Po-04 Procedimiento de Validacion de Metodos Analiticos

PROCEDIMIENTO DE VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS FISICOQUIMICOS

CODIGO PO-04

VERSION 01

FECHA 21/05/2011

Pgina 1 de 44 DOCUMENTO CONTROLADO

RESPONSABLE DEL PROCESO:

DIRECTOR TECNICO FISICOQUIMICA

ANALISTA FISICOQUIMICA

CONTROL DE CAMBIOS EN EL DOCUMENTO

VERSION

QUE CAMBIA CAMBIOS REALIZADOS Y CAUSA

FECHA DEL

CAMBIO

00

Se agrega en el procedimiento las consideraciones a tener en cuenta

para hacer verificaciones de las validaciones de los mtodos analticos en

el Numeral 6.6. Verificaciones de la validacin. En el procedimiento se

unifican la terminologa empleada para definir el conjunto de actividades

descritas (se cambian trminos de estandarizacin y normalizacin por

validacin en todo el cuerpo del documento).

21/05/2011

AUTORIZACIONES

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

Nombre / Cargo

YECITH SANGUINO PUELLO

Director Tcnico Fisicoqumica

Nombre / Cargo

NORBEY ARIAS AARON

Analista Fisicoqumica

Nombre / Cargo

LOANA ARAUJO PUMAREJO

Representante del Sistema de Gestin de Calidad

Firma y Fecha:26/08/2010 Firma y Fecha: 19/05/2011 Firma y Fecha: 21/05/2011


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1. OBJETIVO

Presentar las directrices para realizar la validacin (Confirmacin) de los mtodos analticos

utilizados en el laboratorio.

2. ALCANCE

Este procedimiento aplica a los mtodos analticos utilizados por el laboratorio Ambiental y

de Alimentos Nancy Flrez Garca en el rea Fisicoqumica y para los cuales se solicite

acreditacin.

3. DEFINICIONES

Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que

caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al

mesurando.

Promedio Aritmtico: Es la suma de los valores registrados en una serie de mediciones

divididas entre el nmero de las mismas.

Desviacin: Se designa con este nombre a la diferencia entre cada una de las

mediciones y el promedio aritmtico.

Desviacin Promedio: Es el promedio aritmtico de todas las desviaciones sin

considerar los signos.

Exactitud: Es el grado de aproximacin entre el valor obtenido experimentalmente y el

valor real o aceptado.

Precisin: Es el grado de aproximacin mutua entre resultados independientes (por

ejemplo valores de medicin) de una muestra homognea obtenidos mediante un

mtodo analtico dado en condiciones establecidas.

Lmite de deteccin del mtodo (LDM): Aquella concentracin del analito que cuando

se procesa a travs del mtodo completo proporciona una seal en el instrumento

significativamente (con una probabilidad del 99%) diferente de la seal de una muestra

blanco o seal de fondo. En el lmite de deteccin todava no se puede cuantifica.

Lmite de cuantificacin del mtodo (LCM): La concentracin por encima de la cual se

puede cuantificar un analito. El lmite de cuantificacin es siempre ms grande que el

lmite de deteccin.

Linealidad: Es la caracterstica de tener una relacin proporcional entre el parmetro

analizado y el resultado deseado. La transformacin matemtica se lleva a cabo por


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medio de una funcin lineal. Esta funcin se puede aplicar solamente en un intervalo de

concentracin limitado, en el cual existe proporcionalidad. Este intervalo (intervalo de

trabajo) debe determinarse.

Intervalo de trabajo: Es el intervalo entre dos concentraciones de un analito en una

muestra, para la cual se podra mostrar, que el mtodo tiene suficiente precisin y

exactitud, y muestra linealidad. No se tiene que llevar a cabo una determinacin del

intervalo de trabajo si ya se mostr linealidad en un intervalo definido.

Sensibilidad: Es una medida del factor de respuesta del instrumento como una funcin

de la concentracin. Normalmente se mide como la pendiente de la curva de calibracin.

Como valor se puede reportar el promedio para las curvas obtenidas en los ensayos de

validacin y en la medicin de muestras, indicando su desviacin estndar.

Blanco (BK): Es un sistema fsico que no contiene muestra real y por consiguiente no

debera contener el analito de inters, pero que debe contener todos los reactivos que

se utilizan en el mtodo de anlisis, y ser sometido a las mismas condiciones y al mismo

procedimiento que las muestras reales y los estndares. En lugar de muestra, el volumen

faltante se completar con agua grado reactivo que deber tener la calidad

recomendada por el mtodo respectivo.

Muestra (M): Para este propsito, el trmino se refiere a cada sistema fsico que sea

sometido al procedimiento de anlisis siguiendo el mtodo que se est estandarizando,

ya sea un Blanco, un Estndar, una Muestra Adicionada, o una Muestra Real

propiamente dicha.

Lmites de confianza: Es un estimado de una desviacin individual mxima del

promedio, dentro del cual deben caer un cierto porcentaje de las dems desviaciones.

Lmites de alarma superior e inferior: Son valores determinados para las cartas de

control y se calculan como 2 veces el valor de la desviacin estndar ms el promedio

de los datos de una sustancia o muestra de control. Cualquier dato que caiga fuera de

los lmites de alarma es seal de que existe algn y se hace necesario tomar acciones

que pueden ir desde el lavado completo del material de vidrio empleado en el anlisis

hasta repetir el anlisis de todo el lote de muestras.

Lmite de control superior e inferior: Son valores determinados para las cartas de

control y se calculan como 3 veces el valor de la desviacin estndar ms el promedio

de los datos de una sustancia o muestra de control. Cualquier dato que caiga fuera de

los lmites de control es reexaminado y se suspenden los anlisis hasta que el sistema

vuelva a estar bajo control. Las acciones van desde el lavado completo del material de

vidrio empleado en el anlisis hasta una nueva calibracin con los estndares.

Mensurando: Magnitud particular sometida a medicin.

Recuperacin: Es la capacidad que tiene un procedimiento analtico para determinar

cuantitativamente una especie qumica que ha sido adicionada a una muestra.


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Validacin: Confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han

cumplido los requisitos para una utilizacin o aplicacin especfica prevista.

Verificacin: Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que se han

cumplido los requisitos especificados.

Valor verdadero convencional (de una magnitud): Valor atribuido a una magnitud

particular, y aceptado a veces por convencin, porque la representa, con una

incertidumbre apropiada, para un fin dado.

