1

Polymerase Chain Reaction

Jean-Michel Cayuela

Laboratoire d’hématlogie

Hôpital Saint-Louis, Paris

DES d’hématologie

21/01/10

La réaction de PCR

MatriceNucléotides triphospates

Amorces sens et antisens

Taq polyméraseMg2+

2

Dénaturation : 95 °C

MatriceNucléotides triphospates

Amorces sens et antisens

Taq polyméraseMg2+

Amorçage : 50 - 60 °C

MatriceNucléotides triphospates

Taq polyméraseMg2+

3

Polymérisation : 72 °C

Cinétique d’apparition du produit

Cycles

Produit

Q = Q0 x EN

point finalPhase initiale

Cycles

Produit

Q = Q0 x EN

point finalPhase initiale

°C

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

1 8 15 22 29 36 43 50 57 64 71 78 15 22 29 36 43 50 57 64 71 7815 22 29 36 43 50 57 64 71 78

plateau

Phase exponentielle

Dénaturation (95°C)

Amorçage (55°C)

Polymerisation (72°C)

4

Establishment of a PCR Laboratory

Kwok and Higuchi, Nature 339: 237-238, 1989.

Aire de préparation des échantillons

Aire Pré-PCR

Aire Post-PCR

Amplification des ARN

• Transformation des ARN en ADNc par transcription inverse

1 µg d’ARN

Reverse transcriptase

+ dATP, dCTP, dGTP, dTTP

+ Mg2+

+ hexamères « random »

ADNc

PCR 1 x 2

PCR 2 x 2

PCR 3 x 2

PCR 4 x 2

PCR 5 x 2

5

Cibles d’intérêt en hématologie oncologique

• Réarrangements géniques– ADN : IG/TCR, Tald, délétions IKAROS, NPM-ALK,

BCL2-JH, BCL1-JH…

– ARN : BCR-ABL1, E2A-PBX1, TEL-AML1, SIL-TAL1, CBFβ-MYH11, AML1-ETO, DEK-CAN…

• ARNm (expression de gènes)– WT1, EVI1, TLX1, TLX3, CCND1…

• Allèles mutés– JAK2, NPM1, FLT3, T315I...

La PCR qualitative

En point final

6

Détection des transcrits BCR-ABL au diagnostic d’un SMP/LAL

van Dongen J et al., Leukemia 13, 1901-28, 1999

Détection des transcrits BCR-ABL au diagnostic d’un SMP/LAL

van Dongen J et al., Leukemia 13, 1901-28, 1999

7

Les limites de la PCR qualitative

• Taille des produits d’amplification– 100 pb à 1 kb– Long Range PCR : 10 kb

• Variabilité des cibles : FISH > PCR– inv(16)(p13q22)– Translocations MLL-X

• Polymorphisme ou mutations somatiques dans les régions d’amorçage– Faux négatifs

Transcrits

CBFββββ-MYH11,

inv(16)

FISH > PCR

8

Meyer et al., Leukemia, 23:1490, 2009

Transcrits

MLL-X,

t(11;x)

FISH > PCR

La PCR multiplexe : détection des réarrangements du gène IGH

VH DH JH Cµµµµ

PCR

Recombinaison V-D-J

Amplification jonctionnellein-vitro

germinal

réarrangé

Cδδδδ Cγ3γ3γ3γ3VH DH JH Cµµµµ

PCR

Recombinaison V-D-J

Amplification jonctionnellein-vitro

germinal

réarrangé

Cδδδδ Cγ3γ3γ3γ3

9

La stratégie BIOMED 2

Van Dongen et al., Leukemia (2003) 17, 2257–2317

10

La PCR quantitative

Principe de la quantification par PCR compétitive

Cycles

Produit

N0 N’0

N N’

Si les efficacité d’amplification de la cible et du compétiteur sont identiques alors :

N0/N’0 = N/N’

Cible

Compétiteur

11

RQ-PCR

• Principe :– monitoring de l ’apparition du produit de PCR en

cours d ’amplification par une mesure de fluorescence

• Non spécifique :– sybrgreen

• Spécifique : – sondes fluorescentes (hydrolyse, hybridation,

beacons, etc...)

PCR quantitative en temps réel

avec sondes TaqMan

R Q QR

QR R Q

1- polymérisation 2- déplacement

4- fluorescence3- clivage

5'3'

12

Quantification par RQ-PCR

106 105 104 103 102 101Nombre de copies présentes :

Seuil de positivité

Bruit de fond

Cycles seuil ou Ct 20

23.4

26.8

30.2

33.6

36/38

Courbe de calibration

Cyc

les se

uil o

u C

t

Nombre de copies présentes

Correspondances Ct / Copies : 10 = 23.33

variation d’un facteur 10 # 3.33 Ct

13

reproductibilité

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 5 10 15 20 25 30 35

RQ-PCR runs

Log(

Rat

ios)

High

Int.

