PORÓWNANIE METOD SPEKTRALNYCH W ANALIZIE ŻELAZA W PRÓBKACH PORÓWNANIE METOD SPEKTRALNYCH W ANALIZIE ŻELAZA W PRÓBKACH KRWI I MOCZUKRWI I MOCZU

Pracownia Teoretycznych Podstaw Chemii Analitycznej

KIEROWNIK: prof. dr hab. Ewa BulskaKIEROWNIK: prof. dr hab. Ewa BulskaOPIEKUN: mgr Eliza KurekOPIEKUN: mgr Eliza Kurek

CEL PRACY:CEL PRACY:Optymalizacja warunków pomiarowych FAAS, GFAAS i Optymalizacja warunków pomiarowych FAAS, GFAAS i ICP MS przy oznaczaniu żelaza w próbkach klinicznychICP MS przy oznaczaniu żelaza w próbkach klinicznych

Marzena DębskaMarzena Dębska

ATOMOWA SPEKTROMETRIAATOMOWA SPEKTROMETRIA ABSORPCYJNAABSORPCYJNA

OBIEG ŻELAZA W ORGAIZMIE CZŁOWIEKAOBIEG ŻELAZA W ORGAIZMIE CZŁOWIEKA

Żelazo jest mikroelementem niezbędnym do prawidłowego Żelazo jest mikroelementem niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania organizmów żywych. W organizmie człowieka spełnia funkcjonowania organizmów żywych. W organizmie człowieka spełnia ono kilka istotnych funkcji:ono kilka istotnych funkcji: jest nośnikiem tlenu,jest nośnikiem tlenu, bierze udział w przenoszeniu elektronów, bierze udział w przenoszeniu elektronów, wchodzi w skład wielu ważnych wchodzi w skład wielu ważnych biologiczniebiologicznie związków. związków.

Często zapotrzebowanie na żelazo jest znacznie większe aniżeli Często zapotrzebowanie na żelazo jest znacznie większe aniżeli jego dzienne spożycie. Konsekwencją niedoboru żelaza są liczne jego dzienne spożycie. Konsekwencją niedoboru żelaza są liczne schorzenia i dysfunkcje organizmu takie jak: anemia czy upośledzenie schorzenia i dysfunkcje organizmu takie jak: anemia czy upośledzenie sprawności układu immunologicznego. Zarówno niedobór jak i nadmiar sprawności układu immunologicznego. Zarówno niedobór jak i nadmiar żelaza jest szkodliwy dla organizmu. Nadmiar tego pierwiastka prowadzi żelaza jest szkodliwy dla organizmu. Nadmiar tego pierwiastka prowadzi do marskości wątroby, cukrzycy, niewydolności krążenia, do marskości wątroby, cukrzycy, niewydolności krążenia, hemochromatozy, a w skrajnych przypadkach do śmierci. Przytoczone hemochromatozy, a w skrajnych przypadkach do śmierci. Przytoczone fakty stanowią istotny czynnik w konieczności kontroli poziomu żelaza w fakty stanowią istotny czynnik w konieczności kontroli poziomu żelaza w organizmie człowieka.organizmie człowieka.

ATOMOWA SPEKTROMETRIA ABSORPCYJNA Z ATOMIZAJĄ W PIECU ATOMOWA SPEKTROMETRIA ABSORPCYJNA Z ATOMIZAJĄ W PIECU GRAFITOWYM (GFAAS)GRAFITOWYM (GFAAS)

Zależność absorbancji od temperatury rozkładu termicznego

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550

temperatura [ oC ]

Abs

orba

ncja

Zależność absorbancji od temperatury atomizacji

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500

temperatura [ oC ]A

bsor

banc

ja

SPEKTROMETRIA MAS Z JONIZACJĄ W PLAZMIE INDUKCYJNIE SPEKTROMETRIA MAS Z JONIZACJĄ W PLAZMIE INDUKCYJNIE WZBUDZONEJWZBUDZONEJ

Dobór warunków pracy komory DRC

GAZ REAKCYJNY: HEL

GAZ REAKCYJNY: AMONIAK

Optimizing Nebulizer Gas Flow

0

1 000 000

2 000 000

3 000 000

4 000 000

5 000 000

6 000 000

0,64 0,72 0,8 0,88 0,96 1,04

Przepływ gazu reakcyjnego [ml/min]

Inte

nsy

wn

ość

[li

czb

a jo

nó

w/s

]