Repetitividad (de los resultados de las mediciones): Proximidad entre los resultados

de mediciones sucesivas del mismo mesurando, realizadas bajo las mismas condiciones

de medicin. (Aplicacin de un mismo procedimiento, a un mismo objeto, por el mismo

operador, en intervalos cortos de tiempo, con el mismo equipamiento instrumental, en el

mismo lugar).

Reproducibilidad: Proximidad entre los resultados de mediciones de un mismo

mensurando, realizadas bajo distintas condiciones de medicin.

Precisin intermedia: Magnitud que relaciona la variacin en los resultados observados

cuando uno o ms factores, tales como tiempo, equipamiento, operador, varan dentro de

un mismo laboratorio.

4. RESPONSABLES

El Director Tcnico del rea es el responsable de la aplicacin y supervisin de las

directrices establecidas en este procedimiento.

5. DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM- CITAC Guide QUAM:

2000. Numeral 7.7. (1) DE-339.

American Public Health Association, American Water Work Association and Water

Environment Federation, Standard Methods For the Examination of Water and

Wastewater, 21st Edition. American Public Health Association 1015 Fifteenth Street NW.

Washington, D.C., 2005. DE-208.

La validacin de mtodos analticos. Rius, F. Xavier et al. Departamento de qumica

analtica y qumica organica. Instituto de estudios avanzados. Universidad de Rovira y

Virgili. Tarragona, Espaa. DE-342.


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6. DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO

6.1. PLANEACIN GENERAL DE LA VALIDACIN

Realizar las siguientes actividades para orientar el proceso de la validacin propiamente

dicho:

- Crear un archivo fsico (carpetas) para toda la documentacin generada en el proceso.

Las carpetas debe estar disponibles para su consulta permanente.

- Seleccionar el mtodo para cada analito y por cada matriz.

- Estudiar cada uno de los mtodos de referencia correspondientes a los mtodos a

estandarizar para establecer si se dispone de todos los insumos necesarios.

- Asegurar el conocimiento exacto del funcionamiento de los equipos de medicin

involucrados.

- Definir quienes participarn en las actividades experimentales.

- Establecer el tiempo (semanas o meses) disponibles para realizar la validacin.

Nota: Si al momento de la validacin no se han unificados criterios para los formatos de

captura de datos, los datos primarios pueden ser registrados en un formato libre en el cual se

incluyan las variables de inters e informacin que permita reconstruir claramente las

condiciones de la validacin (fecha, responsable, etc.).

6.2. ACTIVIDADES PRELIMINARES A LA VALIDACIN

Cuando aplique, programar y realizar para el mtodo analtico a validar las actividades

experimentales necesarias que permitan obtener informacin bsica para poder determinar

los atributos de desempeo. Entre las actividades preliminares se deben realizar las

siguientes cuando aplique:

- Determinar el intervalo de concentraciones entre las cuales se puede aplicar el mtodo

analtico. teniendo como criterios: La informacin de la literatura, intereses especficos

(decretos ambientales), ensayos preliminares en el laboratorio. El intervalo de aplicacin

va desde la mnima cantidad detectable (LDI) hasta la concentracin que se podra leer

con la mxima dilucin posible aceptable con las condiciones fisicoqumicas de la

muestra (en lo general no debe ser mayor de 1:1000).

- Determinacin de las matrices de las muestras con las cuales se realizar la validacin

del mtodo.


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- Atributos del mtodo que se pueden determinar con los recursos disponibles.

- Definir las condiciones experimentales especficas no definidas claramente en el mtodo

de referencia, por ejemplo: tiempos de secado, tiempos de enfriamiento, velocidades de

agitacin, volumen de muestra, presiones de succin, tiempo para desarrollo de color,

etc.

- Establecer el mecanismo ms adecuado para calcular el lmite de deteccin del mtodo.

- Establecer las variables instrumentales o metodolgicas particulares del laboratorio que

puedan afectar el proceso de medicin en aquellos aspectos en que no se pueda seguir

estrictamente el protocolo.

- Verificacin y optimizacin de las condiciones y de los parmetros instrumentales,

incluyendo curva de calibracin.

Registrar las conclusiones obtenidas de estos estudios en un solo informe, el cual formar

parte de la validacin.

6.3. METODOLOGA PARA LA VALIDACIN

6.3.1. Recomendaciones generales

- Los experimentos deben ser realizados por los analistas utilizando los mismos equipos y

los mismos reactivos qumicos.

- Disponer de muestras y estndares estables, homogneos y en la cantidad suficiente

para ser utilizados a lo largo del estudio.

- Cada grupo de muestras analizadas se debe considerar totalmente independiente el uno

del otro, aunque las soluciones estndares y las muestras se hayan preparado al inicio

del estudio.

- Analizar en orden aleatorio las muestras definidas.

- Preparar suficiente cantidad de muestras y preservarlas adecuadamente para garantizar

su integridad.

- Analizar por duplicado las muestras de cada lote para disponer de un adecuado nmero

de datos.

6.3.2. Diseo experimental

Para cada mtodo analtico se recomienda preparar 6 lotes de muestras conformados cada

uno de la siguiente manera:

- Un blanco de reactivos (BK) o un patrn con una concentracin baja ( EbC ).


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- Dos estndares de concentracin conocida uno de concentracin baja y otro de

concentracin alta (Ealto, Ebajo). La concentracin se pueden estimar con base en el valor

de C que es el lmite mximo de concentracin del analito para el mbito del mtodo y

definido en la etapa preliminar de la validacin as: Ealto 0,9*C; Ebajo 0,09*C.

- Dos muestras rutinarias, M1 de concentracin baja y M2 de concentracin alta, cuyas

matrices correspondan al inters de la validacin.

- Dos muestras adicionadas (M1+A1 y M2+A2) preparadas para los analitos que aplique.

- Un Material de Referencia Certificado (MRC) o patrn certificado, si est disponible.

Nota 1: El nmero de muestras por lote puede cambiar dependiendo del nmero de matrices

de inters para el laboratorio y de la amplitud del rango de concentracin de inters para

estandarizar.

Nota 2: Este diseo experimental no aplica para la validacin de la Demanda Bioqumica de

Oxgeno, grasas y aceites, su validacin se realiza con base en los lineamientos indicados en

los Anexos 1 y 2.

Nota 3: Este diseo experimental puede ser ms complejo dependiendo del nmero de

equipos disponibles y de analistas que intervengan en el proceso.

Se sebe seguir las siguientes recomendaciones a la hora del desarrollo analtico del diseo

experimental:

- Analizar las muestras de los lotes en forma aleatoria y por duplicado cada una, este

mecanismo permite eliminar los efectos de cambios sistemticos en factores que no

pueden ser controlados y que puedan dar lugar a falsas conclusiones.