Low

343334Number of runs

± 2.3± 2.0± 2.395% CI (fold)

[-1.79 ; -1.05][-0.48 ; 0.13][1.59 ; 2.33]95% CI (Log10)

0.190.160.19SD Log10(Ratios)

-1.42-0.181.96Mean Log10(Ratios)

LowIntHighSamples

A

B

14

Zone de mesure reproductible

• Performance du système de mesure

– Efficacité de la PCR

– >10 copies pour une efficacité maximale

• Quantité de cible maximale

– ADN : nombre de génomes

– ARN niveau d’expression

BCR-ABL

e1a2

TOM1

1 - 10-5

BCR-ABL

e1a2

TOM1

1 - 10-5

Zone de mesure reproductible

15

Gènes de fusion : niveau d’expression au diagnostic

Seuil de détection

• Performance du système de mesure– Efficacité de la PCR

– 1 copie pour une efficacité maximale

• Taille de l’échantillon analysé– ADN : nombre de génome analysés

– ARN : nombre de copies d’un gène contrôle

• Bruit de fond– Transcrits de fusion = 0 (?)

– Transcrits normaux : variable

– PCR allèle spécifique : variable

16

Seuil de détection : WT1

Sai Sa suivi MRD WT1

1,E-04

1,E-03

1,E-02

1,E-01

1,E+00

1,E+01

1,E+02

7/5 27/5 16/6 6/7 26/7 15/8 4/9 24/9

Date de prélèvement

Ratio (

WT1/ABL (

%))

sang seu il sang moelle seuil Moelle seu il techn ique

Seuil de détection BCR-ABLmoelle Seuil NC ABL

11/08/2009 5,7E+01 7,9E-04 1,3E+0514/09/2009 1,8E-02 7,1E-03 1,4E+0418/09/2009 1,0E-02 6,8E-03 1,5E+0422/10/2009 0,0 2,4E-03 4,2E+0419/11/2009 0,0 3,8E-01 2,7E+02

Ber Ar : BCR-ABL IS

1,0E-04

1,0E-03

1,0E-02

1,0E-01

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

11/08/2009

18/08/2009

25/08/2009

01/09/2009

08/09/2009

15/09/2009

22/09/2009

29/09/2009

06/10/2009

13/10/2009

20/10/2009

27/10/2009

03/11/2009

10/11/2009

17/11/2009

moelle

Seuil

17

Seuil de détection BCR-ABLmoelle Seuil NC ABL

11/08/2009 5,7E+01 7,9E-04 1,3E+0514/09/2009 1,8E-02 7,1E-03 1,4E+0418/09/2009 1,0E-02 6,8E-03 1,5E+0422/10/2009 0,0 2,4E-03 4,2E+0419/11/2009 0,0 2,7E-03 3,7E+04

Ber Ar : BCR-ABL IS

1,0E-04

1,0E-03

1,0E-02

1,0E-01

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

11/08/2009

18/08/2009

25/08/2009

01/09/2009

08/09/2009

15/09/2009

22/09/2009

29/09/2009

06/10/2009

13/10/2009

20/10/2009

27/10/2009

03/11/2009

10/11/2009

17/11/2009

moelle

Seuil

Ré-extraction

Normalisation : Gène contrôle

• ADN :

– Gène non délété ni amplifié par oncogénèse

– Dosage génique : résultat en équivalent cellules, 2 copies = 2 génomes = 1 cellule

• ARN :

– Expression non régulée

– Non ciblé par oncogénèse

– Absence de pseudogène

– Niveau d’expression et stabilité comparable à ceux du gène d’intérêt

18

ADN : RQ-PCR Albumine

Fam-5’-GGAGAGATTTGTGTGGGCATGACAGG-3’-tamraSonde

5’-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3’Amorce reverse

5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3’Amorce sense

Laurandeau et al. Clinical Chemistery 45:981-986, 1999

Principe du dosage génique : 2 copie d’Albumine = 2 génomes = 6.7 pgd’ADN = 1 cellule diploïde

Calibration avec une série de dilution au demi d’un ADN de référence à 100 ng/µL.

Echantillon X : Ct à 20 concentration = 50 ng/µL

Une prise d’essai de 5 µL correspond à 250 ng d’ADN soit 37500 cellules

1516171819202122232425

3 6 13 25 50 100

Concentration (ng/µL)

Ct

Gène de contrôle ARN

Beillard et al., Leukemia 17, 2474-86, 2003

19

Qualité des ARN

• Indice de qualitédéfini par rapport du nombre de copie d’un gène de contrôle (ABL1) sur le nombre de copie attendu.

• 100 ng d’ARN de CMNS contiennent 20000 transcrits ABL1 102000

120000

0.1200000

IQNb de copie ABL1

Interprétation d’un résultat faible ou négatif

• Pas de décision thérapeutique sur un seul point

• En dessous de la zone de mesure reproductible

– Interpréter les résultats avec prudence

– Ne pas tenir compte des variations

• Pour les résultats négatifs :

– tenir compte de la qualité/quantité de l’échantillon

– Exiger une qualité optimale si décision thérapeutique

20

EAC strategy for BCR-ABL levelmeasurement

BCR-ABL copy number

Control Gene copy number

%

Gabert J et al., Leukemia 17, 2318-57, 2003

Beillard et al., Leukemia 17, 2474-86, 2003