Produkte, die zur

Eingrenzung des Bruchpunktes auf ein ca. 4 kb großes Intervall auf dem derivativen Chromosom 8 gefuhrt

haben.

2.3.3 Bestatigung eines positionellen Kandidatengens

War es moglich, ein oder mehrere Kandidatengene zu identifizieren, sind weitere Analysen

notig, um den Verdacht, dass dieses Gen krankheitsverursachend ist, zu beweisen. Moglich

ist dies z.B. in dem man ein Mutationsscreening an einem Patientenkollektiv durchfuhrt.

Konnen dabei Mutationen in mehreren, nicht-verwandten Patienten nachgewiesen werden,

so gibt dies starke Hinweise, dass es sich um das gesuchte Gen handelt. Desweiteren sind

Untersuchungen an Zelllinien, z.B. mit der Wiederherstellung des normalen Phanotypen in

vitro, oder aber Mausmodelle zur Aufklarung der Frage, ob das gefundene Kandidatengen

auch das krankheitsverursachende Gen ist, hilfreich [76, S. 428].

Insgesamt hat die Identifizierung von krankheitsassoziierten Genen einen hohen Stellen-

wert in der wissenschaftlichen Forschung. Mit der Verbesserung des Wissens uber die

Grundlagen einer Erkrankung ist es moglich, eine entsprechende Routinediagnostik zu

entwickeln und diese zu verbessern. Zudem ist es nur moglich ein grundlegendes pathoge-

netisches Verstandnis fur eine Erkrankung zu entwickeln, wenn auch das zugrunde liegen-

de Gen identifiziert werden konnte. Dieses Wissen konnte dann fur die Entwicklung neuer

20

Therapieansatze fur eine Vielzahl von genetisch bedingten Krankheiten genutzt werden.

2.4 Ziel der Arbeit

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Identifizierung eines neuen Gens fur syndromale men-

tale Retardierung. Die Grundlage der Arbeit stellte dabei ein Patient mit einer balancier-

ten Translokation t(11;20) bei syndromaler MR dar. Das erste Ziel bestand in der Bruch-

punktfeinkartierung mittels FISH- und Mini-FISH-Analysen, Southern-Blot-Analysen und

bruchpunktuberspannender Sequenzierung.

Falls durch dieses als Positionsklonierung bezeichnete Verfahren die chromosomale Regi-

on naher eingegrenzt und ein Kandidatengene identifiziert werden kann, sollte sich ein

Mutationsscreening dieses Gens in einer passenden Patientenkohorte anschließen. Das

Kandidatengen sollte dann mittels Expressionsanalysen an verschiedenen menschlichen

Geweben weiter charakterisiert werden. Da aufgrund des Phanotyps beim Patienten auch

eine embryonal wichtige Rolle des Kandidatengens anzunehmen war, sollte außerdem die

Expression an Mausembryonen mittels Tissue-in-situ-Hybridisierung uberpruft werden.

21

Kapitel 3

Material und Methoden

3.1 Patienten

3.1.1 Patient mit de novo Translokation

Der bei Vorstellung in der genetischen Sprechstunde 7jahrige Patient ist das dritte Kind

gesunder, nicht blutsverwandter Eltern. Pranatal fielen eine einseitige multizystische Niere

sowie ein pathologischer Triple-Test auf. Aus diesem Grund wurde eine Chorionzottenbi-

opsie durchgefuhrt, welche jedoch einen unauffalligen mannlichen Karyotyp zeigte. Der

weitere Schwangerschaftsverlauf gestaltete sich komplikationslos. Bei der Geburt des Jun-

gen in der 38. Schwangerschaftswoche lag seine Lange mit 51 cm zwischen der 25. und der

50. Perzentile, sein Gewicht entsprach mit 3490 g etwa der 50. Perzentile und sein Kopfum-

fang mit 34 cm etwa der 75. Perzentile. Die Apgar-Werte wurden mit 6 und 8 angegeben.

Im Alter von acht Wochen wurde ein persistierender Ductus arteriosus Botalli diagnos-

tiziert. Im weiteren Verlauf zeigte sich eine deutliche Entwicklungsverzogerung und eine

schwere mentale Retardierung. Der Patient erlernte erst mit ca. 18 Monaten das Sitzen.

Mit 3� Jahren konnte er weder sprechen noch laufen, jetzt, im Alter von 7 Jahren, konnte

er immer noch nicht sprechen aber mit Orthesen war ein selbststandiges Gehen moglich.

Der Patient wird wegen Absencen und fokalen Anfallen mit sekundarer Generalisierung

anti-epileptisch therapiert. Die Einstellung auf entsprechende Medikamente gestaltet sich

22

jedoch sehr schwierig. Desweiteren wurde bei ihm eine beidseitige Innenohrschwerhorigkeit

sowie eine submukose Gaumenspalte festgestellt und er zeigte eine starke Infektanfalligkeit.

Die im pranatalen Ultraschall multizystisch aussehende Niere entwickelte sich zur zystisch-

dysplastischen Niere. Der Patient bietet zudem faciale Dysmorphien mit hoher Stirn, hoch

geschwungenen Augenbrauen, Hypertelorismus, lateral ansteigenden Lidachsen, einem re-

lativ kleinen Mund, einem breiten Nasenrucken und einer knolligen Nasenspitze.

Aufgrund der im Alter von 3� Jahren offensichtlichen Entwicklungsverzogerung des Pa-

tienten und der unauffalligen pranatalen Chromosomananalysen, wurde ein Subtelomer-

Screening mit FISH durchgefuhrt (siehe auch Abbildung 3.1 auf der nachsten Seite). Das

Subtelomer-Screening sowie ein Chromosomen-Painting mit den Libraries fur die Chro-

mosomen 11 und 20 zeigte eine balancierte Translokation zwischen dem kurzen Arm von

Chromosom 11 und dem langen Arm von Chromosom 20, welche schließlich in Verbin-

dung mit der hochauflosenden GTG-Banderung der Chromosomenanayse den Karyotypen

46,XY,t(11;20)(p15;q13.3) ergab (siehe auch Abbildung 3.1 auf der nachsten Seite). Ent-

sprechende Untersuchungen der Eltern ergaben normale Befunde, so dass die Veranderung

beim Patienten de novo entstanden war. Zusatzlich wurde beim Patienten eine molekulare

Karyotypisierung mit einem 10 K SNP Array durchgefuhrt, welche keinen Hinweis auf ein

kryptisches Ungleichgewicht erbrachte.

3.1.2 Patienten fur die Kandidatengenanalyse

Zunachst wurden 96 Patienten mit milder mentaler Retardierung ungeklarter Ursache und

uberwiegend mit epileptischen Anfallen in der Anamnese zusammengestellt. Des Weiteren

wurden 96 Patienten mit schwerer geistiger Behinderung und 30 weitere Patienten mit va-

riablen Symptomkombinationen aus Gaumenspalte, mentaler Retardierung und Innenohr-

schwerhorigkeit sequenziert (siehe auch Tabelle 3.1 auf Seite 24). Acht weitere Patienten

wiesen nur eine Gaumenspalte auf.

23

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(a) Ideogramme der Chromosomen 11 und 20

(b) Chromosome painting mit den Libraries 11 und 20

Abbildung 3.1: Untersuchungsergebnisse vor Beginn der Arbeit

Neben den Ideogrammen der Chromosomen 11 und 20 sind Ausschnitte aus dem Karyogramm des Patien-

ten, welche die normalen, sowie die derivativen Chromosomen 11 und 20 zeigen, zu sehen (Abbildung (a)).

Die Klammern geben dabei den ungefahren Umfang der translozierten Bereiche an. Abbildung (b) zeigt

das Ergebnis des Chromosome-Painting mit den Libraries fur die Chromosomen 11 und 20. Dabei wurden

die Sonden gegen das Chromosom 11 grun und Sonden gegen das Chromosom 20 rot markiert.

24

Tabelle 3.1: Symptomkombinationen bei den untersuchten Patienten

Untersuchte

Patienten

MR Epilepsie Gaumen-

spalte

Schwer-

horigkeit

Sonstige Sym-

ptome

96 Patienten x 58 - - -

96 Patienten x - - - -

8 Patienten - - x - -

16376 x - x - Dysmorphien

20084 x - - - -

23107 x x - x Kleinwuchs

25194 x - - - Kleinwuchs

15852 x - x - Adipositas, Dys-

morphien, Zy-

klusstorung

19758 x - x - Mikrozephalie, In-

fektneigung

20903 x x x - Dysmorphien,

Infektneigung

17617 x - x - -

13183 x - x - Dysmorphien, Adi-

positas

8981 x - - x Dysmorphien,

Kleinwuchs

17460 x - - x Dysmorphien, In-

fektneigung, ADS,

bds. Hodenhoch-

stand

17461 x - - x Dysmorphien

4203 x - - x Dysmorphien,

Laryngomalazie,

Skoliose

Fortsetzung auf der nachsten Seite

25

Untersuchte

Patienten


spalte

Schwer-

horigkeit

Sonstige Sym-

ptome

4830 - - - x VSD, ASD, Klein-

wuchs, musk. Hypo-

tonie

17732 x x - x Dysmorphien, Adi-

positas

7765 x - - x Autistische Zuge

17006 - - - x Entwicklungs-

verzogerung

18366 x x x - Dysmorphien, Aor-

tenisthmusstenose,

Infektneigung

25787 - - - x Entwicklungs-

verzogerung, musk.

Hypotonie

25164 x - x x multizystisch dys-

plastische Niere,

Hauptbronchusste-

nose

25564 x - - x Mikrozephalie

18713 x - - - Kleinwuchs, Hyper-

tonie

18714 x - - x Hypertonie

25085 x x x - Dysmorphien

27178 x x - - Dysmorphien

19472 x x - - -

30754 x - - - Mikrozephalie, In-

fektneigung

32367 x x - x Hypertonie

16449 x - - - Dysmorphien


26

Untersuchte

Patienten


spalte

Schwer-

horigkeit

Sonstige Sym-

ptome

18031 x x - - -

3.2 Methoden

3.2.1 Sequenzierung des Kandidatengens

3.2.1.1 Grundlagen der PCR

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction; PCR) ist eine haufig verwen-

dete Methode, die Mitte der 80er Jahre entwickelt wurde und die Gentechnik revolutionier-

te. Mit ihr ist es moglich, praktisch unbegrenzt Kopien einer spezifischen Nukleotidsequenz

in vitro zu generieren.

Die Synthese erfolgt zyklisch bei gleichzeitiger Vermehrung beider komplementarer Strange

[14, S. 42]. Die PCR-Methode kommt dabei ohne Klonierung aus, ist sehr schnell und

benotigt nur geringe Mengen an Ausgangsmaterial. Als Template kann rekombinante DNA

in verschiedenen Vektoren, genomische DNA, aber auch cDNA oder sogar bereits vorhan-

dene PCR-Produkte (nested PCR) eingesetzt werden [4, S. 148]. Mittlerweile wurde eine

Vielzahl an PCR-Methoden etabliert. Allen gemeinsam ist jedoch ein einfaches Grundprin-

zip, welches dem Reaktionsablauf der naturlichen Rekombination ahnelt. Eine Bedingung

fur die Anwendung der PCR ist, dass zumindest an den Endpunkten des gewunschten

Produktes die Sequenz bekannt ist, um spezifische Starter-Molekule (Primer) auswahlen

zu konnen. Diese Primer sind Oligonukleotide aus 15-30 Basen, die sich an den komple-

mentaren Strang und Gegenstrang des Templates anlagern konnen [76, S. 123]. Die Primer

binden bei einer ihnen spezifischen Schmelz-Temperatur (Annealing-Temperatur; meist

zwischen 50-70 ◦C) an die Einzelstrange der vorher bei 94 ◦C denaturierten Doppelstrang-

DNA. Es schließt sich dann eine Elongationsphase an, in der von den 3’-Enden der Pri-

mer aus eine hitzestabile DNA-Polymerase einen neuen Doppelstrang synthetisiert. Damit

eine Neusynthese von DNA-Strangen uberhaupt moglich ist, werden dem PCR-Ansatz die

27

Desoxynukleosid-Triphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP zugegeben. Die Synthese

erfolgt dann von beiden Primern an jedem Einzelstrang aus, so dass am Ende zwei Kopi-

en entstanden sind. Es folgen insgesamt 25-30 Zyklen aus Denaturierung, Annealing und

Elongation, wobei die jeweils neu entstandenen DNA-Kopien im nachsten Zyklus wieder

als Matrize dienen. So entstehen insgesamt ca. 105 Kopien der gewunschten DNA-Sequenz.

Als DNA-Polymerase dient haufig die Taq-Polymerase, ein hitzestabiles Enzym aus dem

in heißen Quellen lebenden Bakterium Thermophilus aquaticus, dessen optimale Arbeit-

stemperatur zwischen 68-75 ◦C liegt.

Die Spezifitat, Sensitivitat und Reproduzierbarkeit einer PCR ist stark vom Design der

verwendeten Primer abhangig. Man sollte die Annealing-Temperatur, die Sequenz an

den Primer-Enden, die Nukleotid-Zusammensetzung sowie die moglichen Primer/Primer-

Wechselwirkungen beachten. Die Basen an den 3’-Enden sollten moglichst wenig komple-

mentar sein, um einer Primer-Dimer-Bildung entgegen zu wirken. Außerdem sollten die

Primer frei von repetitiven Sequenzen sein, um ein unspezifisches Binden der Primer und

somit zusatzliche Amplifikations-Produkte zu vermeiden [76, S. 123]. Zudem ist es sinnvoll

Primer zu wahlen, die eine ahnliche Annealing-Temperatur besitzen. Es gibt verschiede-

ne Computer-Programme (z.B. Primer3), die dabei helfen, die Primer-Paare moglichst

optimal zu wahlen.

Die PCR wird heute im Allgemeinen in speziellen Thermo-Cyclern durchgefuhrt. Das

sind temperierbare Blocke mit beheizbaren Deckeln, in denen die Proben den zyklischen

Themperaturanderungen unterzogen werden. Die einzelnen Programme sind individuell

einstellbar und laufen dann uber eine automatische Steuerung ab.

3.2.1.2 Durchfuhrung der PCR

Zunachst wurden Großmutterplatten mit den 192 Patienten mit ungeklarter mentaler

Retardierung zusammengestellt (MR1- und MR2-Platte). Von diesen wurden maschinell

Tochterplatten angefertigt, die in jedem Well 50 ng DNA enthielten. Die getrockneten

Platten wurden bei -20 ◦C gelagert und standen so fur die PCR zur Verfugung.

28

Tabelle 3.2: Master-Mix der verwendeten Standard-PCR

Reagenzien Menge in �l

HPLC-Wasser 10,5

10x Puffer 2,5

MgCl2 0,75

DMSO 1,25

5x Betain 5,00

dNTPs 2,00

F-Primer (10 pmol/�l) 1,00

R-Primer (10 pmol/�l) 1,00

Taq-Polymerase 0,12

DNA (bei eingetrockneter DNA

mit HPLC-H2O auffullen)

1,00

Gesamtvolumen: 25�l

Fur die Amplifikation der kodierenden Exons (2-19) des ST5 -Gens wurden Primer an-

hand der Genbank-Sequenzen GI:51470970 und GI:51469381 und mit Hilfe der Version 3

der Primer Design Software des Whitehead Institute for Biomedical Research entworfen

und anschließend uber ”BLAT Search Genome“ mit der Sequenzdatenbank von UCSC

Genome Bioinformatics verglichen, um mogliche Polymorphismen innerhalb der Primer

auszuschließen und die Primer außerhalb von Repeat-Regionen zu platzieren.

Fur alle Primer-Paare konnten die gleichen PCR-Bedingungen verwendet werden. Es wur-

de ein Master-Mix hergestellt, der das Enzym Taq-Polymerase sowie die entsprechenden

Puffer der Firma Invitrogen und weitere PCR-Komponenten enthielt. Das Volumen wurde

auf 25�l pro Ansatz mit Wasser aufgefullt (siehe auch Tabelle 3.2). Dieser Mix wurde dann

auf die vorbereiteten MR1- bzw. MR2-PCR-Platten verteilt. Fur einzelne PCRs wurden

0,2ml Tubes verwendet, in die der Master-Mix vorgelegt und anschließend 1�l DNA zu-

gegeben wurde. Die Proben wurden dann in einen Thermo-Cycler gestellt und mit dem

Touch-Down-Programm TDL64-58 amplifiziert (siehe auch Tabelle B.3 auf Seite 157).

29

3.2.1.3 Gelelektrophorese

Zur Erfolgskontrolle einer abgelaufenen PCR eignet sich eine Gel-Elektophorese. DNA-

Molekule besitzen unter elektrophoretischen Bedingungen eine negative Ladung. Diese

entsteht durch die Ionisierung der Phosphatgruppen im Ruckgrat der DNA. Somit wan-

dern die DNA-Molekule in einer Elektrophorese immer von der Kathode in Richtung der

Anode. Die Beweglichkeit ist dabei abhangig von der Lange und der Konformation der

DNA. Die Elektrophorese ist prinzipiell fur die Analyse, sowie fur die praparative Isolie-

rung von doppel- und einzelstrangigen DNA-Fragmente, sowie von Plasmid-DNA geeignet

[20, S. 72]. Es finden zwei verschiedene Gelarten Anwendung, zum einen Agarose-Gele,

zum anderen Polyacrylamid-Gele. Zur Langenbestimmung der Fragmente wird stets ein

Großenstandard mitgefuhrt und die sichtbaren Banden damit verglichen.

Fur Molekule, die großer als 10 nm sind, ist die Elektrophorese in Agarose-Gelen gut

geeignet. Agarose ist ein Polysaccharid aus roten Meeresalgen, wird durch Aufkochen in

einer Pufferlosung gelost und geliert beim Abkuhlen. Dabei entstehen in Abhangigkeit der

verwendeten Konzentration unterschiedlich große Poren im Gel [20, S. 67] und es konnen

so Fragmente von 0,1-60 kb aufgetrennt werden.

Die Gele werden in der Regel durch Ausgießen in spezielle Gel-Kammern hergestellt, in

die vorher Kamme eingesetzt werden, so dass im festen Gel Taschen entstehen, in die

die Proben geladen werden konnen. Das fertige Gel liegt dann horizontal und vollstandig

von Pufferlosung umgeben in einer Elektrophoresekammer, an die eine Spannung angelegt

wird.

Nach Ablauf der Elektrophorese muss die DNA noch sichtbar gemacht werden. Am

haufigsten wird hierfur eine Ethidiumbromid-Farbung verwendet. Ethidiumbromid in-

terkaliert zwischen die Basen der Nukleinsauren und der Ethidiumbromid-Nukleinsaure-

Komplex wird schließlich unter UV-Licht im Bereich von 500-590 nm als rot-orange leuch-

tende Bande sichtbar [19, S. 80]. In Agarose-Gelen lassen sich so DNA-Mengen ab 5ng

sichtbar machen. Da Ethidiumbromid aufgrund seiner interkalierenden Eigenschaften ein

starkes Mutagen ist und beim Umgang damit entsprechende Vorsicht geboten ist, wird

versucht die eingesetzte Konzentration moglichst gering zu halten. Man ist zum Beispiel

30

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Abbildung 3.2: Gelelektrophorese der Amplikons des ST5 -Gens bei zwei

Patienten

dazu ubergegangen, das Ethidiumbromid nicht mehr im Nachhinein als Farbelosung zu

verwenden, sondern es wird direkt in das Agarose-Gel einpolymerisiert.

3.2.1.4 Aufreinigung des PCR-Produktes

Soll ein PCR-Produkt fur andere Zwecke weiter verwendet werden, ist es haufig notig,

ubrig gebliebene Nukleotide, Primer und storende Salze aus dem Reaktionsgemisch zu

entfernen. Die haufig zur Aufreinigung von Nukleinsauren verwendete Ethanol-Fallung ist

in diesem Fall nicht geeignet, da auch Oligonukleotide wie Primer mit ausgefallt und somit

nicht entfernt werden konnen [52, S. 470]. Ist im Agarose-Gel eine spezifische Bande zu er-

kennen, ist die chromatographische Reinigung durch Zentrifugation von Ionenaustauscher-

Saulen geeignet. Sollten mehrere Banden im Gel-Bild sichtbar sein, kann man die einzelnen

Banden aus dem Gel ausschneiden und durch Eluation der DNA aus dem Gel unspezi-

fische Produkte eliminieren. Fur die Aufreinigung einer großeren Proben-Anzahl gibt es

Verfahren, die durch Roboter vollautomatisch durchgefuhrt werden. Dazu wird das PCR-

Produkt in eine spezielle Filterplatte ubertragen und dann mittels Vakuum die Flussigkeit

mit den darin gelosten Primern, dNTPs und Salzen durch eine Ultrafiltrationsmembran

abgezogen. Fragmente mit einer Lange von mehr als 100 bp bleiben auf der Oberseite der

31

Membran zuruck, konnen in Puffer gelost und in eine neue Platte pipettiert werden. Wei-

terhin als Methode zur Aufreinigung sowohl großer als auch kleinerer Proben-Anzahlen ist

der Exonuclease-Verdau geeignet. Hierbei wird der Probe Exonuklease I sowie Antarkti-

sche Phosphatase zugesetzt und diese Mischung bei 37 ◦C inkubiert. Dabei werden durch

die Exonuklease I einzelstrangige DNA, also uberschussige Primer und durch die Antark-

tische Phosphatase freie Nukleotide abgebaut. Die beiden Enzyme werden schließlich bei

80 ◦C inaktiviert.

3.2.1.5 Grundlagen der Sequenzierung

Erste Sequenzierungen, also die Bestimmung der Basenfolge der DNA, wurden bereits

1977 durchgefuhrt. Damals waren sehr große Mengen an DNA erforderlich und es konn-

ten maximal 400 aufeinanderfolgende Basen bestimmt werden. Die Markierung erfolgte

durch radioaktive Isotope und zur Detektion wurden Polyacrylamid-Gele verwendet [53,

S. 457]. Alles in allem war die Sequenzierung also ein sehr aufwendiges Verfahren. Nach

und nach wurde das ursprungliche Verfahren aber durch das wesentlich schnellere und vor

allem automatisierbare Kettenabbruch- oder Didesoxynucleotidverfahren nach Sanger et

al. abgelost [66]. Fur diese enzymatische Methode sind nur noch wenige Nanogramm DNA

notig und man kann auf Fluoreszenzfarbstoffe anstelle von Radioisotopen zuruckgreifen.

Sears et al. entwickelte daraus schließlich die heute gebrauchliche Zyklus-Sequenzierung

[70], welche zu großen Teilen automatisiert in Thermo-Cyclern ablauft und anschließend

in speziellen Sequenzier-Automaten detektiert werden kann.

Das Prinzip der Sequenzierreaktion ist dem der PCR sehr ahnlich. Zunachst werden wieder

spezifische Starter-Molekule (Primer) benotigt. Wie bei den PCR-Primern, sind auch die

Sequenzier-Primer ca. 15-30 Basen lang und binden an den komplementaren Strang und

Gegenstrang des Templates. Als Template dient ein vorher amplifiziertes PCR-Produkt.

Da Salze und Fremdproteine die Reaktion storen konnten, ist es wichtig, das PCR-Produkt

vor der weiteren Verwendung aufzureinigen (siehe auch Abschnitt 3.2.1.4 auf der vorheri-

gen Seite).

32

Zunachst muss das Template erneut in Einzelstrangform, also denaturiert vorliegen, so

dass die Primer bei der ihnen spezifischen Annealing-Temperatur binden konnen. Ausge-

hend vom Primer erfolgt dann die Synthese des zur Matritze komplementaren Strangs.

Wie bei der PCR auch, erfolgen mehrere Zyklen aus Denaturierung, Annealing und Elon-

gation und es wird eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet [76, S. 182]. Es gibt

aber zwei wesentliche Unterschiede zum PCR-Verfahren. Zum einen wird jedem Ansatz

nur ein Primer zugegeben. Es wird also pro Ansatz nur eine Richtung amplifiziert und

somit sind fur Forward- und Reward-Sequenzen unterschiedliche Reaktionsansatze notig.

Zum anderen enthalt das Reaktionsgemisch nicht nur Template, Primer, Enzym und die

vier Desoxynucleotid-Triphosphate (dNTPs), sondern auch die vier Di-Desoxynukleotid-

Triphosphate (ddNTPs). Die ddNTPs werden in der Elongationsphase mit in den neu

entstehenden Strang eingebaut. Da ihnen jedoch eine Hydroxylgruppe am 3’ Ende fehlt,

kann keine Phosphodiester-Bindung zum nachsten Nukleotid gebildet werden, es werden

keine Nukleotide mehr eingebaut und die Kette bricht ab [53, S. 457]. Somit befinden sich

am Reaktionsende zahlreiche Fragmente mit unterschiedlicher Kettenlange, einem Primer

am 5’ Ende und einem Di-Desoxynukleotid am 3’ Ende im Ansatz. Jedes der vier verwen-

deten Di-Desoxynukleotide ist mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert, welche

spater fur die Detektion wichtig sind.

Auch nach der Sequenzierreaktion ist eine Aufreinigung des Produktes notig, um Puf-

fersalze und storende Restnukleotide aus dem Ansatz zu entfernen. Anschließend er-

folgt die Detektion durch spezielle Sequenzierautomaten. In einer gelgefullten Kapilla-

re erfolgt die Elektophorese der zu sequenzierenden Probe. Aufgrund der unterschiedli-

chen Langen, wandern die Fragmente unterschiedlich schnell und werden so aufgetrennt.

Die Fragmente wandern an einer definierten Stelle der Kapillare an einem Laseranre-

gungs/Detektionssytem vorbei. Dort regt der Laser die Fluoreszenzfarbstoffe an, diese

emittieren Licht einer spezifischen Wellenlange, welches durch einen Sensor detektiert wird.

Diese Rohdaten (farbspezifische Intensitatsprofile) werden dann elektronisch gespeichert

und durch spezielle Computerprogramme direkt in die Basenfolge ubersetzt [76, S.185].

33

Tabelle 3.3: Master-Mix der Sequenzier-Reaktion


HPLC-Wasser 1,8

Big Dye Puffer 2

Premix 0,2

Primer (2,51 pmol/�l) 1

PCR-Produkt 5


3.2.1.6 Durchfuhrung der Sequenzierreaktion

5�l des aufgereinigten PCR-Produktes wurden direkt als Matritze fur die Sequenzier-

Reaktion eingesetzt. Das PCR-Produkt wurde dazu in ein Gemisch aus 0,2�l Premix

(Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactions von Applied Biosystems), 2�l

Puffer-Losung, 1,8�l Wasser und 1�l des jeweiligen Vorwarts- oder Ruckwarts-Primers

(2,5 pmol/�l-Verdunnung) pipettiert und gut gemischt (siehe Tabelle 3.3). Dann wurden

die Proben im Thermo-Cycler mit dem Sequenzier-Programm BD55-2min amplifiziert

(siehe auch Tabelle B.5 auf Seite 158).

Fur die Aufreinigung der Sequenzier-Reaktion wurde wegen der großen Anzahl der Proben

ebenfalls das automatisierte Verfahren mit Hilfe des Pipettierroboters gewahlt. Anschlie-

ßend wurden die Proben in den ABI Prism 3730 Genetic Analyser geladen und analysiert.

Die Auswertung der Sequenzen erfolgte dann zunachst durch die Bearbeitung der Roh-

daten mit ”Sequencing Analysis Software 5.1“ und den anschließenden Vergleich mit der

Referenzsequenz durch ”SeqMan� II (Version 5.03)“. Wurden Abweichungen gegenuber

der Referenzsequenz gefunden, wurden diese gegen die Originalsequenz bei UCSC Genome

Bioinformatics geblatet, um so die genaue Position zu bestimmen und bekannte Polymor-

phismen zu erkennen.

34

3.2.2 Bruchpunktuberspannende-Long-Template-PCR

3.2.2.1 Grundlagen

Durch eine Long-Template-PCR (siehe auch Abschnitt b) auf Seite 44) ist es moglich,

ein bruchpunktuberspannendes Fragment ausgehend von einem derivativen Chromosom

zu amplifizieren. Durch eine anschließende, schrittweise Sequenzierung kann so versucht

werden den Bruchpunkt auf die Base genau zu ermitteln. Ausgehend von der Orientierung

der jeweiligen Sequenzen wurden die Vorwarts-Primer dabei in die Bruchpunktregion des

einen Translokationschromosoms, die Ruckwarts-Primer entsprechend in die Bruchpunkt-

region des anderen Translokationschromosoms gelegt. Damit erhalt man nur im Falle einer

bruchpunktuberspannenden Fragmentsynthese im Agarosegel detektierbare Banden.

3.2.2.2 Durchfuhrung

Die Durchfuhrung erfolgte im Wesentlichen nach dem PCR-Prinzip, es wurden aber der

dNTpack-Kit (siehe auch Tabelle 3.4 auf der nachsten Seite) sowie das Expand 20 kbP lus

PCR System (siehe auch Tabelle 3.5 auf der nachsten Seite) der Firma Roche zur Am-

plifikation verwendet. Es wurden alle moglichen Kombinationen aus den speziell fur die

bruchpunktuberspannende PCR entworfenen Primern getestet. Fur die Long-Template-

PCR wurde das Cycler Programm Exp-LT65-12min verwendet (siehe auch Tabelle B.1

auf Seite 155). Der Erfolg der PCR wurde auf einem 1%igem Testgel uberpruft. Waren

spezifische Fragmente auf dem Gel detektierbar, wurden die jeweiligen Proben maschinell

aufgereinigt.

Anschließend wurden die aufgereinigten PCR-Produkte direkt in einer Standard-

Sequenzierreaktion eingesetzt (siehe auch Tabelle 3.3 auf der vorherigen Seite). Die so

gewonnenen Sequenz-Daten wurden mit der Sequence-Analysis-Software und dem Pro-

gramm Chromas ausgewertet und gegen die Referenzdatenbanken NCBI und UCSC ab-

geglichen.

35

Tabelle 3.4: Long-Template PCR mit dem neuen dNTpack-Kit (Roche)


A. dest. 14,65

Puffer 5,00

Nukleotid-Mix 1,25

DMSO 1,25

Polymerase 0,35

Vorwarts-Primer 0,75

Ruckwarts-Primer 0,75

DNA 1,00


Tabelle 3.5: Long-Template PCR mit dem Expand 20kbP lus PCR System

(Roche)


Mix I

A. bidest. 4,625

dNTPs 0,625



DNA 0,5

Mix II

A. bidest. 4,75

Puffer 1,25

Enzymmix 0,25

Mix II auf Mix I geben und vorsichtig mischen

Gesamtvolumen: 12,5�l

36

3.2.3 RT-PCR

3.2.3.1 Grundlagen

Das Ziel einer normalen Standard-PCR ist es, aus einer heterogenen DNA-Probe selektiv

eine spezifische Target-Sequenz zu amplifizieren. Im Grunde bedient sich auch die RT-PCR

diesem Prinzip. Allerdings wird mit dieser Methode nicht DNA sondern RNA amplifiziert.

Dazu wird zunachst RNA aus einer Zelllinie oder einem spezifischen Gewebe isoliert und

mit einem speziellen Enzym, der Reversen Transkriptase in den komplementaren DNA-

Strang (cDNA) umgeschrieben.

Der Erfolg der RT-PCR ist dabei abhangig vom Expressionslevel der Zielsequenz und

damit vom Vorhandensein von Transkripten in der untersuchten RNA-Population [76,

S. 123]. Besondere Bedeutung erlangt die RT-PCR (Reverse-Transkriptase-PCR) beim

Nachweis seltener Transkripte, das sie im Vergleich zu anderen RNA-Nachweisverfahren

(z.B. Northern-Blot) eine deutlich hohere Sensitivitat besitzt [3, S. 158]. Damit ist es mit

der RT-PCR moglich die Expression einer einzelnen Zelle zu analysieren. Zudem konnen

verschiedenen Isoformen eines Gens identifiziert und analysiert, sowie aberrantes Splicing

untersucht werden.


a) cDNA-Synthese

Die cDNA wird mit Hilfe von randomisierten Oligonukleotiden und dem Enzym Reverse

Transkriptase aus vorher aus einem Gewebe oder einer lymphoblastoiden Zelllinie isolierter

RNA generiert. Die so gewonnene cDNA reprasentiert somit eine Bibliothek aller in diesem

Gewebe oder dieser Zelllinie exprimierten Transkripte.

Die Umschreibung von RNA in cDNA erfolgte nach dem Protokoll fur die Superscript�-II-

Polymerase der Firma Invitrogen. Zunachst wurden jeweils 5�l RNA mit 5�l HPLC-H2O

gemischt und auf Eis aufbewahrt. Dann wurde ebenfalls auf Eis ein Mastermix aus 4�l

37

Tabelle 3.6: cDNA-Synthese


5x First Strand Buffer 4,0

dNTPs (20mM) 1,0

Random-Oligonukleotide 1,0

0,1M DTT 2,0

RNase-Inhibitor 0,6

Superscript�-II 1,0

A. dest. 0,4


Puffer, 1�l 20mM dNTPs, 1�l Random-Oligonukleotide, 2�l 0,1M DTT, 1�l Superscript

II, 0,6�l RNase-Inhibitor sowie 0,4�l HPLC-H2O hergestellt (siehe auch Tabelle 3.6). Die

RNA wurde nun 5-10min bei 80 ◦C im Thermocycler denaturiert, sofort wieder auf Eis ge-

stellt und mit jeweils 10�l des Mastermixes versetzt. Dieser Ansatz inkubierte fur 10min

bei Raumtemperatur bevor die eigentliche cDNA-Synthese bei 37 ◦C uber 2 h im Ther-

mocycler ablief. Anschließend wurde die cDNA bei -20 ◦C bis zur weiteren Verwendung

gelagert.