- Antes de iniciar el anlisis de los lotes y para los mtodos en que aplique, determinar

primero las condiciones ptimas para obtener las mejores curvas de calibracin, aplicar

estas condiciones para analizar las muestras de los lotes.

- Analizar los seis lotes de muestras en das diferentes, si es posible (de acuerdo con la

estabilidad del analito), en caso contrario analizar los seis lotes durante el tiempo de

estabilidad. Registrar los datos primarios obtenidos en el formato de captura de

informacin diseado para cada mtodo analtico.


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6.3.3. Metas de precisin y exactitud

6.3.3.1. Meta de precisin

El coeficiente de variacin CV mximo aceptable para un grupo de mediciones individuales

es de 10%.

Existe el siguiente criterio alterno para establecer la meta de precisin: La desviacin

estndar mxima aceptable de un grupo de mediciones individuales es el valor

correspondiente al 25% de la concentracin mnima de inters (es decir 0,25*CL, en donde

CL = C/10, siendo C la concentracin mxima de inters o la concentracin mxima del

rango lineal) o el 5% del valor promedio de las mediciones, el que sea mayor. Este criterio

se puede utilizar cuando se estime conveniente.

6.3.3.2. Meta de porcentaje de recuperacin de muestras adicionadas

El rango aceptable de porcentaje de recuperacin de muestras adicionadas es entre el 80% y

el 120%. Este rango puede ser mayor si el estudio estadstico realizado con la Hoja de

Clculo Validar 1.1 HC-02; as lo demuestra, este estudio se basa en el clculo del intervalo

de confianza para una recuperacin del 80% y una del 120%.

Nota: Para verificar el cumplimiento de las metas de precisin y del porcentaje de

recuperacin, se utiliza la Hoja de Clculo Validar 1.1 HC-02; desarrollado por el Instituto

Nacional de Salud-Red Nacional de Laboratorios-Grupo de Red Salud Ambiental (Ver Anexo

3). Este software permite determinar la aceptabilidad de las desviaciones estndares y del

porcentaje de recuperacin para cada nivel de concentracin.

6.3.3.3. Meta de exactitud

El Error relativo mximo aceptable de un grupo de mediciones debe ser inferior al 10%.

Existe el siguiente criterio alterno para establecer la meta de exactitud: El error sistemtico

mximo aceptable expresado como Error absoluto (sesgo) para un grupo de mediciones es

el valor correspondiente al 50% de la concentracin mnima de inters (0,5*CL, en donde CL

= C/10, siendo C la concentracin mxima de inters o la concentracin mxima del rango

lineal) o el 10% del valor promedio medido, el que sea mayor. Este criterio se puede utilizar

cuando se estime conveniente.


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Nota: Para los mtodos que aplique y como un mecanismo alterno para evaluar la exactitud,

se puede utilizar el cumplimiento del criterio establecido para el porcentaje de recuperacin

de muestras adicionadas o el cumplimiento de la prueba de significancia Test de t student.

El porcentaje de muestras adicionadas se utiliza tambin para verificar la trazabilidad del

mtodo analtico.

6.3.3.4. Metas de precisin y exactitud para el anlisis de DBO5

La meta de precisin expresada como desviacin estndar mxima es el 15% de la media

del valor obtenido (segn mtodo 5210 B, Standard Methods). La meta de exactitud

expresada como error relativo es de 15% del valor medido.

6.3.3.5. Metas de precisin y exactitud para el anlisis de pH y conductividad

La meta de precisin expresada como coeficiente de variacin CV mximo aceptable para un

grupo de mediciones individuales es de 10%.

La meta de exactitud expresada como error relativo mximo aceptable es de 5%.

6.4. CLCULO DE LOS ATRIBUTOS DE LOS MTODOS

Para realizar el clculo de los atributos de los mtodos analticos indicados en esta etapa del

procedimiento, tomar como base la Hoja de clculo validacin de mtodos analticos

Fisicoqumicos HC-01; la cual tiene proteccin de acceso del registro electrnico

especificado en el Listado Maestro de documentos RA-01.

Nota: Esta hoja de clculo podr ser ajustada de acuerdo a los equipos o analistas que

participen en el proceso y se le insertarn un nmero de fila segn sea el caso.

6.4.1. Rango de trabajo o rango lineal

Para los mtodos analticos en los cuales se utilice curva de calibracin (por ejemplo

espectrofotomtricos) para obtener la concentracin del analito, determinar el rango lineal

utilizando la curva de Ringbom. Para obtener esta grfica realizar los siguientes pasos:

- Abrir el archivo Excel que contiene la hoja de clculo Validacin de mtodos analticos

para el mtodo de inters, abrir la pestaa Rango lineal.


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- Ingresar la informacin solicitada en la tabla de valores, columnas Concentracin (Las

concentraciones de los patrones deben abarcar desde el blanco hasta el 140% del valor

de la concentracin mxima conocida o estimada para el rango lineal del mtodo) y

Absorbancia. En cada nivel de concentracin realizar por lo menos tres mediciones de

absorbancia para obtener su promedio.

- La grafica de la curva de Ringbom se genera tomando los datos de concentracin de

cada patrn en escala logaritmica (eje x) versus Absortividad (eje y). La Absortividad

(ABST) se calcula aplicando la siguiente ecuacin:

ABST = 100 %T, en donde %T = (1 / 10(A))*100

- Visualmente buscar el conjunto de puntos de la curva de Ringbom en donde se presenta

un comportamiento lineal. Establecer el rango de concentraciones correspondiente para

definirlo como el rango lineal.

- Guardar los cambios antes de cerrar el archivo.

6.4.2. Curva de calibracin y linealidad

A) Curva de calibracin

Para los mtodos analticos en los cuales se utilice curva de calibracin (por ejemplo

espectrofotomtricos) para obtener la concentracin del analito, determinar la curva de

calibracin. Para obtener esta grfica realizar los siguientes pasos:

- Abrir el archivo Excel que contiene la Hoja de clculo Validacin de mtodos analticos

Fisicoqumicos HC-01, para el mtodo de inters, abrir la pestaa Rango lineal.

- Ingresar la informacin solicitada en la tabla de valores, columnas Concentracin

(Patrones definidos en la curva de Ringbom como los pertenecientes al rango lineal) y

Absorbancia correspondiente (por lo menos tres valores de absorbancia para obtener un

valor promedio, en la medida de lo posible los valores de absorbancia ingresados deben

corresponder a curvas de calibracin diferentes preparadas en tiempos diferentes).

