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GARCÍA-RUIZ ET AL., POLIFENOLES COMO UNA ALTERNATIVA NATURAL AL EMPLEO DE SULFITOS EN ENOLOGÍA, PAG. 1

WWW.INFOWINE.COM – REVISTA INTERNET DE VITICULTURA Y ENOLOGÍA, 2013, N. 7/2

POLIFENOLES COMO UNA ALTERNATIVA NATURAL AL EMPLEO DE SULFITOS EN ENOLOGÍA Almudena GARCÍA-RUIZ, M. Victoria MORENO-ARRIBAS, Pedro J. MARTÍN-ÁLVAREZ, Begoña BARTOLOMÉ* Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL) (CSIC-UAM). c/ Nicolás Cabrera, 9. Campus de Cantoblanco. Universidad Autónoma de Madrid. 28049 Madrid. Tel 910017900- Fax 910017905. E-mail: [email protected] Trabajo presentado en la 8ª edición de Enoforum, Arezzo, Italia, 7-9 mayo 2013 El anhídrido sulfuroso o dióxido de azufre (SO2) presenta múltiples propiedades como conservante en la elaboración de los vinos, entre las que destacan los efectos antioxidante y antimicrobiano, especialmente frente a bacterias lácticas (BAL). Durante la vinificación, es importante controlar el crecimiento de estas bacterias ya que de lo contrario podrían producirse alteraciones de la calidad y seguridad del vino como es la formación de aminas biógenas. A pesar de que el sulfitado constituye un tratamiento indispensable en la tecnología de elaboración y conservación de los vinos, en los últimos años, existe una tendencia a reducir progresivamente los niveles máximos autorizados de SO2 en los mostos y vinos, debido fundamentalmente a sus posibles efectos perjudiciales para la salud humana, y por razones de protección medioambiental (Santos et al., 2012). Todo ello, junto con la creciente preocupación por parte de los consumidores por el uso de compuestos químicos como conservantes alimentarios, ha promovido un creciente interés en la búsqueda de alternativas totales o parciales, inocuas para la salud, al tradicional uso de SO2 en enología. El empleo de productos naturales, entre los que se encuentran los compuestos fenólicos o polifenoles se muestra como una de las posibilidades más prometedoras, debido a que este amplio grupo de compuestos se caracterizan por mostrar un efecto dual como antimicrobianos y antioxidantes (García-Ruiz et al., 2008). En el presente trabajo se resumen los resultados de un estudio sistemático sobre el efecto de los polifenoles en el crecimiento y metabolismo de BAL del vino, y de su mecanismo de acción, evaluándose además el posible uso de extractos fenólicos naturales como aditivos antimicrobianos durante la elaboración del vino. En una primera etapa se determinó la actividad antimicrobiana de compuestos fenólicos representativos de las diferentes familias de polifenoles presentes en la uva y el vino (n=18), frente a cepas de BAL pertenecientes a las especies Lactobacillus hilgardii y Pediococcus pentosaceus -ambas consideradas generalmente como especies alterantes del vino-, y Oenococcus oeni -principal especie responsable de la fermentación maloláctica (FML) en la mayoría de los vinos-. Dicha actividad se evaluó mediante la determinación de parámetros de inactivación e inhibición: MIC y MBC, e IC50, respectivamente. Se observó una cierta relación entre la estructura química-actividad antimicrobiana de los polifenoles, que dependía a su vez de la concentración del compuesto así como de las características intrínsecas de cada cepa (García-Ruiz et al., 2009; 2011). Entre las familias de polifenoles estudiadas, destacaron los flavonoles por ser los más activos (valores más bajos de MIC, MBC e IC50), mientras que, por el contrario, los flavanoles no mostraron actividad antimicrobiana. La especie O. oeni resultó la más susceptible al efecto antimicrobiano de los polifenoles del vino/uva. También se determinaron los valores IC50 del metabisulfito potásico y la lisozima -cuyo uso está también autorizado en enología. Los resultados mostraron, por un lado, que los



