1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Posibilidades de la Instrumentación Actual

en UHPLC.

Regina Orenga

regina_orenga@non.agilent.com

APORTACIONES CLAVE DE LA UHPLC

Page 2

• 1290/1260/1220: La importancia con gradientes de concentración de

Trabajar a FLUJOS ELEVADOS para ganar RESOLUCIÓN.

Doblar flujo en gradientes DOBLAR LA CAPACIDAD DE

SEPARACIÓN DE PICOS

• 1290/1260/1220 FLEXIBILIDAD: trabajar como UHPLC o HPLC’s

incluso con columnas 4.6mm d.i. a flujos elevados

• 1290/1260/1220 Facilidad de transferencia de métodos de HPLC

(/UHPLC) de equipos antiguos.

• Reducir Tiempos de Análisis SIN reducir Resolución/Capacidad de

Separación de picos.

Reducir X 10/20 (1260/1290) veces con respecto a 5µm

• Aumentar la Resolución/Capacidad de Separación de picos SIN

incrementar tiempo de Análisis.

Página: 3

1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Modelo

UHPLC

Pres. Máx

bars

“Máxima” Longitud

Columna UHPLC cm Rango d.i.

Columna mm

“Delay

Volume”

Bomba

µL

Flujo

máx. mL/min

1.8µm (TP)** Poroshell-120 2.7µm (SP)**

1220 binario

1260 cuaternario 600 10 (15) cm 15 (20) 3-4.6 (16) 600-900 10

1260 binario 600 10 (15) cm 15 (20) 2.1-4.6 (8) 120 /600-800 5

1290 cuaternario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (16) <350 10

1290 binario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (8) 10 / 45 5

¿Qué UHPLC Agilent se Adapta Mejor a Sus

Necesidades/ Presupuesto?

+

-

Coste

• La selección del cromatógrafo depende del

diámetro y longitud de las columnas de UHPLC

que se quieran utilizar.

The Agilent 1200 Infinity Series HPLC

Page 4

Low-

Flow LC

Prep-

Scale LC

1200 Infinity Series

1220 Infinity

Isocratic, manual

Gradient, manual

Gradient, automated

1260 Infinity

Low-flow

Cap.LC

Nano-LC

Chip-LC

Analytical flow

Binary

Binary-SFC

Quaternary

Quaternary Bio-Inert

Isocratic

Prep-flow

Isocratic

Binary

1290 Infinity

Binary

Quaternary

Agilent 1200 Infinity Series HPLC Raising the Standard in HPLC – UHPLC for EVERY Lab

Page 5

1260

Infinity LC

Modular

600 bar, 5ml/min

80 Hz

2x or 10x UV Sensitivity

100% HPLC Compatible

HPLC Price – UHPLC Capability

1220

Infinity LC

Integracromatográfique

s ted

600 bar, 5ml/min

80 Hz

Most affordable

HPLC and UHPLC

1260/1290 Technology

1290

Infinity LC

Modular

1200 bar, 5ml/min

160 Hz

1st Universal LC by ISET

Highest Performance

HPLC Service Costs

The Agilent 1200 Infinity Series - Power range

Page 6

0

200

400

600

800

1000

1200

0 2 4 6 8 10

All analytical columns

Method Transfer

Higher Resolution

Faster Analysis

More viscous solvents

Lower temperatures

Semi-prep

1290 Infinity LC

1260 Infinity Quat./Iso LC

1220 Infinity LC

pressure

flow

1260 Infinity Binary LC

1260 Infinity Bio-inert HPLC Infinitely Better for Bio-molecule Analysis

Page 7

100% Bio-inert

• Metal-free sample flow path (instrument and column)

• Stainless steel–free solvent flow path

• Widest pH range (1-13, short-term 14)

600bar power range

• From lowest pressure up to highest pressure STM

columns

Semi prep 10ml/min

When is this instrument recommended??

1260 Infinity Bio-inert HPLC

What´s new compared to our standard

1260 Infinity Quaternary LC

Pump titanium based, no corrosion

Active Seal included.