- Despus de ingresados todos los datos requeridos, Excel genera la grfica de la curva de

calibracin y calcula los valores del coeficiente de correlacin, de la pendiente, del

intercepto con el eje y, la ecuacin de la curva de calibracin.

La recta de regresin se determina por el mtodo de mnimos cuadrados. La recta de

calibracin es del tipo: Y = bx + a


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Donde:

Pendiente

XX

YYXX b

2

Intercepton

b Y a

X

X: La concentracin de los patrones

Y: Respuesta de los patrones

X : Promedio de las concentraciones de los patrones

Y : Promedio de las respuestas (reas, absorbancias, etc.)

n: Numero de determinaciones

Calcular el coeficiente de correlacin (recomendable que sea mayor a 0.996), retirar los

puntos de la curva hasta obtener el mejor coeficiente de correlacin, como mnimo se deben

establecer 5 puntos para la curva de calibracin.

nCorrelaci de eCoeficient

YY XX

YYXXr

22

Para aquellos mtodos analticos en los cuales se utilice una frmula para obtener la

concentracin del analito (mtodos gravimtricos, volumtricos, etc) y para los cuales sea

necesario demostrar la existencia de relacin lineal entre la concentracin y las seales (por

ejemplo cuando se requieren condiciones analticas diferentes para varios rangos de

concentracin), establecer la linealidad del mtodo para los rangos de concentraciones

definidos calculando el coeficiente de regresin lineal entre las concentraciones de patrones

analizados y la respuesta promedio del equipo de medicin utilizado (por ejemplo volumen

gastado, peso de residuo, etc. y aplicando por lo menos el test de linealidad indicado en el

numeral 6.4.2. B).

B) Test de linealidad (Test del Coeficiente de Correlacin (r)):

El coeficiente de correlacin refleja el grado de relacin entre las variables X (concentracin)

y Y (respuesta).

El valor de r = 1 indica una recta perfectamente lineal, r = 1 una recta perfectamente lineal

de pendiente negativa y r = 0 la no correlacin entre X y Y.


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Valores muy elevados de r no deben tomarse errneamente como indicadores de linealidad,

la linealidad se demuestra estadsticamente por los procedimientos que se describen a

continuacin.

El cuadrado del coeficiente de correlacin se denomina coeficiente de determinacin e indica

la proporcin de la varianza total de la variable independiente Y.

Determinar la linealidad del sistema aplicando el siguiente test estadstico: Despus de

ingresar los valores de Concentracin y absorbancia correspondiente a la curva de

calibracin en la pestaa Linealidad sistema, Excel calcula el valor del t de Student

experimental t exp con la siguiente frmula:

21

2r exp t

r

n

Comparar el valor del t exp con el valor del t de Student de tablas t tablas a dos colas para

un nivel de confianza del 95% y con n2 grados de libertad (p = 0.05, Ver anexo 4), donde n

es el nmero de patrones utilizados para la curva de calibracin.

Evaluar el resultado de este test con base en el siguiente criterio: La hiptesis nula es la no

correlacin entre X y Y. Si el valor de t exp es mayor que el valor de t de tablas se rechaza la

hiptesis, siendo la correlacin lineal significativa. La tabla de Hiptesis para r es la siguiente:

Parmetro Estadstico Valor Obtenido

r

r2

t exp

t tablas (p=0.05, n2 gl) *

CRITERIO:

t exp > t tablas

Por lo tanto, hay correlacin entre la concentracin y la

respuesta

* Se sugiere como mnimo 5 puntos de calibracin, cada uno con tres mediciones de

absorbancia.

C) Test de varianza de la pendiente (b)

A mayor pendiente, mayor sensibilidad (repuesta del mtodo frente a los cambios de

concentracin del analito). La varianza de la pendiente Sb2 se utiliza como expresin

matemtica de la linealidad, a menor varianza mejor linealidad.


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Despus de ingresar los valores de Concentracin y absorbancia correspondiente a la curva

de calibracin en la pestaa Linealidad sistema, Excel calcula la varianza de la pendiente

aplicando las siguientes formulas:

NSS xyxy

/XXXX S

22

,2

2

,2

b

Donde

2 N 1YY 2

2

,2

rS xy

Siendo S2y,x la varianza del error experimental total, varianza residual o varianza de regresin

de Y sobre X debida a la variacin dentro de la serie mas la variacin debida a la falta de

ajuste entre la recta de regresin y los datos experimentales.

Con los datos ingresados, Excel calcula tambin los lmites de confianza de la pendiente as:

b = b t Sb

Determinar la existencia de regresin lineal sistema aplicando el siguiente test estadstico:


de calibracin en la pestaa Curva de calibracin, Excel calcula el valor del t de Student

experimental t exp con la siguiente frmula

t exp = b / Sb

Comparar el valor de t exp con el valor del t de Student de tablas t tablas a dos colas para

n 2 grados de libertad a una probabilidad de 95 % (p= 0,05).

Evaluar el resultado de este test con base en el siguiente criterio: El valor de t tablas debe

ser menor que el t exp, indicando que la pendiente es significativamente diferente de cero y

existe regresin.


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Tabla de Hiptesis para la Pendiente


t exp

b

Sb

t tablas (p=0.05, n-2 gl) *

Limite de confianza Superior

Limite de confianza Inferior

CONCLUSIN

t exp > t tablas

Por lo tanto, la pendiente es significativamente diferente de cero y

existe regresin

* Se sugiere como mnimo 5 puntos de calibracin, cada uno con tres mediciones de absorbancia.

D) Test de la varianza de la ordenada o termino independiente (a)

El valor de a, intercepcin con el eje de ordenadas u ordenadas en el origen, ndica el error

sistemtico del mtodo. En el caso ideal debe ser cero.


de calibracin en la pestaa Linealidad sistema, Excel calcula la varianza del trmino

independiente con base en la siguiente frmula:

N

X Sa

222 bS

La desviacin o error estndar del trmino independiente es calculada por Excel con base en

la siguiente frmula:

Sa = (Sa2)1/2

Los lmites de confianza de la ordenada al origen se calculan as:

a = a t Sa

Siendo t el valor de distribucin de Student para n 2 grados de libertad a una probabilidad

de 0.05.

Evaluar los valores para los lmites obtenidos con base en el siguiente criterio: Si estos

lmites incluyen el cero, se cumple la condicin de proporcionalidad.