In meiner Arbeit wurden RNAs aus lymphoblastoiden Zelllinien des Translokationspati-

enten sowie von funf weiteren Kontrollpersonen umgeschrieben. Desweiteren wurde RNA

aus verschiedenen Mausgeweben fur die Generierung der cDNA-Sonden fur die In-situ-

Hybridisierung sowie RNA aus verschiedenen humanen Geweben in cDNA umgeschrieben.

b) RT-PCR

Fur die RT-PCR wurde das Standard-PCR-Verfahren angewandt, allerdings wurde als

Template 1�l der zuvor synthetisierten cDNA eingesetzt (siehe auch 3.2.1.2 auf Seite 27).

Es wurden immer Kontroll-Primer (SIPrt2-7 bzw. GAPDH) mitgefuhrt, um den Erfolg der

PCR uberprufen zu konnen. Dazu wurden die PCR-Produkte auf ein 1,5%iges Agarose-

Gel aufgetragen und eine Elektrophorese durchgefuhrt (siehe auch Abschnitt 3.2.1.3 auf

Seite 29).

38

3.2.4 Real-Time-PCR

3.2.4.1 Grundlagen

Die Real-Time-PCR ist ein quantitatives PCR-Verfahren. Das heisst, das aus der Menge

an amplifiziertem PCR-Produkt auf die Menge der eingesetzten DNA bzw. RNA geschlos-

sen werden kann [5, S. 163]. Dies wird durch spezielle Thermo-Cycler ermoglicht, in denen

die PCR-Produkte direkt wahrend ihrer Generierung erfasst werden konnen. Die ersten

Real-Time-PCRs wurden im Jahr 1992 von Higuchi et al. durchgefuhrt und basierten im

Wesentlichen auf der fluoreszierenden Eigenschaft des Ethidiumbromids [32]. Dieses inter-

kaliert in die doppelstrangige DNA und fluoresziert nachdem es mit UV-Licht angeregt

wird. Auf diese Weise war mit zunehmender PCR-Produktmenge eine steigende Fluores-

zenz zu beobachten und es war moglich die Konzentration der DNA zu jedem beliebigen

Zeitpunkt der PCR zu bestimmen.

Das Prinzip der Real-Time-PCR blieb bis heute erhalten, jedoch werden nun spezifische

Hybridisierungssonden eingesetzt. Dieses Verfahren ist zwar sehr kostenintensiv, durch die

Verwendung einzelstrangiger, sequenzspezifischer Sonden aber auch hoch spezifisch. In der

Regel sind diese Sonden am 3’-Ende mit einem Quencher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat,

z.B. TAMRA) und am 5’-Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (Fluorescein-

Derivat, z.B. FAM) markiert. Im Annealing-Schritt der PCR lagern sich diese sequenz-

spezifischen Sonden sowie die entsprechenden PCR-Primer an die denaturierte Zielsequenz

an. Solange der Quencher nahe genug am Reporter-Farbstoff liegt, wird dessen Anregungs-

energie auf den Quencher ubertragen. Dieser fluoresziert in einer anderen Wellenlange und

wird somit nicht detektiert. Wahrend der Synthese des Zweitstranges erreicht die Polyme-

rase die Sonde. Die Taq-DNA-Polymerase verfugt uber eine 5’-3’-Exonuklease-Aktivitat,

wodurch die Sonde hydrolytisch gespalten wird. So wird raumlich der Quencher vom Re-

porter getrennt und die Anregung des Reporters fuhrt zur Emission einer definierten Wel-

lenlange. Diese wird dann messtechnisch erfasst. Die wahrend der Synthese gemessene

Floureszenzintensitat ist direkt proportional zur Anzahl der neu gebildeten DNA-Strange

und damit proportional zur Menge an Ausgangs-DNA [5, S. 163].

39


In meiner Arbeit wurden von Applied Biosystems entworfene und getestete Taqman-

Sonden verwendet, welche mit den ebenfalls vorgepruften Primern geliefert wurden und

direkt eingesetzt werden konnten.

Fur jede der funf verwendeten Taqmen-Sonden wurde zunachst ein funffacher Master-

Mix hergestellt. Dieser enthielt 10�l 2x MM-Puffer, 9�l HPLC-H2O sowie 1�l Sonden-

/Primer-Mix. Bei dem 2x MM-Puffer handelt es sich um den qPCR Master-Mix der Firma

Eurogentec, welcher neben dNTPs die HotGoldStart-DNA-Polymerase und Magnesium-

chlorid enthalt. Zu jeweils 90�l dieses Master-Mixes wurden dann 10�l (∼= 25ng/�l) der

cDNA gegeben und sehr gut miteinander vermischt. Zur Vierfachbestimmung wurden je-

weils 20�l dieser Mischung in vier Wells einer 384-Well-Platte pipettiert. Die Detektion

erfolgte anschließend im ABI Prism� 7900 HT Sequence Detection System der Firma

Applied Biosystems. Es wurde dabei ein PCR-Programm mit 45 Zyklen gewahlt und die

Fluoreszenzsignale bei 60 ◦C detektiert (PCR-Programm siehe B.6 auf Seite 158).

3.2.4.3 Quantitative Bestimmung der qRT-PCR-Resultate

Fur die Quantifizierung der erhaltenen qRT-PCR-Resultate wurde die ΔΔCT -Methode

verwendet. In einem ersten Schritt wird dabei der Fluoreszenz-Schwellenwert, der soge-

nannte Treshold-Cycle oder CT -Wert berechnet. Dieser CT -Wert bezeichnet die Zyklen-

zahl, bei der zum ersten Mal ein Anstieg der Reporter-Fluoreszenz neben der Hintergrund-

Fluoreszenz ermittelt werden konnte. Dieser Wert alleine ist allerdings fur eine quantitati-

ve Aussage noch nicht ausreichend. Dazu ist der ΔCT -Wert notig. Man kann diesen uber

folgende Formel berechnen:

ΔCT (Probe) = CT (Referenz) − CT (Probe)

Das bedeutet, der ΔCT -Wert der unbekannten Probe ergibt sich aus der Differenz des CT -

Wertes einer parallel amplifizierten Referenz und des CT -Wertes der untersuchten Probe.

Die Referenz stellt also ein zur Normalisierung der Ergebnisse unerlassliches Signal dar. Oft

werden als Referenzen endogene Kontrollen und bevorzugt sogenannte Housekeeping-Gene

verwendet. Dies sind Gene, die ubiquitar exprimiert werden und uber die verschiedenen Ge-

40

webe nur eine geringe Varianz in ihrer Expression aufweisen. In meiner Arbeit wurden ne-

ben der eigentlichen Probe vier endogene Kontrollen mitgefuhrt, β2-Mikroglobulin (B2M),

RNA-Polymerase II (RPII), Actin beta (ACTB) sowie die Hypoxanthin Phosphoribosyl-

Transferase (HPRT). Zusatzlich wurden neben der Patienten-cDNA noch funf weitere

cDNAs von Kontrollpersonen mitgefuhrt. Diese dienten in der Berechnung als Kalibrato-

ren auf die der normalisierte Wert bezogen wurde. Fur jeden Kalibrator wurde erneut der

ΔCT -Wert bestimmt.

ΔCT (Kalibrator) = CT (Referenz) − CT (Kalibrator)

Im nachsten Schritt wurden die ΔCT -Werte von Probe und Kalibrator zueinander in Bezug

gesetzt:

ΔΔCT = ΔCT (Kalibrator) − ΔCT (Probe)

Nun ist es moglich, den Wert fur die relative Quantifikation (RQ) uber folgende Formel

zu berechnen:

RQ = 2−(ΔΔCT )

Die ΔΔCT -Berechnungsmethode ist in der ABI Prism� 7900 HT SDS V2.1.2-Software der

Firma Applied Biosystems integriert, so dass samtliche Berechnungen zur Quantifizierung

der Rohdaten uber dieses Programm durchgefuhrt werden konnten.

3.2.5 Hybridisierungen

3.2.5.1 Allgemeines

Als Hybridisierung bezeichnet man die Bildung von Duplexmolekulen aus zwei komple-

mentaren Nukleinsaurestrangen, wobei es sich bei einem der Strange um eine in ihrer

Sequenz bekannte und markierte Sonde handelt [76, S.156]. Es existieren viele unterschied-

liche Hybridisierungsverfahren, die sich z.B. in der Art der verwendeten Sonde, der Mar-

kierungsweise der Sonde aber auch im eigentlichen Ziel der Sonde unterscheiden. Bei der

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) werden Sonden verwendet, die mit einem Fluo-

reszenzfarbstoff markiert wurden und zu bestimmten DNA-Abschnitten komplementar

sind. Anders ist das Prinzip der Tissue-in-situ-Hybridisierung, bei der die Sonden mit

einem Hapten markiert werden, an das Antikorper konjugieren und einen Farbumschlag

41

bewirken. Mit diesem System lasst sich so mRNA innerhalb einer spezifischen Zelle und in

Geweben lokalisieren [33, S. 223]. Ein drittes Hybridisierungsverfahren ist der Southern-

Blot, bei dem radioaktiv markierte Sonden gegen bestimmte DNA-Fragmente eingesetzt

werden [76, S.169]. Diese kleine Auswahl an Hybridisierungsverfahren zeigt bereits die

zahlreichen Anwendungsmoglichkeiten der Hybridisierungstechniken, u.a. die Aufklarung

von Funktion und Expression von Genen [33, S. 223].

Das Prinzip einer Hybridisierung ist denkbar einfach. Bei der Sonde handelt es sich in

der Regel um eine homogene, markierte Nukleinsaurepopulation, welche sich haufig in

Losung befindet [76, S.161]. Das Target hingegen ist eine unmarkierte und heterogene

Nukleinsauremischung, die meist vorher an eine feste Unterlage gebunden wurde. Sowohl

Sonde, als auch Target liegen zunachst als Doppelstrang vor und werden durch Anwendung

von Hitze oder Alkalisierung denaturiert. Die nun entstandenen Einzelstrange reassoziieren

und bilden Heteroduplex- und Homoduplexmolekule aus. Wichtig fur die Auswertung des

Versuches sind die aus Target und Sonde bestehenden Heteroduplexmolekule.

Bei der Markierung der Sonden unterscheidet man generell zwei Verfahren, die direkte und

die indirekte Markierung. Bei der direkten Markierung werden Nukleotide, die markierte

Gruppen enthalten eingebaut. Hier finden Radioisotope Anwendung, aber auch Fluores-

zenzfarbstoffe gehoren in diese Gruppe. Bei der indirekten Markierung werden zunachst

sogenannte Reportermolekule in die DNA eingebaut. In einem zweiten Schritt kommt es

zur Bindung eines Affinitatsmolekuls an die Reportergruppe und erst durch diese Komplex-

Bildung wird die Detektion ermoglicht [76, S.161].

3.2.5.2 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

a) Grundlagen

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Methode, bei der spezifische, in

ihrer Große begrenzte Abschnitte der chromosomalen DNA im mikroskopischen Bild sicht-

bar gemacht werden konnen. Insbesondere als Erganzung zur konventionellen Chromoso-

mendarstellung findet diese Technik ihre Anwendung. In normalen Karyogrammen betragt

42

der kleinste sichtbare Verlust oder Zugewinn von Erbmaterial ca. 4Mb, wahrend sich durch

die FISH viel kleinere Veranderungen sichtbar machen lassen [76, S. 51].

Die Methode basiert auf der Hybridisierung von denaturierter DNA von Metaphasechro-

mosomen und spezifisch gewahlten DNA-Sonden auf vorbehandelten Objekttragern. Hier-

bei ist es wichtig, dass sowohl die Sonde, als auch die chromosomale DNA denaturiert,

also als Einzelstrange, vorliegen. Ziel der Hybridisierungsreaktion ist es, dass sich neue

Doppelstrange aus Sonde und chromosomaler DNA bilden (Heteroduplexbildung).

Die verwendeten Sonden werden entweder durch Klonierung in Zellen, mit einer Lange

von 0,1 kb bis zu mehreren Hundert kb, oder durch PCR mit einer Lange von 0,1-20 kb

gewonnen [76, S. 156]. Die als Sonde eingesetzte DNA muss in einem Schritt vor der

eigentlichen Hybridisierung markiert werden, um sie spater sichtbar machen zu konnen.

Fruher erfolgte die Markierung durch den Einbau von Radioisotopen, heute verwendet

man Nukleotide, die durch einen Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden. Meist wird ein

direktes Markierungsverfahren angewendet, dass heißt, die eingebauten Nukleotide selbst

enthalten eine markierte Gruppe, die spater direkt detektiert werden kann.

Zum Einbau der Fluoreszenzfarbstoffe in die Sonden-DNA findet oft die enzymatisch

vermittelte Nick-Translation Anwendung. Hierbei werden Einzelstrangbruche, die so-

genannten ”nicks“, produziert, die ungeschutzte 3’-Hydroxyl- und 5’-Phosphatenden

zurucklassen. Die DNA-Polymerase I aus E.coli benutzt im Anschluss die entstandenen

3’-Hydroxylenden der ”nicks“ als Startpunkte fur den Einbau der markierten Nukleotide.

Gleichzeitig besitzt das Enzym eine 5’→3’ Exonuclease-Aktivitat und entfernt so die rest-

lichen Nukleotide an der anderen Seite der Einzelstrangbruche. Der ”nick“ wandert so in

5’→3’ Richtung an der DNA entlang und es entsteht ein neuer Einzelstrang aus markier-

ten Nukleotiden. Da die Reaktion bei der relativ niedrigen Temperatur von 15 ◦C ablauft,

ist sicher gestellt, dass es zu keinerlei DNA-Neusynthese kommt. Es werden lediglich un-

markierte Nukleotide durch markierte ersetzt, bis die DNA-Sequenz vollstandig erneuert

ist [76, S. 157].

Sowohl innerhalb der Sonde, als auch in der chromosomalen DNA finden sich zahlrei-

che repetitive Sequenzen. Diese fuhren dazu, dass die markierte DNA bevorzugt an die

43

im Uberschuss vorliegenden repetitiven Sequenzen und nicht wie gewunscht an die ei-

gentliche Zielsequenz hybridisiert. Um dies zu vermeiden, wird eine sogenannte Kompeti-

tionshybridisierung eingeschoben. Hierbei versetzt man die Hybridisierungssonde nach der

Nick-Translation mit einem Uberschuss an unmarkierter genomischer DNA, welche mit

repetitiven Sequenzen angereichert wurde (z.B. COT1 und HTD). Es kommt nun zu einer

Absattigung der repetitiven Sequenzen der Sonde, so dass es im Idealfall ausschließlich zu

einer Hybridisierung der Sonden-DNA an die gewunschte Zielsequenz kommt.

In der Hybridisierungsreaktion lagern sich nun die denaturierten, fluoreszenz-markierten

Einzelstrange der Sonde an die komplementaren denaturierten Einzelstrange der chromo-

somalen DNA an und bilden so neue Doppelstrange aus. Fur die Detektion bedient man

sich der Eigenschaft der Fluoreszenzfarbstoffe, durch Anregung, Licht einer bestimmten

Wellenlange zu emittieren. Dazu wird Licht einer speziellen Lichtquelle durch verschiede-

ne Filter geleitet, welche nur fur eine definierte Wellenlange durchlassig sind. Diese Filter

sind spezifisch fur den jeweilig verwendeten Fluoreszenzfarbstoff. Das gefilterte Licht wird

dann durch die optischen Systeme des Mikroskops zum Objekttrager geleitet. Die an die

DNA gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe werden angeregt und emittieren Licht mit einer

großeren Wellenlange, welches dann zum Objektiv zuruck geleitet wird [76, S. 164]. Es

sollten dann in einer Metaphase je vier Signale pro eingesetzter Sonde sichtbar sein, je ein

Signal pro Chromatid.

b) Gewinnung der Sonden-DNA

BAC-Plasmide Als Sonden fur die FISH wurden Plasmide aus RP11-, RP4- und

RP5-BAC-Klonen verwendet. BACs (bacterial artificial chromosomes) gehoren zu den ge-

brauchlichen, auf E.coli basierenden Klonierungssystemen. BACs konnen bis zu 300 kb

fremder DNA aufnehmen. Man nennt BACs auch Low-Copy-Plasmide, da sie sich im

Unterschied zu anderen Vektoren durch ihre niedrige Kopienzahl in der Bakterienzelle

auszeichnen [71, S. 116]. Als Plasmide bezeichnet man extrachromosomale, ringformige

doppelstrangige DNA mit einer Lange von 3-20 kb. Plasmide konnen sich unabhangig von

ihrer Wirtszelle vermehren und bieten ihren prokaryotischen Wirten Uberlebensvorteile.

Zum Beispiel tragen Plasmide Resistenzen gegen Antibiotika. Diese macht man sich bei der

44

Klonierung zu Nutze, da in Gegenwart eines Antibiotikums nur die Zellen wachsen konnen,

die auch das gewunschte Plasmid in sich tragen [30, S. 101]. Die RP11-BAC-Klone weisen

eine Resistenz gegen das Antibiotikum Chloramphenicol und die RP4- und RP5-BAC-

Klone eine gegen das Antibiotikum Kanamycin auf. Die Kultivierung der BACs sollte

unter moglichst schonenden Bedingungen erfolgen, da es sonst zu unerwunschten Rear-

rangements und Deletionen kommen kann. Nach ausreichender Kultivierung werden die

Bakterien lysiert und so die Plasmide isoliert. Anschließend werden noch die Konzentrati-

on, sowie die Reinheit der isolierten Plasmide photometrisch bestimmt. Die Konzentration

wird bei einer Wellenlange von 260 nm bestimmt, fur die Reinheit der Probe werden die

Absorbtionswerte bei 260 und 280 nm ins Verhaltnis zueinander gesetzt [72, S. 126].

LongTemplate-PCR-Produkte Zu einem spateren Zeitpunkt der Arbeit wurden auch

PCR-Produkte aus einer Long-Template-PCR fur die FISH eingesetzt. Mit Hilfe der nor-

malen Taq-Polymerase lassen sich nur Fragmente bis zu 7 kb amplifizieren. Um in der

FISH Signale erkennen zu konnen sind jedoch wesentlich langere Fragmente notig. Die

Long-Template-PCR erlaubt es, Kopien von 20-40 kb zu amplifizieren. Das besondere

an dieser Technik ist, dass zwei thermostabile DNA-Polymerasen zum Einsatz kommen.

Zum einen wird die Taq-Polymerase mit ihrer hohen Umsatzrate verwendet, zum ande-

ren nutzt man die Korrektureigenschaften einer Proofreading-Polymerase. Es ist bekannt,

dass die Taq-Polymerase vor allem bei großeren Produkten zunehmend falsche Basen in

die neu synthetisierten Strange einbaut und es darum zu vorzeitigen Strang-Abbruchen

kommt. Die Proofreading-Polymerase erkennt und beseitigt diese Fehler, was insgesamt

zu einer enormen Steigerung der Produktlange fuhrt [4, S. 149]. Durch Anwendung der

Long-Template-PCR war es moglich, von den 150-300 kb langen BAC-Plasmiden mehrere

kurzere Fragmente zu gewinnen.

c) Durchfuhrung

Plasmid-Isolierung aus BACs Die RP-BAC-Klone wurden zunachst auf Agarplatten

und spater in LB-Medium kultiviert. Die Kultivierung erfolgte zunachst 8 h in 5ml Kul-

turen, in die jeweils eine Kolonie der Agarplatte gepickt wurde. Dann wurde eine 200ml

Hauptkultur angelegt, die uber Nacht inkubiert wurde. Von jedem Klon wurden Glycerin-

45

kulturen angelegt, die als Gefrierstock bei -80 ◦C uber langere Zeit gelagert werden konnen.

Die Plasmid-Isolierung erfolgte schließlich gemaß dem Standardprotokoll des ”QUIAGEN

Plasmid Midi Kits“ aus der 200ml Hauptkultur. Im Anschluss wurde die Konzentration,

sowie die Reinheit der Probe photometrisch bestimmt.

LongTemplate-PCR Aus den isolierten Plasmiden der weiter zu analysierenden BACs,

wurden Verdunnungen mit einer Konzentration von 10 ng/�l hergestellt. Diese wurde

dann als Template im PCR-Ansatz eingesetzt. Um entsprechende spezifische Primer aus-

zuwahlen, wurden anhand der Genbank-Sequenzen GI:6010222 und GI:23343872 mit der

Version 3 der Primer Design Software die Primer entworfen und anschließend uber ”BLAT

Search Genome“ mit der Sequenzdatenbank von UCSC Genome Bioinformatics verglichen,

um Polymorphismen innerhalb der Primer auszuschließen und Repeat-Regionen auszu-

sparen. Die Primer wurden dabei so gewahlt, dass der jeweilige BAC in uberlappende

Fragmente von 12-18 kb aufgeteilt wurde. Zur Amplifikation der Fragmente wurde das

Expand Long Template PCR-System der Firma Roche verwendet und die Reaktion nach

dem beiliegenden Protokoll durchgefuhrt (siehe auch Tabelle 3.7 auf der nachsten Seite).

Aufgrund der Lange der erwarteten Fragmente wurde das PCR-Programm Exp-LT65-

12min mit einer Elongationszeit von 12min und insgesamt 35 Zyklen gewahlt. Nach Ab-

lauf der Reaktion wurden 3�l PCR-Produkt mit 1�l Load-Mix versetzt und das Ge-

misch auf ein 1,0%iges, mit Ethidiumbromid versetztes, TBE-Agarose-Gel aufgetragen. Als

Großenstandard wurde 1�l λ/HindIII-Marker mit gefuhrt. Die Elektrophorese lief dann ca.

60min bei 80V und 160mA und die Banden konnten anschließend unter UV-Licht detek-

tiert und dokumentiert werden. War ein spezifisches PCR-Produkt der gewunschten Lange

sichtbar, wurde die Probe uber Ionenaustauscher-Saulen der Firma Quiagen (”QIAquick

PCR purification kit“) aufgereinigt und stand so vorbereitet fur die Markierungsreaktion

zur Verfugung.

Untersuchungsmaterial Es wurde eine Chromosomensuspension verwendet, die nach

Standardpraparation aus VPHA-stimulierten 72 h-Kulturen gewonnen wurde. Die Kul-

turen wurden aus einer peripheren Blutprobe des Patienten angefertigt. Die Chromoso-

mensuspensionen wurden in einem 3:1 Gemisch aus Methanol und Eisessig bei -20 ◦C

aufbewahrt. Pro Objekttrager wurden zweimal 50�l der Suspension aufgebracht und die

Chromosomen durch sofortiges Kreisen des Objekttragers ”gespreitet“. Unter dem Mikro-

46

Tabelle 3.7: Master-Mix der verwendeten LongRange-PCR


Mix I

A. bidest. 8,125

dNTPs 0,875



DNA 1,0

Mix II

A. bidest. 9,625

Puffer (1, 2 oder 3) 2,5

Enzymmix 0,375

Mix II auf Mix I geben und vorsichtig mischen


skop waren nun zahlreiche Chromosomen, die sich in der Metaphase einer Mitose befanden

sichtbar. Die aufgetropften Objekttrager wurden dann uber Nacht bei -20 ◦C in 70%igem

Ethanol aufbewahrt.

Vorbehandlung Die Objekttrager mussten zunachst gut trocknen. Anschließend wur-

den sie mit 100�l RNase-Gebrauchslosung beschichtet und mit einem Deckglas versehen.

Die Objekttrager wurden nun in eine Metallbox gegeben und bei 37 ◦C fur drei Minuten

in ein Wasserbad gestellt. In diesem Schritt der Vorbehandlung sollen RNA-Abschnitte,

die spater als Bindungsstelle fur die eigentliche Sonde dienen konnten, entfernt werden.

Es folgten mehrere Waschschritte bei Raumtemperatur, fur die die Objekttrager in einer

Kuvette auf dem Schuttler mit verschiedenen Waschlosungen versetzt wurden. Zunachst

wurden die Objekttrager drei Mal fur jeweils funf Minuten in 2xSSC und anschließend ein

Mal fur ebenfalls funf Minuten in 1xPBS gewaschen. Gleichzeitig wurde 1ml 1M HCl zu

99ml A. dest. gegeben und die Losung im 37 ◦C-Wasserbad vorgewarmt. Kurz vor Ge-

brauch wurden 50�l 10%iges Pepsin zugegeben und die Losung in eine Kuvette uberfuhrt.

In dieser Pepsin-Losung wurden die Objekttrager nun fur exakt acht Minuten behandelt,

um auch letztes Zellmaterial endgultig zu entfernen. Nun folgte erneut ein Spulschritt in

47

Tabelle 3.8: Markierungsreaktion - Nick Translation


DNA 1�g

Nick-Translation-Mix 4,0

5x Fluoreszenzfarbstoff 4,0

mit Ampuva auf ein Gesamtvolumen von 20�l auffullen

1xPBS/MgCl2 bei Raumtemperatur fur funf Minuten auf dem Schuttler bevor die Ob-

jekttrager in 1%igem Formaldehyd fur 10 Minuten fixiert wurden. Es schloss sich erneut

ein Spulschritt in 1xPBS fur funf Minuten bei Raumtemperatur an. Im Anschluss wur-

den die Objekttrager in einer aufsteigenden Alkoholreihe, bestehend aus 70%-, 90%- und

100%-igem Ethanol, jeweils fur funf Minuten dehydriert. So vorbehandelt und getrocknet

konnten die Objekttrager entweder direkt mit der Sonde hybridisiert, ca. eine Woche bei

Raumtemperatur, oder fur eine langere Zeit bei -20 ◦C gelagert werden.

Markierungsreaktion Fur die Markierung der DNA-Sonden mittels Nick-Translation

wurde auf Eis zunachst ein 20�l Ansatz aus Sonden-DNA, Ampuva, Nick-Translations-

Mix und Fluoreszenzfarbstoff hergestellt (siehe auch Tabelle 3.8). Dabei unterschieden

sich die eingesetzten Volumina bei Verwendung einer BAC-Sonde von denjenigen, bei de-

nen ein Long-Template-PCR-Produkt eingesetzt wurde. Da bei der Plasmid-Isolierung die

Konzentration der Probe bestimmt wurde, konnte genau 1�g DNA eingesetzt werden. Der

Ansatz wurde mit Ampuva auf insgesamt 12�l aufgefullt und 4�l des Nick-Translations-

Mixes sowie 4�l des 5x Fluoreszenzfarbstoff-Mixes dazu gegeben. Wurde ein Produkt einer

Long-Template-PCR verwendet, wurden 2�l aufgereinigtes PCR-Produkt mit 2�l Ampu-

va versetzt und dazu jeweils 8�l Nick-Translations- und Fluoreszenzfarbstoff-Mix gegeben.

Es wurden zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe verwendet. Fur die eigentliche DNA-

Sonde wurde Cy3, ein roter Farbstoff, und fur die Kontrollsonden FluoroX, ein gruner

Farbstoff, eingesetzt.

Der entstandene Ansatz wurde dann fur 2 h bei Verwendung von BAC-Plasmiden, bzw.

fur 30 Minuten bei Verwendung von Long-Template-PCR-Produkten in einem 15 ◦C-

Wasserbad inkubiert. Die Wartezeit wurde fur die Vorbereitung der Sephadex-Saulen ge-

48

nutzt. Dazu wurden 1ml Spritzen bis zur 0,1ml-Markierung mit Glaswolle gestopft, in

ein Reagenzglas gestellt und dann bis zum Rand mit Sephadex aufgefullt. Dann wurden

sie bei 3000 r/min zwei mal drei Minuten zentrifugiert. Die Saulen wurden dann erneut

mit Sephadex aufgefullt und zentrifugiert, dann mit 100�l TE 10/1-Puffer gespult und

wieder zentrifugiert. Das entstandene Eluat wurde verworfen und die Spritze im Reagenz-

glas in ein deckelloses Eppendorfgefaß gestellt. Die so vorbereiteten Saulchen wurden bis

zum Gebrauch im Kuhlschrank aufbewahrt. Der Markierungsansatz wurde schließlich aus

dem Wasserbad geholt und sofort mit 20�l Stopp-Mix und 60�l TE 10/1-Puffer versehen.

Diese Mischung (100�l) wurde auf die Sephadex-Saulchen pipettiert und diese zwei mal

drei Minuten bei 300 r/min zentrifugiert. Dieser Schritt hat zum Ziel, nicht eingebaute

und somit storende Nukleotide abzutrennen. Das Sauleneluat wurde dann zu 2�l HTD-

und 2�l Cot1-DNA pipettiert und 500�l 100%iges Ethanol dazu gegeben. Diese Mischung

wurde uber Nacht bei -20 ◦C gelagert, um die DNA auszufallen.

DNA-Behandlung und Proben-Herstellung Die gefallte DNA wurde bei

13000 r/min 30 Minuten zentrifugiert, so dass ein sichtbares Pellet entstand. Der Uberstand

wurde verworfen und das Pellet in 500�l 70%igem Ethanol gewaschen. Dann wurde erneut

funf Minuten bei 13000 r/min zentrifugiert und der Uberstand ebenfalls verworfen. Das

Pellet wurde dann im Speed-Vac getrocknet und schließlich in 30�l 20%igem Dextran-

sulfat gelost. So aufbereitet ist die Sonde bei -20 ◦C uber langere Zeit haltbar. Um die

entgultige, fur die Hybridisierung der Objekttrager verwendete Probe zu erhalten, wurden

8,5�l 20%iges Dextransulfat mit 1�l der DNA-Sonde und 0,5�l einer Kontrollsonde ge-

mischt. Wurden Long-Template-PCR-Produkte verwendet, wurden 1,5�l der DNA-Sonde

eingesetzt. Als Kontrolle wurden mit grunem Fluoreszenzfarbstoff markierte Subtelomer-

Proben fur den langen Arm des Chromosoms 11 und fur den kurzen Arm des Chromosoms

20 mitgefuhrt. So konnten diese Chromosomen spater eindeutig identifiziert werden.

Hybridisierung Von den hergestellten Proben werden nun 1,5-2�l auf die vorbehan-

delten Objekttrager aufgetragen und mit einem Deckglas abgedeckt. Es ist dabei moglich,

mehrere Proben auf einen Objekttrager aufzutragen. Dann ist aber darauf zu achten, dass

sich die einzelnen Proben nicht mischen, also immer ausreichend Abstand eingehalten wird

und dass jede Probe mit einem eigenen Deckglas abgedeckt wird. Die Deckglaser wurden

mit Fixogum luftdicht verschlossen und die Objekttrager anschließend auf einer Metall-

49

platte im 75 ◦C-Wasserbad denaturiert. In einer feuchten Kammer (mit feuchtem Papier

ausgelegte Kunststoffdose) wurden die Objekttrager dann bei 37 ◦C im Brutschrank in-

kubiert. Bei Verwendung von BAC-Sonden wurde uber Nacht inkubiert, wahrend Sonden

aus Long-Template-PCR-Produkten zwei Tage im Brutschrank belassen wurden.

Posthybridisierungswaschung und DNA-Farbung Die Objekttrager wurden

zunachst aus der feuchten Kammer geholt und vorsichtig vom Fixogum und den

Deckglasern befreit. Danach wurden sie fur zwei Minuten in eine Kuvette mit einer

Waschlosung bestehend aus 98ml A. dest., 2ml 20xSSC und einem Tropfen 1M HCl

gestellt. Diese Waschlosung wurde bereits im 75 ◦C-Wasserbad vorgewarmt. Die Objekt-

trager wurden dann kurz in 4xSSC/0,2%Tween gespult, bevor sie mit jeweils 50�l DAPI

fur funf Minuten gegengefarbt wurden. Nachdem die Deckglaser vorsichtig abgeschuttelt

wurden, wurden die Objekttrager kurz in A. dest. gespult und zum Trocknen abgestellt.

Sowohl fur die DAPI-Farbung, als auch fur das Trocknen wurden die Objekttrager mit

einem Karton abgedunkelt. Waren die Objekttrager gut getrocknet, wurde perlschnurartig

20�l Antifade darauf verteilt und mit einem Deckglas abgedeckt. Die Objekttrager konnen

so bei -20 ◦C aufbewahrt werden.

Auswertung Die Signale wurden schließlich an einem Fluoreszenz-Mikroskop (Axioplan

2 der Firma Zeiss) ausgewertet und mit einer CCD-Kamera dokumentiert. Die aufgenom-

menen Bilder wurden dann noch mit Hilfe der ISIS-Software bearbeitet und gespeichert.