polifenoles tenían mayor actividad antimicrobiana que la lisozima y, por otro, que los flavonoles se caracterizaban por exhibir mayor capacidad de inhibición que el metabisulfito frente a las cepas de L. hilgardii y P. pentosaceus. Respecto al mecanismo de acción de los polifenoles, las microfotografías obtenidas por microscopía de fluorescencia y electrónica de transmisión, revelaron pérdida de la viabilidad bacteriana y daños en la integridad de la membrana, respectivamente (Figuras 1, 2). Este resultado sugería que en el mecanismo de inhibición de los polifenoles sobre las BAL podrían estar implicadas interacciones hidrofóbicas entre los compuestos fenólicos y la fracción lipídica de la membrana bacteriana, que conllevan a la pérdida de su integridad y posterior muerte celular (Ibrahim et al., 1996).

Figura 1. Microfotografías de epifluorescencia (40x) de P. pentosaceus CIAL- 85 incubada en presencia y ausencia de compuestos fenólicos. A: control, B: incubación con metabisulfito potásico (600 mg/l), C: incubación con kanferol (100 mg/l), D: incubación con trans-resveratrol (300 mg/l) (Tomada de García-Ruiz et al., 2009).

A B

C D



Figura 2. Microfotografías electrónicas de transmisión de P. pentosaceus CIAL- 85 incubada en presencia y ausencia de compuestos fenólicos. A: control (30x), B: incubación con metabisulfito potásico (600 mg/l) (30x), C: incubación con kanferol (100 mg/l) (30x), D: incubación con kanferol (100 mg/l) (100x) (Tomada de García-Ruiz et al., 2009).

En conjunto, estos resultados muestran el potencial empleo de los polifenoles como alternativa al tradicional uso del SO2 durante la vinificación. Sin embargo, a nivel práctico, es inviable pensar en la adición de compuestos individuales (obtenidos por síntesis orgánica) al vino para el control del crecimiento de BAL, y por tanto de la FML. La posible aplicación tecnológica de las propiedades antimicrobianas de los polifenoles, tendría que pasar necesariamente por el empleo de extractos fenólicos obtenidos por procedimientos técnicos y económicamente viables. Si además los extractos proceden de plantas, es decir, tienen la categoría de productos naturales, estaríamos añadiendo un doble atractivo al procedimiento. Por ello, se procedió a ensayar el efecto antimicrobiano de extractos fenólicos vegetales (n=54) frente a BAL (L. hilgardii CIAL-49, L. casei CIAL-52, L. plantarum CIAL-92, P. pentosaceus CIAL-85, O. oeni CIAL-91 y CIAL-96), así como frente a bacterias acéticas (Acetobacter aceti CIAL-106 y Gluconobacter oxydans CIAL-107) enológicas, cuya presencia en el vino siempre está asociada a procesos de alteración. Los extractos ensayados, todos ellos de calidad alimentaria, procedían de diversos orígenes vegetales (incluida la vid), y presentaban diferente composición y contenido fenólico. Los resultados mostraron que los extractos fenólicos tienen un amplio espectro antimicrobiano frente a los microorganismos presentes en el vino, observándose, al igual que en el caso de los polifenoles, una cierta selectividad frente a las bacterias ensayadas. En particular, los extractos de eucalipto y de piel de almendra fueron más activos frente a BAL no O. oeni mientras que los extractos de granada#1, pepita de uva, canela, hollejo de uva y orujo de uva#2 sólo fueron activos