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Con los datos ingresados para la curva de calibracin, Excel realiza el siguiente test

estadstico para a, el cual consiste en calcular el valor del t de Student experimental t exp

as:

t exp = a / Sa

Comparar ell valor de t exp con el valor del t de Student de tablas t tablas a dos colas para

n 2 grados de libertad a una probabilidad de 95 % (p= 0,05).

Evaluar el resultado obtenido con base en el siguiente crterio: El valor de t tabulado en

las tablas t tablas debe ser mayor que el t exp indicando que el intercepto no es

significativamente diferente de cero.

Tabla de Hiptesis para a:


t exp

a

Sa

t tablas (p=0.05, n-2 gl) *

Limite de confianza Superior

Limite de confianza Inferior

CRITERIO:

t exp < t tablas

Por lo tanto, el intercepto no es significativamente diferente

de cero

* Se sugiere como mnimo 5 puntos de calibracin, cada uno con tres mediciones de absorbancia.

E) Limites de confianza para la recta


de calibracin en la pestaa Linealidad sistema, Excel realiza calcula los lmites de

confianza para la recta de calibracin con base en la siguiente frmula:

/Sxx)X) - (Xi +(1/n *Sxy * t Yi = Y 2

Donde, Yi : Respuesta corregida

Xi: Concentracin terica

X: Promedio de concentraciones

t: t de Student para n1 grados de libertad y un 95% de confianza


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Tabla Lmites de confianza para la recta

Concentracin Lmite Inferior Lmite Superior y (Xi-X)2

t tabla, n1 gl

Sxy

Sxx

n

6.4.3. Sensibilidad

La sensibilidad indica la capacidad de respuesta de un mtodo analtico a pequeas

variaciones en la concentracin del analito. La sensibilidad entre la seal medida y la

concentracin de analito es igual al valor de la pendiente de la curva de calibracin a una

concentracin determinada.

Nota: El clculo de este atributo solo aplica para mtodos analticos en los cuales se utilice

curva de calibracin para determinar la concentracin del analito.

Para determinar la sensibilidad del mtodo analtico, realizar las siguientes acciones:


Fisicoqumicos HC-01, para el mtodo de inters, abrir la pestaa Rango lineal.

- Ingresar en la Tabla 3, Intervalo de aceptacin para verificacin de curva de

calibracin-Pendiente de curvas la informacin correspondiente al estudio de curvas

de calibracin: nmero de la curva de calibracin, la fecha de realizacin, el coeficiente

de correlacin correspondiente a cada curva y la pendiente respectiva de las curvas de

calibracin elaboradas.

- Despus de ingresados todos los datos requeridos, Excel calcula el valor de la pendiente

promedio de las curvas de calibracin (Sensibilidad), la desviacin estndar de las

pendientes y los lmites de control mximo y mnimo para los valores de pendiente.


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6.4.4. Lmite de deteccin y de cuantificacin

Lmite de Deteccin: Es la concentracin de analito mas baja que puede ser detectada por

un procedimiento analtico dado pero no necesariamente cuantificada con precisin y

exactitud razonable.

Lmite de Cuantificacin: Es la concentracin de analito ms baja que puede ser medida

con una aceptable precisin (repetibilidad) y exactitud por un procedimiento analtico dado.

Existen diversas maneras de determinar el lmite de deteccin, estas pueden ser:

A) Anlisis de blancos de reactivos utilizando los valores de sus seales

Esta metodologa aplica para mtodos analticos que utilizan curva de calibracin, en los

cuales la lectura de la muestra se obtiene por comparacin con un blanco.

Determinar el valor del Lmite de Deteccin del Mtodo con base en las siguientes acciones:


Fisicoqumicos HC-01, para el mtodo de inters, abrir la pestaa Blancos LD LC.

- ingresar la informacin solicitada en la tabla de valores identificada como Tabla 5.1

Anlisis de blancos: En la columna llamada Absorbancia ingresar los valores de las

Absorbancias obtenidas para el blanco de reactivos, ingresar los 12 valores obtenidos

segn el diseo experimental de la validacin (ver numeral 6.3.2).

- Despus de ingresados todos los datos requeridos, Excel calcula el valor de la desviacin

estndar de las absorbancias de los blancos.

- Ingresar el valor de la pendiente de la curva de calibracin utilizada para medir las

absorbancias de los blancos.

- Excel calcula el valor del Lmite de deteccin del mtodo LDM y del Lmite de

cuantificacin del mtodo LCM, utilizando las siguientes frmulas:

LDM = 3 * Sbl / b

Donde: LDM: Lmite de Deteccin del Mtodo

Sbl: Desviacin estndar de las respuestas de los 10 blancos

b: Pendiente de la recta de calibracin utilizada.

LCM = 10 * Sbl / b


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Donde: LDM: Lmite de Deteccin del Mtodo

Sbl: Desviacin estndar de las respuestas de los 10 blancos

b: Pendiente de la recta de calibracin utilizada.

Si el valor del coeficiente de variacin para las seales de los blancos es mayor de 20%,

realizar el clculo del lmite de deteccin como se indica en el inciso c) de este numeral.

Si el valor del coeficiente de variacin para las seales de los blancos est entre 10% y 20%,

verificar experimentalmente los valores calculados para el LDM y para el LCM, preparando

patrones con concentraciones iguales o aproximadas a los valores calculados, analizar por lo

menos 10 fracciones de cada patrn aplicando el mtodo analtico completo.

El valor de concentracin determinado para el LDM se acepta si los resultados

experimentales presentan un coeficiente de variacin CV superior al 10% pero inferior al

20% y un error relativo entre 10% y 20%.

El valor de concentracin determinado para el LCM se acepta si los resultados

experimentales presentan un coeficiente de variacin CV igual o menor al 10% y un error

relativo igual o menor de 10%.

Cuando los resultados experimentales del patrn preparado con una concentracin

equivalente al valor del LDM calculado presentan un coeficiente de variacin mayor del 20%,

calcular el lmite de deteccin como se indica en el inciso C) de este numeral.

B) Anlisis de blancos de reactivos utilizando los valores de sus concentraciones

Esta metodologa aplica para mtodos analticos en los cuales se pueden obtener valores de

concentracin para blancos de reactivos con un nivel de precisin adecuada. Se considera

nivel de precisin adecuada cuando el coeficiente de variacin CV de los datos est entre 10

% y 20 %. Las acciones a realizar para obtener los lmites son las siguientes:




Anlisis de blancos de reactivos utilizando los valores de sus concentraciones:

En la columna llamada Concentracin ingresar los valores de las concentraciones

obtenidas para el blanco de reactivos, ingresar los 12 valores obtenidos segn el diseo

experimental de la validacin (ver numeral 6.3.2).