Autosampler metal-free

Capillaries and connections metal-free

Detector Flow Cell metal-free

pH-range 1-13, shortterm pH 14

Advantatges:

•Wide pH range

• High salt tolerance

• Lowest surface activity

Bio-Inertness, no passivation

needed

8

600 bar (UHPLC) high

resolution Bioseparations

Target Applications Biologic Characterization

Size Exclusion: Aggregate Analysis

Reverse Phase:

Separation of Intact Biologics/Variants

Peptide Mapping:

Post-translational modifications

Ion Exchange: Separation of Isoforms

9

Agilent 1290

Infinity LC El UHPLC

infinitamente

mejor para

cubrir todas

sus

necesidades en

LC y LC/MS

1290 Infinity: ¿Qué aporta al mundo del UHPLC?

1290 Infinity NO solo es un equipo capaz de

proporcionar unos rangos mayores de Flujo y de

Presión…

1290 Infinity es un equipo INNOVADOR

1290 Infinity incorpora grandes avances en todos sus

módulos, que una vez más, marca la diferencia

tecnológica.

Tecnología Bombas 1290 Infinity UHPLC

- Máxima Potencia y Robustez

Bombas UHPLC 1290 Infinity Robustez y alta capacidad de disipación de calor

Nuevo material del pistón: SSiC*

(Carburo de silicio sintético). Proporciona Mejor Conductividad térmica y menor

fricción para menor desgaste.

Permite una optima disipación de calor

• Mayor presión x flujo (1200bar at 2 ml/min)

• Alarga el tiempo de vida de los sellos/ intervalos de

mantenimiento (>150L)

• Un solo sello para fase normal y reversa

Capilares Multi-Capa para un óptimo

intercambio de calor entre los

cabezales de las bombas.

SSiC*: Material cerámico de alta

dureza formado por Carburo de Silicio sintético.

Volumen Embolada variable (patentado)

menor desgaste y mejores prestaciones.

1290 Infinity Bomba Binaria: nuevo diseño La siguiente generación en Tecnología de Bombas UHPLC

Mezclador

“Jet Weaver“

µ-Desgasificador

Válvula de

Purga

automática

Canal

B Canal

A

Válvula de selección

de 4 disolventes

Gradientes binarios

Pistones de

Carburo de Silicio

Bombas

de alta

resolución

Alta velocidad y resolución

1200 bar @ 2.0 mL/min

1000bar @ 3.5ml/min

800 bar @ 5.0 mL/min

Volumen muerto: 10 µl / 45 µl

Amortiguador electrónico de pulsos

Procesador de doble núcleo

dedicado al control de pulsos

Motores de 300 picolitros

por paso (0.0003µL)

Largos intervalos de mantenimiento

Corrección Automática Fugas

> 150 Litros de disolvente

Automatismo

Purga automática

4 Motores de alta

precisión:

independientes

para cada pistón

Intercambiador

de calor

multicapa

- How to achieve lowest delay volume, lowest noise and highest RT precision?

Page 15

1200 Series

Solvent A

Passive Damper

180-580 µl

Passive Mixer

400 µl

1200 Series

Solvent B

1290 Inifinity

Solvent A

1290 Inifinity

Solvent B

Very Good Noise

~ 800 µl

+ = Active Damping

< 5µl

Microfluidic Mixing

35µl

5 µl / 40µl DV:

80x / 20x lower

Lowest Noise

< 50%

1290 Infinity LC – Delay Volume and Mixing Noise

1290 Infinity Binary Pump Amortiguación electrónica de pulsos

Page 16

O

N

OF

F

Motor del Pistón

1290

Inifinity

Chanel

A

1290

Inifinity

Chanel

B

• Motores independientes

para cada pistón-> minimas

oscilaciones en la linea de base

• Pasos de 300 picolitros

HPLC

1200

UHPLC

1290

Agilent Jet Weaver: Nuevo sistema de mezclado

Mezclador de alta eficacia.

PLACA ACERO INOXIDABLE CON MICROCANALES DE 35µl de volumen

Tecnología:

• Tecnología Propietaria de Microfluidos Multi-capa.

• Bandas de difusión de acero con estructuras de

(100x120µm)

La mas alta eficiencia de mezcla con el mínimo

volumen para un bajo nivel de ruido

• V=35 µl, para aplicaciones UV estándar.