A B

C D



frente a O. oeni, siendo el extracto de taninos de quebracho el más activo frente a ambas bacterias acéticas. En conjunto, estos resultados confirmaban que el efecto inhibidor de los extractos fenólicos dependía de su composición y contenido fenólico (Baydar et al., 2004; Özkan et al., 2004). Finalmente, para confirmar el potencial uso de extractos fenólicos como alternativa al SO2 se hacía necesario demostrar su capacidad antimicrobiana durante la elaboración del vino. Para ello, se desarrolló un procedimiento de vinificación que comprende la adición de extractos fenólicos antimicrobianos de origen vegetal una vez finalizada la fermentación alcohólica (Bartolomé et al., 2011). En concreto, este procedimiento se aplicó en experimentos de FML de vinos tintos (var. Merlot) a escala de laboratorio y durante la crianza en madera de vinos blancos (var. Verdejo) a escala de bodega. En base a los resultados anteriores obtenidos en medio de cultivo, para estos experimentos se seleccionó el extracto hoja de eucalipto. Los experimentos de FML, tanto inoculada como espontánea, realizados a escala de laboratorio sobre vinos tintos elaborados a nivel industrial, mostraron que la adición del extracto de hoja de eucalipto (2 g/L) retrasaba significativamente la FML, tanto espontánea como inoculada, aunque en menor proporción que la adición de metabisulfito potásico (30 mg/L) (Tabla 1). Tabla 1. Porcentaje de ácido málico residual durante la fermentación maloláctica (FML) de los vinos tintos estudiados.

ÁCIDO MÁLICO RESIDUAL (%)

FML INOCULADA FML ESPONTÁNEA

Tras 14 días Tras 19 días Tras 24 días Tras 14 días Tras 19 días

Control <0.03 n.d. n.d. 40 <0.03

+ Extracto de eucalipto

10

<0.03

n.d. 55 <0.03

+ SO2

89 35 <0.03

n.d.: no determinado

Por otro lado, y con el fin de evaluar el impacto organoléptico de la adición de extractos fenólicos sobre los vinos, se procedió a caracterizar la fracción volátil y fenólica de los vinos estudio (García-Ruiz et al., 2013). En comparación con el vino control, los vinos adicionados con extracto de hoja de eucalipto se caracterizaron por presentar un menor contenido en compuestos volátiles (excepto fenoles volátiles) y un alto contenido de ácido gálico, trans-resveratrol y flavonoles, así como una concentración antociánica similar. Esto último indicaba que la adición de extractos fenólicos no induciría cambios en las características del color del vino, ya que los antocianos son los principales responsables del color del vino tinto (Monagas et al., 2005). También es importante mencionar que, en general, los vinos inoculados con el starter maloláctico experimentaron mayores cambios en la composición química que los vinos sujetos a FML espontánea, lo que revelaba una diferente susceptibilidad de las BAL al efecto de los extractos fenólicos antimicrobianos. En conjunto, estos resultados sugerían que la adición de extractos fenólicos durante la elaboración de vino tinto no conllevaría a mayores cambios organolépticos que los producidos durante la FML per-sé.



Finalmente, los experimentos de crianza (6 meses de envejecimiento) de vinos blancos a escala de bodega revelaron una menor carga de BAL en los vinos tratados con el extracto de hoja de eucalipto (0,1 g/L) y SO2 (80 mg/L), que en el vino control (SO2= 160 mg/L) (Tabla 2). Este resultado confirmaba que el empleo de extractos fenólicos durante el envejecimiento aseguraba la estabilidad microbiológica del vino y permitía reducir el contenido de sulfitos en el mismo. Por otro lado, el análisis de la composición volátil y fenólica de estos vinos mostró nuevamente un mayor contenido de fenoles volátiles en los vinos adicionados con extracto de hoja de eucalipto que en los vinos control, así como un mayor contenido de flavonoles. A su vez, los resultados también ponían de manifiesto que el periodo de permanencia en barrica, como era de esperar, tiene un menor efecto sobre la fracción fenólica que sobre la fracción volátil, así como que los cambios observados en la composición volátil de los vinos estudiados se debían en gran medida al efecto de la madera de la barrica y no a la adición de extractos fenólicos antimicrobianos. Por último y con el objetivo de evaluar posibles diferencias en el perfil sensorial de los vinos tratados o no con extracto, se procedió a realizar un análisis sensorial discriminatorio (prueba triangular), en el que se detectaron mínimas diferencias significativas entre los vinos envejecidos en barrica en ausencia de extractos y los vinos tratados con extractos fenólicos. Tabla 2. Recuento de la población de bacterias lácticas (UFC/mL) en el vino de la variedad Verdejo envejecido en acero inoxidable o en barrica de roble en ausencia (control)/ presencia de extracto de eucalipto (0.1 mg/L).