3.2.5.3 Southern-Blot

a) Grundlagen

Beim Southern Blot handelt es sich um ein Hybridisierungsverfahren, bei dem mit Hilfe von

kurzen, radioaktiv markierten DNA-Fragmenten einer bekannten Sequenz, komplementare

genomische DNA-Abschnitte detektiert werden konnen [58, S. 101]. Die Methode wurde

1975 von E. M. Southern entwickelt und wird mittlerweile analog als Northern Blot zur

Analyse von mRNA und als Western Blot zur Analyse von Proteinen eingesetzt [75].

50

Zunachst wird die genomische DNA durch ausgewahlte Restriktionsenzyme in Fragmen-

te von mehreren hundert bis tausend Basenpaaren Lange zerschnitten und diese mittels

Gelelektrophorese der Lange nach aufgetrennt [76, S. 169]. Dabei spalten die Restrikti-

onsenzyme die doppelstrangige DNA innerhalb einer fur sie spezifischen Sequenz hydroly-

tisch in mehrere Fragmente unterschiedlicher Lange auf. Die im Gel aufgetrennten DNA-

Fragmente werden in einem zweiten Schritt, dem eigentlichen Blotten, auf eine Membran

(Nylon oder Nitrocellulose) gebunden und dort fixiert. Beim Blotten wird die DNA durch

Kapillarkrafte auf die Membran gezogen, wo sie schließlich hangen bleibt, da die Poren

der Membran zu klein fur DNA-Molekule sind [33, S. 224].

Die fixierten DNA-Fragmente werden durch Alkalien in ihre Einzelstrange gespalten und

so die Hybridisierung ermoglicht. Auf die Membran wird die ebenfalls denaturierte und

radioaktiv markierte Sonde gegeben. Die Sonde besteht aus einer bekannten Sequenz, wel-

che zur gesuchten genomischen Sequenz komplementar ist. Bei der Hybridisierung bilden

sich fest an die Membran gebundene Heteroduplexmolekule aus. Nach der Inkubationszeit

wird uberschussige, nicht-gebundene Sonden-DNA sowie unspezifisch gebundene Sonde

abgewaschen. Die Detektion erfolgt schließlich durch das Auflegen eines unbelichteten

Rontgenfilms auf die Membran. Dieser wird durch die radioaktive Strahlung dort belich-

tet, wo die Sonde an die Ziel-DNA gebunden hat, was als dunkle Banden sichtbar wird

[76, S. 169].

b) Auswahl der Sonden

In dieser Arbeit wird der Southern Blot als Methode zur naheren Eingrenzung der Bruch-

punktregion verwendet. Damit dies gelingt, ist es notig, die Restriktionsenzyme sowie

die Lage der DNA-Sonden uberlegt zu wahlen. Liegt der gesuchte Bruchpunkt in dem Re-

striktionsfragment, welches durch die DNA-Sonde erfasst wird, so ist auf dem Rontgenfilm

neben der Bande mit der erwarteten Lange eine zweite, davon abweichende Bande zu er-

kennen. Es ist wichtig, eine Kontroll-DNA mitzufuhren, um eventuelle Abweichungen vom

erwarteten Muster zu erkennen. Ist eine zusatzliche Bande beim Patienten, nicht aber bei

der Kontrolle zu sehen, so enthalt dieses Fragment bereits einen Teil des anderen Translo-

kationschromosoms bis zur nachsten dort definierten Schnittstelle des Restriktionsenzyms.

51

Auf diese Weise kann versucht werden uber die erhaltene Große des unerwarteten Frag-

ments unter Berucksichtigung der definierten Restriktionsschnittstellen die Bruchpunkt-

region auf beiden Chromosomen naher einzugrenzen.

c) Durchfuhrung

Wahl der Restriktionsenzyme Durch die zuvor durchgefuhrte Mini-FISH-Analyse

konnte der Bruchpunktbereich auf dem derivativen Chromosom 20 bereits auf ca. 10 kb ein-

gegrenzt werden. Als Ausgangssequenz fur die Wahl der Restriktionsenzyme und der DNA-

Sonden wurde daher diese Sequenz gewahlt. Insgesamt wurde die Region zunachst mit

vier Restriktionsenzymen so abgedeckt, dass jedes Enzym innerhalb der Bruchpunktregion

mindestens zweimal und maximal funfmal schneidet. Zusatzlich mussten die gewahlten En-

zyme folgende Kriterien erfullen: keine Sternaktivitat (reduzierte Spezifitat bei suboptima-

len Bedingungen) sowie keine CpG-Methylierungssensitivitat. Nur so konnte gewahrleistet

werden, dass die gesamte genomische DNA verdaut wird und nur die zu erwartenden

Schnittstellen entstehen. In den Abbildungen 3.3 auf der nachsten Seite und 3.4 auf der

nachsten Seite sind exemplarisch Retsriktionskarten der Bruchpunktregionen auf den chro-

mosomen 11 und 20 gezeigt.

In der vermuteten Bruchpunktregion wurden dann mehrere DNA-Sonden von 350-400 bp

Lange so gewahlt, dass sie nicht mit den gewahlten Restriktionsschnittstellen uberlappen

und moglichst an verschiedenen Restriktionsfragmenten binden.

Nachdem ein erster Southern Blot mit den Enzymen BamHI, BstXI, BbsI und SbfI und den

DNA-Sonden SF1 und SF2 den Bruchpunkt nicht ausreichend eingrenzen konnte, wurde

ein zweiter Blot mit dem Enzym KpnI und den DNA-Sonden SF1 und SF4 durchgefuhrt.

Restriktionsverdau Fur den Restriktionsverdau wurde zunachst die Konzentration

einer Kontroll-DNA sowie der Patienten-DNA photometrisch bestimmt, so dass in den

Ansatz genau 10�g genomische DNA eingesetzt werden konnten. Dem Ansatz wurden

außerdem 100U vom jeweiligen Restriktionsenzym, 10 �l des entsprechenden 10xRestrik-

tionspuffers sowie bei BamHI und KpnI je 10�l BSA zugegeben (siehe auch Tabelle 3.9

52

chrom2010540 bp

Sonde2

Sonde 3

Sonde 1

Bruchpunktbereich

Bbs I (594)

Bbs I (9576)

Kpn I (5696)

Kpn I (5730)

Kpn I (8243)

Nsi I (6028)

Nsi I (6357)

Nsi I (8834)

Bst XI (160)

Bst XI (3716)

Bst XI (10007)

Xmn I (901)

Xmn I (1036)

Xmn I (2465)

Xmn I (3372)

Xmn I (3433)

Xmn I (3907)

Xmn I (5525)

Xmn I (7798)

Xmn I (9319)

Xmn I (9731)

Abbildung 3.3: Karte der Restriktionsschnittstellen in der Bruchpunktregion

auf Chromosom 20

chrom1139013 bp

E3

E4

E5

E6

E7

E8

E11

E12

E16

E18

E19

E17

E15

E14

E13

E10

E9Kpn I (1246)

Kpn I (1545) Kpn I (16766)

Kpn I (24294)

Kpn I (32607)

Kpn I (33984)

Nsi I (2423)

Nsi I (6180)

Nsi I (16955)

Nsi I (17483)

Nsi I (18441)

Nsi I (21907)

Nsi I (24465)

Xmn I (1390)

Xmn I (3921)

Xmn I (3969)

Xmn I (14366)

Xmn I (16887)

Xmn I (19120)

Xmn I (25254)

Xmn I (28637)

Abbildung 3.4: Karte der Restriktionsschnittstellen in der Bruchpunktregion

auf Chromosom 11

53

Tabelle 3.9: Ansatz fur Restriktionsverdau

Reagenzien Menge

DNA 10�g

Restriktionsenzym 100U

10x Puffer 10�l

BSA (wenn notig) 10�l

mit HPLC-H2O auf 100�l auffullen

auf Seite 53). Dann wurde jeder Mix mit A. dest. auf ein Gesamtvolumen von 100�l auf-

gefullt, gut gemischt und fur 22,5 h bei der fur das jeweilige Restriktionsenzym optimalen

Temperatur inkubiert. Nach etwa 7h Inkubationszeit wurden dem Ansatz noch einmal 5U

Restriktionsenzym zugegeben.

Nach Ende der Inkubationszeit wurde der Erfolg des Verdaus mittels einer Gelelektropho-

rese uberpruft. Bei einem vollstandigen Verdau sieht man DNA-Fragmente jeder Große und

es einsteht ein sog. Restriction Smear. War dieser nicht, oder nur unvollstandig sichtbar,

wurde erneut ca. 30-50U des jeweiligen Enzyms in den Ansatz gegeben und dieser weite-

re 5-6 h inkubiert. Anschließend wurde der Verdau erneut im Gelbild auf Vollstandigkeit

uberpruft.

Ethanol-Fallung Mit der im Restriktionsverdau fragmentierten DNA sollte nun das

Blot-Gel beladen werden. Da allerdings die Taschen des TAE-Gels nur etwa 70-80�l fass-

ten, die einzelnen Ansatze aber mindestens ein Volumen von 100�l hatten, wurden die

Proben mit Hilfe einer Ethanolfallung aufgereinigt und konzentriert. Dazu wurden dem

Restriktionsverdau 0,1 Volumen 3M Natriumacetat und 2,5 Volumen 100%iges Ethanol

zugesetzt, gut gemischt und die Probe dann 30min bei 13.000 r/min zentrifugiert. Der

enstandene Uberstand wurde vorsichtig entfernt und das zuruckgebliebene Pellet in 5 Vo-

lumen 70%igem Ethanol gewaschen. Im Anschluss wurde erneut 10min bei 13.000 r/min

zentrifugiert, der Uberstand wieder abgenommen, das Pellet luftgetrocknet und im An-

schluss in 30�l 10xTE-Puffer gelost.

54

Gelelektrophorese Mit den gereinigten und konzentrierten Verdauansatzen wurde nun

das Blot-Gel beladen. Es handelte sich hierbei um ein 1%iges TAE-Gel. Zusatzlich zu den

Verdauansatzen wurden zwei Langenstandards mitgefuhrt. In die erste Tasche wurden

10�l eines 1 kb-Ladders und in die letzte Tasche 10�l λ/HindIII-Marker pipettiert. Die

Gelelektophorese lief dann uber insgesamt 17 h bei 20V. Der Gellauf wurde schließlich

unter UV-Licht sichtbar gemacht und zusammen mit einem Lineal dokumentiert. Dies

ist wichtig, da der Langenstandard nach der Detektion der Sonden unter Umstanden

nicht mehr sichtbar ist und so eine Bestimmung des Molekulargewichts der Banden nicht

mehr moglich ware. Desweiteren wurden die Banden des 1 kb-Markers mit einem Skalpell

eingeschnitten. Dadurch war es moglich die Banden des Markers auch ohne UV-Licht

nachzuvollziehen und spater auf der Membran zu markieren.

Blotting Jetzt folgte der eigentliche Blot, also der DNA-Transfer vom Agarose-Gel auf

eine Nylon-Membran unter Ausnutzung der Kapillarkrafte. Dazu wurde das Gel zunachst

30min in einer Denaturierungslosung aus 1,5M Natriumchlorid (NaCl) und 0,5M Natri-

umhydroxid (NaOH) geschwenkt.

Uber einer mit 20xSSC gefullten Wanne wurde eine vorher mit Ethanol gesauberte Glas-

platte so platziert, dass an zwei Seiten ein Spalt frei blieb. Auf die Glasplatte wurde

nun ein in Gelbreite zurecht geschnittener, aber wesentlich langerer Streifen Whatman-

Papier als ”Brucke“ gelegt. Der Streifen wurde vorher in 20xSSC getrankt und die beiden

uberhangenden Enden ragen wahrend der gesamten Blot-Zeit in die mit Puffer gefullte

Wanne. Auf das Whatman-Papier wurde das Gel platziert und eventuelle Luftblasen vor-

sichtig entfernt. Luftblasen konnen den Flussigkeitsstrom und damit den Transfer der DNA

auf die Membran unterbrechen. Zudem wurde das Gel von allen Seiten hin mit Frischhal-

tefolie abgedichtet um ein Austrocknen bzw. einen Flussigkeitsstrom am Gel vorbei zu ver-

hindern. Dann wurden die Nylon-Membran sowie zwei weitere Whatman-Papierstucke auf

die genaue Gelgroße zugeschnitten. Die Membran wurde kurz in der Denaturierungslosung

befeuchtet, in A. dest. geschwenkt und luftblasenfrei auf das Gel gelegt. Anschließend wur-

den auch die beiden in 20xSSC getrankten Whatman-Papiere auf die Membran gelegt und

alle Luftblasen entfernt. Es folgten dann ca. 15 Lagen saugfahiger Zellstoff und zuoberst

eine Beschwerung mit einem Gewicht von ca. 1-1,5 kg. Eine schematische Darstellung des

Blot-Aufbaus ist in Abbildung 3.5 auf der nachsten Seite zu sehen.

55

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Abbildung 3.5: Schema des Blottens beim Southern-Blot

Durch die einwirkenden Kapillarkrafte wird Flussigkeit aus dem Reservoir in der Wanne

am Whatman-Papier entlang gesaugt und erreicht so das Gel. Der Flussigkeitsstrom zieht

dann die DNA aus dem Gel mit nach oben, wo sie schließlich an der Membran, dessen Poren

fur die DNA zu klein sind, hangen bleibt. Der Flussigkeitsstrom lauft bis in den trockenen

Zellstoffstapel hinein. Dieser Vorgang dauerte ca. 4 h. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das

System abgebaut und die im Gel sichtbare Taschen sowie die eingeschnittenen Marker-

Banden mit einem Bleistift auf der Membran markiert. Stellen an denen die Membran

”verletzt“ wurde, sind auch auf dem spateren Rontgenfilm sichtbar und erlauben so ein

genaueres Zuordnen der Banden. Am Ende wurde die Membran noch 30min bei 80 ◦C

inkubiert und damit die DNA auf der Membran fixiert. Nun konnte die Membran entweder

direkt weiter verwendet werden oder in Folie eingepackt bei -20 ◦C gelagert werden.

Sondenherstellung Innerhalb der Bruchpunktregion wurden Primerpaare so aus-

gewahlt, dass sequenzspezifische Sonden von ca. 350-400 bp Lange entstanden. Die Pri-

mer wurden mit der Version 3 der Primer Design Software entworfen und die entspre-

chende DNA-Sonde anschließend uber ”BLAT Search Genome“ mit der Sequenzdaten-

bank von UCSC Genome Bioinformatics verglichen. Es ist essentiell fur die erfolgreiche

Durchfuhrung des Southern Blots, dass die Sonden spezifisch fur die zu untersuchende

Region sind.

Die Synthese der DNA-Sonden erfolgte schließlich uber ein Standard-PCR-Verfahren (siehe

auch Abschnitt 3.2 auf Seite 28). Als Template diente dabei genomische DNA einer ge-

56

sunden Kontrollperson. Es wurden die ublichen 25�l-Ansatze mit Taq-Polymerse, DMSO

und Betain verwendet und die PCR mit dem Touch-Down-Programm TDL64-58 durch-

gefuhrt. Es wurden jeweils mindestens zwei PCR-Reaktionen pro Sonde durchgefuhrt, da

die Sonden uber das Gelextraktionsverfahren (siehe auch Abschnitt 3.2.1.4 auf Seite 30)

aufgereinigt wurden und somit trotz Verlust bei der Aufreinigung genug Sonde fur die

Markierungsreaktion zur Verfugung stand.

Markierung der Sonden Im nachsten Schritt wurden die aufgereinigten DNA-Sonden

radioaktiv markiert. Dazu wurden zunachst 50 ng der Sonde entnommen und mit A. dest.

auf ein Gesamtvolumen von 55�l aufgefullt. Dieses Gemisch wurde nun 3min lang bei

99 ◦C im Heizblock denaturiert und somit in Einzelstrange aufgespalten. Die Sonde wurde

nach Ablauf der Denaturierungszeit sofort auf Eis gestellt um ein Renaturieren zu ver-

hindern. Dann wurden 45�l der denaturieten Sonde in ein Tube pipettiert, welches den

von der Firma Amersham Biosciences vorgefertigten ”Oligolabeling-Mix“ enthalt. Dieser

Mix enthalt die zur Markierungsreaktion benotigte DNA-Polymerase, dATPs, dGTPs und

dTTPs sowie Random Oligomere. Diese binden an unspezifische Stellen der DNA und die-

nen dort als Primer fur die DNA-Polymerase. Nun folgte im Isotopenlabor die Zugabe von

5�l des 32P-markierten α-dCTPs (3.000Ci/mmol). Dieser Mix wurde 30min bei 37 ◦C

inkubiert, so dass die eigentliche Markierungsreaktion statt finden konnte.

Nach der Markierungsreaktion war ein Aufreinigen der Sonde notig, um nicht einge-

baute Nukleotide zu entfernen. Dies geschieht mit Hilfe eines Quant� G-50 Micro-

Sephadex-Saulchens der Firma Amersham Biosciences. Die Saule wurde zunachst in einem

Eppendorf-Cup 1min bei 3.000 r/min zentrifugiert, in ein frisches Eppendorf-Cup umge-

setzt und der Sonden-Mix mittig auf das Saulchen pipettiert. Dann wurde erneut 2min

bei 3.000 r/min zentrifugiert und die aufgereinigte Sonde bis zum weiteren Gebrauch auf

Eis gestellt. Mit einem Szintillationsmessgerat wurde uberpruft, ob in der erhaltenen auf-

gereinigten Sonden-Losung Radioaktivitat nachweisbar war.

Hybridisierung Zunachst erfolgte eine Prahybridisierung der Membran. Dazu wur-

de die Nylonmembran vorsichtig mit der DNA-Seite nach innen in ein Hybridisie-

rungsrohrchen gegeben, etwa 10ml auf 60 ◦C vorgewarmte Hybridisierungslosung (Clon-

tech) zugegeben und 30min bei 60 ◦C im Hybridisierungsofen belassen. Die Inkubationszeit

57

wurde dazu genutzt, die Sonde wie oben beschrieben zu markieren und aufzureinigen. Die

aufgereinigte Sonde wird schließlich kurz vor Ende der Prahybridisierung ca. 3min bei

97 ◦C im Heizblock denaturiert und sofort wieder auf Eis gestellt um ein Renaturieren zu

verhindern. Nach Ablauf der Inkubationszeit der Prahybridisierung wurde die Hybridisie-

rungslosung abgegossen und durch frische, mit der radioaktiv markierten, denaturierten

Sonde versetzten Hybridisierungslosung ersetzt. Die eigentliche Hybridisierung erfolgte

uber Nacht bei ebenfalls 60 ◦C im speziellen Hybridisierungsofen. Die hohe Temperatur

erhoht dabei die spezifische Bindung der Sonde an die Zielsequenz und vermindert unspe-

zifische Bindungen mit anderen Sequenzen.

Waschung Nach der Hybridisierung war es notig, die ungebundene Sonde sowie

mogliche unspezifische Bindungen zu entfernen. Dazu wurde die Blot-Membran mehre-

re Male gewaschen. Zunachst erfolgte eine 30-40 minutige Waschung bei Raumtemperatur

in Wasch-Puffer 1. Die Waschlosung war dabei standig in Bewegung (Schuttler) und wur-

de mindestens einmal gewechselt. Der zweite Waschschritt erfolgte in Wasch-Puffer 2 bei

50 ◦C im Wasserbad. Auch hier wurde etwa 30-40min gewaschen und die Losung ein-

mal ausgetauscht. Anschließend wurde mit einem Szintillationsmessgerat der Wascherfolg

uberpruft.

Detektion Bei zufriedenstellendem Waschergebnis wurde die Membran umgehend in

Frischhaltefolie eingeschlagen, um ein Austrocknen zu vermeiden, in eine Rontgenkassette

gelegt und dort mit Klebestreifen fixiert. In der Dunkelkammer folgte dann das Auflegen

eines Rontgenfilms. Die Belichtung des Films geschah bei -20 ◦C und dauerte je nach

Datierung des Radioisotops zwischen drei und sieben Tagen.

Schließlich wurde der Rontgenfilm in der Dunkelkammer aus der Kassette genommen und

entwickelt. Dazu wurde der Film so lange in Entwicklerlosung geschwenkt, bis erste Banden

sichtbar waren. Anschließend erfolgte die etwa 10 minutige Fixierung. Dann wurde der

Film nur kurz in Wasser abgespult und zum Trocknen aufgehangt. Anhand der zu sehenden

Banden bzw. der Hintergrundschwarzung wurde entschieden, ob erneut ein Rontgenfilm

aufgelegt wurde.

58

Auswertung Zur Auswertung wurde neben dem entwickelten Rontgenfilms auch das

fotografierte Blot-Gel harangezogen. Zunachst wurden auf diesem Photo die Abstande der

einzelnen Markerbanden von den Geltaschen anhand des mitfotografierten Lineals ausge-

messen und entsprechend ihrer Große in einem x/y-Diagramm (Microsoft Exel) dargestellt.

Auf der x-Achse befand sich dabei die Entfernung der DNA-Banden von der Geltasche, auf

der y-Achse kam die der Bande entsprechende Großenangabe in kb zur Darstellung. An-

hand dieses Diagramms wurde eine Eichgerade erstellt. Erst jetzt konnte der entwickelte

Rontgenfilm ausgewertet werden. Dazu wurde auf dem Film zu jeder sichtbaren Bande der

Abstand zu den Geltaschen ausgemessen. Anhand der Eichgeraden ließ sich nun fur jeden

ausgemessenen Abstand einer Bande auf dem Rontgenfilm die entsprechende Molekular-

große ermitteln. Wichtig war dabei der Vergleich zwischen den bei den Kontrollpersonen

gefundenen Banden und den Banden bei dem Translokationspatient. Insbesondere von

großer Bedeutung waren zusatzliche, bei den Kontrollen nicht sichtbare Banden.

Stripping Unter ”Stripping“ versteht man das Entfernen der Sonden-DNA von der

Nylon-Membran, um so eine erneute Hybridisierung mit einer anderern Sonde zu

ermoglichen ohne den gesamten Blotvorgang wiederholen zu mussen. Dazu mussten

zunachst die Heteroduplexbindungen aufgebrochen werden, so dass die an die Membran

gebundenen DNA-Fragmente sowie die eingesetzte Sonde wieder als Einzelstrange vor-

lagen. Dies geschah, in dem die Blot-Membran ca. 30min bei 45 ◦C in 0,4M Natrium-

hydroxidlosung (NaOH) inkubiert wurde. Anschließend wurde die Sonden-DNA 15min

bei 45 ◦C mit 0,1xSSC +0,1% SDS abgewaschen. Die Blot-Membran wurde danach noch

15min bei Raumtemperatur in 0,2M Tris-HCl-Losung mit dem pH-Wert 7,4 inkubiert

und anschließend getrocknet. So aufbereitet konnte die Membran direkt fur die nachste

Hybridisierung verwendet oder aber in Folie eingepackt bei -20 ◦C gelagert werden.

3.2.5.4 Tissue-in-situ-Hybridisierung

a) Grundlagen

Auch bei der Tissue-in-situ-Hybridisierung handelt es sich um ein Hybridisierungsverfah-

ren. Allerdings richtet sich hier die markierte Sonde nicht gegen DNA, sondern gegen

59

endogene RNA in zytologischen oder histologischen Praparaten. Diese Technik erlaubt

den Nachweis spezifischer mRNA in einzelnen Zellen und ist somit eine der genauesten

Methoden zur Bestimmung der Genexpression [33, S. 240].

Die Hybridisierung erfolgt an auf Objektragern fixierten Gewebeschnitten. Dabei kann

grundsatzlich jedes Gewebe verwendet werden. Aber auch mehrere Gewebe gleichzeitig

konnen analysiert werden, wie dies z.B. bei der Whole-mount-in-situ-Hybridisierung der

Fall ist [76, S. 196]. Die Hybridisierung erfolgt mit einzelstrangigen komplementaren RNA-

Sonden (Riboproben) die entweder radioaktiv oder aber indirekt markiert wurden [76, S.

172]. Bei der indirekten Markierung wird in die Sonde ein Reporter-Molekul, z.B. Digoxi-

genin eingebaut. Nach der Hybridisierung wird ein Antikorper zugegeben, der mit Digoxi-

genin einen Komplex bildet. Schließlich erfolgt die Detektion durch Zugabe von Substraten,

die bei Bindung an den Antikorper einen Farbumschlag bewirken [76, S. 161].

Wird in einer Zelle ein bestimmtes Gen exprimiert, so ist im Zytoplasma die zur Transla-

tion benotigte mRNA vorhanden. Bei der Hybridisierungsreaktion binden die Riboproben

an diese mRNA. Nach mehreren Waschschritten, in denen unspezifische Bindungen und

uberschussige Sonde entfernt wird, werden die Heteroduplexe durch Zugabe eines Substra-

tes sichtbar. Die Signale sollten dabei innerhalb einer Zelle, aber außerhalb des Zellkerns

lokalisiert sein. Je starker die Expression eines Gens, um so besser lasst sich dieses mit der

Tissue-in-situ-Hybridisierung nachweisen. Bei nur schwach exprimierten Genen kommen

wegen der hoheren Sensitivitat radioaktiv markierte Riboproben zum Einsatz. Es werden

bei einer in-situ-Hybridisierung immer mehrere Sonden verwendet. Zum einen ist dies die

der mRNA komplementare, und damit dem kodierenden Strang entsprechende antisense-

Sonde. Zum anderen ist es eine dem nicht-kodierenden Strang entsprechende sense-Sonde

und in der Regel auch eine antisense-Sonde fur ein Gen, dessen Expressionsmuster bereits

bekannt ist. Diese bekannte antisense-Sonde dient als Kontrolle, ob die Hybridisierung

erfolgreich war und Signale an der erwarteten Position sichtbar sind. Die sense-Sonde des

zu untersuchenden Gens dient hauptsachlich der Erkennung von Hintergrundsignalen aus

unspezifischen Bindungen.

60

b) Sonden-Gewinnung

Oligonukleotid-Sonden In meiner Arbeit kamen zwei verschiedene Verfahren der

Sonden-Generierung zur Anwendung. Zunachst wurden aufgrund der einfacheren Hand-

habung Oligonukleotid-Sonden eingesetzt. Diese Oligomere aus 30-50 Nukleotiden werden

durch ein End-Labeling-Verfahren markiert und stehen so relativ schnell fur die Hybridi-

sierung zur Verfugung.

cDNA-Sonden Die Generierung von cDNA-Sonden ist zeitaufwendiger als die der

Oligonukleotid-Sonden, dafur ist die Bindung jedoch spezifischer, da die Sonden ca. 200-

500 Nukleotide lang sind [33, S. 231]. Zunachst wurden die gewunschten Fragmente mittels

einer PCR aus cDNA amplifiziert, anschließend in einen Vektor kloniert und dort vermehrt.

Dann wurden die Plasmide isoliert und durch einen Restriktionsverdau linearisiert. Je nach

Orientierung des Fragments im Vektor ließen sich nun durch eine in-vitro-Transkription

markierte sense- oder antisense-Sonden generieren, welche schließlich fur die Hybridisie-

rung eingesetzt werden konnten.

c) Durchfuhrung

Gewebeschnitte und Fixierung Fur meine Versuche wurden Mause in verschiede-

nen Embryonalstadien sowie das Gehirn adulter Tiere verwendet. Die Embryonen bzw.

das Hirngewebe wurde prapariert, in TissueTek� eingebettet und bei -80 ◦C gelagert.

Die Herstellung der Schnitte erfolgte am Kryostat, nachdem das zu schneidende Gewebe

ca. 30min bei -20 ◦C angetaut wurde. Es wurden Schnitte mit einer Dicke von 10-12�m

angefertigt und vorsichtig auf einen Objekttrager ”aufgeschmolzen“. Je nach Große des

Embryos bzw. des Gewebestucks konnten 2-3 Schnitte auf einen Objekttrager aufgebracht

werden. Die Objekttrager wurden beschriftet und ca. 15min luftgetrocknet.

Durch die Fixierung der Schnitte bleibt die Gewebemorphologie erhalten und die DNA

degradiert nur gering [33, S. 240]. Zur Fixierung der Schnitte auf dem Objekttrager wur-

de dieser zunachst 10min bei 50 ◦C auf einer Heizplatte getrocknet. Die wieder gut ab-

gekuhlten Schnitte wurden dann in Kuvetten mit eiskaltem Aceton uberfuhrt und 15min

61

bei -20 ◦C belassen. Die Objekttrager wurden dann erneut auf dem 50 ◦C-Heizblock ge-

trocknet und konnten so vorbereitet direkt weiter verwendet werden. Alternativ wurden

die Objekttrager in dafur geeignete Boxen verbracht, diese mit Parafilm verschlossen und

in Alufolie eingepackt bei -80 ◦C gelagert. Wenn moglich, wurden die Schnitte jedoch we-

gen des Qualitatsverlustes beim Einfrieren direkt weiter verarbeitet bzw. die Lagerzeit auf

wenige Tage beschrankt.

HE-Farbung Bereits nach der Fixierung in Aceton wurde etwa jeder sechste Objekt-

trager fur eine HE-Farbung beiseite gestellt. Auch wenn Schnitte eingefroren waren, wur-

den nach dem Auftauen an 1-2 Schnitten pro Box eine HE-Farbung durchgefuhrt. Die

HE- oder Hamatoxylin-Eosin-Farbung dient einerseits der Uberprufung der Qualitat der

Schnitte, andererseits ist sie aber auch zur Orientierung und Identifizierung bestimmter

Gewebe und Gewebestrukturen von Bedeutung und damit fur die endgultige Auswertung

der Tissue-in-situ-Hybridisierung unerlasslich.

Hamatoxylin ist ein blauer, positiv geladener Farbstoff, der an die negativ geladene DNA

bindet und somit die Zellkerne anfarbt. Das rot farbende Eosin hingegen ist negativ gela-

den, bindet an Proteine und farbt dadurch das Zytoplasma an [12, S. 5].

Zunachst wurden die Schnitte fur 3min in eine Kuvette mit Hamatoxylin gestellt. Dann

folgte eine 5-minutige Spulung der Objekttrager unter fließendem Leitungswasser. An-

schließend waren die Schnitte bereits tiefblau eingefarbt. Um auch letzte Hamatoxylinreste

zu entfernen, wurden die Objekttrager noch einmal kurz in A. dest. gespult und dann di-

rekt in eine Kuvette mit Eosin inkubiert. Dort blieben die Schnitte dann ca. 3min lang,

bevor sie erneut kurz in A. dest. gespult und schließlich in einer aufsteigenden Alkoholreihe

entwassert wurden. Dafur wurden die Schnitte jeweils ca. 1min in Kuvetten mit 70%igem,

90%igem und 100%igem Ethanol gestellt. So gefarbt und entwassert wurden die Schnitte

luftgetrocknet und eingedeckelt.

Generierung der Oligonukleotid-Sonden Fur meine Arbeit wurden Oligomere aus

38-41 Nukleotiden anhand der bei NCBI hinterlegten cDNA-Sequenz des st5 -Gens der

Maus designed. Um eine hohe Spezifitat zu gewahrleisten, wurden die Sonden uber ”BLAT

Search Genome“ mit der Sequenzdatenbank von UCSC Genome Bioinformatics verglichen.

62

Tabelle 3.10: End-Labeling der Oligo-Sonden

Zutat Menge in �l

Oligonukleotid (100 pmol/�l) 1,0

5x Reaction-Buffer 4,0

25mM CoCl2 4,0

1mM DIG-ddUTP 1,0

Terminale Transferase 1,0

A. dest. 8,0


Es wurden drei zur cDNA und damit auch zur mRNA komplementare antisense-Sonden

und eine sense-Sonde ausgewahlt und durch die Firma Invitrogen synthetisiert. Bei der

Hybridisierung sollten die antisense-Sonden Signale zeigen, die sense-Sonde jedoch nicht.

Sie dient hauptsachlich dazu, Hintergrundsignale aus unspezifischen Bindungen zu erken-

nen, um damit die Signale der antisense-Sonden besser interpretieren zu konnen [33, S.

240].

Die Markierung der Oligonukleotide erfolgte uber ein 3’-End-Labeling Verfahren. Da-

bei wurde durch die Terminale Transferase eine DIG-markierte ddUTP-Gruppe ans 3’-

terminale Nukleotid des Oligomers angehangt [69]. Fur diese Reaktion wurde der DIG

Oligonucleotide 3’-End-Labeling Kit der Firma Roche verwendet.

Fur die Markierungsreaktion wurde ein Reaktionsansatz gemaß des im verwendeten Kit

der Firma Roche beiliegenden Protokolls hergestellt (siehe Tabelle 3.10). Dieser Mix wurde

15min bei 37 ◦C inkubiert und stand so fur die in-situ-Hybridisierung zur Verfugung. Der

Erfolg der Markierungsreaktion wurde durch einen Dot-Blot uberpruft und die Sonde bei

-20 ◦C gelagert.

Generierung der cDNA-Sonden Fur die Generierung von cDNA-Sonden wurden

zunachst anhand der bei NCBI hinterlegten cDNA-Sequenz des st5 -Gens der Maus Pri-

merpaare designed, so dass die drei zu amplifizierenden Fragmente eine Lange von etwa

300-600 bp aufwiesen. Diese Fragmente wurden mittels einer Standard-PCR (siehe auch

63

Abschnitt 3.2.1.2 auf Seite 27) aus cDNA amplifiziert. Die cDNA wurde vorher per cDNA-

Synthese aus RNA verschiedener Mausgewebe gewonnen.