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Los 3 Puntos Cruciales para conseguir las máximas prestaciones en una

bomba cuaternaria con mezclado a baja presión:

1. Conocer y tener muy bien caracterizados los eluyentes utilizados.

La Historia de la Bomba Cuaternaria 1290

Infinity es una Historia sobre EXACTITUD!!

La Historia de la Bomba Cuaternaria 1290

Infinity es una Historia sobre EXACTITUD!!

Los 3 Puntos Cruciales para conseguir las máximas prestaciones en una bomba

cuaternaria con mezclado a baja presión:

1. Conocer y tener muy bien caracterizados los eluyentes utilizados.

2. Disponer de una bomba inteligente – Amortiguación Activa – con una

bomba de alta resolución (~300 pL por paso del motor)

3. Nuevo mezclador InletWeaver basado en la super-eficiente tecnología Jet

Weaver:

La Bomba Cuaternaria 1290 Infinity ofrece la mayor exactitud y precisión en

todo tipo de aplicaciones.

Premezcla el eluyente

antes de entrar en el

cabezal de bombeo

Mezclador opcional

situado después del

cabezal de bombeo (sólo para condiciones

muy críticas- p.e. TFA)

Bomba Cuaternaria 1290 Infinity Herramientas que proporcionan sus elevadas Prestaciones

1. 4-channel

Degasser

2. MCGV (Multi-

Channel-

Gradient-Valve)

3. Inlet-Weaver

4. Pump Head

5. Multi-Purpose-

Valve

6. In-line Filter

7. Switchable Jet

Weaver Mixer

8. Bomba peristáltica

lavado pistones

9. Sensor presión

10. Sensor de fugas

disolvente

1

2 3

4

4

5

6

7

10

8

9

Válvula Multifunción para la Mayor Comodidad

y Flexibilidad

Purga Automática (controlada por software)

Válvula Multifunción para la Mayor Comodidad

y Flexibilidad

Filtrado eluyentes en línea para proteger columna

en aplicaciones con volumen de retardo estándar

Válvula Multifunción para la Mayor Comodidad

y Flexibilidad

Lavado Automático del filtro en

contracorriente (backflush)

Válvula Multifunción para la Mayor Comodidad

y Flexibilidad.

Mezclado Extra para el mínimo rizado/ruido de la línea de base

en las aplicaciones más exigentes (TFA como modificador)

Bomba Cuaternaria 1290 Infinity: BlendAssist

(Asistente de Mezclas)

Heramienta de software para la dilución en línea de tampones y

modificadores:

• Mejora la reproducibilidad de los tiempos de retención (inter-día).

• Facilita la programación del gradiente con diferentes concentraciones a

partir de soluciones stock.

Water Water

1% TFA

ACN

ACN

1% TFA

Ejemplo 2 Métodos con distinto % modificador:

1. 5 to 95% gradiente de ACN con 0.1% TFA en Agua y

0.08% TFA en ACN.

2. 20 – 80% gradiente de ACN con 0.5% TFA en Agua y

0.4% TFA en ACN.

Sin BlendAssist: se deben preparar manualmente los 4

eluyentes requeridos o programar complejos gradientes

(%A, B, C, D).

Con BlendAssist:

1. Definir el factor de dilución de las soluciones stock.

2. Programar un sencillo gradiente binario

orgánico/acuoso!!

29-11 m

1290 Infinity Cuaternario: Asistente Preparación

Mezclas “On-line: BlendAssist*”

* BlendAssist standard incluido en bombas 1290 Cuartenarias. Opcional “BlendAssist Pro“ con funciones adicionales

Heramienta de software para la dilución en línea de tampones y modificadores:

Mejora la reproducibilidad y Facilita la programación del gradiente.

BlendAssist calculará

el factor de dilución

necesario,

Programar un sencillo

gradiente binario

Bomba Cuaternaria 1290 Infinity Conclusiones

Más Amplio Rango de Potencia: hasta 1200 bars (a 2mL/min) y hasta

10ml/min de flujo máximo.

La Mejor Precisión y Exactitud de Composición del mercado,

independiente del disolvente y en todo el rango de composiciones, flujos

y presiones.