TRATAMIENTO

Acero inoxidable Control Eucalipto#1 Eucalipto#2

UFC/mL (103) 36 115 11 13

En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo confirman el potencial empleo de los polifenoles como alternativa natural al empleo de SO2 en enología, lo que abre nuevas investigaciones y desarrollos tecnológicos en esta línea.

BIBLIOGRAFÍA Bartolomé, B.; García-Ruiz, A.; Cueva, C.; González-Rompinelli, E.; Rodríguez- Bencomo, J.J.; Sánchez-Patán, F.; Martín-Álvarez, P.J.; Moreno-Arribas, M.V. (2011). Procedimiento de elaboración de vino que comprende adicionar un extracto fenólico de origen vegetal con propiedades antimicrobianas frente a bacterias lácticas y/o acéticas. Oficina Española de Patentes y Marcas. ESP201132134. Baydar, N. G.; Özkan, G.; Sagdiç, O. (2004). Total phenolic contents and antibacterial activities of grape (Vitis vinifera L.) extracts. Food Control, 15: 335-339. García-Ruiz, A.; Bartolomé, B.; Martínez-Rodríguez, A.; Pueyo, E.; Martín Álvarez, P.J.; Moreno-Arribas, M.V. (2008). Potential of phenolic compounds for controlling lactic acid bacteria growth in wine. Food Control, 19: 835-841. García-Ruiz, A.; Bartolomé, B.; Cueva, C.; Martín-Álvarez, P.J.; Moreno-Arribas, M.V. (2009). Inactivation of oenological lactic acid bacteria (Lactobacillus hilgardii and Pediococcus pentosaceus) by wine phenolic compounds. J. Appl. Microbiol., 107, 1042-1053 García-Ruiz, A.; Moreno-Arribas, M.V.; Martín-Álvarez, P.J.; Bartolomé, B. (2011). Comparative study of the inhibitory effects of wine polyphenols on growth of different oenological lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol., 145: 426–431



García-Ruiz, A.; Rodríguez-Bencomo, J.J.; Garrido, I.; Martín-Álvarez, P.J.; Moreno-Arribas, M.V.; Bartolomé, B. (2013). Assessment of the impact of the addition of antimicrobial plant extracts to wine. Volatile and phenolic composition. J. Sci. Food Agric., DOI: 10.1002/jsfa.6067. Ibrahim, H.R.; Higashiguchi, S.; Koketsu, M.; Juneja, L.R.; Kim, M.; Yamamoto, T.; Sugimoto, Y.; Aoki, T. (1996). Partially unfolded lysozyme at neutral pH agglutinates and kills Gram-negative and Gram-positive bacteria through membrane damage mechanism. J. Agric. Food Chem., 44: 3799–3806. Monagas, M.; Gómez-Cordovés, C.; Bartolomé, B. (2005). Evolution of polyphenols in red wines from Vitis vinifera L. during aging in the bottle: I. Anthocyanins and pyranoanthocyanins. Eur. Food Res. Technol., 220: 607-614. Özkan, G.; Sagdiç, O.; Baydar, N.G.; Kurumahmutoglu, Z. (2004). Antibacterial activities and total phenolic contents of grape pomace extracts. J. Sci. Food Agric., 84: 1807-1811. Santos, M.C.; Nunes, C.; Saraiva, J.A.; Coimbra, M.A. (2012). Chemical and physical methodologies for the replacement/reduction of sulfur dioxide use during winemaking: Review of their potentialities and limitations. Eur. Food Res. Technol., 234: 1-12.

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