Die drei so gewonnenen Amplikons wurden in einem nachsten Schritt in einen TOPO

TA-Vektor kloniert. Die Klonierung in einen Vektor ist wichtig, da die in den multiple-

cloning-sites der Vektoren vorhandenen Promotorregionen fur die spater folgende In-vitro-

Transkription benotigt werden. Fur die Klonierung wurde zunachst ein Mix aus 4�l PCR-

Produkt, 1�l Salz und 1�l TOPO-Vektor hergestellt und 5 Minuten bei Raumtempera-

tur inkubiert. 2�l dieses CloningReaction-Mixes wurde dann vorsichtig auf die chemisch-

kompetenten E. coli-Bakterien gegeben und diese 10min auf Eis belassen. Danach folgte

ein 30 s Hitzeschock im 42 ◦C Wasserbad. Die Zellen wurden sofort wieder zuruck auf Eis

verbracht und mit 250�l SOC-Medium versehen. So vorbereitet wurden die Bakterien nun

ca. 1 h bei 37 ◦C inkubiert und anschließend jeder Ansatz auf insgesamt zwei Kanamycin-

Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden dann uber Nacht bei 37 ◦C inkubiert. Am

nachsten Tag wurden in die Wells einer 96er Kulturplatte jeweils 100�l eines Medium-

Kanamycin-Mixes vorgelegt (20ml LB-Medium + 20�l Kanamycin) und dann in jedes

Well eine Kolonie von den Agarplatten gepickt. Diese Platte wurde erneut uber Nacht bei

37 ◦C inkubiert.

Aus jeder Probe wurde eine Kolonie-PCR angefertigt. Auch hier kam das Standard-

PCR-Verfahren zum Einsatz (siehe auch Abschnitt 3.2.1.2 auf Seite 27). Als Primer

wurden T3-Primer und T7-Primer entsprechend den in den multiple-cloning-sites des

TOPO-Vektors enthaltenen Primerbindungsstellen verwendet. Der Erfolg der PCR und die

Fragmentlange wurde zunachst in einem Agarose-Gel uberpruft, die PCR-Produkte uber

einen Exonuklease-Verdau aufgereinigt und anschließend gemaß des Standard-Sequenzier-

Protokolls (siehe Abschnitt 3.2.1.6 auf Seite 33) sequenziert. Damit ließ sich zunachst

durch den Vergleich mit den online verfugbaren Datenbanken ermitteln, ob es sich um

das gewunschte Fragment handelte. Zum anderen ließ sich die Orientierung des Fragmen-

tes im Vektor genau feststellen. So wurde jeweils ein Klon pro cDNA-Amplikon mit der

richtigen Orientierung ausgewahlt und kultiviert. Schließlich erfolgte die Isolierung der

Plasmide gemaß dem Standardprotokoll des ”QUIAGEN Plasmid Midi Kits“ aus einer

200ml Hauptkultur.

64

Die so gewonnenen Plasmide wurden durch einen Restriktionsverdau linearisiert. Dies ge-

schah fur jedes Plasmid in einem Ansatz mit dem Enzym NotI und in einem zweiten

Ansatz mit SpeI. Dabei schneidet NotI vor dem eingebauten Fragment, also am 3’-Ende,

SpeI nach dem eingebauten Fragment, also am 5’-Ende. Die linearisierten Plasmide wur-

den nun noch uber eine Ethanolfallung aufgereinigt und standen so vorbereitet fur die

eigentliche Sondengenerierung mittels In-vitro-Transkription zur Verfugung. Dafur war es

wichtig die Vektoren vorher ”stromabwarts“ zu linearisieren um ”run-around-Transkripte“

zu vermeiden [55, S. 17].

Bei der in-vitro-Transkription handelt es sich um ein Strang-Synthese Markierungsverfah-

ren. Dabei dient ein DNA-Strang, hier das linearisierte Plasmid, einer RNA-Polymerase als

Matritze fur die Generierung eines komplementaren RNA-Strangs [76, S. 157]. Die jeweilige

RNA-Polymerase startet dabei die Transkription in der entsprechenden Promotor-Region

im Vektor. Haufig Verwendung finden dabei SP6-, T3- und T7-RNA-Polymerasen. Zu des-

sen Synthese werden unter anderem DIG-markierte rNTPs verwendet. Somit ist es moglich,

in diesem Verfahren etwa an jeder 20.-25. Position des neu entstehenden RNA-Strangs ein

markiertes Nukleotid einzubauen. Unter optimalen Reaktionsbedingungen lasst sich so aus

ca. 1�g linearisiertem Plasmid etwa 10�g markiertes RNA-Transkript synthetisieren [55,

S.17].

In meiner Arbeit wurden die RNA-Sonden mittels des RNA-Labeling Kits der Firma Ro-

che hergestellt. Von jedem Plasmid wurden sense- und antisense-Sonden generiert. Die

sense-Sonden entstanden dabei aus dem mit SpeI linearisiertem Plasmid mit Hilfe der T7-

RNA-Polymerase. Fur die antisense-Sonden wurde das mit NotI linearisierte Plasmid und

die T3-RNA-Polymerase verwendet. Dafur wurde jeweils ein Reaktionsansatz aus 10�l

Plasmid (entspricht etwa 1�g), 2�l 10x DIG RNA Labeling-Kit, 2�l 10x Transcription

Buffer, 1�l RNase-Inhibitor, 2�l Polymerase (T3 oder T7) sowie 3�l A. dest. hergestellt

(siehe Tabelle 3.11 auf der nachsten Seite) und fur 2 h bei 37 ◦C inkubiert. Der Erfolg der

Markierungsreaktion wurde anschließend im Agarose-Gel uberpruft und die fertig gestell-

ten Sonden bei -20 ◦C gelagert.

65

Tabelle 3.11: In-vitro-Transkription


linearisiertes Plasmid 10,0

10x DIG RNA Labeling-Kit 2,0

10x Transcription-Buffer 2,0

RNase-Inhibitor 1,0

Polymerase (T3 oder T7) 2,0

A. dest. 3,0


Uberprufung der markierten Oligonukleotid-Sonden mittels Dot-Blot Mittels

des Dot-Blot-Verfahrens wurde uberpruft, ob die Markierung der Oligonukleotide erfolg-

reich war und in welcher Verdunnung die Sonde fur die Tissue-in-situ-Hybridisierung ein-

gesetzt werden musste [33, S. 223].

Von den DIG-markierten Oligonukleotid-Sonden wurden zunachst Verdunnungsreihen

(1:10, 1:50, 1:100, 1:1000 und 1:10.000) hergestellt. Je 1�l dieser Verdunnungen wurde

dann auf eine positiv geladene Nylonmembran aufgetropft und diese fur ca. 30min luftge-

trocknet. Die getrocknete Membran wurde zunachst 5min in Puffer I gewaschen und dann

fur 15min in Puffer II inkubiert. Durch den Puffer II werden unspezifische Bindungsstellen

abgesattigt, so dass die anschließend auf die Membran aufgebrachte Antikorperlosung nur

an die in die Sonde eingebauten DIG-Molekule bindet. Als Antikorper dienten dabei AP-

konjugierte Anti-DIG Fab-Fragmente 1:5000 in Puffer II verdunnt. Die Antikorperlosung

verblieb 45min auf der Membran. Nun wurde der Blot noch zwei Mal 5min in Puffer

III gewaschen, so dass nicht gebundener Antikorper entfernt wurde. Die Substratreaktion

erfolgte abgedunkelt in frisch angesetzter Substratlosung fur ca. 20-30min bei 37 ◦C im

Hybidisierungsofen. Das Ergebnis der Substratreaktion sollte dabei regelmaßig kontrolliert

und rechtzeitig abgestoppt werden, um eine Uberfarbung zu vermeiden. Das Abstoppen

erfolgte durch kurzes Waschen der Membran in 1xPBS. Am Ende wurde die Membran luft-

getrocknet und der Erfolg der Markierungsreaktion anhand der Starke der Blaufarbung

beurteilt (siehe Abbildung 3.6 auf der nachsten Seite.

66

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Abbildung 3.6: Beispiel eines Dot Blots

Zu sehen ist ein Dot Blot mit verschiedenen markierten Oligonukleotidsonden, die in einer

Verdunnungsreihe aufgetragen wurden. Bei mst5 1as-3as handelt es sich um die Antisense-Sonden des

st5 -Gens der Maus, bei mst5 2s um die entsprechende Sense-Sonde. m4051 as und m4051 s sind die

mitgefuhrten Kontroll-Oligonukleotidsonden mit einem bekannten Expressionsmuster. Bei der Kontroll-

Antisense-Sonde handelt es sich um ein im verwendeten Labeling-Kit mitgeliefertes Oligonukleotid.

Fixierung der Schnitte Wurden bei -80 ◦C gelagerte Schnitte fur die Hybridisierung

verwendet, wurden diese langsam, im verschlossenen Kastchen uber mindestens 1 h aufge-

taut. Sowohl die frischen, als auch die tiefgefrorenen Schnitte wurden vor der Hybridisie-

rung erneut fixiert. Dazu wurden die Objekttrager bei Raumtemperatur und unter dem

Abzug in Kuvetten mit frischem 4%igem PFA gestellt und dort fur mindestens 45min

inkubiert. Die so fixierten Schnitte wurden dann noch 2 Mal 5min in PTW gewaschen

und standen nach dieser Behandlung fur die Hybridisierung zur Verfugung.

Hybidisierung mit Oligonukleotid-Sonden Fur die Hybridisierung wurden zunachst

die markierten Oligonukleotid-Sonden 1:70 mit 2xSSC/Formamid verdunnt und bis zur

Verwendung auf Eis aufbewahrt. Von dieser Verdunnung wurden pro Schnitt 50�l vor-

sichtig, ohne den Objekttrager zu beruhren, auf den Schnitt pipettiert. Waren zwei oder

mehrere Schnitte auf einem Objekttrager aufgebracht, wurden fur jeden Schnitt 50�l auf-

gebracht. Die Schnitte wurden dann luftblasenfrei mit Parafilm abgedeckt, in eine vor-

bereitete feuchte Hybridisierungskammer gelegt und 3h bei 33 ◦C inkubiert. In meinen

Versuchen wurden außer den entsprechenden antisense- und sense-Sonden fur das St5 -Gen

67

zusatzlich antisense- und sense-Sonden eines bereits getesteten Gens sowie Leerkontrollen

mitgefuhrt. Die Kontrollsonden waren besonders zu Beginn der Analysen wichtig, um zu

uberprufen, ob die Methode prinzipiell funktioniert hat.

Nach der Hybridisierungsreaktion wurden die Objekttrager in eine Kuvette mit auf 33 ◦C

vorgewarmter 2xSSC-Losung gestellt und dort solange belassen, bis sich der Parafilm vom

Objekttrager abgelost hatte. Anschließend erfolgte die Waschung der Schnitte zunachst

3 Mal 5min in 2xSSC und dann 2 Mal 10min in 0,1xSSC. Beide Waschungen erfolgten

im 33 ◦C-Wasserbad. Nun wurden die Schnitte noch 5min bei Raumtemperatur in PBT

gewaschen und im Anschluss die unspezifischen Bindungsstellen mit Blockierungspuffer

abgesattigt. Dazu inkubierten die Objekttrager 15min bei Raumtemperatur im Blockie-

rungspuffer.

Nun folgte die Inkubation der Schnitte mit den AP-konjugierten Anti-DIG-Fab-

Fragmenten. Dazu wurde eine 1:100-Verdunnung der Antikorper in Blockierungspuffer

hergestellt und davon 50�l pro Schnitt vorsichtig auf die Objekttrager pipettiert. Die

Schnitte wurden erneut mit Parafilm abgedeckt, zuruck in die feuchte Kammer gelegt und

fur 1 h bei 37 ◦C im Hybridisierungsofen inkubiert. Anschließend mussten die Objekttrager

erneut gewaschen werden. Diesmal zunachst 2 Mal 5min in PBT und dann 5min in Puffer

III.

Um die DIG-Antikorper-Konjugate zu detektieren, wurde frische Substratlosung herge-

stellt und diese zugig sowie moglichst lichtgeschutzt weiterverarbeitet. Pro Objekttrager

wurden 100-200�l der Substratlosung aufgetragen, die Schnitte erneut mit Parafilm abge-

deckt, in die feuchte Kammer gelegt und bei 37 ◦C ca. 30min im Hybridisierungsofen inku-

biert. Es ist wichtig die Substratreaktion immer wieder zu beobachten, um ein Uberfarben

der Schnitte zu verhindern. Alternativ kann die Reaktion auch langsam, bei ca. 4 ◦C statt-

finden, dann sind jedoch langere Inkubationszeiten notig. Zeigt die Substratreaktion ein

zufriedenstellendes Ergebnis, wird die Reaktion abgestoppt, in dem man die Objekttrager

in eine Kuvette mit 1xPBS uberfuhrt und ca. 5min darin inkubiert.

Hybridisierung mit cDNA-Sonden Bei Verwendung von cDNA-Sonden, wurden die

Schnitte zunachst prahybridisiert und so fur die eigentliche Hybridisierung vorbereitet.

68

Dazu wurde eine Losung aus 5xSSC und 1xFormamid im Verhaltnis 1:1 hergestellt und

50�l pro Schnitt auf die Objekttrager pipettiert. Die Schnitte werden dann vorsichtig mit

Hybridisierungfolie abgedeckt, in eine feuchte Hybridisierungskammer gelegt und 2h bei

60 ◦C im Hybridisierungsofen inkubiert. Anschließend wurden die Objekttrager bis sich

die Folie komplett von den Objekttragern gelost hat in eine Kuvette mit 5xSSC gestellt.

Im Anschluss erfolgte die eigentliche Hybridisierung. Zunachst wurden Verdunnungen der

Sonden aus 0,1�l Sonde und 100�l 5xSSC/Formamid (1:1) hergestellt. Bevor die Hy-

bridisierungslosung auf die Schnitte aufgebracht werden konnte, musste die Sonde erst

10min bei 80 ◦C denaturiert und direkt auf Eis abgekuhlt werden, um eine Renaturie-

rung zu verhindern. Analog zur Hybridisierung mit Oligonukleotid-Sonden wurden bei

der Hybridisierung mit cDNA-Sonden pro Schnitt 50�l der Hybridisierungslosung auf die

Objekttrager aufgetragen, die Schnitte mit Hybridisierungsfolie abgedeckt, in die feuchte

Kammer gelegt und uber Nacht bei 60 ◦C hybridisiert.

Am nachsten Tag folgten mehrere Waschungen. Zunachst wurde bei Raumtemperatur

fur ca. 20min vorsichtig die Hybridisierungsfolie in 2xSSC abgelost. Danach wurden die

Schnitte 3 Mal 20min bei 60 ◦C in 2xSSC, 3 Mal 20min bei 60 ◦C in 0,1xSSC und 5min

bei Raumtemperatur in 1xPBT gewaschen. Anschließend erfolgte die Absattigung un-

spezifischer Bindungsstellen fur 40min bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer. Dann

wurden pro Schnitt 50�l einer 1:100 Antikorper-Verdunnung in Blockierungspuffer auf die

Objekttrager aufgebracht, die Schnitte wieder mit Hybridisierungsfolie abgedeckt, zuruck

in die feuchte Kammer gelegt und 1h bei 37 ◦C inkubiert. Nach der Konjugation mit dem

Antikorper wurden die Schnitte erneut 2 Mal 5min in PBT-Puffer und 2 Mal 5min in

Puffer III gewaschen. Es wurde frische Substratlosung angesetzt, pro Schnitt ca. 60�l auf-

getragen, die Schnitte mit Hybridisierungsfolie abgedeckt und bei 37 ◦C mindestens 30min

inkubiert. Auch hier sollte der Fortschritt der Reaktion regelmaßig uberpruft werden. Falls

notig konnen die Schnitte auch uber Nacht bei 4 ◦C inkubiert werden. Zum Abstoppen

der Reaktion werden die Schnitte ca. 5min in eine Kuvette mit 1xPBS gestellt.

Ethanolreaktion Falls die Substratreaktion zu intensiv war, ist es moglich, unspezifi-

sche Signale durch eine Ethanolreihe wieder zu entfernen. Zuruck bleiben dann nur die

spezifischen Signale der Sonden. Die Objekttrager wurden dazu zunachst 2min lang in eine

69

Kuvette mit 70%igem Ethanol verbracht. Dann wurde der 70%ige durch 90%igen Alkohol

ersetzt und unter standiger Sichtkontrolle entfarbt. Hat die Entfarbung das gewunschte

Ausmaß erreicht, werden die Objekttrager noch 5min in 100%igem Alkohol inkubiert und

dann bis zum Eindeckeln in 1xPBS gelagert.

Eindecken Die Objekttrager wurden aus dem 1xPBS genommen, kurz abgetropft und

mit einem Tropfen Crystal Mount versehen. Der Tropfen wurde durch vorsichtiges Schwen-

ken uber die Schnitte verteilt, so dass diese vollstandig davon bedeckt waren. Anschlie-

ßend wurden die Objekttrager ca. 10min bei 50 ◦C auf einer Heizplatte getrocknet. Auf

den vollstandig getrockneten Schnitt wurden nun 2 Tropfen Clarion gegeben und ein Deck-

glas aufgebracht. Dann wurden die fertigen Objekttrager uber Nacht bei Raumtemperatur

getrocknet und konnten am nachsten Tag ausgewertet werden.

Auswertung Die Auswertung erfolgte unter Zuhilfenahme der angefertigten HE-

Schnitte unter dem Lichtmikroskop. Mittels einer an das Mikroskop angeschlossenen digi-

talen Kamera konnten die einzelnen Schnitte in verschiedenen Vergroßerungen dokumen-

tiert werden.

3.3 Biologische Materialien

3.3.1 Bakterien: BAC-Klone

Fur meine Arbeit geeignete BAC-Klone wurden mit Hilfe des NCBI Map Viewers aus-

gewahlt und uber Pieter J. de Jong (Children’s Hospital Oakland Research Institute;

CHORI) in Form von E. coli-Stammen bezogen. Alle verwendeten BACs sind in Tabel-

le 3.12 aufgefuhrt.

Tabelle 3.12: Verwendete BACs

BAC-

Bezeichnung

Accession-

Number

zytogenetische

Bande

ungefahre Lage

(Mb) (hg17)

RP11-38L8 AC021424.3 11p15.5 2,67-2,81


70

BAC-

Bezeichnung

Accession-

Number

zytogenetische

Bande

ungefahre Lage

(Mb)

RP11-11A9 AC109309.2 11p15.5 3,19-3,22

RP11-120E20 AC060812.5 11p15.4 3,57-3,76

RP11-438N5 AC087441.9 11p15.4 3,85-4,01

RP11-390G21 AC090893.5 11p15.4 4,90-5,10

RP11-454O22 AC087380.3 11p15.4 5,33-5,54

RP11-304C12 AC068733.12 11p15.4 6,24-6,44

RP11-324J3 AC027804.7 11p15.4 7,09-7,27

RP11-494M8 AC044810.7 11p15.4 7,76-7,95

RP11-236J17 AC116456.12 11p15.4 7,95-8,10

RP11-379P15 AC091013.7 11p15.4 8,15-8,37

RP11-321F11 AC105357.7 11p15.3 8,37-8,54

RP11-691A5 AC104360.8 11p15.3 8,63-8,81

RP11-152H18 AC091053.11 11p15.3 8,72-8,87

RP11-318C2 AC026894.7 11p15.3 8,82-9,05

RP11-467K18 AC079296.5 11p15.3 9,05-9,24

RP11-5L12 AP006259.1 11p15.3 9,22-9,32

RP11-682B13 AC055845.15 11p15.3 9,32-9,47

RP11-48J22 AC023850.10 11p15.3 10,99-11,16

RP11-573E11 AC025300.10 11p15.3 12,28-12,46

RP5-827E24 AL160415.14 20q13.3 60,74-60,63

RP11-402F1 AL162291.1 20q13.3 57,12-57,02

RP4-718J7 AL035541.15 20q13.3 56,87-56,74

RP11-560A15 AL157414.19 20q13.3 56,41-56,28

RP11-46O3 AL161657.22 20q13.3 56,1-56,01

RP11-380D15 AL139824.22 20q13.2 55,52-55,33

RP11-6L15 AL162292.20 20q13.2 53,79-53,69

RP11-15M15 AL391097.13 20q13.2 52,35-52,17

RP5-1022J11 AL049765.16 20q13.2 51,85-51,71

RP5-831D17 AL109984.14 20q13.2 51,39-51,27


71

BAC-

Bezeichnung

Accession-

Number

zytogenetische

Bande

ungefahre Lage

(Mb)

RP5-1009H6 AL035682.16 20q13.2 50,72-50,64

RP5-906P16 AL079339.11 20q13.2 50,63-50,55

RP5-1106N18 AL035457.13 20q13.2 50,55-50,41

RP5-1193N1 AL121915.8 20q13.2 50,41-50,35

RP4-811M8 AL121785.48 20q13.2 50,35-50,28

RP5-955M13 AL050404.3 20q13.2 50,28-50,24

RP11-244L4 AL353653.19 20q13.2 49,97-49,91

Tabelle 3.13: Verwendete Kontroll-Sonden nach Knight et al. [41]

Kontroll-Sonde BAC/PAC-Bezeichnung

ST 11p Pac 11p908-h22

ST 20q Pac 20q81-f12

3.3.2 Metaphasepraparate

In meiner Arbeit wurden aus peripheren Lymphozyten gewonnene Metaphasepraparate

in der FISH eingesetzt. Diese wurden durch Mitarbeiter des Instituts nach dem Stan-

dardprotokoll angefertigt. Alle Suspensionen wurden bei -20 ◦C in einem 3:1 Gemisch aus

Methanol und Eisessig gelagert.

3.3.3 DNA

Die in den Versuchen verwendete DNA wurde durch die Mitarbeiter des molekulargeneti-

schen Labors des Hauses maschinell aus EDTA-Blut extrahiert.

3.3.4 RNA

Die RNA wurde nach dem gultigen Standardprotokoll aus humanen peripheren Lympho-

zyten bzw. aus lymphoblastoiden Zelllinien (LBL) isoliert und bei -80 ◦C aufbewahrt.

72

3.3.5 Mausembryonen und Mausgewebe

In meiner Arbeit wurden Mausembryonen an den Entwicklungstagen E8.5, E13.5 und E15

untersucht. Desweiteren wurden Gehirn und Nieren von 6, 10 und 15 Tage alten Mausen

(P6, P10, P15), sowie von 7 Wochen alten und adulten Tieren untersucht. Außerdem wurde

aus verschiedenen Geweben der Maus (Gehirn, Herz, Skelettmuskel) RNA gewonnen und

in cDNA umgeschrieben.

3.4 Gerate und Chemikalien

Eine vollstandige Liste aller in dieser Arbeit verwendeten Gerate, der Software sowie der

Chemikalien, Losungen und Verbrauchsmaterialien findet sich im Anhang A auf Seite 142.

73

Kapitel 4

Ergebnisse

4.1 Bruchpunktfeinkartierung

4.1.1 Ausgangssituation vor Beginn der Arbeit

Das Subtelomer-Screening sowie das Chromosomen-Painting in Verbindung mit der hoch-

auflosenden GTG-Banderung der Chromosomenanalyse zeigte bei dem Patienten eine de

novo vorliegende balancierte Translokation 46,XY,t(11;20)(p15;q13.3). Vor Beginn meiner

Arbeit wurden bereits erste FISH-Analysen mit BAC-Sonden durchgefuhrt die jedoch auf

beiden Chromosomen jeweils translozierte Signale zeigten. Somit musste der Bruchpunkt

weiter in Richtung Zentromer liegen. Ausgehend von diesen Daten wurde auf Chromosom

11 der Bruchpunkt proximal des BACs RP11-38L8 und auf Chromosom 20 proximal des

BACs RP5-827E24 vermutet (siehe auch Abbildung 4.1 auf der nachsten Seite).

74

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Abbildung 4.1: Ausgangssituation auf den Chromosomen

Dargestellt ist die Situation auf den Chromosomen zu Beginn der Arbeit. Beide eingezeichneten BACs

wurden bereits in einer FISH-Analyse untersucht und zeigten translozierte Signale.

4.1.2 Bruchpunktkartierung mit FISH-Analysen

4.1.2.1 Chromosom 11

Auf Chromosom 11 erfolgte die weitere Kartierung der Bruchpunktregion mit Hilfe von

BACs, welche zentromerwarts des translozierten BACs RP11-38L8 lagen. Insgesamt wur-

den 19 BACs untersucht, von denen zwei aufgrund ihrer falschen Lage nicht ausgewer-

tet werden konnten. Alle ubrigen BACs hybridisierten aber in der erwarteten Region.

Schließlich konnte das BAC RP11-152H18 als bruchpunktuberspannend identifiziert wer-

den. Dieses BAC liegt in der zytogenetischen Bande 11p15.4, also weit entfernt von der

ursprunglich vermuteten Region (siehe auch Abbildung 4.4 auf Seite 78). Die entsprechen-

den FISH-Bilder sind in Abbildung 4.2 auf der nachsten Seite zu sehen.


Ahnlich wie bei Chromosom 11 erfolgte auch auf Chromosom 20 die weitere Kartierung

des Bruchpunktes durch FISH-Analysen weiterer BACs. Insgesamt wurden 16 weiter pro-

75

(a) Sonde RP11-691A5 (b) Sonde RP11-152H18

(c) Sonde RP11-467K18

Abbildung 4.2: Ergebnis der FISH-Analysen auf Chromosom 11

Auf der Abbildung (b) ist der bruchpunktuberspannende BAC, auf den Abbildungen (a) und (c) die beiden

flankierenden BACs zu sehen. Grun markiert ist die Subtelomer-Sonde gegen 11q, rot markiert sind die

untersuchten BAC-Sonden. Beim BAC RP11-691A5 sind Signale auf dem normalen Chromosom 11 sowie

auf dem derivativen Chromosom 20 zu erkennen, es ist vollstandig transloziert. Beim BAC RP11-467K18

sind rote Signale nur auf den beiden Chromosomen 11 zu erkennen, es ist nicht-transloziert. Fur das

BAC RP11-152H18 sind Signale sowohl auf dem normalen Chromosom 11, als auch auf den derivativen

Chromosomen 11 und 20 zu erkennen. Durch dieses”gesplittete“ Signal konnte das BAC RP11-152H18

eindeutig als bruchpunktuberspannend identifiziert werden.

76

ximal von BAC RP5-827E24 gelegene BACs uberpruft, einer davon konnte aufgrund sei-

ner falschen Lage und der zahlreichen Kreuzhybridisierungenn mit anderen Chromoso-

men nicht ausgewertet werden. Schließlich konnte auch auf diesem Chromosom ein bruch-

punktuberspannendes BAC identifiziert werden Hierbei handelt es sich um das BAC RP5-

1106N18 in der zytogenetische Bande 20q13.2 (siehe auch Abbildung 4.4 auf Seite 78).

Die entsprechenden FISH-Bilder sind in Abbildung 4.3 auf der nachsten Seite zu sehen,

eine schematische Darstellung der verwendeten Sonden wird in Abbildung 4.4 auf Seite 78

gezeigt.

Tabelle 4.1: Lage der Bruchpunkte nach der FISH-Analyse

Chromosom BAC genomische Lokalisation in

bp

Chrom. 11 RP11-152H18 ∼ 8.635.000 - 8.796.000

Chrom. 20 RP5-906P16 ∼ 49.344.000 - 49.431.000

4.1.3 Bruchpunktkartierung mit Mini-FISH-Sonden

Nachdem fur beide Chromosomen das bruchpunktuberspannende BAC gefunden war, wur-

de eine Feinkartierung des Bruchpunktes mit Mini-FISH-Sonden angestrebt. Hierfur wur-

den fur beide BACs Primer fur etwa 10-20 kb lange Sonden entworfen, welche dann uber

eine Long-Template-PCR amplifiziert und durch Nick-Translation rot markiert wurden.


Fur das bruchpunktuberspannende BAC RP11-152H18 wurden insgesamt 9 Mini-FISH-

Sonden mit einer Lange zwischen 12-21 kb hergestellt, welche fast das ganze BAC, ins-

besondere aber den mittleren bis distalen Bereich abdeckten. Diese Eingrenzung wurde

deswegen vorgenommen, da in der FISH-Analyse das starkere Signal auf dem derivativen

Chromosom 20 zu sehen war und daher davon ausgegangen wurde, dass der großere Teil

des BACs transloziert war. Leider war fur zwei der gewahlten Primerpaare keine Ampli-

fikation mit Hilfe des PCR-Verfahrens moglich. Bei zwei weiteren Fragmenten war auch

eine wiederholte Nick-Translation erfolglos, so dass sich die amplifizierten Fragmente nicht

direkt markieren ließen. Fur die anderen funf Fragmente war sowohl die Amplifikation mit

77

(a) Sonde RP5-906P16 (b) Sonde RP5-1106N18

(c) Sonde RP5-1193N1

Abbildung 4.3: Ergebnis der FISH-Analysen auf Chromosom 20

Auf der Abbildung (b) ist der bruchpunktuberspannende BAC, auf den Abbildungen (a) und (c) die beiden

flankierenden BACs zu sehen. Die Subtelomer-Sonde gegen 20p ist grun, die BAC-Sonden sind rot markiert.

Beim BAC RP5-906P16 sind Signale auf dem normalen Chromosom 20 sowie auf dem derivativen Chromo-

som 11 zu erkennen, es ist vollstandig transloziert. Beim BAC RP5-1193N1 sind rote Signale nur auf den

beiden Chromosomen 20 zu erkennen, es ist nicht-transloziert. Beim BAC RP5-1106N18 sind Signale so-

wohl auf dem normalen Chromosom 20, als auch auf den derivativen Chromosomen 20 und 11 zu erkennen.

Durch dieses”gesplittete“ Signal konnte das BAC RP5-1106N18 eindeutig als bruchpunktuberspannend

identifiziert werden.

78

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Abbildung 4.4: Ergebnisse nach der FISH-Analyse mit BAC-Sonden

In blau dargestellte BACs waren transloziert, in schwarz dargestellte nicht-transloziert. Die beiden rot-

BACs lieferten”gesplittete“ Signale auf beiden derivativen Chromosomen. Grun dargestellt ist der BAC

auf Chromosom 20, der wegen der großen Uberlappungsregion mit dem gesplitteten BAC fur die weiteren

Mini-FISH-Analysen verwendet wurde.

der Long-Template-PCR, als auch die Nick-Translation erfolgreich und sie konnten in der

FISH-Analyse eingesetzt werden. Leider war das BAC durch diese funf Fragmente nicht

vollstandig abgedeckt und aufgrund zahlreicher Repeats war es nicht moglich, weitere

Primerpaare fur neue Mini-FISH-Sonden zu platzieren.

Die FISH-Analyse mit den funf funktionierenden Mini-FISH-Sonden ergab folgendes Er-

gebnis: Die beiden am weitesten telomerwarts gelegenen Sonden RP11-152H18-F1 und

RP11-152H18-F2 zeigten eindeutig translozierte Signale auf dem derivativen Chromosom

20. Die weiter proximal gelegenen Sonden RP11-152H18-F7, RP11-152H18-F4 und RP11-

152H18-F5 wurden als nicht-transloziert ausgewertet. Damit musste der Bruchpunkt in

dem etwa 50 kb großen Bereich zwischen Sonde RP11-152H18-F7 und RP11-152H18-F1

liegen. Die entsprechenden FISH-Bilder werden in Abbildung 4.5 auf der nachsten Seite ge-

zeigt und eine detaillierte schematische Darstellung aller verwendeten Mini-FISH-Sonden

findet sich in der Abbildung 4.7 auf Seite 81.

79

(a) Sonde RP11-152H18-F1 (b) Sonde RP11-152H18-F7

Abbildung 4.5: Ergebnis der Mini-FISH-Analysen auf Chromosom 11

Dargestellt sind die beiden den Bruchpunkt auf Chromosom 11 eingrenzenden Mini-FISH-Sonden. Grun

markiert ist jeweils die Subtelomer-Sonde gegen 11q und rot markiert die Mini-FISH-Sonden. Die Sonde

F2 in Abbildung (a) zeigt ein vollstandig transloziertes Signal auf dem derivativen Chromosom 20. Sonde

F7 in Abbildung (b) dagegen war nicht-transloziert und zeigte nur Signale auf beiden Chromosomen 11.


Da sich die beiden BACs RP5-1106N18 und RP5-906P16 zu einem nicht unerhebli-

chen Teil uberlappen und anhand der FISH-Analysen der uberwiegende Teil des bruch-

punktuberspannenden BACs RP5-1106N18 nicht transloziert war, wurden die Primer fur

die Mini-FISH-Sonden anhand der Sequenz des BACs RP5-906P16 entworfen und amplifi-

ziert. Insgesamt wurden 5 Sonden generiert, von denen sich die Fragmente RP5-906P16-F1

und RP5-906P16-F2 mit der Long-Template-PCR nicht amplifizieren ließen. Die anderen

drei Sonden konnten erfolgreich amplifiziert und markiert werden und standen so fur die

Mini-FISH-Analysen zur Verfugung.