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- Despus de ingresados todos los datos requeridos, Excel calcula el valor de la desviacin

estndar de las concentraciones de los blancos Scb.

- Excel calcula el valor del Lmite Inferior de Deteccin LID as:

Lmite Inferior de Deteccin (LID) = 3,290 x Scb

- Excel tambin calcula el valor del Lmite Deteccin Instrumental LDI, del Lmite de

Deteccin del Mtodo LDM y del lmite de cuantificacin del mtodo LCM con base en la

siguiente relacin:

LDI : LID : LDM : LCM = 1 : 2 : 4 : 10.

Es decir: LDI = LID / 2 LDM = 2 * LID LCM = 2,5 * LDM

Verificar experimentalmente los valores calculados para el LDM y para el LCM, preparando

patrones con concentraciones iguales o aproximadas a los valores calculados, analizar por lo

menos 10 fracciones de cada patrn aplicando el mtodo analtico completo.

El valor de concentracin determinado para el LDM se acepta si los resultados

experimentales presentan un coeficiente de variacin CV superior al 10% pero inferior al

20% y con un error relativo entre 10% y 20%.

El valor de concentracin determinado para el LCM se acepta si los resultados

experimentales presentan un coeficiente de variacin CV igual o menor al 10%y un error

relativo igual o menor de 10%.

Cuando los resultados experimentales del patrn preparado con una concentracin

equivalente al valor del LDM calculado presentan un coeficiente de variacin mayor del 20%,

calcular el lmite de deteccin como se indica en el inciso C) de este numeral.

C) Estudio de la menor cantidad detectable

Esta metodologa aplica para aquellos mtodos analticos en los cuales el anlisis de blancos

de reactivos (incisos A y B) presenta coeficientes de variacin CV mayores de 20%. La

metodologa se fundamenta en el anlisis de blancos dopados con el analito de inters y

preparados a la concentracin ms baja que sea posible preparar (puede ser la que

recomiende el mtodo analtico de referencia o la de inters segn normatividad). Las

acciones a realizar para obtener los lmites son las siguientes:


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Estudio de la menor cantidad detectable: En la columna llamada Concentracin

ingresar los valores de las concentraciones obtenidas para el blanco dopado, ingresar la

fecha de realizacin de cada medicin. Ingresar por lo menos 10 valores. Adems

ingresar el valor de la Concentracin estimada del blanco dopado en el ttulo de la tabla.

- Despus de ingresar los datos, Excel calcula el valor promedio de las concentraciones

(Ceb), la desviacin estndar de los datos s y el coeficiente de variacin CV.

- En este punto se pueden presentar las siguientes situaciones:

Si el CV es menor del 10%, preparar un nuevo blanco dopado pero con una concentracin

inferior, realizar su anlisis y evaluar el CV. Realizar disminucin en la concentracin hasta

cuando la evaluacin del CV de los resultados obtenidos se encuentre entre 10% y 20%.

Nota: (El archivo Excel proporciona suficientes tablas de datos para realizar las evaluaciones

del valor de CV)

Si el CV es est entre 10% y 20%, calcular el Lmite de Deteccin del Mtodo como se indica

ms adelante.

Si el CV es mayor del 20%, preparar una nueva solucin de blanco dopado pero

incrementado levemente la concentracin del analito (el incremento se debe poder preparar

fcilmente), analizarlo y nuevamente calcular y evaluar el coeficiente de variacin CV de los

resultados obtenidos. Realizar incrementos en la concentracin hasta cuando la evaluacin

del CV de los resultados obtenidos se encuentre entre 10% y 20%.

- Con la informacin ingresada y una vez definido el valor de CV adecuado, Excel calcula el

Lmite de Deteccin del Mtodo con base en la siguiente frmula:

LDM = Ceb + tn-1 * s

Donde: LDM: Limite de Deteccin Del Mtodo

tn1: t student al 99% de confianza para n1 grado de libertad

s: Desviacin estndar de las concentraciones de los 10 blancos dopados

Ceb: Promedio de las concentraciones del blanco dopado

Nota: El LDM debe ser recalculado cuando se produzca un cambio significativo en el mtodo

analtico o en el equipo utilizado.


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En el Anexo 5 se presentan algunos valores de referencia para realizar el clculo del lmite

de deteccin del mtodo utilizando blancos dopados, tambin se presenta la tabla con los

valores de t student al 99% de confianza.

- Excel tambin calcula el Lmite de Cuantificacin del Mtodo aplicando las siguientes

frmulas:

LCM = 2,5 * LDM o LCM = Ceb + 10 * s

De los dos valores seleccionar el que sea menor.

Verificar experimentalmente el valor calculado para el LCM, preparando un patrn con

concentracin igual o aproximada al valor calculado, analizar por lo menos 10 fracciones de

este patrn aplicando el mtodo analtico completo. El valor de concentracin determinado

para el LCM se acepta si los resultados experimentales presentan un coeficiente de variacin

CV igual o menor al 10% y un error relativo igual o menor a 10%.

Nota 1: Cuando para un mtodo analtico sea posible determinar los lmites de deteccin y

cuantificacin por varios mecanismos, seleccionar los valores ms bajos como lmites

representativos del mtodo.

Nota 2: Para los mtodos de pH y conductividad, no es posible obtener un blanco de

reactivos, por esta razn para el pH no se calcula el LDM. Para la conductividad se realiza la

estimacin del LDM utilizando un agua desionizada preferiblemente con una conductividad

menor de 1 S/cm.

6.4.5. Exactitud

La exactitud del mtodo indica la capacidad del mtodo analtico para dar resultados lo ms

prximos posibles al valor verdadero.

Calcular la exactitud del mtodo utilizando estndares preparados en el laboratorio o

utilizando Material de Referencia Certificado como se indica a continuacin.

La exactitud se puede calcular aplicando alguno de los siguientes mecanismos:


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A) Utilizando patrones preparados en el laboratorio:

- Abrir el archivo Excel Hoja de clculo Validacin de mtodos analticos Fisicoqumicos

HC-01, correspondiente al mtodo de inters y abrir la pestaa Exactitud.

- Ingresar la informacin solicitada en la tabla de valores identificada como Tabla 9.

Exactitud con estndares preparados en el laboratorio la siguiente informacin:

Fecha de anlisis, pendiente y coeficiente de correlacin (si el mtodo involucra curva de

calibracin), resultados del anlisis por duplicado de los Estndares bajo y alto definidos

en el diseo experimental (en las filas llamadas Patrn 1, Patrn 2 respectivamente, si se

utilizan ms patrones se puede utilizar ora fila).