Todo tipo de aplicaciones con prestaciones tipo bombas binarias con

mezclado a alta presión.

Blend Assist dilución en línea de soluciones stock de modificadores/

tampones

ISET-ready! (emulación de otras bombas)

Menor precio que la bomba binaria 1290 Infinity.

La máxima Flexibilidad!

Costes de operación y mantenimiento similares a bombas de HPLC.

1290 Infinity Compartimento Columnas Termost.

- Mejora en Facilidad de uso y Versatilidad:

New prolonged HX-carrier

with 3rd hand (not shown)

New valve drive and valve head

Nueva guía Capilares

New leak funnel

modified lowdisp HX

New door-open sensor

RFID-tag, stores

type, pressure

range, valve

switches

Nuevo Aislamiento

Térmico:

fácil cierre del

compartimento

Nuevas válvulas ALta Presión: 2PS/6PT, 2PT/10PT and 9PT/8PS. Rápido intercambio de

distintas válvulas

1290 Infinity UHPLC: Infinitas Soluciones !!! - Automatización Flexible

29

Desarrollo de métodos y Multi-Métodos

• Hasta 3 compartimentos de Columna

para un máximo de 8 Columnas, 26

Solventes y 6 zonas de temperatura.

• MD: ChromSword and AutoChrom

• Multi-Métodos: ChemStation, EZAccess

Regeneración Automática de Columna

• 2000 muestras/día con inyecciones

superpuestas y offline data analysis

Preparación de muestra “Online“

• Enriquecimiento

• …….

Soluciones 1290 Infinity LC - 2000 muestras/día usando ACR (Reg. Aut. de Columna)

• Análisis y Regeneración de columna

simultáneos con válvula de 2

posiciones / 10 puertos

• Tiempos de ciclo más cortos y mayor

capacidad de análisis de muestras para

laboratorios de HT y desarrollo de

métodos

• Respuestas más rápidas en los

controles de calidad durante la fase de

producción o de liberación de producto

acabado

La Solución: Fibra no recubierta (sílice fundida)

1290 Infinity Diode-Array Detector Mejora Sensibilidad x10 “versus” Detectores 1200-VWD/DAD

- Comparación celdas “Max-Light High Sensitivity vs 1200-VWD“

1200-VWD (10 mm x σ Vol.: 14 µL)

S/N: 253

Muestra: Antraceno, 835 pg/µL

Col.:: 4.6x150mm ZORBAX SB C18, 5 µm

Fase móvil: Agua/Acetonitrilo = 20/80

Flujo: 1.5ml/min

Detección 251nm, PW >0.1min,

Volumen inyección : 5µl

Temp. columna: 40°C

Celda “Max-Light High Sensitivity“ (60 mm x σ Vol.: 4 µL)

S/N: 2944

Technical Note: 5990-5326EN

mD

LFr

24

42

V2

V

Mayor Sensibilidad: hasta x10 veces. Sin aumento de la dispersión del pico

1290 Infinity Diode Array Detector - How the optics work

Deuterium lamp

Max-Light cartridge cell

Programmable

slit

1024 element

diode-array

Grating Mirror

Max-Light Cartridge Cell - Optofluidic waveguides

High Light Transmission due to Total-Internal Reflection (TIR) principle

(~ 100 % Light efficiency)

Non-coated fiber (fused silica)

Benefits: Highest Sensitivity (S/N) with small cell volumes (dispersion effects)

More reliable and robust peak integration (automated) due to

nearly no Refractive Index and thermal effects (solvent temperature)

Cartridge design for ease of use

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Optofluidic Waveguides

• Long path length

• Small cell volume

• High light transmission Highest S/N

Rango Dinámico x30 con HDR-DAD Combina 2 DAD‘s con celdas Max-Light de 3.7 mm y 60 mm

60 mm path-length

3.7 mm path-length

Computing the signals from 60 mm path-length for the low concentration

3.7 mm path-length for the high concentration

Detector Signal

[AU/cm]

Conc

[µg/mL] 10 x higher

sensitivity

~3x higher upper

limit

30x lower Limit of Detection

(LOD)