In der FISH-Analyse mit den drei Mini-FISH-Sonden zeigten sich die distal gelegenen

Sonden RP5-906P16-F4 und RP5-906P16-F5 als eindeutig transloziert mit roten Signalen

auf dem normalen Chromosom 20 und dem derivativen Chromosom 11. Die weiter zentro-

merwarts gelegene Sonde RP5-906P16-F3 wurde als nicht-transloziert ausgewertet. Damit

konnte die Bruchpunktregion auf den etwa 10 kb großen Bereich, in dem sich die beiden

Sonden RP5-906P16-F5 und RP5-906P16-F3 uberlappen, kartiert werden. Die entspre-

80

(a) Sonde RP5-906P16-F3 (b) Sonde RP5-906P16-F5

Abbildung 4.6: Ergebnis der Mini-FISH-Analysen auf Chromosom 20

Dargestellt sind die beiden den Bruchpunkt auf Chromosom 20 eingrenzenden Mini-FISH-Sonden. Grun

markiert ist jeweils die Subtelomer-Sonde gegen 20p und rot markiert die Mini-FISH-Sonden. Die Sonde

F5 in Abbildung (b) zeigt ein vollstandig transloziertes Signal auf dem derivativen Chromosom 11. Die

Sonde F3 in Abbildung (a) war nicht-transloziert und zeigte nur Signale auf beiden Chromosomen 20.

chenden FISH-Bilder werden in Abbildung 4.6 gezeigt und eine detaillierte schematische

Darstellung aller verwendeten Mini-FISH-Sonden findet sich in der Abbildung 4.7 auf der

nachsten Seite.

Tabelle 4.2: Lage der Bruchpunkte nach der Mini-FISH-Analyse

Chromosom BAC BAC-Lokalisation

in bp

genomische Lokalisation

in bp

Chrom. 11 RP11-152H18 ∼ 43.000 - 129.000 ∼ 8.666.600 - 8.752.700

Chrom. 20 RP5-906P16 ∼ 1 - 15.840 ∼ 49.344.500 - 49.359.500

4.1.4 Bruchpunktkartierung mit Southern Blot

Da sich die weitere Feinkartierung des Bruchpunktes auf Chromosom 11 mit Mini-FISH-

Sonden als sehr schwierig erwies und eine bruchpunktuberspannende PCR aufgrund der

Große des in Frage kommenden Bruchpunktbereiches noch nicht in Frage kam, musste nach

Alternativen zur FISH- und Mini-FISH-Analyse gesucht werden. Als weitere Methode zur

Bruchpunktkartierung wurde die Southern Blot-Analyse ausgewahlt. Als Ausgangspunkt

81

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Abbildung 4.7: Ergebnisse nach der FISH-Analyse mit

Long-Template-PCR-Sonden

Dargestellt sind die fur beide bruchpunktuberspannenden BACs entworfenen Mini-FISH-Sonden RP11-

152H18-F1 bis -F9 sowie RP5-906P16-F3 bis -F5. In rot sind dabei die Sonden dargestellt, welche trans-

lozierte Signale ergaben und in dunkelgrau die Sonden, deren Signale nicht-transloziert erschienen. Die

hellgrauen Fragmente ließen sich entweder nicht durch die PCR amplifizieren oder die Nick-Translation

konnte nicht erfolgreich durchgefuhrt werden, so dass diese Fragmente nicht in der FISH eingesetzt werden

konnten. Auf beiden Chromosomen wurde der durch die Mini-FISH eingegrenzte Bruchpunktbereich rot

eingerahmt.

diente der bereits enger eingegrenzte Bruchpunktbereich auf Chromosom 20. Dafur wurde

fur die ermittelte Bruchpunktregion auf Chromosom 20 eine Restriktionskarte erstellt

und anhand dieser Restriktionsenzyme und Sonden gewahlt (siehe auch Abbildung 3.3

auf Seite 52). Auch fur das Chromosom 11 wurde eine solche Restriktionskarte fur den

Bruchpunktbereich angefertigt, um Enzyme zu wahlen, die auf beiden Chromosomen eine

hohe Aussagekraft des Blottes ermoglicht (siehe auch Abbildung 3.4 auf Seite 52).

Zunachst wurde ein Southern Blot mit den Restriktionsenzymen BstXI und BbsI sowie

den Sonden SF1 und SF2 durchgefuhrt. Der Southern Blot mit Sonde SF1 lieferte da-

bei das aussagekraftigste Ergebnis. Fur beide Restriktionsfragmente, also fur BstXI und

auch fur BbsI konnten signifikante Großenunterschiede zwischen der mitgefuhrten Kontrol-

le und dem Patienten nachgewiesen werden. Kleine Großenunterschiede von 1-2 kb sind

dabei zu vernachlassigen, sie gehen auf eine ungleichmaßige Auftrennung im Gel zuruck.

Fur das Restriktionsenzym BbsI waren bei Patienten zwei Banden sichtbar, eine in der

erwarteten Lange und eine von einem deutlich kurzeren Fragment. Die Bande der erwar-

teten Lange beim Patienten entspricht dabei dem Wildtyp-Allel, die Bande des kurzeren

82

Fragmentes enthalt wahrscheinlich den Bruchpunkt. Dieses Restriktionsfragment enthalt

vermutlich bereits einen Teil des anderen Tanslokationschromosoms bis zur nachsten, auf

diesem vorhandenen, Schnittstelle des Restriktionsenzyms. Fur BstXI waren beim Pati-

enten ebenfalls zwei Banden sichtbar. Allerdings entsprach davon keiner der erwarteten

Lange des Restriktionsfragmentes. Auch bei der Kontrolle waren zwei Banden detektier-

bar, von der eine die erwartete Lange aufwies. Moglicherweise ist die zweite Bande durch

einen SNP entstanden, der eine neue Restriktionsschnittstelle gebildet hat. Sollte es sich

dabei um einen haufig vorkommenden Polymorphismus handeln, ließe sich damit erklaren,

warum auch der Patient diese Bande, nicht jedoch die normal erwartete Bande aufweist.

Wenn es sich bei der Doppelbande der Kontrolle um das Wildtyp-Allel und ein durch

einen SNP verandertes Allel handeln, wurde das kurzeste Fragment beim Patienten den

Bruchpunkt enthalten. Fur eine sichere Aussage ist aber eine Wiederholung des Blots mit

weiteren Kontrollen notig. Die zugehorigen Bilder des Blot-Gels sowie des entwickelten

Rontgenfilms sind in Abbildung 4.8 auf der nachsten Seite zu sehen.

Der Southern Blot mit Sonde SF2 zeigte nur sehr schwache Banden, so dass die Auswer-

tung schwierig war. Fur BbsI konnte das Ergebnis der Sonde SF1 auch mit SF2 bestatigt

werden. Auch hier zeigte sich beim Patienten eine Doppelbande, wobei die dem kurzeren

Fragment entsprechende Bande den Bruchpunkt enthalt. Fur BstXI war leider keine ein-

deutige Auswertung moglich, da sich beim Patienten zwei Banden, jedoch keine in der er-

warteten Große detektieren ließen. Keine dieser Banden stimmte mit der bei der Kontrolle

sichtbaren und der erwarteten Große entsprechenden Bande uberein. Insgesamt ergab sich

fur die Sonde SF2 also ein ahnliches Bild wie bei Sonde SF1. Aufgrund der leider sehr

schwachen Signale sollte der Blot jedoch wiederholt werden um das Ergebnis zu reprodu-

zieren.

Obwohl diese beiden Southern Blots gute Ergebnisse erbrachten und der Bereich auf Chro-

mosom 20 damit auf 5,5 kb eingegrenzt werden konnte, waren sie fur eine Verkleinerung

der Bruchpunktregion auf Chromosom 11 nicht ausreichend. Aus diesem Grund wurde

erneut ein Southern Blot in der verkleinerten Region von Chromosom 20, mit dem Re-

striktionsenzym KpnI und mit den Sonden SF1, SF3 und SF4 durchgefuhrt. Zusatzlich

wurden hier zwei Kontrollen mitgefuhrt. Leider ergab der Southern Blot mit der Sonde

SF3 zu viele unspezifische Signale, so dass er nicht ausgewertet werden konnte. Mit den

83

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(b) Southern Blot

Abbildung 4.8: Restriktionsverdau und Southern Blot mit den

Restriktionsenzymen BbsI und BstXI sowie der Sonde SF1

In Abbildung (a) ist das 1%ige Blot-Gel nach dem Restriktionsverdau zu sehen. Der Verdau war erfolg-

reich und man erkennt den gewunschten”restriction smear“, welcher Fragmente jeder Große enthalt. In

Abbildung (b) ist der entwickelte Rontgenfilm des Southern-Blots mit der Sonde SF1 zu sehen. Fur BbsI

war bei der Kontrolle und beim Patienten die erwartete Bande von 9 kb Lange sichtbar. Zusatzlich zeigte

sich beim Patienten eine unerwartete Bande mit einer Lange von ca. 5,5 kb. Fur BstXI konnte bei der

Kontrolle die erwartete Bande mit einer Lange von 6,3 kb und eine zusatzliche Bande von 5,7 kb detektiert

werden. Beim Patienten konnte die erwartete 6,3 kb große Bande mit nicht nachgewiesen werden, jedoch

die schon in der Kontrolle detektierbare zusatzliche Bande der Große 5,7 kb. Zudem war beim Patienten

eine weitere unerwartete Bande mit einer Lange von ca. 4,5 kb nachweisbar.

84

Sonden SF1 und SF4 ließen sich schwache Banden detektieren. Diese entsprachen jedoch

auch bei der Kontrolle nicht den erwarteten Fragmentlangen. Wahrscheinlich war bereits

der Restriktionsverdau der DNA mit KpnI fur das Scheitern des Versuchs verantwortlich,

da teilweise uber 48 h verdaut werden musste, um den gewunschten ”restriction smear“ zu

erhalten. Durch diesen unvollstandigen Verdau waren die gewunschten DNA-Fragmente

moglicherweise gar nicht gewonnen worden.

Tabelle 4.3: genomische Position der Bruchpunkte nach dem Southern Blot

Chromosom Bruchpkt. nach der

Mini-FISH in bp

Bruchpkt. nach Southern

Blot in bp

Chrom. 11 8.666.600 - 8.752.700 ∼ 8.666.600 - 8.752.700

Chrom. 20 49.344.500 - 49.359.500 ∼ 49.347.000 - 49.353.500

4.1.5 Bruchpunktuberspannende PCR

Obwohl sich die Bruchpunktregion insbesondere auf Chromosom 11 durch die Mini-

FISH-Analysen und den Southern Blot nicht wesentlich eingrenzen ließ, wurde eine

bruchpunktuberspannende PCR zunachst ausgehend vom derivativen Chromosom 20

durchgefuhrt. Dabei wurde mit Hilfe einer Long-Template-PCR versucht, ein bruch-

punktuberspannendes Fragment zu amplifizieren. Eine Rekonstruktion der Chromosomen-

situation war sehr hilfreich, da die Orientierung der Sequenzen eine entscheidende Rolle fur

die Auswahl der Primer spielt (siehe auch Abbildungen 4.9 auf der nachsten Seite). Damit

konnte verdeutlicht werden, dass das terminale Ende des kurzen Arms von Chromosom 11

transloziert ist und das p-Ende terminal am derivativen Chromosom 20 zu liegen kommt.

Bei Chromosom 20 ist das terminale Ende des langen Arms transloziert und das q-Ende

kommt terminal am derivativen Chromosom 11 zu liegen.

Auch wenn die maximalen Fragmente teilweise sehr groß waren (bis zu 45 kb), wurden

fur die verbliebenen Bruchpunktregionen auf beiden Chromosomen Primer fur die Long-

Template-PCR entworfen. Auf Chromosom 20 wurden so insgesamt 26 Primer und auf

Chromosom 11 22 Primer ausgewahlt (siehe Abbildung 4.10 auf Seite 86). Durch Austesten

der verschiedenen Primerkombinationen wurde versucht, ein bruchpunktuberspannendes

Fragment zu amplifizieren. Außerdem wurden verschiedene Annealing-Temperaturen aus-

85

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Abbildung 4.9: Chromosomensituation beim Patienten

getestet und neben dem alteren ”Expand Long Template PCR-System“ auch die neueren

Long Template Systeme ”Expand Long Template dNTPack“ und ”Expand 20 kbP lus PCR

System“ von Roche verwendet.

Erste spezifische Fragmente ließen sich bei den Primerkombinationen BP20 F 4/BP11 F 9

und BP20 F 4/BP11 F 10 amplifizieren (siehe Abbildung 4.11 auf Seite 87). Da sich fur

den Primer BP20 F 3 in keiner Kombination ein PCR-Produkt amplifizieren ließ, wohl

aber fur den Primer BP20 F 4, wurde der Bruchpunkt in dem Bereich zwischen diesen

Primern vermutet und in dieser Region neue Primer designed. Auch fur Chromosom 11

wurden neue Primer generiert, da hier fur den Primer BP11 F 10, nicht aber fur den

Primer BP11 F 11 Produkte amplifizierbar waren. Waren spezifische Banden im Gel de-

tektierbar, so wurden die PCR-Produkte maschinell aufgereinigt und anschließend in einer

Sequenzierreaktion eingesetzt. Dabei wurden immer mehrere Ansatze pro PCR-Produkt

hergestellt und auch Primer eingesetzt, die auf dem Amplikon liegen mussten. Die gewon-

nenen Sequenzdaten wurden gegen die UCSC-Datenbank abgeglichen, um die genaue Lage

des Sequenzstucks zu bestimmen. Ziel war es, eine Sequenz zu generieren, die auf beiden

Chromosomen, also auf Chromosom 11 und Chromosom 20 zu liegen kommt. Dies gelang

schließlich, nachdem der in Frage kommende Bereich mit neuen Primern immer weiter ein-

gegrenzt werden konnte, mit den Fragmenten der Kombinationen BP20 F 21/BP11 F 19,

BP20 F 21/BP11 F 20, BP20 F 22/BP11 F 19 und BP20 F 22/BP11 F 20 (siehe Abbil-

86

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(a) Primer auf Chromosom 11

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(b) Primer auf Chromosom 20

Abbildung 4.10: Primer fur die bruchpunktuberspannende PCR

Dargestellt sind die fur die beiden Chromosomen gewahlten Primer fur die bruchpunktuberspannende

PCR.

87

dung 4.11). Dabei wurden die Fragmente mit den Primern BP20 F 21 und BP20 F 22

bzw. mit den Primern BP11 F 23 und BP11 F 24 sequenziert (siehe Abbildung 4.12 auf

der nachsten Seite).

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(a) PCRs ausgehend vom derivativen Chromosom 20

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(b) PCR ausgehend vom derivativen Chro-

mosom 11

Abbildung 4.11: Agarose-Gelbilder der bruchpunktuberspannenden Long

Template PCRs

Zu sehen sind die Gelbilder fur die bruchpunktuberspannende PCR ausgehend von den derivativen Chro-

mosomen 11 und 20. Die Primer ausgehend vom derivativen Chromosom 20 wurden willkurlich als Forward-

Primer (F) bezeichnet, die Primer ausgehend vom derivativen Chromosom 11 als Reward-Primer (R).

Nachdem ausgehend vom derivativen Chromosom 20 der Bruchpunkt auf die Base ge-

nau bestimmt werden konnte, wurde dies auch vom derivativen Chromosom 11 aus ver-

88

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(a) Sequenzierung mit Primern von Chromosom 11

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(b) Sequenzierung mit Primern von Chromosom 20

Abbildung 4.12: Sequenzierung der bruchpunktuberspannenden Fragmente

Zu sehen sind die Sequenzen der bruchpunktuberspannenden Fragmente ausgehend vom derivativen Chro-

mosom 20. (a) zeigt die Sequenzierung mit Primern von Chromosom 11. Bei (b) wurden Primer von

Chromosom 20 fur die Sequenzierung verwendet.

sucht. Dafur wurden um den auf dem anderen derivativen Chromosom bekannten Bruch-

punkt Primer mit entgegengesetzter Orientierung zu den bisher verwendeten designed.

Dann wurde analog zum Vorgehen auf dem anderen derivativen Chromosom versucht

ein bruchpunktuberspannendes PCR-Produkt zu amplifizieren und dieses zu sequenzie-

ren. Auch hier gelang schließlich die Generierung von Fragmenten, die zum Teil auf

Chromosom 11 und zum Teil auf Chromosom 20 lagen. Die Fragmente entstanden bei

Verwendung der Primerkombinationen BP20 R 18/BP11 R 16, BP20 R 18/BP11 R 18,

BP20 R 18/BP11 R 19, BP20 R 19/BP11 R 16 (siehe auch Abbildung 4.11 auf der vor-

herigen Seite). Fur die Sequenzierung wurden die Primer BP11 R 16 und BP20 R 18 ver-

wendet.

89

Tabelle 4.4: genomische Position der Bruchpunkte nach der

bruchpunktuberspannenden PCR

Chromosom Bruchpkt. nach dem

Southern Blot in bp

Bruchpkt. nach der

bruchpunkt-

uberspannenden PCR

in bp

Chrom. 11 ausgehend vom

derivativen Chrom. 11

8.666.600 - 8.752.700 8.729.575



8.666.600 - 8.752.700 8.729.572



49.347.000 - 49.353.500 49.349.871



49.347.000 - 49.353.500 49.349.869

4.2 Kandidatengene in den Bruchpunktregionen

Auf beiden Chromosomen liegen die Bruchpunkte in ausgedehnten Repeatregionen. Aus-

gehend vom derivativen Chromosom 11 liegt der Bruchpunkt von Chromosom 11 nach der

Position 8.729.575 bp und der von Chromosom 20 nach der Position 49.349.871 bp. Die

vom derivativen Chromosom 20 aus bestimmten Bruchpunkte unterscheiden sich um eini-

ge Basen und liegen bei Chromosom 11 nach der Position 8.729.572 bp und bei Chromosom

20 nach der Position 49.349.869 Das wurde bedeuten, dass sowohl von Chromosom 11,

als auch von Chromosom 20 jeweils 3 Basenpaare deletiert sind.

4.2.1 Kandidatengene auf Chromosom 11

Auf Chromosom 11 liegt der Bruchpunkt in der 5’-UTR des ST5 -Gens, 725 Basen vor dem

ersten kodierenden Exon. Somit wird die gesamte kodierende Sequenz des ST5 -Gens von

der 5’-UTR und von der Promotorregion getrennt (siehe Abbildung 4.13 auf der nachsten

Seite).

90

Abbildung 4.13: Abgleich der Lage des Bruchpunktes (rote Linie) auf

Chromosom 11 mit der Referenzdatenbank UCSC


Der Bruchpunkt auf Chromosom 20 liegt in einer Region, in der bisher keine bekannten

Gene oder Gene-Predictions zu finden sind. Der Bruchpunkt befindet sich 91.304 bp nach

dem NFATC2 -Gen und 276.846 bp vor dem KCNG1 -Gen (siehe auch Abbildung 4.14 auf

der nachsten Seite). Da im Bruchpunktbereich auch regulatorische Elemente wie z.B. En-

hancer, Silencer oder Promotoren liegen konnten, die die Expression umliegender Gene

positiv oder negativ regulieren konnen, wurde auch der Bereich 2Mb vor und nach der

kartierten Bruchpunktregion nach Genen durchsucht. Dabei waren insbesondere Gene in-

teressant, die im Gehirn exprimiert werden bzw. die bereits mit mentaler Retardierung,

Epilepsie, Gaumenspalten, Innenohrschwerhorigkeit oder Nierenfehlbildungen in Verbin-

dung gebracht wurden.

Bei dieser Analyse wurden drei potentiell interessante Gene gefunden (siehe auch Abbil-

dung 4.14 auf der nachsten Seite). Das Gen KCNG1 (potassium voltage-gated channel,

subfamily G, member 1) liegt 276 kb in Richtung Zentromer von der Bruchpunktregion ent-

91

Abbildung 4.14: Abgleich der Lage des Bruchpunktes (rote Linie) auf

Chromosom 20 mit der Referenzdatenbank UCSC

fernt. Das Gen DPM1 (dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide 1, catalytic

subunit) liegt ca. 339 kb zentromerwarts der Bruchpunktregion. Das dritte Gen, SALL4,

liegt etwa 481 kb terminal von der kartierten Bruchpunktregion (siehe Abbildung 4.14).

Nachdem auf Chromosom 11 der Bruchpunkt inn der 5’-UTR des ST5 -Gens liegt, auf

Chromosom 20 aber, wenn uberhaupt, nur ein regulatorisches Element eines Gens durch

den Bruchpunkt beeinflusst wurde, habe ich mich in meiner Arbeit auf weiterfuhrende

Analysen des ST5 -Gens konzentriert.

92

4.3 Expressionsanalysen des Kandidatengens

4.3.1 Expressionsanalyse beim Patienten mit RT-PCR

4.3.1.1 Expressionsanalyse der verschiedenen Isoformen des Kandidatengens

Da die Angaben in der Literatur uber die Expression von ST5 sehr widerspruchlich sind,

sollte in einem ersten Schritt uberpruft werden, ob ST5 im Blut exprimiert wird, da uns

als weiteres Untersuchungsmaterial nur eine lymphoblastoide Zelllinie des Patienten zur

Verfugung stand. Dazu wurde aus der Zelllinie des Patienten sowie aus Zelllinien von

funf Kontrollen RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Dann wurde mit dieser cDNA

als Template eine RT-PCR mit vier verschiedenen Primerpaaren im ST5 -Gen sowie einem

Kontroll-Primerpaar (SIPrt2-7) durchgefuhrt. Das Kontroll-Gen ZFHX1B (zinc finger ho-

meo box 1B-Gen) wird ubiquitar und auch in lymphoblastoiden Zellinien exprimiert. Drei

Primerpaare fur das ST5 -Gen waren so gewahlt, dass sie sowohl die Isoform 1, als auch die

Isoform 2 detektieren (ST5-rtPCRiso2-e2+4, -e4+7 und -e17+19). Ein Primerpaar (ST5-

rtPCRiso2-e5+6) wurde so gewahlt, dass es spezifisch fur die Isoform 1 ist. Fur alle sechs

cDNAs waren Banden in der erwarteten Lange bei Verwendung der drei Primerpaare, wel-

che die Isoformen nicht unterscheiden zu sehen. Fur das Isoform 1-spezifische Primerpaar

ließ sich kein Fragment amplifizieren. Daraus lasst sich schließen, dass nur Isoform 2 in

Lymphozyten des peripheren Blutes exprimiert wird. Dies deckt sich mit den Angaben

in der Literatur, nach denen ST5 in vielen Geweben exprimiert wird, Isoform 1 jedoch

nicht in den Blutlymphozyten (UniProtKB/Swiss-Prot entry P78524). Das entsprechende

Gel-Bild wird in Abbildung 4.15 auf der nachsten Seite gezeigt.

4.3.2 Expressionsanalyse mit Real-Time-PCR

Da fur ST5 eine, wenn auch schwache, Expression im Blut nachgewiesen werden konn-

te, wurde mittels Real-Time-PCR uberpruft, ob das Expressionslevel beim Patienten ge-

genuber den mitgefuhrten Kontrollen Unterschiede aufwies. Die Analyse wurde mit einer

durch die Firma Applied Biosystems getesteten und mit entsprechenden Primern geliefer-

ten, ST5 -spezifischen Taqmen-Sonde an der cDNA des Patienten sowie an funf weiteren

93

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Abbildung 4.15: RT-PCR mit verschiedenen Primerpaaren im ST5 -Gen

Der Erfolg der RT-PCR wurde im 1,5%igen Agarose-Gel uberpruft. Fur die alle Isoformen erfassenden Pri-

merpaare ST5-rtPCRiso2-e17+19, -e4+7 und -e2+4 sind fur alle Kontroll-cDNAs sowie fur die Patienten-

cDNA Banden in der erwarteten Große detektierbar. Dabei sind die Banden von den Kontroll-cDNAs

143/06 und 144/06, aber auch die der Patienten-cDNA wesentlich starker als die der anderen cDNAs. Fur

das fur die Isoform 1 des ST5 -Gens spezifisch gewahlte Primerpaar ST5-rtPCRiso1-e5+6 waren weder

fur die Kontroll-cDNAs noch fur den Patienten Banden detektierbar. Als Kontrolle wurde außerdem das

Primerpaar SIPrt2-7 mitgefuhrt, welches fur alle Kontroll-cDNAs, sowie fur die Patienten-cDNA Banden

in der erwarteten Große zeigte.

Kontroll-cDNAs durchgefuhrt. Die Taqmen-Sonde liegt dabei in den Exons des ST5 -Gens

(Exons 7 und 8), die in allen drei Isoformen transkribiert werden. Außerdem wurde bei

diesen sechs cDNAs auch die Expression von vier endogenen Kontrollen getestet, um die

fur ST5 gewonnenen Daten zu normalisieren und so valide Ergebnisse zu gewinnen. Alle

cDNAs wurden aus RNA aus lymphoblastoiden Zelllinien generiert.

Die Ergebnisse zeigen eine große Schwankung des Expressionslevels bei den Kontrollen, so

dass beim Translokationspatienten keine signifikante Abweichung gegenuber den gesunden

Kontrollen feststellbar war (siehe auch Abbildung 4.17 auf der nachsten Seite). Betrachtet

man die Amplifikationskurven von ST5 und den verwendeten endogenen Kontrollen, fallt

auf, dass fur ST5 nur eine sehr niedrige Basisexpression vorhanden ist, da erst ab dem 25.

Zyklus Meßwerte generiert werden konnten (siehe Abbildung 4.16 auf der nachsten Seite).

In solchen Bereichen ist die Real-Time-PCR aber sehr ungenau und nicht valide, so dass

die Ergebnisse nicht verwendet werden konnten.

94

Abbildung 4.16: Amplifikationskurve des ST5 -Gens nach der Real-Time-PCR

an lymphoblastoiden Zelllinien

Abbildung 4.17: Ergebnis der Expressionsanalyse des ST5 -Gens mittels

Real-Time-PCR an lymphoblastoiden Zelllinien

In der Abbildung dargestellt sind jeweils die RQ-Werte bezogen auf den Mittelwert der endogenen Kon-

trollen. In hellblau sind dabei die funf gesunden Kontrollen, in dunkelblau ein Mittelwert aus diesen funf

Kontrollen und in gelb die Ergebnisse des Translokationspatienten dargestellt.

95

Abbildung 4.18: Ergebnis der Expressionsanalyse des ST5 -Gens mittels

Real-Time-PCR an fetalen und adulten Geweben

In der Abbildung dargestellt sind jeweils die RQ-Werte der einzelnen fetalen und adulten humanen Gewebe

dargestellt. Als Referenzgewebe wurde dabei fetalem Gehirn der RQ-Wert 1 zugewiesen und alle anderen

Gewebe dazu ins Verhaltnis gesetzt.

Zudem wurde eine Real-Time-PCR an Multiple Tissue cDNA-Kits mit verschiedenen adul-

ten und fetalen Geweben der Firma Clontech durchgefuhrt. Im fetalen Gewebe ist die Ex-

pression in allen untersuchten Geweben nahezu gleich, nur in fetaler Niere war die Expres-

sion etwas hoher (siehe auch Abbildung 4.18). Adultes Gehirn, Niere und Skelettmuskel

erreicht sehr hohe Expressionswerte im Vergleich zu den anderen adulten Geweben und

zu den fetalen Geweben. In adultem Thymus, Milz, Lunge und Leber liegt die Expression

niedriger als in den entsprechenden fetalen Geweben.

4.3.3 Expressionsanalyse durch Maus-in-situ-Hybridisierung

Da der Patient eine schwere mentale Retardierung sowie epileptische Anfalle aufweist, uber

ST5 aber bisher nur bekannt ist, dass es im Gehirn exprimiert wird, nicht aber in wel-

chen Strukturen oder in welchen Entwicklungsabschnitten, waren weiterfuhrende Analy-

sen notig. Dazu wurden Maus-in-situ-Hybridisierungen an Mausembryonen verschiedener

96

Embryonaltage sowie am Gehirn von adulten Tieren durchgefuhrt.

Zunachst wurde die in-situ-Hybridisierung mit den relativ einfach zu generierenden

Oligonukleotid-Sonden durchgefuhrt. Dazu wurden drei verschiedene antisense-Sonden

sowie eine sense-Sonde hergestellt und deren Hybridisierung an Schnitten von adultem

Gehirn und an Schnitten ganzer Mausembryonen der Embryonaltage E13.5 und E15 un-

tersucht. Zudem wurden immer eine gewisse Anzahl an Leerkontroll-Schnitten, aber auch

Schnitte, auf die eine bereits getestete und funktionierende Kontrolle hybridisiert wurde,

mitgefuhrt. Die Auswertung der Objekttrager gestaltete sich als schwierig, weil zum einen

relativ viele Background-Signale auf den Schnitten zu sehen waren, durch die es nur schwer

moglich war, ”echte“ Signale vom Hintergrund zu unterscheiden. Diese Hintergrundfarbung

war auch auf den Leerkontrollen zu finden und trotz Anwendung verschiedener Methoden

nicht zu reduzieren. Desweiteren lieferte die sense-Sonde zum Teil intensivere Signale als

die drei antisense-Sonden. Da die mitgefuhrten Kontrollen Signale mit dem erwarteten

Muster aufwiesen, wurde vermutet, dass die starke Hintergrundfarbung und die intensi-

veren sense-Sonden-Signale auf die Wahl der Sondengenerierung zuruck zu fuhren waren.

Aus diesem Grund wurde schließlich die aufwendigere, aber dafur sensitivere Hybridisie-

rung mit cDNA-Sonden gewahlt. Dafur wurden drei antisense-Sonden mit dazu passender

sense-Sonde generiert und in-situ-Hybridisierungen an Mausembryonen der Embryonalta-

ge E8.5, E13.5 und E15, sowie an Gehirn- und Nierenschnitten von 6, 10 und 15 Tage alten,

7 Wochen alten und adulten Mausen. Auch hier wurden immer eine bestimmte Anzahl an

Leerkontrollen und Kontrollen mit einer bereits validierten Sonde fur Kollagen II A 1 (Co-

lIIA1) mitgefuhrt. Zur besseren Ubersicht wurden zudem Hamatoxylin-Eosin Farbungen

durchgefuhrt. Durch die mitgefuhrte Kollagen-Sonde, die reproduzierbar gute Signale an

den erwarteten Stellen zeigte, ließ sich sicherstellen, dass die Methode funktionierte. Zu-

dem waren bei Verwendung von cDNA-Sonden kaum mehr storende Hintergrundsignale zu

erkennen und die mitgefuhrten Leerkontrollen wiesen keine Signale auf. Aus diesen Beob-

achtungen wurde geschlossen, dass es sich bei den Signalen der ST5 -Sonden um spezifische

Signale und nicht um Artefakte handelt.

Abbildung 4.19 auf Seite 98 zeigt die Ergebnisse der Tissue-in-situ-Hybridisierung

(ISH). Die Hybridisierung mit der St5 -Riboprobe (A) im Vergleich zu einer Negativkon-

trolle (B) zeigt keine signifikante Expression an E13.5 Mausembryonen. An Embryonaltag

97

15.5 zeigt die ISH mit der St5 -Riboprobe (C) im Vergleich zur Negativkontrolle (D) das

St5 in der Ventrikular- und der Marginalzone des Frontalen Cortex (C1), aber auch in der

Niere (C2) und im Gaumen (Pfeil) (C3) exprimiert wird. St5 -Expression ist außerdem in

sich entwickelnden tubularen Strukturen der Niere von neugeborenen Mausen (E) im Ver-

gleich zur Negativkontrolle (F) und in der Niere von 15 Tage alten Mausen (G) im Vergleich

zur Negativkontrolle (H) nachweisbar. (E1) und (G1) zeigen eine hohere Vergoßerung der

Bilder (E) und (G). Die Bilder (I) und (J) zeigen die ISH mit der St5 -Riboprobe (I) im

Vergleich zu einer Neuronen-spezifischen Nissl-Farbung (J) einer P6-Maus, wodurch die

Expressions-Signale von St5 den Neuronen zugeordnet werden konnen. (I1) und (J1) zei-

gen das Kleinhirn, (I2) und (J2) die hippocampale Region unter starkerer Vergroßerung.

Außerdem wurde das Gehirn von 7 Wochen alten Mausen mit der St5 -Riboprobe (K)

und der Negativkontrolle (L) hybridisiert und eine Nissl-Farbung (M) durchgefuhrt. Auch

Gehirnschnitte von adulten Mausen wurden mit der St5 -Riboprobe (N) und der Nega-

tivkontrolle (O) hybridisiert, Signals waren hauptsachlich im Cortex (N1) und im Gyrus

Dendatus (N2) lokalisiert. (N11) und (N21) zeigen eine starkere Vergroßerung der Bilder

(N1) und (N2).