- Despus de ingresados todos los datos requeridos, Excel calcula para cada Estndar el

error relativo y el sesgo con las siguientes frmulas:

Error relativo = (Cexp CTerica) * 100 / CTerica

Sesgo = Cexp CTerica

Cexp = Concentracin promedio de los resultados obtenidos experimentalmente

para cada solucin patrn.

CTerica = Concentracin terica de cada solucin patrn preparada.

- Verificar si los errores calculados cumplen con la meta de exactitud establecida en el

numeral 6.3.3.3. de este procedimiento. Si la meta se cumple en el anlisis de las dos

soluciones patrn, seleccionar como exactitud del mtodo el valor de Error relativo ms

alto obtenido. Si la meta no se cumple en alguna de las soluciones patrn, revisar

clculos y si es necesario repetir los anlisis.

B) Utilizando materiales de referencia certificados

- Abrir el archivo Excel, Hoja de clculo Validacin de mtodos analticos Fisicoqumicos



Datos con Materiales de Referencia Certificados: El valor certificado para el Material

y el valor promedio de los anlisis del Material Certificado realizados en el laboratorio.

Excel calcula el porcentaje de Error Relativo y el Sesgo como se indica en el inciso A) de

este numeral.

Nota: Preparar el Material de Referencia Certificado MRC siguiendo las instrucciones del

fabricante o proveedor.


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- Verificar si el error calculado cumple con la meta de 3establecida en el numeral 6.3.3.3.

de este procedimiento. Si la meta se cumple, definir como Exactitud del mtodo el valor

del Error relativo calculado; si la meta no se cumple, revisar clculos y si es necesario

repetir el anlisis del MRC.

C) Utilizando muestras de ejercicios Interlaboratorio

Este mecanismo solo aplica para aquellos resultados de ejercicios Interlaboratorio para los

cuales se hayan obtenido resultados satisfactorios. El mecanismo es el siguiente:




Datos con patrones certificados: Valor de referencia para cada muestra, el valor

reportado por el laboratorio para cada una de ellas. Excel calcula el porcentaje de Error

Relativo y el Sesgo como se indica en el inciso A) de este numeral.

- Verificar si el error calculado cumple con la meta de exactitud establecida en el numeral

6.6.3.3. de este procedimiento. Si la meta se cumple, definir como Exactitud del mtodo

el valor del Error relativo calculado; si la meta no se cumple, evaluar los resultados

emitidos o evaluar los lmites de aceptacin definidos.

Nota: Cuando para un mtodo analtico sea posible determinar la exactitud por varios

mecanismos, seleccionar como exactitud del mtodo el valor ms alto que cumpla con las

metas establecidas.

D) Utilizando los resultados del porcentaje de recuperacin en muestras adicionadas

En el inciso E) de este numeral se presenta la aplicacin de la prueba estadstica t de

Student para los resultados de porcentaje de recuperacin en muestras adicionadas, con

este mecanismo se establece si la exactitud del mtodo es adecuada o no.

E) Utilizando los resultados del porcentaje de recuperacin de patrones

Verificar el cumplimiento de las metas de aceptacin (error relativo y sesgo) Utilizando los

resultados obtenidos en el anlisis de los patrones preparados en el laboratorio. Seleccionar

el valor relativo mas lato que cumpla las metas establecidas. Los resultados que se utilizan

que se utilizan para tal fin corresponden el resultado promedio, el ms alto y el ms bajo de

los datos repostados.


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Utilizar el Test G de Cochran (test para establecer si existe igualdad de varianza de varios

grupos mustrales del mismo tamao) para determinar si la concentracin de los patrones

tiene alguna influencia en los resultados y en su precisin. Aplicar las siguientes directrices:


HC-01, correspondiente al mtodo de inters, abrir la pestaa Rec patrn Cochran.

- Con los datos ingresados en la tabla Recuperacin de patrones, en la Tabla 2. Datos

para el Test de Cochran aparecen los datos bsicos para calcular el test: desviacin

estndar y la varianza de los resultados de cada grupo de datos.

- Excel calcula el estadstico Gexp como se indica a continuacin:

n2

32

22

12

max2

....S +S + S + S

S =expG

Donde: S2max :Varianza mxima obtenida entre los grupos de datos de patrones analizados.

S21: Varianza obtenida para los resultados del primer grupo de datos.

S22: Varianza obtenida para los resultados del segundo grupo de datos.

S23: Varianza obtenida para los resultados del tercer grupo de datos.

S2n: Varianza obtenida para los resultados del grupo n de datos.

- Comparar el valor del Gexp con el valor del G de tablas Gtabla y aplicar el siguiente

criterio: Si Gexp. < Gtablas la concentracin del patrn no influye en la variabilidad de los

resultados.

Nota: En el Anexo 6 se presenta la tabla con los valores de G tabla para un nivel de

confianza del 95% (P = 0.05), tener en cuenta los valores de K (nmero de patrones

analizados) y n (nmero de anlisis por cada patrn) para establecer el valor de G tabla.

Tabla de Test de Cochran.


Valor Mximo de Varianza

Sumatoria de las Varianzas

Gexp

G tabla p=0.05, para n, k

CRITERIO G exp < G tabla Cumple, la concentracin no tiene influencia sobre la precisin de los resultados, las varianzas son comparables


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6.4.6 Precisin

A) Coeficiente de variacin del mtodo CV

Establecer el coeficiente de variacin del mtodo de inters a travs de las siguientes

acciones:


HC-01, correspondiente al mtodo de inters, abrir la pestaa CV.

- Para cada lote de muestras analizadas, ingresar la siguiente informacin en la Tabla 6.

Coeficiente de variacin: Fecha de anlisis, pendiente y coeficiente de correlacin (si el

mtodo tiene curva de calibracin), en las filas correspondientes los resultados del

anlisis por duplicado de las muestras M1, M2, de las muestras adicionadas M1+A1, M2

+ A2, de los resultados de los estndares E1 y E2, incluir los resultados del MRC si estn

disponibles o los de otro estndar si se analiz.

- Verificar la existencia de datos atpicos (Ver metodologa en el Anexo 7) en la parte

derecha de la Tabla 1. Si existe algn dato atpico eliminarlo para que Excel recalcule (no

olvidar cambiar el valor del estadstico T de referencia para el nuevo nmero de datos).

Registrar los valores determinados como atpicos. Realizar como mximo dos rechazos.

Si existen ms de dos rechazos, es necesario repetir todos los anlisis correspondientes

a la muestra en cuestin.