Optimizing Nebulizer Gas Flow

0

100 000

200 000

300 000

400 000

500 000

600 000

700 000

800 000

0,64 0,69 0,74 0,79 0,84 0,89 0,94 0,99 1,04

Przepływ gazu reakcyjnego [ml/min]

Inte

nsy

wn

ość

[li

czb

a jo

nó

w/s

]

Do oznaczania żelaza w próbkach klinicznych wykorzystano Do oznaczania żelaza w próbkach klinicznych wykorzystano płomieniową atomową spektrometrię absorpcyjną (FAAS), atomową płomieniową atomową spektrometrię absorpcyjną (FAAS), atomową spektrometrię absorpcyjną z atomizacją w piecu grafitowym (GFAAS) spektrometrię absorpcyjną z atomizacją w piecu grafitowym (GFAAS) oraz spektrometrię mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie wzbudzonej oraz spektrometrię mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie wzbudzonej (ICP MS). (ICP MS).

Optymalizacja programu temperaturowego przeprowadzona została przy użyciu Optymalizacja programu temperaturowego przeprowadzona została przy użyciu roztworu wzorcowego żelaza (50 roztworu wzorcowego żelaza (50 μμg/l), z zawartością albumin (4 g/l) w roztworze g/l), z zawartością albumin (4 g/l) w roztworze buforu Tris-HCl o stężeniu 50 mmol/l i pH=7,4. buforu Tris-HCl o stężeniu 50 mmol/l i pH=7,4.

W celu uzyskania wysokiej czułości oznaczeń żelaza w próbkach klinicznych W celu uzyskania wysokiej czułości oznaczeń żelaza w próbkach klinicznych zoptymalizowano parametry pracy przyrządu oraz sposób rozpylenia próbki przez zoptymalizowano parametry pracy przyrządu oraz sposób rozpylenia próbki przez porównanie pracy rozpylacz zwykłego i rozpylacz typu Babington’a. Ostatnim etapem porównanie pracy rozpylacz zwykłego i rozpylacz typu Babington’a. Ostatnim etapem optymalizacji było porównanie krzywych kalibrowania uzyskanych dla wody i kwasu optymalizacji było porównanie krzywych kalibrowania uzyskanych dla wody i kwasu azotowego.azotowego.

Oznaczanie żelaza metodą ICP MS nastręcza trudności wynikające z Oznaczanie żelaza metodą ICP MS nastręcza trudności wynikające z interferencji pochodzących od jonów CaOinterferencji pochodzących od jonów CaO++ i ArO i ArO++, powodujących zawyżanie , powodujących zawyżanie sygnału, a tym samym otrzymywanie błędnych wyników oznaczenia. W celu sygnału, a tym samym otrzymywanie błędnych wyników oznaczenia. W celu wyeliminowania jonów przeszkadzających zastosowana została komora wyeliminowania jonów przeszkadzających zastosowana została komora reakcyjna (DRC) z helem lub amoniakiem jako gazami reakcyjnymi. reakcyjna (DRC) z helem lub amoniakiem jako gazami reakcyjnymi. Przeprowadzona została optymalizacja komory DRC poprzez badanie wpływu Przeprowadzona została optymalizacja komory DRC poprzez badanie wpływu użytego gazu na otrzymany sygnał żelaza.użytego gazu na otrzymany sygnał żelaza.

PARAMETRPARAMETR OPISOPIS

Długość fali [nm]Długość fali [nm] 248 248

Rodzaj lampyRodzaj lampy Fe:HCLFe:HCL

Prąd lampy [mA]Prąd lampy [mA] 2222

Przepływ gazu [l/min]Przepływ gazu [l/min]

2 (acetylen)2 (acetylen)

15 (powietrze)15 (powietrze)

ATOMOWA SPEKTROMETRIA ABSORPCYJNA Z ATOMIZAJĄ W ATOMOWA SPEKTROMETRIA ABSORPCYJNA Z ATOMIZAJĄ W PŁOMIENIU (FAAS)PŁOMIENIU (FAAS)

PODSUMOWANIE :PODSUMOWANIE :

SPEKTROMETRIA MAS

SCHEMAT APARATURY AAS

SCHEMAT UKŁADU ICP-DRC-MS

Optymalne parametry pracy FAAS parametry pracy FAAS

Otrzymane doświadczalnie optymalne parametry pracy GFAAS Otrzymane doświadczalnie optymalne parametry pracy GFAAS

ETAPETAP TEMPERATURA [TEMPERATURA [°° C]C]