4.4 Sequenzierung des Kandidatengens

Insgesamt wurden fur das ST5 -Gen 22 Primerpaare fur die 19 kodierenden Exons entwor-

fen. Zunachst wurden damit im Plattenformat 96 Patienten mit milder mentaler Retardie-

rung (MR1-Platte) und 96 Patienten mit schwerer mentaler Retardierung (MR2-Platte)

untersucht. Außerdem wurden weitere acht Patienten mit einer Gaumenspalte und 30 Pa-

tienten mit Symptomkombinationen aus mentaler Retardierung, Innenohrschwerhorigkeit,

Gaumenspalte und Epilepsie untersucht. Auch der Translokationspatient selbst wurde im

ST5 -Gen analysiert, zeigte jedoch außer bereits beschriebenen SNPs (single nucleotide

polymorphisms) keine weiteren Sequenzabweichungen (siehe Tabelle 4.5 auf Seite 99).

Wurden bei den Patienten Sequenzauffalligkeiten gefunden, die auch in den Referenzda-

tenbanken NCBI und UCSC nicht beschrieben waren, wurden von diesen Patienten die

Eltern bzw. weitere Geschwister auf diese Sequenzabweichung hin untersucht. Neben zahl-

reichen, zum Teil bereits als SNPs charakterisierten intronischen Sequenzauffalligkeiten

fanden sich auch in mehreren Exons des ST5 -Gens Abweichungen von der Referenzsequenz

98

Abbildung 4.19: Expressionsanalyse von St5 mittels

Tissue-in-situ-Hybridisierung an murinem Gewebe

Zu sehen ist die ISH an E13.5 Mausembryonen mit der St5 -Riboprobe (A) und einer Negativkontrolle

(B). Bild (D) zeigt die ISH an E15.5 Mausembryonen mit der Negativkontrolle und Bild (C) mit der St5 -

Riboprobe. Hohere Vergroßerungen von (C) zeigen den Frontalen Cortex (C1), die Niere (C2) und den

Gaumen (C3). Nierengewebe von neugeborenen Mausen hybridisiert mit der St5 -Riboprobe (E) und der

Negativkontrolle (F), und Nierengewebe von 15 Tage alten Tieren mit St5 (G) und Negativkontrolle (H).

(E1) und (G1) zeigen hohere Vergroßerungen von (E) und (G). Bilder (I) und (J) zeigen die ISH mit der

St5 -Riboprobe (I) im Vergleich zur einer Nissl-Farbung (J) an Gehirn einer P6-Maus. (I1) und (J1) zeigen

das Kleinhirn, (I2) und (J2) die hippocampale Region unter starkerer Vergroßerung. ISH an Hirngewebe

einer 7 Woche alten Maus mit der St5 -Riboprobe (K) und der Negativkontrolle (L) im Vergleich zur Nissl-

Farbung (M). Schnitte an Gehirnen von adulten Mausen hybridisiert mit der St5 -Riboprobe (N) und der

Negativkontrolle (O). (N1) und (N11) zeigen hohere Vergoßerungen der Cortexregion, (N2) und (N21)

zeigen hohere Vergroßerungen der hippocampalen Region.

99

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Abbildung 4.20: Bei den Patienten A11 und B12 gefundene

Sequenzabweichungen in Exon 2

(siehe Abbildungen 4.20, 4.21 auf der nachsten Seite, 4.22 auf der nachsten Seite, 4.23 auf

der nachsten Seite, 4.24 auf Seite 101 und 4.25 auf Seite 101). Eine Darstellung der Er-

gebnisse findet sich in den beiden nachfolgenden Tabellen 4.6 auf Seite 103 sowie 4.7 auf

Seite 104. Die ausfuhrliche Auflistung aller gefunden intronischen Veranderungen sowie

der bekannten SNPs im Exon 3 des ST5 -Gens finden sich in der Tabelle D.1 auf Seite 167

im Anhang. Alle weiter untersuchten Veranderungen konnten auch bei einem gesunden El-

ternteil nachgewiesen werden. Bei dem Patienten CLP4/3, einem der Patienten aus dem

Gaumenspaltenkollektiv, konnten zwei Abweichungen von der Referenzsequenz in zwei

verschiedenen Exons festgestellt werden. Bei Untersuchung der Eltern ergab sich bei dem

Patienten eine Compound-Heterozygotie, das bedeutet, eine der Veranderungen konnte

beim Vater, die andere bei der Mutter nachgewiesen werden (siehe auch Abbildung 4.26

auf Seite 102).

Tabelle 4.5: Sequenzabweichungen beim Indexpatient

Position Veranderung AS-Austausch

bzw. Position

rs-Nr.

g.80994 G�C p.Lys316Asn rs3794153

g.81243 C�G p.Asp399Glu rs3812762

g.115880 G�A IVS19+7 rs2270956

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Abbildung 4.21: Beim Patienten 13183 gefundene Sequenzabweichungen in

Exon 5

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Abbildung 4.22: Beim Patienten 18713 gefundene Sequenzabweichungen in

Exon 6

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Abbildung 4.23: Beim Patienten G03 gefundene Sequenzabweichungen in Exon

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Abbildung 4.24: Bei den Patienten A12 und E05 gefundene


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Abbildung 4.25: Bei den Patienten A04 und 197585 gefundene


102

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(b) Exon 18

Abbildung 4.26: Beim Patienten CLP4/3 und dessen Eltern gefundene

Sequenzabweichungen in Exon 12 und 18

103

Tabelle 4.6: Sequenzabweichungen bei den untersuchten Patienten

Exon Patient Veranderung Aminosaure-

austausch

Nachweis bei Fa-

milienmitgliedern

e2 A11-

MR1

g.60667T�C p.Ile11Thr Vater

e2 B12-

MR1

g.60671C�T p.Thr12Thr Vater

e3 D03-

MR2

g.80772G�A p.Glu242Glu Mutter

e5 D07-

MR1

g.93504G�A p.Arg513Gln Mutter

e5 13183 g.93570G�C p.Arg535Thr Mutter

e6 18713 g.956444C�G p.Leu586Val Vater

e7 G03-

MR1

g.96686A�G p.Lys634Lys Vater

e7 H07-

MR2

g.96624A�T IVS7-6 Mutter

e9 A12-

MR1

g.98623C�T p.His670His Mutter

e9 E05-

MR1

g.98623C�T p.His670His Vater + Geschwister

e9 C09-

MR2

g.98623C�T p.His670His Mutter

e12 CLP4/3 g.103534T�G p.Leu802Arg Vater

e14 A04-

MR1

g.108692T�C p.Val883Ala Mutter

e14 19758 g.108692T�C p.Val883Ala Mutter

e14 25194 g.108692T�C p.Val883Ala Vater

e18 CLP4/3 g.114729G�A p.Val1038Ile Mutter

104

Tabelle 4.7: Zusammenfassung der detektierten Sequenzabweichungen

Veranderung insge-

samt

Abgleich mit

Datenbanken

Anzahl weitere Infos

AS-Austausch 5 bekannt

unbekannt

3

2 davon 1 bei insgesamt

16 Patienten

und 1 bei gesunder

Kontrollperson

stille SNPs 23 bekannt

unbekannt

10

13

105

Kapitel 5

Diskussion

5.1 Phanotyp des untersuchten Patienten

Bei dem in dieser Arbeit untersuchten Patienten mit einer schweren mentalen Retar-

dierung, epileptischen Anfallen, einer beidseitigen Innenohrschwerhorigkeit, multizystisch

dysplastischen Nieren sowie einer submukosen Gaumenspalte konnte auf zytogenetischer

Ebene eine de novo entstandene Translokation t(11;20) festgestellt werden. Da bei den

Eltern diese Chromosomenaberration nicht nachgewiesen werden konnte und sie auch kei-

nen, mit dem Patienten vergleichbaren Phanotypen aufwiesen, ging man davon aus, dass

der Phanotyp auf die Translokation zuruckzufuhren ist.

5.2 Bruchpunktfeinkartierung

Auf Chromosom 20 konnte der Bruchpunkt mittels FISH- und Mini-FISH-Analysen auf

den relativ kleinen Bereich von etwa 10 kb eingegrenzt werden. Fur das Chromosom 11 war

eine Eingrenzung mit diesen Techniken nur auf einen etwa 50 kb großen Bereich moglich.

Eine feinere Kartierung des Bruchpunktes war mit Hilfe der Mini-FISH nicht moglich.

Insbesondere gestaltete sich bereits die Auswahl der Sonden sehr schwierig, da der Bruch-

punktbereich auf Chromosom 11 fast durchgangige Repeatsequenzen aufweist. Es ist be-

106

reits seit langerer Zeit bekannt, dass Bruchpunkte bevorzugt in Chromosomenregionen

mit hochrepetitiven Bereichen liegen [63, 73]. Von insgesamt neun Sonden, ließen sich nur

funf amplifizieren. Fur diese funf Sonden ließen sich jedoch bei der Mini-FISH-Analyse

bei einer Testperson gut sichtbare, spezifische Signale detektieren. Leider lieferte die Mini-

FISH-Analyse beim Patienten deutlich schwachere Signale und war schwer auszuwerten.

Problematisch war dabei aber vor allem die Qualitat der Zellsuspension. Diese wurde aus

einer lymphoblastoiden Zelllinie des Patienten gewonnen und zeigte nur sparliche Mitosen

mit stark kondensierten Chromosomen. Trotzdem konnten fur die funf Sonden Ergebnisse

erzielt werden, durch die eine Eingrenzung der Bruchpunktregion auf 50 kb moglich war.

Da die weitere Eingrenzung der Bruchpunktregion auf Chromosom 11 mit Hilfe der Mini-

FISH-Analysen nur unzureichend gelang, wurden als weitere Methode der Feinkartierung

Southern Blots durchgefuhrt. Der Southern Blot mit dem Restriktionsenzym BbsI und den

Sonden SF1 und SF2 lieferte dabei die besten Ergebnisse. Es zeigte sich fur beide Sonden

eine Doppelbande beim Patienten im Vergleich zur Kontrolle. Mit diesem Ergebnis konnte

der Bruchpunkt auf Chromosom 20 auf eine ca. 5,5 kb große Region eingegrenzt werden.

Mit nur diesem einen Restriktionsenzym war eine feinere Kartierung auf Chromosom 11

immer noch nicht moglich. Weitere Southern Blots mit den Restriktionsenzymen BstXI

und KpnI sowie mit anderen Sonden (SF3, SF4 und SF5) lieferten leider auch keine ein-

deutigen Ergebnisse. Das lag zum Teil ebenfalls am Repeatreichtum der Region, der ein

Setzen der Sonden schwierig gestaltete. Zum anderen waren dadurch auf dem Blot auch im-

mer unspezifische, durch das Binden der Sonde an andere Restriktionsfragmente bedingte

Signale sichtbar. Somit waren die eigentlich interessanten Banden oft nur schwach zu er-

kennen oder unscharf. Außerdem war der Restriktionsverdau mit KpnI nicht zufriedenstel-

lend. Um uberhaupt den gewunschten Restriktions-Schmier nach einer Elektrophorese zu

erkennen, war zum Teil eine sehr lange Verdauzeit, mit immer neuen Enzymzugaben notig.

Vermutlich wurde die DNA nicht vollstandig verdaut und somit waren die gewunschten

Restriktionsfragmente gar nicht auf der Blotmembran enthalten. Damit lassen sich die

beim Southern Blot mit KpnI sichtbaren Banden erklaren, die auch bei der Kontrolle eine

nicht erwartete Große zeigten. Beim Southern Blot mit BstXI und der Sonde SF1 ließen

sich ebenfalls sehr gut Banden nachweisen und beim Patienten war eine Doppelbande mit

signifikantem Großenunterschied zur Kontrolle zu erkennen. Jedoch war aber auch bei der

Kontrolle eine unerwartete Doppelbande zu sehen. Moglicherweise ist die zweite Bande

107

durch einen SNP entstanden, durch die eine neue Restriktionsschnittstelle gebildet wurde.

Trotz der relativ großen verbliebenen Bruchpunktregionen wurde versucht, bruch-

punktuberspannende Fragmente fur beide derivativen Chromosomen zu generieren. Auch

hier war es aufgrund der zahlreichen Repeats in den Bruchpunktregionen sehr schwierig

Primer zu entwerfen. Zudem war auch die Etablierung der Long Template PCR zunachst

kompliziert. Es kamen dabei mehrere verschiedene Long Template Kits zum Einsatz, es

wurden mehrere Annealing-Temperaturen und Elongationszeiten ausprobiert und auch das

Ansatzvolumen variiert. Nachdem die Long Template PCR jedoch etabliert war, gelang

es reproduzierbare und spezifische Fragmente zu amplifizieren und diese auch zu sequen-

zieren. So konnte schließlich der Bruchpunkt auf beiden beteiligten Chromosomen auf die

Base genau bestimmt werden.

Es wurde von jedem derivativen Chromosom ausgehend ein bruchpunktuberspannendes

Fragment generiert und dieses von beiden Seiten sequenziert um mogliche Deletionen oder

Duplikationen an einem der Chromosomen zu erkennen. Es zeigte sich dabei tatsachlich

auf beiden Chromosomen jeweils eine Deletion von 3 Basenpaaren.

5.3 Kandidatengene in den Bruchpunktregionen


Ausgehend vom derivativen Chromosom 11 liegt der Bruchpunkt auf Chromosom 11 nach

der Position 8.729.575 bp und ausgehend vom derivativen Chromosom 20 nach der Po-

sition 8.729.572 bp. Demnach liegt der Bruchpunkt in der nicht-kodierenden Gensequenz

von ST5 (suppression of tumorigenicity 5; HeLa tumor suppression 1; DENN domain-

containing protein 2B) (siehe auch Abbildung 4.13 auf Seite 90), 725 Basenpaare vor dem

ersten kodierenden Exon. Damit wird durch den Bruchpunkt die untranslatierte Sequenz

(UTR) am 5’-Ende des Gens fast komplett von der kodierenden Gensequenz getrennt.

Es ist somit anzunehmen, dass entscheidende Promotorregionen des Gens ebenfalls von

den kodierenden Exons getrennt wurden und somit eine normale Translation nicht mehr

moglich ist.

108

Das ST5-Gen liegt auf dem Ruckwartsstrang des Chromosoms 11 und umfasst eine geno-

mische Lange von 217.600 bp. Es wurden bisher drei Isoformen des Gens identifiziert [35].

Die durch ST5 kodierten Proteine enthalten jeweils drei Domanen, eine DENN- (differen-

tially expressed in neoplastic versus normal cells), eine upstream gelegene uDENN und

eine downstream lokalisierte dDENN-Domane [49]. Die Isoform 1 besteht aus insgesamt

23 Exons, wobei die ersten 4 Exons in der 5´-UTR liegen. Somit hat die Isoform 1 des

ST5 -Gens insgesamt 19 kodierende Exons [15] und wird in ein ca. 4,6 kb großes Tran-

skript umgeschrieben. In Exon 6 liegt dabei eine Region, die fur eine Interaktionsstelle

mit cABL1 kodiert, in den Exons 13-15 die kodierende Region fur die uDENN-Domane,

in den Exons 15-19 die fur die DENN-Domane und in Exon 21 die kodierende Region

fur die dDENN-Domane [35]. Isoform 2 entsteht durch alternatives Spleißen der mRNA

[50]. Dabei wird das Exon 6 ausgespleißt, das 3´- und das 5´Ende der RNA sind jedoch

identisch zur Isoform 1 [48, 9]. Das entstehende Transkript ist etwa 3,1 kb groß. Durch den

Verlust des Exons 6, ist diese Isoform nicht in der Lage mit cABL1 zu interagieren [51]. Die

kurzeste Isoform des ST5 -Gens, Isoform 3, ensteht durch die Steuerung eines intronisch

gelegenen Promotors [50]. Bei diesem Promotor handelt es sich um einen Enhancer etwa

1500 Nukleotide upstream der Startsequenz [48]. Das durch Isoform 3 kodierte Transkript

hat eine Große von ca. 2,8 kb. Somit unterscheiden sich die drei Isoformen des ST5 -Gens

nur im 5´-Teil der Transkripte, wahrend der 3´-Teil, welcher die drei DENN-Domanen

enthalt, bei allen Isoformen enthalten ist. Ein Schema des ST5 -Gens ist Abbildung 5.1

auf der nachsten Seite dargestellt.

Das ST5 -Gen wurde durch seine Fahigkeit identifiziert, die Tumorgenitat von HeLa-Zellen

in Nacktmausen zu unterdrucken. Die drei durch ST5 kodierten Proteine enthalten C-

terminal eine Region, welche sehr starke Ahnlichkeiten mit der Rab3-Familie der klei-

nen GTP-bindenden Proteine aufweist. Die in diesem Bereich liegenden DENN-Domanen

wurden z.B. auch in Rab3GEP (Rab3 GDP/GTP exchange protein) bei Ratten oder bei

MADD (MAP kinase activating protein containing death domain) beim Menschen nachge-

wiesen [47]. Diese Proteine sind am MAPK (mitogen-activated protein kinase)/ERK2 (ex-

tracellular signal-regulated kinase 2)-Pathway beteiligt und fuhren uber eine Aktivierung

dieses Pathways zu Zellwachstum und Zellteilung [47]. Das durch die Isoform 1 kodierte

Protein bindet bevorzugt an die SH3-Domane der cABL1-Kinase und wirkt damit regula-

torisch auf die MAPK1/ERK2-Kinase. Isoform 1 fuhrt bereits alleine, aber insbesondere

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bei Ko-Expression mit cABL1 zu einer Aktivierung der MAPK1/ERK2-Kinase [51]. Die

Expression der Isoform 3 hingegen blockiert die durch Isoform 1 vermittelte Steigerung der

MAPK/ERK2-Aktivitat [36]. Wahrscheinlich wird durch die Isoform 3 die Fahigkeit der

Isoform 1, cABL1 zu binden, gestort [51]. Bei Koexpression von Isoform 1 und Isoform 3

des ST5 -Gens wird das Basis-Niveau der ERK2-Aktivitat aufrecht erhalten [50]. Durch die

Beteiligung an der Regulation des MAPK/ERK2-Pathways ist das ST5 -Gen somit an der

zytoskelettalen Organisation der Zelle sowie an einer moglichen Tumorentstehung betei-

ligt. Dies wird insbesondere dadurch deutlich, dass die hemmend auf die ERK2-Aktivitat

wirkende Isoform 3 nur in Nicht-Tumorzellen exprimiert wird [36]. Damit spielt das ST5 -

Gen fur die Modifizierung der Zellmorphologie und des Zellwachstums eine entscheidende

Rolle.

Weiterhin interessant ist die Funktion der DENN-Domanen des Gens. Proteine, welche

ebenfalls DENN-Domanen enthalten, sind z.B. das bei der Ratte vorkommende Rab3GEP,

das bei der Maus vorkommende Rab6IP1 (Rab6 interacting protein 1) und das bei C. ele-

gans identifizierte AEX3 (Ortholog zu Rab3GEP bei der Ratte) [47]. Alle diese Proteine

gehoren in die Familie der Ras-Superfamilie der GTPasen und sind am intrazellularen

Transport sowie an der Bildung und Freisetzung von Vesikeln beteiligt [79]. Bis heute

ist die genaue Funktion der DENN-Domanen noch unklar, vermutet wird jedoch eine

GTP/GDP-Austausch-Aktivitat und eine Beteiligung an der Kalzium-abhangigen Exozy-

tose. Bei Ratten wurde bereits ein intrazellularer Kreislauf identifiziert, an dem Rab3GEP

elementar beteiligt ist, und durch den die Vesikelbildung, die Membranfusion der Vesikel

und damit die Exozytose gesteuert wird und der daher bei der Neurotransmitterfreiset-

zung von Bedeutung [47] ist. Bei Knock-Out-Mausen, bei denen Gene aus diesem Kreislauf

ausgeschaltet wurden, ließen sich epileptische Anfalle beobachten [79]. Desweiteren konnte

bei Menschen eine Form der X-gebundenen mentalen Retardierung (X-linked non-specific

mental retardation MRX; Omim: #309541) aufgeklart werden, fur die Mutationen im

RABGDIA-Gen (RAB GDP-DISSOCIATION INHIBITOR, ALPHA) verantwortlich sind

[17]. Auch dieses Gen spielt im oben genannten Kreislauf der Transmitterfreisetztung eine

Rolle [79].

Zusammenfassend ist dieses Gen an elementaren Vorgangen in der Zelle beteiligt, welche

einen moglichen Zusammenhang mit dem Symptombild des Patienten erklaren konnten.

111

Daher habe ich mich in dieser Arbeit hauptsachlich auf eine nahere Charakterisierung

dieses Kandidatengens konzentriert.


Auf Chromosom 20 liegt der Bruchpunkt ausgehend vom derivativen Chromosom 11 nach

der Position 49.349.871 bp und ausgehend vom derivativen Chromosom 20 nach der Positi-

on 49.349.869 bp. Somit liegt der Bruchpunkt in einer Region, in der sich keine bekannten

oder vorhergesagten Gene identifizieren ließen (siehe Abbildung 4.14 auf Seite 91). Aus

diesem Grund wurde nach Kandidatengenen in der Nahe des Bruchpunktes gesucht. Da im

Bruchpunktbereich auch regulatorische Elemente wie z.B. Enhancer, Silencer oder Promo-

toren liegen konnten, die die Expression umliegender Gene positiv oder negativ regulieren

konnen, wurde auch der Bereich 2Mb vor und nach der kartierten Bruchpunktregion nach

Genen durchsucht. Dabei waren insbesondere Gene interessant, die im Gehirn exprimiert

werden bzw. die bereits mit mentaler Retardierung, Epilepsie, Gaumenspalten, Innenohr-

schwerhorigkeit oder Nierenfehlbildungen in Verbindung gebracht wurden.

Bei dieser Analyse wurden drei potentiell interessante Gene gefunden (siehe Abbil-

dung 4.14 auf Seite 91). Das Gen KCNG1 (potassium voltage-gated channel, subfamily G,

member 1) liegt 276.846 bp in Richtung Zentromer von der Bruchpunktregion entfernt. Das

Gen kodiert fur einen spannungsabhangigen Kaliumkanal, welche zu den funktionell und

strukturell komplexesten Ionenkanalen gehoren. Zu den zahlreichen bekannten Funktionen

gehoren z.B. die Regulation der Neurotransmitterfreisetzung, die Insulinsekretion, neuro-

nale Erregbarkeit sowie der epitheliale Elektrolyttransport. Der durch das Gen KCNG1

kodierte Kaliumkanal der Unterfamilie G wird besonders reichlich im Skelettmuskel, aber

auch im fetalen Gehirn und im Kleinhirn exprimiert. Eine schwache Expression findet sich

zudem in der Niere, den Hoden und in der Plazenta.

Das Gen DPM1 (dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide 1, catalytic subu-

nit) liegt ca. 341.403 bp zentromerwarts der Bruchpunktregion. Dieses Gen kodiert fur ein

Enzym an der zytosolischen Seite des Endoplasmatischen Retikulums (ER), welches die

Synthese von Dolichol-Phosphomannose (Dol-P-Man) aus GDP-Mannose und Dolichol-

Phosphat katalysiert. Ein Mangel an Dol-P-Man resultiert in einer unzureichenden Ex-

112

pression von GDI-verankerten Proteinen an der ER-Oberflache. Das Gen wird ubiquitar

exprimiert, insbesondere jedoch in der Leber. Mutationen im DPM1 -Gen wurden bereits

beschrieben und fuhren zur angeborenen Storung der Glycosylierung vom Typ Ie (Omim:

#608799). Fur diese Erkrankung wurde ein autosomal-rezessiver Erbgang beschrieben

und die Betroffenen weisen eine schwere mentale Retardierung, epileptische Anfalle sowie

zahlreiche weitere Fehlbildungen des Skelettsystems und der inneren Organe auf. Dazu

gehoren ein persistierender Ductus arteriosus Botalli, eine Hepato- und Splenomegalie,

dysplastische Nagel, verkurzte Arme sowie Knie- und Sprunggelenkskontrakturen, eine

muskulare Hypotonie, aber auch eine Blutgerinnungsstorung aufgrund einer Antithrombin-

III-, Protein-S- und Protein-C-Defizienz.

Das dritte Gen liegt etwa 484.122 bp terminal von der kartierten Bruchpunktregion. SALL4

(sal-like 4, Drosophila) gehort zu den SAL-ahnlichen Genen, welche fur putative Zink-

Finger-Transkriptions-Faktoren kodieren. SALL4 wird besonders stark im Corpus callo-

sum, im Ruckenmark sowie in der Schilddruse aber auch in der Niere exprimiert. Auch

fur dieses Gen wurden bereits Mutationen beschrieben, welche zum autosomal-dominanten

Duane-Radial Ray Syndrom (DRRS; Omim: #607323) fuhren. Bei diesem Syndrom kommt

es zu zahlreichen das Auge und das Skelettsystem betreffenden Fehlbildungen, aber auch

zu Innenohrschwerhorigkeit, Herzfehlern und Fehlbildungen der Niere, wie z.B. hypoplas-

tische Nieren oder Nierenagenesie. Das Krankheitsbild zeigt einen sehr variablen Phanotyp

mit unterschiedlicher Beteiligung der verschiedenen Organsysteme. Die geistige Entwick-

lung der Betroffenen ist jedoch normal.

Nachdem auf Chromosom 11 der Bruchpunkt in der 5’-UTR des ST5 -Gens liegt, auf

Chromosom 20 aber, wenn uberhaupt, nur ein regulatorisches Element eines Gens durch

den Bruchpunkt beeinflusst wurde und die bereits bekannte Systematik dieser Gene nicht

beim Patienten volag, habe ich mich in meiner Arbeit auf weiterfuhrende Analysen des

ST5 -Gens konzentriert.

113

5.4 Expressionsanalysen

5.4.1 Expressionsanalysen des ST5 -Gens mittels RT- und Real-Time-

PCR

In dieser Arbeit wurde mit RNA aus lymphoblastoiden Zelllinien gearbeitet, da vom Trans-

lokationspatienten leider kein anderes Material zur Verfugung stand. Solche Zellen werden

mit dem EBV-Virus immortalisiert. Bereits in der Diplomarbeit von S. Bauhuber wurde

gezeigt, dass lymphoblatstoide Zellen ihr Expressionsmuster willkurlich verandern konnen

und damit fur quantitative Analysen nicht geeignet sind [8]. Insbesondere sind dabei Gene

betroffen, die am Zellwachstum, der Zellteilung sowie an der zytoskelettalen Organisation

beteiligt sind. ST5 ist jedoch genau an diesen Prozessen mit beteiligt [36, 47].

Zunachst musste also uberpruft werden, ob ST5 in lymphoblastoiden Zelllinien expri-

miert wird. Hubbs et al. [36] beschreiben in ihrer Arbeit, dass ST5 zwar in allen Geweben

exprimiert wird, die Isoform 1 jedoch in lymphoiden Zellen und in Lymphozyten nicht

nachgewiesen werden konnte. Fur die Isoformen 2 und 3 des ST5 -Gens wurde ein sehr

niedriges Expressionslevel angegeben. Die in der Literatur angegebenen Ergebnisse ließen

sich reproduzieren. Mit den Primerpaaren, welche in dem Bereich des ST5 -Gens liegen,

welcher bei allen drei Isoformen exprimiert wird, ließen sich Fragmente der gewunschten

Lange amplifizieren. Diese Amplikons waren jedoch im Verhaltnis zur mitgefuhrten Kon-

trolle sehr schwach und deuten somit auch eine schwache Expression von ST5 in lympho-

blastoiden Zellen hin. Ein Primerpaar, dessen eingeschlossenes Fragment nur bei Isoform

1 transkribiert wird, konnte nicht nachgewiesen werden. Dies deckt sich mit den Litera-

turangaben, dass Isoform 1 nicht in lymphoblastoiden Zellen exprimiert ist [36, 15]. Auch

die Ergebnisse der Real-Time-PCR lieferten Ergebnisse, die darauf schließen ließen, dass

ST5 in lymphoblastoiden Zelllinien, nur auf einem sehr schwachen Basisniveau exprimiert

wird. Das bedeudete fur diese Arbeit, dass die Expressionsanalyse beim Translokations-

patienten selbst nicht aussagekraftig war, da von diesem nur RNA vorhanden war, welche

aus einer lymphoblastoiden Zelllinie gewonnen wurde. Entsprechend konnte eine Haploin-

suffizienz des ST5 -Gens bisher nicht nachgewiesen werden. Es ware wunschenswert, wenn

man eine neue Blutprobe des Translokationspatienten, und damit RNA aus nativem Blut,

114

oder aber Fibroblasten untersuchen zu konnen. Die Eltern des Patienten stimmten jedoch

einer weiteren Probenentnahme nicht zu.

Da gemaß Hubbs et al. und der Datenbank UCSC ST5 in zahlreichen Geweben exprimiert

wird, wurde in einem nachsten Schritt die Expression von ST5 mittels Real-Time-PCR

an verschiedenen kommerziell erhaltlichen cDNA-Panels untersucht. Die Analysen wurden

an verschiedenen adulten und fetalen humanen Geweben durchgefuhrt. Im fetalen Gewebe

konnte eine ubiquitare ST5-Expression in allen untersuchten Geweben nachgewiesen wer-

den. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Expression in fetaler Niere etwas hoher

als in den ubrigen Geweben war. Die adulten Gewebe zeigen im Vergleich zu den fetalen

Geweben niedrigere Expressionslevel, nur adultes Gehirn, Niere und Skelettmuskel errei-

chen deutlich hohere Expressionswerte im Vergleich zu den anderen adulten und zu den

fetalen Geweben. Demnach scheint ST5 insbesondere in der Embryonalentwicklung in allen

sich entwickelnden Geweben, insbesondere aber in der Niere eine Rolle zu spielen. In den

meisten adulten Geweben dagegen scheint ST5 keine entscheidende Funktion zu erfullen.

Die einzigen Gewebe, die auch im adulten Gewebe sehr hohe ST5 -Expression aufweisen,

sind die Gewebe (Gehirn und Niere), in denen der Translokationspatient phanotypische

Effekte zeigt.

5.4.2 Expressionsanalyse des ST5 -Gens mittels Tissue-in-situ-

Hybridisierung

a) St5 -Expression

Durch eine Tissue-in-situ-Hybridisierung wurde die Expression des St5 -Gens in verschiede-

nen embryonalen Entwicklungsstadien der Maus (E8.5, E13.5 und E15), sowie an Gehirn-

und Nierenschnitten von 6, 10 und 15 Tage alten, 7 Wochen alten und adulten Mausen

untersucht. Dabei konnte keine signifikante Expression an E13.5 Mausembryonen nach-

gewiesen werden. An Embryonaltag 15.5 hingegen zeigte sich eine Expression von St5

in der Ventrikular- und der Marginalzone des Frontalen Cortex, aber auch in der Nie-

re und im Gaumen. Die St5 -Expression war außerdem in sich entwickelnden tubularen

Strukturen der Niere von neugeborenen und 15 Tage alten Mausen nachweisbar. Eine Ex-

115

pression von ST5 konnte auch im Cortex, der hippocampalen Region und im Kleinhirn

von P6-, P10- und P15-Mausen nachgewiesen werden. Auch Gehirne adulter Mause wie-

sen St5 -spezifische Signale auf, welche hauptsachlich im Cortex und im Gyrus Dendatus

lokalisiert waren.

Durch die Hybridisierung an Sagittalschnitten von E15-Embryonen konnten spezifische

Hybridisierungssignale in der ventrikularen Zone sowie in der Cortikalplatte nachgewie-

sen werden. Besonders kraftige Signale waren jedoch in der Marginalzone zu erkennen.

Moglicherweise handelt es sich bei diesen intensiv gefarbten Zellen der Marginalzone um

sog. Cajal-Retzius-Zellen. In fruheren Stadien waren keine, oder schwache Signale detek-

tierbar, so dass das St5 -Gen moglicherweise erst in spateren Stadien der Gehirnentwicklung

exprimiert wird oder das Expressionsniveau in den fruhen Embryonalstadien so gering ist,

dass eine Expression mit der verwendeten Technik nicht nachweisbar ist. Im Gehirn der

adulten Tiere ließen sich ubiquitar im Cortex verteilt Signale nachweisen. Der Balken sowie

die anteriore Commisur zeigten dagegen keine Signale. Starke Signalanreicherungen waren

in der hippocampalen Formation, insbesondere im Ammonshorn und im Gyrus dentatus

zu erkennen. Des Weiteren zeigte der Plexus choroideus, der Bulbus olfactorius sowie das

Kleinhirn eine starke Signaldichte. Aus den Expressionsanalysen mittels Tissue-in-situ-

Hybridisierung lasst sich schlussfolgern, dass das St5 -Gen in bestimmten Regionen des

Gehirns exprimiert wird und insbesondere die Expression wahrend der Cortexentwicklung

auf eine Beteiligung an dieser hinweisen konnte. Durch die Tissue-in-situ-Hybridisierung

ergaben sich somit weitere Hinweise, dass das St5 -Gen ein gutes Kandidatengen fur die

neurologischen Symptome des Translokationspatienten darstellt.

b) Die cortikale Entwicklung

Die Entwicklung des Cortex erfolgt uber drei Entwicklungsstadien, welche in Abbildung 5.2

auf Seite 117 dargestellt sind. Die Entwicklung verlauft uber das Vorplatten-Stadium

(”preplate stage“) uber das Cortikalplatten-Stadium (cortical-plate stage“) bis zum adul-

ten Stadium. Bei der Maus spricht man am Embryonaltag E10-12, beim Menschen in

der Woche 8-9, vom ”Preplate“-Stadium. In diesem Stadium sind zwei Schichten unter-

scheidbar, die ventrikulare Zone und die Vorplatte. Die ventrikulare Zone stellt dabei eine

116

germinative Zone dar, aus welcher alle post-mitotischen Neuronen abstammen [26]. Die

Vorplatte dagegen ist eine aus radialen Gliazellen und horizontalen Neuronen bestehen-

de geflechtartige Zone. Zu den horizontalen Neuronen werden auch die bereits erwahnten

Cajal-Retzius-Zellen gezahlt [54]. Wahrend der weiteren cortikalen Entwicklung wandern

post-mitotische Neuronen aus der proliferierenden ventrikularen Zone in die Vorplatte

ein. Diese Migration erfolgt entlang der radialen Gliazellen [59]. Durch das Einwandern

der Neuronen in die Vorplatte, teilt sich diese schließlich in zwei neue Schichten auf. Au-

ßen entsteht die Marginalzone und weiter innen die basale Schicht (”subplate“) [31, 29].

Die eingewanderten Neuronen siedeln sich zwischen diesen neu entstandenen Schichten

an und bilden die sog. Cortikalplatte. Dabei wandern die jungsten Neuronen durch die

bereits angesiedelten alteren Neuronen hindurch und bilden die nachste oberflachennahere

Schicht [1]. Im Cortikalplatten-Stadium lassen sich also im Cortex funf Schichten vonein-

ander unterscheiden: die ventrikulare Zone, die intermediare Zone, die basale Schicht, die

Cortikalplatte und die außen gelegene Marginalzone (siehe auch Abbildung 5.2 auf der

nachsten Seite). Das Corticalplatten-Stadium reicht bei der Maus vom Embryonaltag E10

bis etwa E17, beim Menschen entspricht dies etwa den Entwicklungswochen 10-18.

Ist die Migration der Neuronen schließlich abgeschlossen, differenzieren die eingewander-

ten Neuronen weiter aus. Dadurch bilden sich innerhalb der Cortikalplatte sechs Schichten

aus. Die Zellen der basalen Schicht bilden sich zusammen mit den Zellen der Marginal-

zone weitestgehend zuruck, nur wenige Zellen dieser Zonen bleiben aus fruheren Stadien

erhalten [29].

c) Auf gestorter neuronaler Migration beruhende Erkrankungen

Bis heute konnten bereits eine Reihe von Erkrankungen beim Menschen beschrieben wer-

den, die auf einer gestorten Migration von Neuronen aus der ventrikularen Zone in die

Cortikalplatte beruhen. Einige dieser Gene sind in Abbildung 5.2 auf der nachsten Seite

mit abgebildet. Dabei konnen Mechanismen wie z.B. der Beginn, der Verlauf und das En-

de der Migration beeinflusst werden. Fur einige Gene konnten Mutationen nachgewiesen

werden, die zu einer Storung der neuronalen Migration fuhren und je nachdem, in wel-

cher Phase der Migration das Gen aktiv ist und an welchem Ort es exprimiert wird, zu

unterschiedlichen Phanotypen fuhren.

117

Abbildung 5.2: Die cortikale Entwicklung

Dargestellt sind die drei Stadien der cortikalen Entwicklung: das Vorplatten-Stadium (”preplate stage“),

das Corticalplatten-Stadium (”cortical-plate stage“) und das Stadium des adulten Gehirns. Einige Gene,

welche an der Steuerung der cortikalen Entwicklung beteiligt sind, wurden entsprechend ihres Expressions-

ortes mit in der Darstellung abgebildet. CP, Cortikalplatte; IZ, intermediare Zone; MZ, Marginalzone; PP,

Vorplatte (”Preplate“); SP, basale Schicht (

”Subplate“); V, Ventrikel; VZ, ventrikulare Zone; WM, weiße

Substanz (”white matter“). Die Abbildung wurde aus Gleeson et al. 2000 entnommen [29].

Das Filamin 1 -Gen (FLN1 ) kodiert fur ein Actin-bindendes Protein, welches vermutlich

uber das Actin-Cytoskelett Einfluss auf die Neuronenmigration hat. Durch Mutationen in

diesem Gen konnen die post-mitotischen Neuronen die ventrikulare Zone nicht verlassen

und lagern sich uber dieser als neue Schicht an. Somit scheint FLN1 insbesondere bei der

Initiierung der Migration eine entscheidende Rolle zu ubernehmen. Mutationen im FLN1 -

Gen fuhren bei den Betroffenen zur periventrikularen Heterotopie [24].

Eine Erkrankung, welche mit schwerer mentaler Retardierung und Epilepsie einhergeht

ist die Lissenzephalie Typ I, welche durch Mutationen im LIS1 -Gen hervorgerufen wird.

Das durch LIS1 kodierte Protein interagiert mit Mikrotubuli und konnte deren Dynamik

regulieren [67]. Die genaue Funktion sowie die Bedeutung des LIS1 -Gens in der neurona-

len Migration sind jedoch noch unbekannt. Allerdings weisen Patienten mit Lissenzephalie

Typ I nur einen vier-schichtigen Cortex auf [28]. Die Mehrzahl der Neuronen befindet sich

in der vierten cortikalen Schicht, wonach sich schließen lasst, dass hier der Verlauf der

Migration gestort sein muss.

Ein weiteres Mikrotubuli-assoziiertes Protein ist Doublecortin, welches durch DCX kodiert

wird [27, 25]. Auch bei diesem Gen ist die genaue Rolle der Regulation der neuronalen Mi-

gration nicht endgultig geklart, aber Mutationen in diesem Gen fuhren zum Krankheitsbild

des ”doppelten Cortex“. Die Betroffenen weisen dabei einen normalen sechs-schichtigen

118

Cortex auf, allerdings auch eine zusatzliche Schicht von Neuronen innerhalb der subkorti-

kalen weißen Substanz [6]. Die Betroffenen zeigen eine milde mentale Retardierung sowie

epileptische Anfalle.

Es gibt auch Erkrankungen, bei denen die Schichtung des Cortex der normalen ”Inside-

Out“-Schichtung entgegengesetzt ist. Bei dieser Erkrankung durchwandern die jungeren

Neuronen nicht die Schicht der alteren Neuronen, sondern lagern sich unter diesen alteren

Neuronen an. Zudem spalten die Neuronen die Vorplatte nicht auf und lagern sich un-

ter dieser an. Es entsteht eine sog. ”Superplate“ bestehend aus Marginalzone und basaler

Schicht [40]. Verantwortlich fur den Phanotypen der Lissenzephalie Typ III mit cerebellarer

Hypoplasie, der sich in Mikrozephalie, Epilepsie und mentaler Retardierung außert, sind

Mutationen im RELN -Gen. Diese Gen kodiert fur Reelin, ein extrazellulares Signalmo-

lekul. Reelin wird von den Cajal-Retzius-Zellen der Marginalzone sezerniert und nimmt

uber Membranrezeptoren Einfluss auf die Positionierung der Neuronen [34, 18, 61].

Ein weiteres in der Cortexentwicklung exprimiertes Gen ist das Fukutin. Es kodiert fur ein

Protein, welches sezerniert wird und vermutlich als Signalmolekul fungiert. Wahrscheinlich

wird durch Fukutin die Migration der Neuronen in der ersten Zone des Cortex gestoppt,

da bei Mutationen in diesem Gen die Neuronen uber den Cortex hinaus wandern [65, 42].

Betroffene Personen zeigen das Krankheitsbild der Lissenzephalie Typ II mit mentaler

Retardierung und epileptischen Anfallen.

Bei den Proteinen, die an der neuronalen Migration beteiligt sind, handelt es sich in der

Regel um Proteine, die als extrazellulare Signalmolekule wirken oder die mit dem Zytoske-

lett assoziiert sind.

5.5 Moglicher Einfluss von ST5 auf die Gehirnentwicklung

und den Phanotypen des Patienten

Die untersuchten Mausembryonen des Entwicklungsstadiums E15 befinden sich im

Cortikalplatten-Stadium, in dem die Migration von Neuronen in die Cortikalplatte statt-

findet. Hier konnte eine Expression insbesondere in der Marginalzone, aber auch in der

Cortikalplatte und in der ventrikularen Zone nachgewiesen werden. In der intermediaren

Zone dagegen waren kaum Signale detektierbar. Aufgrund der Signalverteilung und dem

Vergleich mit der Nissl-Farbung lasst sich schließen, dass es sich bei den gefarbten Zellen

119

um Neuronen handelt, die von der ventrikularen Zone aus durch die intermediare Zone

wandern und sich in der Cortikalplatte ansiedeln. In diesem Stadium finden auch Pro-

zesse des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung statt. Da ST5 regulatorisch an der

MAPK/ERK2-Signalkaskade beteiligt ist, und somit sowohl am Zellwachstum, als auch

an der zytoskelettalen Organisation der Zellen maßgeblich beteiligt ist, und da bekannt

ist, dass Proteine, die mit dem Zytoskelett assoziiert sind an der neuronalen Migration

beteiligt sind, konnten Defekte im ST5 -Gen zu einer fehlerhaften Migration der Neuronen

fuhren. Ahnlich wie bei den bereits bekannten Storungen der neuronalen Migration konnte

dies eine mentale Retardierung sowie epileptische Anfalle zur Folge haben (siehe auch c)

auf Seite 116).

Auch im adulten Gehirn ließen sich jedoch ubiquitar im Cortex verteilt Signale nach-

weisen, auch hier handelt es sich um Neuronen. Dies passt gut zu der bereits fur die

DENN-Domanen beschrieben GTP/GDP-Austausch-Aktivitat und der damit anzuneh-

menden Beteiligung an der Vesikelbildung, Fusion der Vesikel mit der Membran und an

der Neurotransmitterfreisetzung [47]. Somit ist fur ST5 auch eine wesentliche Rolle in

der Signalubertragung im adulten Hirn denkbar. Weitere orthologe Proteine, die DENN-

Domanen enthalten sind z.B. Rab3GEP bei der Ratte, Rab6IP1 bei der Maus und AEX3

bei C. elegans [47]. Rab-Proteine sind die großte Gruppe der Ras-Superfamilie der GT-

Pasen und sind an der zytosolischen Seite aller Membranen von Zellorganellen lokalisiert.

Es existiert ein Zyklus zwischen der GDP- und der GTP gebundenen Form, wobei die

GTP-gebundene, die aktive Form ist. Fur die DENN-Domanen wird eine GDP/GTP-

Austausch-Aktivitat vermutet, so dass die Rab-Proteine eng an die Kalzium-abhangige

Exozytose und damit an die Neurotransmitterfreisetzung aus Neuronen gekoppelt sind

[79]. Bei C. elegans konnte bei Mutationen im AEX3 -Gen eine Akkumulation von Rab3 in

den Nervenzellkorpern und nicht wie normalerweise synapsennah in den Axonen nachge-

wiesen werden. Dies fuhrte zu einer deutlich reduzierten Neurotransmitterfreisetzung [47].

Auch fur Rab3GEP Knock-out-Mause konnte diese Beobachtung bestatigt werden. Diese

Mause wiesen zudem eine stark verminderte Anzahl an synaptischen Vesikel auf [47]. Somit

liegt die Vermutung nahe, dass die Rab-Proteine insbesondere an der Vesikelbildung betei-

ligt sind. Aber auch die Fusion mit der Membran und die Transmitterfreisetzung sind stark

beeintrachtigt. Moglicherweise hat ST5, da es die gleichen Domanen aufweist und vermut-

lich in Neuronen exprimiert wird, eine ahnliche Funktion in diesem Prozess. Zudem konnte

120

bei Knock-Out-Mausen, bei denen Gene aus dem Zyklus der Rab-Proteine ausgeschaltet

wurden, epileptische Anfalle beobachtet werden [79]. Da der Translokationspatient eben-

falls eine Epilepsie aufweist, konnte dies die These, dass das ST5 -Gen an diesem Zyklus

beteiligt ist, stutzen. Desweiteren wurde beim Menschen auch eine Form der X-gebundenen

mentalen Retardierung (X-linked non-specific mental retardation MRX; Omim: #309541)

aufgeklart, fur die Mutationen im RABGDIA-Gen (RAB GDP-DISSOCIATION INHI-

BITOR, ALPHA) verantwortlich sind [17]. Auch dieses Gen spielt im oben genannten

Kreislauf der Transmitterfreisetztung eine Rolle. Sollte ST5 also an dem Zyklus der Ve-

sikelbildung und Exozytose beteiligt sein, besteht moglicherweise ein Zusammenhang zur

mentalen Retardierung des Patienten.

Insgesamt gesehen ließen sich die neurologischen Symptome des Translokationspatienten,

also die mentale Retardierung und die Epilepsie, durch eine Veranderung im ST5 -Gen und

damit uber eine Migrationsstorung wahrend der cortikalen Entwicklung oder aber uber

Storungen der Neurotransmitterfreisetzung erklaren. Auch eine Beteiligung an der beid-

seitigen Innenohrschwerhorigkeit ist durch die mogliche Storung der Signalubertragung

denkbar. Die Gaumenspalte und die Nierenfehlbildung sind moglicherweise durch die re-

gulatorische Funktion des ST5 -Gens an der MAPK/ERK2-Signalkaskade zu erklaren.

Durch diesen Signalweg wird insbesondere das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und

die Zellteilung beeinflusst und auch eine Auswirkung auf die Organisation des Zytoskelet-

tes ist beschrieben. Dies wird durch die Ergebnisse aus den Expressionsanalysen gestutzt.

Zum einen konnte durch die Real-Time-PCR an fetalem humanen Gewebe eine Basis-

Expression von ST5 in allen untersuchten Geweben, und eine starke Expression in der

Niere nachgewiesen werden. Zum anderen konnten bei der Tissue-in-situ-Hybridisierung

an Mausembryonen sowohl in der Niere, als auch in der Gaumenregion spezifische Signale

nachgewiesen werden.

5.6 Mutationsscreening

Bisher wurden Veranderungen im ST5 -Gen noch nicht mit einer Erkrankung assoziiert.

Lediglich die Beobachtung, dass Tumorzellen die Isoform 3 nicht mehr exprimieren, ist

beschrieben worden [36]. Daher sollte in dieser Arbeit versucht werden, bei Patienten

121

mit uberlappendem Phanotyp zum Translokationspatienten, Veranderungen wie Nonsense-

oder Missense-Mutationen bzw. kleinere, wenige Basen umfassende Deletionen oder Du-

plikationen durch eine Sequenzierung des ST5 -Gens bei diesen Patienten zu erfassen.

Neben zahlreichen bereits beschriebenen SNPs wurden auch bisher unbekannte Sequenzab-

weichungen nachgewiesen. Bei diesen Sequenzveranderungen handelte es sich ausschließlich

um Missense-Mutationen, welche auch bei einem gesunden Elternteil nachgewiesen werden

konnten und somit vererbt wurden. Es ist daher unwahrscheinlich, dass es sich um krank-

heitsverursachende Mutationen bei den Betroffenen handelt. Des Weiteren wurde bei einem

Patienten eine Compound-Heterozygotie fur zwei bisher unbekannte Veranderungen nach-

gewiesen. Die Sequenzanalyse beim Translokationspatienten ergab jedoch keinen Hinweis

auf ein rezessives Geschehen, so dass von einer durch die Translokation hervorgerufenen

Haploinsuffizienz ausgegangen werden kann.

Insgesamt gehen wir aber davon aus, dass eine Haploinsuffizienz des ST5 -Gens die Ursache

fur eine spezielle, aber seltene syndromale Form der schweren Mentalen Retardierung

darstellt.

122

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Abkurzungsverzeichnis

A. dest. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aqua destillatum

ADS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom

AS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Aminosaure

ASD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vorhof-Septum-Defekt

BAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . bacterial artificial chromosomes

bds. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .beidseits

bzw. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . beziehungsweise

ca. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . circa

DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Desoxyribonukleinsaure

dpc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . days post-conceptionem

E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Escherichia coli Bakterien

FISH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

IQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Intelligenzquotient

kb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kilobasen

LB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Luria broth

LBL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . lymphoblastoide Zelllinie

Mb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Megabasen

MLPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Multiplex ligation-dependent probe amplification

MR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mentale Retardierung

mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . messenger Ribonukleinsaure

musk. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . muskular

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Polymerase-Kettenreaktion

SNP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .single nucleotide polymorphism

sog. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . sogenannt

134

UTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . untranslated region

VSD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ventrikel-Septum-Defekt

z.B. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . zum Beispiel

135

Abbildungsverzeichnis

2.1 Ursachen der mentalen Retardierung nach Rauch et al. . . . . . . . . . . . . 11

2.2 Schema struktureller Chromosomenaberrationen . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.3 Positionsklonierung des SUMO1 -Gens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.1 Untersuchungsergebnisse vor Beginn der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2 Gelelektrophorese der Amplikons des ST5 -Gens bei zwei Patienten . . . . . 30

3.3 Karte der Restriktionsschnittstellen in der Bruchpunktregion auf Chromo-

som 20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.4 Karte der Restriktionsschnittstellen in der Bruchpunktregion auf Chromo-

som 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.5 Schema des Blottens beim Southern-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.6 Beispiel eines Dot Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

4.1 Ausgangssituation auf den Chromosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.2 Ergebnis der FISH-Analysen auf Chromosom 11 . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.3 Ergebnis der FISH-Analysen auf Chromosom 20 . . . . . . . . . . . . . . . 77

4.4 Ergebnisse nach der FISH-Analyse mit BAC-Sonden . . . . . . . . . . . . . 78

4.5 Ergebnis der Mini-FISH-Analysen auf Chromosom 11 . . . . . . . . . . . . 79

136

4.6 Ergebnis der Mini-FISH-Analysen auf Chromosom 20 . . . . . . . . . . . . 80

4.7 Ergebnisse nach der FISH-Analyse mit Long-Template-PCR-Sonden . . . . 81

4.8 Restriktionsverdau und Southern Blot mit den Restriktionsenzymen BbsI

und BstXI sowie der Sonde SF1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.9 Chromosomensituation beim Patienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

4.10 Primer fur die bruchpunktuberspannende PCR . . . . . . . . . . . . . . . . 86

4.11 Agarose-Gelbilder der bruchpunktuberspannenden Long Template PCRs . . 87

4.12 Sequenzierung der bruchpunktuberspannenden Fragmente . . . . . . . . . . 88

4.13 Abgleich der Lage des Bruchpunktes (rote Linie) auf Chromosom 11 mit

der Referenzdatenbank UCSC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

4.14 Abgleich der Lage des Bruchpunktes (rote Linie) auf Chromosom 20 mit

der Referenzdatenbank UCSC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

4.15 RT-PCR mit verschiedenen Primerpaaren im ST5 -Gen . . . . . . . . . . . . 93

4.16 Amplifikationskurve des ST5 -Gens nach der Real-Time-PCR an lympho-

blastoiden Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

4.17 Ergebnis der Expressionsanalyse des ST5 -Gens mittels Real-Time-PCR an

lymphoblastoiden Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

4.18 Ergebnis der Expressionsanalyse des ST5 -Gens mittels Real-Time-PCR an

fetalen und adulten Geweben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

4.19 Expressionsanalyse von St5 mittels Tissue-in-situ-Hybridisierung an muri-

nem Gewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

4.20 Bei den Patienten A11 und B12 gefundene Sequenzabweichungen in Exon 2 99

4.21 Beim Patienten 13183 gefundene Sequenzabweichungen in Exon 5 . . . . . . 100

4.22 Beim Patienten 18713 gefundene Sequenzabweichungen in Exon 6 . . . . . . 100

137

4.23 Beim Patienten G03 gefundene Sequenzabweichungen in Exon 7 . . . . . . . 100

4.24 Bei den Patienten A12 und E05 gefundene Sequenzabweichungen in Exon 9 101

4.25 Bei den Patienten A04 und 19758 gefundene Sequenzabweichungen in Exon

14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

4.26 Beim Patienten CLP4/3 und dessen Eltern gefundene Sequenzabweichungen

in Exon 12 und 18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

5.1 Schema des ST5 -Gens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

5.2 Die cortikale Entwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

138

Tabellenverzeichnis

2.1 Einteilung der mentalen Retardierung anhand des IQs . . . . . . . . . . . . 8

2.2 Ursachen der mentalen Retardierung nach Curry et al. . . . . . . . . . . . . 9

2.3 Die 10 haufigsten genetischen Ursachen fur MR . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.4 Haufige Diagnosen bei Mentaler Retardierung . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.5 Strukturelle Chromosomenaberrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.1 Symptomkombinationen bei den untersuchten Patienten . . . . . . . . . . . 24

3.2 Master-Mix der verwendeten Standard-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.3 Master-Mix der Sequenzier-Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.4 Long-Template PCR mit dem neuen dNTpack-Kit (Roche) . . . . . . . . . 35

3.5 Long-Template PCR mit dem Expand 20 kbP lus PCR System (Roche) . . . 35

3.6 cDNA-Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.7 Master-Mix der verwendeten LongRange-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.8 Markierungsreaktion - Nick Translation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.9 Ansatz fur Restriktionsverdau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.10 End-Labeling der Oligo-Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

139

3.11 In-vitro-Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.12 Verwendete BACs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.13 Verwendete Kontroll-Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

4.1 Lage der Bruchpunkte nach der FISH-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

4.2 Lage der Bruchpunkte nach der Mini-FISH-Analyse . . . . . . . . . . . . . 80

4.3 genomische Position der Bruchpunkte nach dem Southern Blot . . . . . . . 84

4.4 genomische Position der Bruchpunkte nach der bruchpunktuberspannenden

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.5 Sequenzabweichungen beim Indexpatient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

4.6 Sequenzabweichungen bei den untersuchten Patienten . . . . . . . . . . . . 103

4.7 Zusammenfassung der detektierten Sequenzabweichungen . . . . . . . . . . 104

A.1 Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

A.2 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

A.3 Losungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

A.4 verwendete Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150

A.5 Langenmarker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

A.6 Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

A.7 verwendete Taqman-Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

A.8 Gerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

A.9 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

A.10 Datenbanken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

140

B.1 Exp-LT65-12min . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

B.2 Cx32-LT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

B.3 TDL64-58 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

B.4 Exo-Verd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

B.5 BD55-2min . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

B.6 qRT-PCR-Programm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

C.1 Primer ST5 -Gen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159

C.2 Primer Long-Range PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161

C.3 Primer fur Bruchpunktuberspannende PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162

C.4 Southern-Blot Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

C.5 Oligonukleotid-Sonden fur Maus-in-situ-Hybridisierung . . . . . . . . . . . . 165

C.6 Primer fur cDNA-Sonden fur Maus-in-situ-Hybridisierung . . . . . . . . . . 166

C.7 rt-PCR Primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

D.1 Weitere Sequenzabweichungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

141

Vorveroffentlichungen

Gohring, I., Tagariello, A., Endele, S., Stolt, C.C., Ghassibe, M., Fisher, M., Thiel, C.T.,

Trautmann, U., Vikkula, M., Winterpacht, A., FitzPatrick, D.R., Rauch, A.: Disruption

of ST5 is associated with mental-retardation and multiple congenital anomalies. J Med

Genet. 2009 Oct 19 [Epub ahead of print].

142

Anhang A

Gerate und Chemikalien

A.1 Verbrauchsmaterialien

Tabelle A.1: Verbrauchsmaterialien

Material Hersteller

Deckglaser (24x60mm Roth

Falcon (15ml, 50ml) Nunc

Fixogum Marabu

Glaswolle Serva

Illustra� Probe-Quant� G-50 Micro-Sephadex-Saulchen Amersham Biosciences

Nylonmembran Pall Corporation

Objekttrager Roth

Optical Adhesive Covers Applied Biosystems

Papierfilter Machery-Nagel

Parafilm Pechiney Plastic Packa-

ging

Petrischalen Josef Peske oHG

Pipettenspitzen, 10�l Biozym

Pipettenspitzen, 200 + 1000�l Sarstedt

Pipettenspitzen mit Filter, 10 + 20 + 200 + 1000�l Biozym


143

Material Hersteller

Reaktionsgefaß, 1,5ml (Deckel) Josef Peske oHG

Reaktionsgefaß, 1,5ml (ohne Deckel) Josef Peske oHG

Reaktionsgefaß, 2ml Greiner

Reaktionsgefaß, 0,2ml Peqlab

Reaktionsgefaß, 0,5ml Josef Peske oHG

Spritzen, 1mlml BD Plastipak

Whatman-Papier (3MM) Whatman Laboratory

384 Well Optical Reaction Plate Applied Biosystems

96 Well PCR-Platten Costar Corning Inc.

96 Well Sequenzier-Platten Greiner

A.2 Chemikalien

Tabelle A.2: Chemikalien

Chemikalien bzw. Material Hersteller

Aceton Roth

Agar-Agar Merck

Agarose Sigma

Ampuva Fresenius Kabi

AP-konjugierte Anti-DIG Fab-Fragmente Roche

BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphat Toluidinsalz) Roche

Betain (5M) Sigma

BigDye 5xPuffer Applied Biosystems

Blocking-Reagent Sigma

Borsaure Merck

Bromphenolblau Sigma

BSA Sigma

Chloramphenicol (20�g/ml) Sigma

Chloroform Roth

Clariøn Biømeda


144


Cot-1-DNA Sigma

Cresylviolett Sigma

Crystal Mount Biømeda

Cy3-dCTP Amersham Biosciences

Dabco (Triethylen-Diamin) Sigma

Dapi Serva

DEPC Roth

Desoxynucleotid-Triphosphate Roche

Dextranblau Sigma

Dextransulfat Sigma

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth

Dinatriumwasserstofftetraphosphat(dihydrat) (Na2HPO4) Merck

Eosin Sigma

Ethanol 100% Roth

Ethidiumbromid (10mg/ml) Roth

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Roth

FluoroX-dCTP Amersham Biosciences

Formaldehyd VWR

Formamid VWR

Glycerin Roth

Hamatoxylin Sigma

HCl VWR

Hefe-Extrakt VWR

HPLC-H2O Merck

HTD Sigma

Ionenaustauscher Bio Rad

Isopropanol Roth

Kaliumchlorid (KCl) Merck

Kaliumwasserstoffphosphat (KH2PO4) Fluca

Loading Puffer (6 x) PeqLab


145


Magnesiumchlorid (MgCl2) VWR

Methanol Roth

Natriumacetat Merck

Natriumchlorid (NaCl) VWR

Natriumcitrat VWR

Natriumhydroxid-Platzchen (NaOH) Merck

Natriumphosphatdihydrat VWR

Natriumphosphatmonohydrat VWR

NBT (Nitroblau Tetrazoliumsalz) Roche

Paraformaldehyd Sigma

Pepsin Sigma

Pepton (aus Fleisch) VWR

Radionuklid (α32P-dCTP) MP Biomedicals

SDS Merck

Sephadex� G-50 Fine Amersham Biosciences

T7-Primer Invitrogen

T3-Primer Invitrogen

Tris Roth

Tween VWR

Vectashield Linaris

Tabelle A.3: Losungen

Losung Inhalt und Arbeitsanweisung

20xSSC � 263 g NaCl + 132,3 g Natrium-Citrat + 1,5 l A. bidest.

� pH-Wert auf 7,0 einstellen, autoklavieren

2xSSC � 20xSSC : A. bidest. = 1 : 10

0,1xSSC � 20xSSC : A. bidest. = 1 : 200

10xPBS � 80 g NaCl + 2 g KCl + 11,5 g Na2HPO4-(dihydrat) +

1,5 g KH2PO4 mit A. bidest. auf 1 l auffullen

� pH-Wert auf 7,0 einstellen, autoklavieren


146


1xPBS � 10xPBS : A. bidest. = 1 : 10

MgCl2 1M � 203,3 g MgCl2 mit A. bidest auf 1 l auffullen, autokla-

vieren

Ethanol-HCl-

Lagerungslosung (Eises-

sig)

� 350ml Ethanol (100%) + 10ml HCl + 640ml A. dest.

RNase-Stammlosung � 10mg RNase A in 1ml 2xSSC losen

� 10min im kochenden Wasserbad inkubieren

� 100�l Portionen aliquotieren, Lagerung bei -20 ◦C

RNase-Gebrauchslosung � 0,25�l RNase-Stammlosung + 100�l 2xSSC

Pepsin 10% � 1 g Pepsin mit 10ml A. bidest. auffullen

� 50�l aliquotieren, Lagerung bei -20 ◦C

Pepsin 0,005% � 1ml 1M HCl auf 100ml mit A. dest. auffullen

� im 37 ◦C Wasserbad erwarmen; kurz vor Gebrauch 50�l

Pepsin 10% dazu

1xPBS/MgCl2 � 5ml 1M MgCl2 + 95ml 1xPBS

Formaldehyd 1% � 5ml 1M MgCl2 + 95ml 1xPBS + 2,7ml Paraformalde-

hyd (37%)

Ethanol 70% � 70ml Ethanol 100% auf 100ml mit A. dest. auffullen

Ethanol 90% � 90ml Ethanol 100% auf 100ml mit A. dest. auffullen

4xSSC/0,2% Tween � 100ml 20xSSC + 1ml Tween + 400ml A. bidest.

Antifade � Dapco : Vectashield = 1 : 1

LB-Medium � 10 g Pepton + 5g Hefe-Extrakt + 10 g NaCl + 0,2 g

NaOH (2 Platzchen)

� mit A. bidest. auf 1 l auffullen, autoklavieren

Chloramphenicol � 20�g Chloramphenicol in 1ml 100% Ethanol losen

� Lagerung bei -20 ◦C

Kanamycin � 1,25 g Kanamycin in 50ml Bidest losen

� steril filtrieren, aliquotieren, Lagerung bei -20 ◦C


147


Chloramphenicol-

Agarplatten

� 250ml LB-Medium + 3,5 g Agar, autoklavieren, auf

60 ◦C abkuhlen lassen

� 100�l Chloramphenicol dazu geben; Platten gießen;

� mit Parafilm verschlossen im Kuhlschrank lagern

Kanamycin-Agarplatten � 250ml LB-Medium + 3,5 g Agar, autoklavieren, auf

60 ◦C abkuhlen lassen

� 500�l Kanamycin dazu geben; Platten gießen;

� mit Parafilm verschlossen im Kuhlschrank lagern

TE (Tris/EDTA) 10/1 � 1ml 1M Tris-HCl (pH7,5) + 20�l 0,5M EDTA +

98,98ml A. bidest.; autoklavieren

Dextransulfat 20% � 2 g Dextransulfat auf 10ml 50% Formamid

� 3 h bei 70 ◦C inkubieren, aliquotieren, Lagerung bei

-20 ◦C

deionisiertes Formamid

(100%)

� 50ml Formamid + 2,5 g Ionenaustauscher (Analytical

grade, Mixed Bed Resin)

� 2 h rollen lassen, aliquotieren, Lagerung bei -20 ◦C

Formamid 50% � 5ml deionisiertes Formamid + 1ml 0,5M Phosphatpuf-

fer + 1ml 20xSSC + 3ml A. dest.