SUSZENIESUSZENIE 110110

130130

ROZKŁAD TERMICZNYROZKŁAD TERMICZNY 14001400

ATOMIZACJAATOMIZACJA 21002100

WYPALANIEWYPALANIE 24502450

•Optymalny sygnał dla żelaza otrzymano według programu Optymalny sygnał dla żelaza otrzymano według programu temperaturowego zamieszczonego w tabeli – temperaturowego zamieszczonego w tabeli – „„Otrzymane Otrzymane doświadczalnie optymalne parametry pracy GFAAS” doświadczalnie optymalne parametry pracy GFAAS” •Ze względu na wyższą czułość pomiaru do analizy próbek Ze względu na wyższą czułość pomiaru do analizy próbek klinicznych wykorzystany zostanie rozpylacz typu Babington’aklinicznych wykorzystany zostanie rozpylacz typu Babington’a•Zarówno hel jak i amoniak mogą być stosowane w układzie Zarówno hel jak i amoniak mogą być stosowane w układzie ICP-DRC-MS jako gazy reakcyjne w celu wyeliminowania ICP-DRC-MS jako gazy reakcyjne w celu wyeliminowania jonów wieloatomowych przeszkadzających w analizie żelazajonów wieloatomowych przeszkadzających w analizie żelaza

Cell Gas A

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2

Przepływ gazu reakcyjnego [ml/min]

Inte

ns

yw

no

ść

[li

czb

a j

on

ów

/s]

Cell Gas A

0

100 000

200 000

300 000

400 000

500 000

600 000

700 000

800 000

0,10 0,45 0,80 1,15 1,50 1,85 2,20 2,55 2,90

Przepływ gazu reakcyjnego [ml/min]

Inte

nsy

wn

ość

[li

czb

a jo

nó

w/s

]

Krzywa kalibracji w 1% kwasie azotowym i 0.1% Tritonie

y = 0,067x + 0,0011

R2 = 0,9997

y = 0,0612x + 0,0003

R2 = 0,9997

-0,01

0,01

0,03

0,05

0,07

0,09

0,11

0,13

0,15

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Stężenie [mg/l]

Ab

sorb

an

cja

nebulizer typu Babington nebulizer zwykły

Krzywa kalibracji w wodzie

y = 0,0566x - 0,0002

R2 = 1

y = 0,0608x + 0,0002

R2 = 0,9999

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Stężenie [mg/l]

Ab

sorb

an

cja

nebulizer typu Babington nebulizer zwykły

W ostatnich latach metoda ICP MS jest szeroko W ostatnich latach metoda ICP MS jest szeroko wykorzystywana do oznaczania pierwiastków śladowych w różnych wykorzystywana do oznaczania pierwiastków śladowych w różnych rodzajach próbek. Charakteryzuje się niską granicą wykrywalności rodzajach próbek. Charakteryzuje się niską granicą wykrywalności (pg/ml), szerokim zakresem liniowości wskazań i możliwością analizy (pg/ml), szerokim zakresem liniowości wskazań i możliwością analizy wielopierwiastkowej. Poważny problem stanowią jednak interferencje wielopierwiastkowej. Poważny problem stanowią jednak interferencje pochodzące od głównych składników próbki powodujące pochodzące od głównych składników próbki powodujące zafałszowanie wyników.zafałszowanie wyników.

Spektrometria absorpcyjna z atomizacją w piecu grafitowym jest Spektrometria absorpcyjna z atomizacją w piecu grafitowym jest coraz powszechniej stosowana w analizie próbek klinicznych, w coraz powszechniej stosowana w analizie próbek klinicznych, w szczególności płynów fizjologicznych. Zaletą metody jest niewielkie szczególności płynów fizjologicznych. Zaletą metody jest niewielkie zużycie próbki (zużycie próbki (µµl) i wysoka czułość. l) i wysoka czułość.

Płomieniowa spektrometria absorpcyjna (FAAS) jest równie Płomieniowa spektrometria absorpcyjna (FAAS) jest równie często wykorzystywana w analizie próbek biologicznych, cechuje się często wykorzystywana w analizie próbek biologicznych, cechuje się krótkim czasem analizy, małym kosztem eksploatacji oraz krótkim czasem analizy, małym kosztem eksploatacji oraz możliwością uzyskania dużej czułości dzięki wykorzystaniu możliwością uzyskania dużej czułości dzięki wykorzystaniu odpowiednio dobranego rozpylacza.odpowiednio dobranego rozpylacza.