Na-Phosphatpuffer

0,5M

� 0,69 g Na-Phosphat-Monohydrat in 10ml A. bidest.

losen

� 0,89 g Na-Phosphat-Dihydrat in 10ml A. bidest. losen

� beide Losungen mischen, pH 7,0 einstellen, aliquotieren,

Lagerung bei -20 ◦C

5 x Fluorophor-Mix � 5�l dATP + 5�l dGTP + 5�l dTTP + 4�l Cy3-dCTP

� mit A. dest auf 50�l auffullen

Sephadex G50 � 8 g Sephadexin in 100ml TE 10/1 losen

� 1 h bei 60 ◦C inkubieren, uber Nacht bei Raumtempera-

tur quellen lassen


148


Stopp-Mix � 4mg Bromphenolblau + 20mg Dextranblau + 80�l 5M

NaCl + 160�l 0,5M EDTA + 80�l 1M Tris/HCl pH

7,5

DAPI-Losung � 1�l Stammlosung + 1ml4x SSC/Tween

� mit A. dest. auf 4ml auffullen

EDTA 0,5M � 18,61 g EDTA auf 100ml mit A. bidest auffullen; pH8,0

einstellen

3M Na−Acetat � 246,09 g Natriumacetat in 100ml A. dest. losen

Tris-HCl 1M pH7,5 � 121,14 g HCl auf 1 l mit A. bidest. auffullen

� pH7,5 einstellen, autoklavieren

10xTBE-Puffer � 108 g Tris-Base + 55 g Borsaure + 40ml 0,5M EDTA

pH 8,0

� auf 1 l mit A. dest. auffullen

1xTBE-Puffer � 10xTBE : A. bidest. = 1 : 10

10xTAE-Puffer � 48,4 g Tris-Base + 11,42ml Essigsaure + 20ml 0,5M

EDTA pH 8,0

� auf 1 l mit A. dest. auffullen

1xTAE-Puffer � 10xTAE : A. bidest. = 1 : 10

Agarose-Gel 1,0% � 1,0 g Agarose auf 100ml mit 1xTBE auffullen

� kochen bis keine Schlieren mehr zu sehen sind

� 1�l Ethidiumbromid dazu, Gel gießen

Agarose-Gel 1,5% � 1,5 g Agarose auf 100ml mit 1xTBE auffullen

� kochen bis keine Schlieren mehr zu sehen sind

� 1�l Ethidiumbromid dazu, Gel gießen

DEPC-H2O � auf 1 l A. bidest. 1ml DEPC, uber Nacht ruhren, auto-

klavieren

Tris-HCl 1M pH9,5 � 121,14 g HCl auf 1 l mit A. bidest. auffullen

� pH9,5 einstellen, autoklavieren

3M Natriumacetat � 40,8 g in 100ml A. dest. losen, pH5,2 einstellen; auto-

klavieren


149


4% PFA/PBS � 20 g Paraformaldehyd auf 500ml mit 1xPBS auffullen

� uber Nacht auf Heizplatte bei 60 ◦C ruhren

� pH7,4 einstellen, abfiltrieren, aliquotieren, Lagerung bei

-20 ◦C

NaCl 1M � 58,44 g in 100ml A. dest. losen; autoklavieren

PTW � 500ml 1xPBS + 500�l Tween (0,1%)

PBT � 1 g BSA + 500�l Tween, mit 1xPBS auf 500ml auffullen

Puffer I � 100ml Tris-HCl (pH7,5) + 30ml NaCl 1M, mit DEPC-

H2O auf 1 l auffullen

Puffer II = Blocking-

Puffer

� 1 g Blocking-Reagent + 100ml Puffer I

� kochen bis keine Schlieren mehr sichtbar sind, auf Raum-

temp. abkuhlen

Puffer III = NBT � 50ml Tris-HCl (pH9,5) + 10ml NaCl + 25ml MgCl2,

mit DEPC-H2O auf 500ml auffullen

2xSSC/FA � 2xSSC : deionisiertes Formamid = 1 : 1

Antikorper-Verdunnung

1:5000

� 2�l AP-konjugierte Anti-DIG Fab-Fragmente + 10ml

Puffer II

Antikorper-Verdunnung

1:100

� 10�l AP-konjugierte Anti-DIG Fab-Fragmente + 1ml

Puffer II

Substratlosung � 45�l NBT + 35�l BCIP in 10ml Puffer III

Denaturierungslosung

= 1,5M NaCl, 0,5M

NaOH (Southern Blot)

� 87,66 g NaCl + 20 g NaOH

� mit A. dest auf 1 l auffullen

20x SDS (Sodium-

Dodecylsulfat)

� 20 g SDS + 100ml A. dest.

Waschpuffer 1 =

2x SSC, 0,05% SDS

(Southern Blot)

� 100ml 20xSSC + 2,5ml 20x SDS


150


� mit A. dest. auf 1 l auffullen

Waschpuffer 2 =

0,1x SSC, 0,1% SDS

(Southern Blot)

� 5ml 20x SSC + 5ml 20x SDS

� mit A. dest. auf 1 l auffullen

Entwicklerlosung � 0,5 l Entwicklerkonzentrat + 1,75 l A. dest.

Fixiererlosung � 0,4 l Fiexiererkonzentrat + 1,6 l A. dest.

alle Losungen fur die Maus-in-situ-Hybridisierung werden nicht mit A. bidest sondern

mit DEPC-H2O angesetzt

Tabelle A.4: verwendete Kits

Kit Hersteller

DNA Sequencing Kit BigDye�-Terminator Cycle Sequencing

ready Reaction

Applied Biosystems

Expand Long Template PCR-System Roche

Expand Long Range dNTPack Roche

DIG-Nick-Translation Mix Roche

Expand 20kbP lus PCR System, dNTPack Roche

Ready-To-Go� DNA Labelling Beads (-dCTP) Amersham Biosciences

QIAprep� Plasmid Purification Mini Kit Qiagen

QIAprep� Plasmid Purification Midi Kit Qiagen

Express-Hybridisierungslosung Clontech

QIAquick� PCR Purification Kit Qiagen

QIAquick� Gel Extraction Kit Quiagen

DyeEx� 2.0 Spin Kit Qiagen

qPCR Master Mix Eurogentec

Taq-DNA-Polymerase (5U/�l) Invitrogen

DIG-Oligonucleotide Tailing Kit, 2nd Generation Roche

GC-Rich PCR-System Roche

TOPO TA Cloning� Kit pCR� 2.1-TOPO�Vector Invitrogen


151

Kit Hersteller

DIG-RNA Labeling Mix Roche

Human Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel I Clontech

Human Fetal Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel Clontech

Human Adult Normal Tissue cDNA Panel Neural 2 BioChain

Human Fetal Normal cDNA Panel Tissue Neural BioChain

Tabelle A.5: Langenmarker

Langenmarker Hersteller

1 kb-Ladder New England BioLabs

1 kb Plus-Ladder Fermentas

pUC-mix 8 Fermentas

λ/HindIII-Marker Fermentas

Tabelle A.6: Enzyme

Enzym Hersteller

Antarktische Phosphatase I (5U/�l) New England BioLabs

Exonuclease I (20U/�l) New England BioLabs

NotI New England Biolabs

SpeI New England Biolabs

BbsI New England Biolabs

BstXI New England Biolabs

KpnI New England Biolabs

NsiI New England Biolabs

XmnI New England Biolabs

DNAseI, RNAse-free (10U/�l) Roche

RNase A Roche

RNase Inhibitor (40U/�l) Roche

Superscript TM II (200U/�l) Fermentas

T3-RNA-Polymerase Invitrogen


152

Enzym Hersteller

T7-RNA-Polymerase Invitrogen

Tabelle A.7: verwendete Taqman-Sonden

Bezeichnung Produkt-Nr. Hersteller

ST5 Hs00373572 Applied Biosystems

β2-Mikroglobulin (B2M) 4726319E-0508005 Applied Biosystems

RNA-Polymerase II (RPII) Hs00172187m1

POLR2A

Applied Biosystems

Actin beta (ACTB) 4352668-0605005 Applied Biosystems

Hypoxanthin Phosphoribosyl-Transferase

(HPRT)

4326321E-0501006 Applied Biosystems

A.3 Gerate

Tabelle A.8: Gerate

Gerat Hersteller

Autoklaven Melag, Webeco, Schembera

Kuhl- und Gefrierschranke Siemens, Liebherr

Thermo-Cycler MJ Research, Thermo Fischer Biosciences

Mikrowelle Panasonic

Elektrophorese-Netzteile Bio-Rad (Power Pac 300)

Elektophoresekammer MWG Biotech

Gel-Kamme PeqLab

Gel-Schiffchen MWG Biotech

UV-Licht MWG Biotech

Geldokumentations-Kamera Kaiser

masch. Aufreinigung Tecan (MiniPrep 75)

Sequenzierer Applied Biosystems (ABI3730)

Tischzentrifuge Eppendorf


153

Gerat Hersteller

Brutschrank Heraeus

Zentrifugen Heraeus, Eppendorf

Schuttel-Inkubator Heraeus

Sterile Werkbank Gelaire (BSB6A)

Kuhlfalle Savant (Refrigerated Condensation Trap

RT100)

Speed Vac Savant (SVC100)

Lichtmikroskop Olympus (BH-2)

Fluoreszenz-Mikroskop und CCD-Kamera Zeiss (Axioplan 2)

Kryostat Microm (HM 560)

Hybridisierungsofen Bachofer GmbH

MZ16 Mikroskop Leica

DC300 Kamera Leica

Real-Time-Cycler Applied Biosystems (ABI Prism 7900 HT

Sequence Detection System)

Heizblock Eppendorf

Magnetruhrer Janke und Kunkel Labortechnik

ph-Meter Wissenschaftliche Technische Werkstatten

Photometer Pharmacia Biotech (Ultraspec III)

Kuvette Implen

Waage Sartorius

Vortexer Janke und Kunkel Labortechnik

Pipetten Dunn (8-Kanal-Pipette), Gilson (P2, P20,

P200, P1000), Eppendorf (Easypet 4420)

Szintillationsmessgerat Berthold

Wasserbader GFL, Memmert, Julabo, Lauda ecoline

154

A.4 Software

Tabelle A.9: Software

Software Hersteller

Primer 3 http://frodo.wi.mit.edu/

SeqEdit DNA Star

Sequencing Analysis Applied Analysis

Seqmen DNA Star

Chromas Version 2.23 Technelysium

Isis Metasystems

IM-Software Version 1.20 Leica

ABI PRISM R 7900 HT SDS V2.1.1 Applied Biosystems

Vector NTI Advance 10 Invitrogen

Tabelle A.10: Datenbanken

Datenbank Internet-Adresse

Map Viewer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/

NCBI BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

NCBI PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db

OMIM http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM

UCSC BLAT http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start

UCSC Genome Browser http://genome.ucsc.edu/

Allen Brain Atlas http://www.brain-map.org/welcome.do

Swiss Prot http://us.expasy.org/sprot/

155

Anhang B

Cycler-Programme

Tabelle B.1: Exp-LT65-12min

Step Temperatur Dauer/Anzahl

1 94 ◦C 2min

2 94 ◦C 10 s

3 65 ◦C 30 s

4 68 ◦C 12min

5 Go to Step 2 10x

6 94 ◦C 10 s

7 65 ◦C 30 s

8 68 ◦C 12min + 12 s/cycle

9 Go to Step 6 25x

10 68 ◦C 7min

11 10 ◦C 10min

12 End

156

Tabelle B.2: Cx32-LT


1 94 ◦C 2min

2 94 ◦C 20 s

3 65 ◦C - 1 ◦C/cycle 30 s

4 68 ◦C 6min

5 Go to Step 2 9x

6 94 ◦C 20 s

7 55 ◦C 30 s

8 68 ◦C 8min + 20 s/cycle

9 Go to Step 6 35x

10 68 ◦C 30min

11 15 ◦C 15min

12 End

157

Tabelle B.3: TDL64-58


1 94 ◦C 3min

2 94 ◦C 30 s

3 64 ◦C 1min

4 72 ◦C 1,5min

5 Go to Step 2 2x

6 94 ◦C 30 s

7 62 ◦C 1min

8 72 ◦C 1,5min

9 Go to Step 6 2x

10 94 ◦C 30 s

11 60 ◦C 1min

12 72 ◦C 1,5min

13 Go to Step 10 2x

14 94 ◦C 30 s

15 58 ◦C 1min

16 72 ◦C 1,5min

17 Go to Step 14 35x

18 72 ◦C 20min

19 10 ◦C 15min

20 End

Tabelle B.4: Exo-Verd


1 37 ◦C 15min

2 80 ◦C 15min

3 15 ◦C 15min

4 End

158

Tabelle B.5: BD55-2min


1 96 ◦C 10 s

2 55 ◦C 10 s

3 60 ◦C 2min

4 Go to Step 1 24x

5 10 ◦C 15min

6 End

Tabelle B.6: qRT-PCR-Programm


1 50 ◦C 2min

2 95 ◦C 10min

3 95 ◦C 15 s

4 60 ◦C 1min

5 Go to Step 3 45x

6 End

159

Anhang C

Primer

Tabelle C.1: Primer ST5 -Gen

Exon

ST5 -Gen

Primer vorwarts

Primer ruckwarts

Fragment-

lange

Annealing

Temp.

e2 caaattagctcacactcctccgta

ttccaaaatccacggtttctct

761 bp 62 ◦C

e3a1b 1 ggaaaaagatgctgagttctgtaa

aagggcttctgtccaaataacc

343 bp 60 ◦C

e3a1b 2 cttcaccccagaatcctcaaga

tctctccacacatgctcatcct

336 bp 62 ◦C

e3a1b 3 atccgggagaagatatcagcat

aggacctgttcaattttctggat

386 bp 61 ◦C

e3a2 2 gtccccctgcagctctgaaaag

actgggcttactcttggggttctt

589 bp 65 ◦C

e3a3 ccagagagggaaggcagtggt

gactgcgacccatcctacaatctg

382 bp 65 ◦C

e4 ctgtcacttccatctcctctttca

agccttccaaaaataaaggaaagg

781 bp 62 ◦C

e5 gcagaagccattctctttgg

aaaagcctgagtggaagctg

363 bp 60 ◦C


160

Exon

ST5 -Gen

Primer vorwarts

Primer ruckwarts

Fragment-

lange

Annealing

Temp.

e6 caggtgtttttagcctctgctt

gaaatgcttatgtgtgcggata

771 bp 60 ◦C

e7b cagggatgggctcctactca

catttcctggcagggctcta

290 bp 62 ◦C

e8c gtagagatccatcccctgtgag

attgttctggtatctggcctgt

292 bp 60 ◦C

e9 cgtggatgttcgtgtattctagtc

aagcacattgagaggttctttctt

757 bp 60 ◦C

e10 gagatcatgcccgctagtcagt

actcaggtgcccacgctatg

296 bp 63 ◦C

e11 tcaccccacgtgaaaatgac

caggaagcataacataggatttca

300 bp 62 ◦C

e12 aggcttaaagtcttcctccactaga

tcacaggtggttttctcatctaag

300 bp 60 ◦C

e13 gctagcctggtcagatgctt

acccccaaagactacgacctt

327 bp 60 ◦C

e14b agcaggttggaaggggaaag

acttgctgattcgcttgtgg

319 bp 63 ◦C

e15c agcctccagcgagctctaagt

cacaagtaagatcccagcacct

314 bp 61 ◦C

e16b ttaccaggctcttatcctttctcc

ttaccaggctcttatcctttctcc

297 bp 61 ◦C

e17 gcagatagagggacctgctaagtt

cagagcaccactttcatcatatcc

781 bp 62 ◦C

e18 cacaagaaagcaagcttccaga

agcttgtgcatagccttgtgaa

858 bp 62 ◦C

e19 2 tttttggcatctgtgctccatggtt

tgttctgtctacagccccagt

308 bp 60 ◦C

161

Tabelle C.2: Primer Long-Range PCR

Long-Range

Fragment

Primer vorwarts

Primer ruckwarts

Frag-

ment-

lange

Annea-

ling

Temp.

RP5 906P16 F3 aattctcctaaaacttgcatctctcacttg

acctgatgcactcctacagaagaaattaaa

8,73 kb 63 ◦C

RP5 906P16 F4 tatttaaaaaggctccaccaaaatttcttt

gagatgacagcatttcaggagaatttactt

11,89 kb 63 ◦C

RP5 906P16 F5 gaaggcaaggacactggtctttattcta

ctgatccaaaccttcagtaaagtctgct

10,07 kb 63 ◦C

RP5 906P16 F5 2 gaaggcaaggacactggtctttattcta

gtctttggttactgatccaaaccttcag

10,08 kb 63 ◦C

RP11 152H18 F1 aggatttagccagatggtatttttaacctg

gagctgactgctcttagagatagggaga

12,17 kb 63 ◦C

RP11 152H18 F2 atgggacttagggtgatggagataaag

actgagctgtgactaatcccacttattttc

13,43 kb 63 ◦C

RP11 152H18 F3 aggataggaaggtccattcttagaggtg

caagaaaaacactgggagagaagtgaat

12,59 kb 63 ◦C

RP11 152H18 F4 tatgcatggttggtgtttggtgtatatt

ttagatcattagggctcaatttcccttt

15,89 kb 63 ◦C

RP11 152H18 F5 actccttagtggaggtaagtttccttgc

ttgatcaccactttgttttagctgagag

21,37 kb 63 ◦C

RP11 152H18 F6 gagctcctgtaccttgcttttgtaaaga

ttcacaaaattccatctgaaagaagtga

15,22 kb 63 ◦C

RP11 152H18 F7 agatgtaaagctggatttgtgtaaaagc

ctaagaatggaccttcctatcctagagc

13,86 kb 63 ◦C

RP11 152H18 F8 tatgtgagaaacaactagatttcctttgg

ttgcattagagaacagtgaactattaggg

14,55 kb 63 ◦C

RP11 152H18 F9 ctgtaacacatggagttaaacattaagtgg

accataaatacaaaaggtcatcagtctagc

17,59 kb 63 ◦C

162

Tabelle C.3: Primer fur Bruchpunktuberspannende PCR

Primer-

Name

Sequenz Primerlange Annealing

Temp.

BP20 F 1 agaaggagcataagataacctcccttgc 28 bp 66,6 ◦C

BP20 F 2 gagattgaagctaagtccacctcatagc 28 bp 64,7 ◦C

BP20 F 3 ccttgcttgtcttgtagtctgaagagc 27 bp 64,9 ◦C

BP20 F 4 gtgacaaccctacattgcacactaagc 27 bp 65,9 ◦C

BP20 F 5 gctaggctagaacagaaagcagagatcc 28 bp 65,9 ◦C

BP20 F 6 cagcagtattgagaaagtctctgtgtgc 28 bp 65,6 ◦C

BP20 F 7 atcccaactcttagctacaggactgatcc 29 bp 66,7 ◦C

BP20 F 8 agaccatctcttgaccatctcttgagc 27 bp 66,3 ◦C

BP20 F 9 gagggaggtatttactgagggaataggg 28 bp 65,9 ◦C

BP20 F 10 ctctatcttccctctcttcttgctctgg 28 bp 66 ◦C

BP20 F 11 gaagctaatactttcagcagcctctgg 27 bp 65,6 ◦C

BP20 F 12 ctgagtcctaagatgctgcagaaaagc 27 bp 66,6 ◦C

BP20 F 13 tctcctacctgtctcttcctttctttcc 28 bp 65,4 ◦C

BP20 F 14 gagatccacctactaagggctttctgg 27 bp 66,3 ◦C

BP20 F 15 caaacctacaggaagcctcttaatcacc 28 bp 66 ◦C

BP20 F 16 tctctcaggtgagaatgaccataactcc 28 bp 66 ◦C

BP20 F 17 ttcaagatgtgcctgcattccatacg 26 bp 69,8 ◦C

BP20 F 18 acatgtagtcctcaagaaggtcaagc 26 bp 63,2 ◦C

BP20 F 19 gaagatccctctaggacagaagtgatgc 28 bp 66,6 ◦C

BP20 F 20 ctgtctggacaggaaacctctgtcg 25 bp 67,6 ◦C

BP20 F 21 ctgcaagccaagaagagagg 20 bp 60,3 ◦C

BP20 F 22 aactgttatgtgtggggatagc 22 bp 58 ◦C

BP20 F 23 gtggatgttttcctgtgatgg 21 bp 59,4 ◦C

BP20 F 24 gaggggtgacagagtcttgc 20 bp 59,8 ◦C

BP20 F 25 gatgggacgagagagaaagc 20 bp 59 ◦C

BP20 F 26 tagactccagcttgcagacc 20 bp 58,2 ◦C

BP20 F 27 tagtgtcgagtccccagagg 20 bp 60,3 ◦C


163

Primer-

Name


Temp.

BP20 F 28 gagtctgtgagcacgaagagc 21 bp 60,4 ◦C

BP20 R 1 agggaggttatcttatgctccttcttcc 28 bp 65,9 ◦C

BP20 R 2 catgaaactcctgagcaaggtaatgg 26 bp 66 ◦C

BP20 R 3 ctgactcatccaatgcaggtgaagc 25 bp 68,3 ◦C

BP20 R 4 aggaagggagagatgagttgagtgagg 27 bp 67,3 ◦C

BP20 R 5 gtgaacagtgcaactatgaggctatgg 27 bp 66 ◦C

BP20 R 6 ctttctcaatactgctgggtgtctaacc 28 bp 65,3 ◦C

BP20 R 7 atacatggctatggagtaaggagcaagc 28 bp 66,4 ◦C

BP20 R 8 aactccagggtagactagaccagagagc 28 bp 65,6 ◦C

BP20 R 9 ccaaactagatgcaccctgattagacc 27 bp 66 ◦C

BP20 R 10 ggactcgtgggaattacagtagaaaacg 28 bp 66,7 ◦C

BP20 R 11 ctcccttctaagccagtcttctgagc 26 bp 66 ◦C

BP20 R 12 agacttttagagctggagacaccacacc 28 bp 67 ◦C

BP20 R 13 ctgggttctataggatttccctgtatcc 28 bp 65 ◦C

BP20 R 14 gagaggtgaacaaagagagtgtgagagc 28 bp 66,1 ◦C

BP20 R 15 agaggcttcctgtaggtttgtaatgtgg 28 bp 66,5 ◦C

BP20 R 16 cctcaccacttttcttagttgtgcttcc 28 bp 67 ◦C

BP20 R 17 ggaatgaataaatctcaaagaacaataacc 30 bp 62,4 ◦C

BP20 R 18 tcctagagggatcttctcatcttaattgg 29 bp 65 ◦C

BP20 R 19 tatcccctattccattagcttgtgttcc 28 bp 66 ◦C

BP20 R 20 ttgaggactacatgttaaggcattgagg 28 bp 66,3 ◦C

BP11 F 1 ctacctttccacctagtcttccatctcc 28 bp 65,7 ◦C

BP11 F 2 cagtcacaggtggttttctcatctaagc 28 bp 66,3 ◦C

BP11 F 3 gactagaatacacgaacatccacgaagg 28 bp 66 ◦C

BP11 F 4 tgtaggaagggaaagaagataggacagg 28 bp 65,8 ◦C

BP11 F 5 cctgttctctaagtgctccaaagatccc 27 bp 65,6 ◦C

BP11 F 6 agtagactcagcatcgtatgcaggtagc 28 bp 66 ◦C

BP11 F 7 gggacttcttggtcttccctactagacc 28 bp 66,4 ◦C

BP11 F 8 caactcttagctctttcacaccctaccc 28 bp 66,3 ◦C


164

Primer-

Name


Temp.

BP11 F 9 gcactatcttttacccacagctactcagg 29 bp 66,1 ◦C

BP11 F 10 ctgagaccttgacttgtttctaccttgg 28 bp 65,5 ◦C

BP11 F 11 tggtgatagggagtggtatgttaactgg 28 bp 66 ◦C

BP11 F 12 gtgacagtatagtgacccaacagtgtgc 28 bp 66 ◦C

BP11 F 13 gcctatcatcattcttccccatctagg 27 bp 66,7 ◦C

BP11 F 14 tttgtgtatctagtgccagcagagaacc 28 bp 66,3 ◦C

BP11 F 15 gctaatatgcgtaactgcctctctaccc 28 bp 66 ◦C

BP11 F 16 aaagaagcccaagaaactccatctcc 26 bp 66,8 ◦C

BP11 F 17 gacattttctcaggccagttttcagg 26 bp 67 ◦C

BP11 F 18 aggttagaaacacagatgcctactcacc 28 bp 65 ◦C

BP11 F 19 tcttctgcctaatggtcagc 20 bp 58 ◦C

BP11 F 20 gcttaagagaccccaagaaacc 22 bp 60,5 ◦C

BP11 F 21 cgtaaaatggaccaatcagc 20 bp 58 ◦C

BP11 F 22 catggtttttgccatatttgc 21 bp 60,2 ◦C

BP11 F 23 gcaggagaattgcttgaacc 20 bp 59,8 ◦C

BP11 R 1 gaactggtttctcaccctagttttcagg 28 bp 66,2 ◦C

BP11 R 2 tacaatggcttgtcctaaggatgtaccc 28 bp 66,8 ◦C

BP11 R 3 cttcgtggatgttcgtgtattctagtcc 28 bp 66 ◦C

BP11 R 4 ctgtctgagaactccttggactctttgc 28 bp 67,7 ◦C

BP11 R 5 cttatgcaagactaacatcccagagtgg 28 bp 66 ◦C

BP11 R 6 tccttgggaatacttatcctcctacacc 28 bp 65,4 ◦C

BP11 R 7 tggtctagtagggaagaccaagaagtcc 28 bp 66 ◦C

BP11 R 8 tgaaggcagaaagaggagttaagagacc 28 bp 66,2 ◦C

BP11 R 9 tactcgagatgcttcctagaatccaacc 28 bp 66,6 ◦C

BP11 R 10 ctccacagcttcttcactatgaaactcc 28 bp 65,6 ◦C

BP11 R 11 accactcccatacaccatcactaaaacc 28 bp 66,2 ◦C

BP11 R 12 tgagcagaattgcttaggagagtagtgg 28 bp 66 ◦C

BP11 R 13 ccctagatggggaagaatgatgatagg 27 bp 66,6 ◦C

BP11 R 14 cctagtcagctacatccctcaaaaatgc 28 bp 66,9 ◦C


165

Primer-

Name


Temp.

BP11 R 15 catggagttaaacattaagtgggaaagc 28 bp 64,8 ◦C

BP11 R 16 aacttaaggaatgaggagagatggatgg 28 bp 65,7 ◦C

BP11 R 17 gttcaagcaattctcctgcctcagc 25 bp 68,4 ◦C

BP11 R 18 cttggcataaaatagtgttcctgaaagg 28 bp 65 ◦C

BP11 R 19 tttcttaatttcattttcagattgttcg 28 bp 62 ◦C

Tabelle C.4: Southern-Blot Sonden

Southern-

Sonde

Primer vorwarts

Primer ruckwarts

Fragment-

lange

Annealing

Temp.

SF1 ggtcaatgctcctcctgacc

agccatgtgctgaaatgtgg

442 bp 62 ◦C

SF2 ggcctttggtccttaaatgc

ctttctctctcgtcccatcg

400 bp 60 ◦C

SF3 gctttactgcctaggctgaag

cctacaaaggaccagagagc

383 bp 60 ◦C

SF4 gaccataaggccaacaaagc

aagtgctcctgactgaaatcg

364 bp 60 ◦C

SF5 gcctcttctggaacacaagc

tgggacatgaggcatctagg

335 bp 60 ◦C

Tabelle C.5: Oligonukleotid-Sonden fur Maus-in-situ-Hybridisierung

Oligo-Sonde Sequenz Oligolange

mst5p1as cgtggcaaacgatggctcttcctttctgaccagttcccac 40 Nukleotide

mst5p2as gatggcaggctcagctgagccaacagcatcatgtcatcatg 41 Nukleotide

mst5p3as ctttctaggtaacagtgtgtcctcgtcgtccatctgtc 38 Nukleotide

mst5p2s catgatgacatgatgctgttggctcagctgagcctgccatc 41 Nukleotide

166

Tabelle C.6: Primer fur cDNA-Sonden fur Maus-in-situ-Hybridisierung

cDNA-Sonde Primer vorwarts

Primer ruckwarts

Fragment-

lange

Annealing

Temp.

mst5 cDNA1 ggagactgtgggtcactactcc

aatatggtgaaggcagaagtgg

448 bp 60 ◦C

mst5 cDNA2 agtacgaggctgacaagaatcc

ttaagtccacatcctcgtaggg

336 bp 60 ◦C

mst5 cDNA3 cctgcagctcagaaaagacc

ggaggtagaccattgcttgg

598 bp 60 ◦C

Tabelle C.7: rt-PCR Primer

rt-PCR Fragment Primer vorwarts

Primer ruckwarts

Frag-

ment-

lange

Annea-

ling

Temp.

rtPCRiso2e2 4 aacaagaattccagcatcacc

caaggagttctcagacagttgc

293 bp 60 ◦C

rtPCRiso2e4 7 tgagaactccttggactctttgc

cctctcttggcattgtagatgg

276 bp 60 ◦C

rtPCRiso2e17 19 acagggagctaagaaagtgtcg

gaaacttcatccatgctctgg

438 bp 60 ◦C

rtPCRiso1e5 6 aacaagaattccagcatcacc

tcccatgctgatatcttctcc

498 bp 60 ◦C

167

Anhang D

Nachtrag Ergebnisse

Tabelle D.1: Weitere Sequenzabweichungen

Position Patient(en) Veran-

derung

AS-Austausch

bzw. Position

bekannt

g.80285 15 Patienten MR1-Platte

12 Patienten MR2-Platte

17732

C�G p.Pro80Ala nein



6 Gaumenspaltenpatienten

23/30 sonstigen Patienten

G�C p.Lys316Asn rs3794153

g.81046 23107, CLP352/3

Kontroll-DNA K3

G�A p.Ala334Thr nein



CLP352/3

15/30 Sonstigen Patienten

C�G p.Asp399Glu rs3812762



G�A IVS4+18(g+a) nein

g.84906 6 Patienten MR1-Platte C�T IVS4-221(c+t) rs7110224


168


derung

AS-Austausch

bzw. Position

bekannt




A�T IVS4-66(a+t) rs7128811

g.93392 3 Patienten MR1-Platte G�C IVS5-52(g+c) nein

g.95402 D09-MR1 G�C IVS6-119(g+c) rs884188

g.95508 B06-MR1 + Mutter C�A IVS6-10(c+a) nein

g.96552 E03-MR1 T�A IVS7-78(t+a) nein



20084

G�A IVS8+111(g+a) rs931757



20084, 23107

C�T IVS8-73(c+t) rs931756

g.98501 A12-MR1, F8-MR2,

B10-MR2

A�G IVS9-100(a+g) nein

g.99946 B05-MR1 T�C IVS10-124(t+c) nein



C�T IVS13+48(c+t) nein

g.103662 E06-MR2, B11-MR2 G�A IVS13+103(g+a) nein


20084

T�C IVS13+267(t+c) rs3752849

g.104014 7 Patienten MR1-Platte A�T IVS13-97(a+t) nein

g.108600-

02



20084, 13183, 25164, 18031,

30754

Del. CAT IVS14-

14 16(delCAT)

nein

g.112143 C06-MR1 A�C IVS16+20(a+c) nein


CLP4/3, 20084

G�T IVS16-94(g+t) rs2270958


169


derung

AS-Austausch

bzw. Position

bekannt

g.113621 5 Patienten MR1-Platte C�T IVS17-79(c+t) nein

g.114649 B05-MR1 Insertion

A

IVS18-21(ins a) nein



C�G IVS19+367(c+g) rs2134309




16/30 sonstigen Patienten

G�A IVS20+9(g+a) rs2270956

g.115915 19 Patienten MR1-Platte A�T IVS20+42(a+t) rs2270955

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Danksagung

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Andre Reis fur die freundliche Aufnahme am Hu-

mangenetischen Institut und Frau Prof. Dr. med. Anita Rauch fur die Uberlassung des

interessanten Themas, fur die Unterstutzung und die geduldige Betreuung meiner Arbeit.

Fur die stetige und engagierte Hilfe und fur die vielen wertvollen Tipps und Tricks im

Laboralltag danke ich Frau Michaela Kirsch, Frau Brigitte Dintenfelder und Frau Dr.

rer. nat Cornelia Kraus. Desweiteren mochte ich Frau Dr. rer. nat. Sabine Endele fur die

ausdauernde Hilfe bei der Tissue-in-situ-Hybridisierung und Herrn Dr. rer. nat. Andreas

Tagariello fur die motivierte und geduldige Unterstutzung beim Southern Blot danken.

Außerdem mochte ich mich bei allen Mitarbeitern des Humangenetischen Instituts fur die

Hilfsbereitschaft, die andauernde moralische Unterstutzung und ”Aufbauarbeit“ sowie fur

die vielen unvergesslichen Momente im Labor bedanken. Insbesondere sind dabei Herr Dr.

med. Christian Thiel, Frau Dr. med. Christiane Zweier, Frau Dr. med. Juliane Hoyer, Herr

Dr. rer. nat. Arif B. Ekici, Frau Angelika Diem, Frau Heike Friebel und Frau Petra Rothe

zu nennen.

Weiterhin gilt mein Dank Denny Schanze, der insbesondere am Ende der Arbeit geduldig

meine Launen ertrug und mir immer hilfreich zur Seite stand sowie meinen Eltern, die mir

eine Hochschulausbildung ermoglicht haben und mich sowohl wahrend meiner Schul-, als

auch wahrend meiner Studienzeit immer unterstutzt und ermutigt haben.

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Lebenslauf

Personliche Daten

Name Ina Gohring

Anschrift Luitpoldstr. 15

91054 Erlangen

Geburtstag 7. Juli 1980

Geburtsort Neuhaus am Rennweg

Eltern Gabriele und Gunther Gohring

Nationalitat Deutsch

Familienstand ledig

Kinder keine

Schulausbildung

09/1987 - 07/1991 Grundschule, Haselbach, Thuringen

09/1991 - 07/1999 1. staatliches Gymnasium, Sonneberg, Thuringen

Abschluss: Abitur (Zeugnis der allgemeinen Hochschulreife)

Hochschulausbildung

10/1999 - 11/2005 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-Alexander

Universitat Erlangen-Nurnberg

09/2001 arztliche Vorprufung (Physikum)

09/2002 Erster Abschnitt der arztlichen Prufung (1.Staatsexamen)

08/2004 Zweiter Abschnitt der arztlichen Prufung (2.Staatsexamen)

11/2005 Dritter Abschnitt der arztlichen Prufung (3. Staatsexamen)

Aktuelle Tatigkeit

seit 01/2006 Wissenschaftliche Angestellte am Humangenetischen Institut

des Universitatsklinikums Erlangen, Friedrich-Alexander

Universitat Erlangen-Nurnberg

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Positionsklonierung eines neuen Gens für syndromale ... · 1 Kapitel 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung eines neuen Gens für