- Despus de ingresados todos los datos requeridos y haber verificado si existen datos

atpicos, Excel calcula el coeficiente de variacin para cada nivel de concentracin de

muestras y estndares. Comparar los valores obtenidos con los criterios de aceptacin

indicados en el numeral 6.3.3.1 (seleccionar como criterio de aceptacin aquel cuyo valor

sea mayor). Entre los valores de desviacin estndar y/o coeficiente de variacin que

cumplan con el criterio de aceptacin definido, escoger como Coeficiente de variacin del

mtodo el valor correspondiente al coeficiente de variacin ms alto obtenido.

Nota: Antes de hacer oficiales los resultados de coeficiente de variacin, evaluar la

aceptabilidad de las desviaciones estndar en diferentes niveles de concentracin utilizando

la Hoja de Clculo Validar 1.1 HC-02, elaborada por el Doctor SAUL ANTONIO

PEARANDA CANOSA qumico del Instituto Nacional de Salud INS. La cual tiene

proteccin de acceso del registro electrnico especificado en el Listado Maestro de

documentos RA-01.

Los pasos a seguir son los siguientes: - Abrir la Hoja de Clculo Validar 1.1 HC-02, y a travs de los mens Archivo - Guardar

como crear un archivo para el mtodo analtico de inters.


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- En la Hoja de Clculo Validar 1.1 HC-02, correspondiente al mtodo, abrir la pestaa

MENU DE INICIO.

- Con la ayuda del puntero del mouse (con un solo clic), abrir el hipervnculo llamado 1.

PARAMETROS ESTABLES.

- En la tabla de datos que aparece, ingresar la siguiente informacin: Resultados del

anlisis por duplicado del blanco (filas BK1 y BK2), resultados promedio de los anlisis de

los estndares (filas E 0,9C y E 0,09C), resultados promedio de los anlisis de las

muestras (filas M1 y M2) y de las muestras adicionadas (filas M1 + A1 y M2 + A2)

correspondientes a cada lote analizado; el valor C de la concentracin madre del patrn

utilizado para el adicionado en cada muestra, el valor del volumen v de solucin patrn

adicionado a cada muestra para preparar la muestra adicionada y el valor del volumen V

tomado de cada muestra para preparar cada muestra adicionada (Filas llamadas

Constantes M1 y Constantes M2 ubicadas en la parte superior e inferior de la tabla de

datos). Despus de ingresada la informacin Excel calcula el valor de U (Concentracin

promedio de cada muestra sin adicionar).

- Volver a la pestaa MENU DE INICIO y con el puntero del mouse hacer clic sobre el

hipervnculo llamado 6. ACEPTABILIDAD DE LAS DESVIACIONES ESTANDAR (St < W)

para abrir la hoja de clculo en donde se puede verificar si la meta de precisin definida

en la hoja de clculo se logra para cada muestra (Aparece SI o NO en la fila llamada

St < W). En el caso de que la desviacin estndar de alguna de las muestras aparezca

con un NO, es necesario revisar la metodologa analtica y repetir los ensayos

respectivos.

Utilizar el Test G de Cochran (test para establecer si existe igualdad de varianza de varios

grupos mustrales del mismo tamao) para determinar si la concentracin tiene alguna

influencia en los resultados y en su precisin. Aplicar las siguientes directrices:


HC-01, correspondiente al mtodo de inters, abrir la pestaa CV.

- Con los datos ingresados en la Tabla 6 de la pestaa Cv, Excel calcula el estadstico

Gexp y lo presenta en la Tabla Test de Cochran, all tambin aparecen los datos

bsicos para calcular el test: Sumatoria de varianzas y valor mximo de varianza.

- Excel calcula el estadstico Gexp como se indica a continuacin:

n2

32

22

12

max2

....S +S + S + S

S =expG

Donde: S2max :Varianza mxima obtenida entre las muestras analizadas.

S21: Varianza obtenida para los resultados de la primera muestra.


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S22: Varianza obtenida para los resultados de la segunda muestra.

S23: Varianza obtenida para los resultados de la tercera muestra.

S2n: Varianza obtenida para los resultados de la muestra n.

- Comparar el valor del Gexp con el valor del G de tablas Gtabla y aplicar el siguiente

criterio: Si Gexp. < Gtablas el factor de concentracin no influye en la variabilidad de los

resultados.

Nota: En el Anexo 6 se presenta la tabla con los valores de G tabla para un nivel de

confianza del 95% (P = 0.05), tener en cuenta los valores de K (nmero de muestras

analizadas) y n (nmero de anlisis por muestra) para establecer el valor de G tabla. Para el

diseo experimental indicado en el numeral 6.3.2., el valor de K es 7 y el valor de n es 6 sin

considerar el MRC, considerando MRC el valor de K es 8 y el de n es 6.

Tabla de Test de Cochran.

PARMETRO ESTADSTICO Valor Obtenido

Valor Mximo de Varianza

Sumatoria de las Varianzas

Gexp

G tabla p=0.05, para n, k

CRITERIO G exp < G tabla

Cumple, la concentracin no tiene influencia sobre la

precisin de los resultados, las varianzas son

comparables

B) Rango relativo entre duplicados RRD

Este atributo permite establecer un mecanismo de control para las mediciones por duplicado

realizadas sobre una muestra. En los anlisis de rutina el valor del RRD calculado no debe

exceder el valor del lmite mximo del RRD determinado durante la validacin del mtodo,

para determinar el valor de este lmite seguir las siguientes instrucciones:


HC-01, correspondiente al mtodo de inters.

- Ubicarse en la pestaa Muestras RRD,ADIC.

- Para cada lote de muestras analizadas, ingresar la siguiente informacin en la Tabla 7

Clculo lmite superior RRD: Fecha de anlisis, pendiente y coeficiente de correlacin

(si el mtodo tiene curva de calibracin), en las filas correspondientes los resultados del

anlisis por duplicado de los blancos BK, de las muestras M1, M2, de las muestras

adicionadas M1+A1, M2 + A2, de los resultados de los estndares E1 y E2 (Si se analiza


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un tercer estndar, incluirlo). No incluir las parejas de muestras que involucren un valor

como atpico.

- Despus de ingresados todos los datos requeridos, Excel calcula el valor relativo del

rango entre duplicados para cada pareja de muestras. Adems calcula el Rango relativo

promedio para cada nivel de concentracin y el Lmite de control alto (LCA) para el Rango

Relativo entre Duplicados RRD. Para realizar estos clculos se utilizan las siguientes

frmulas:

2/X XX - X

=RRD21

21

Donde I X1 - X2 I significa valor absoluto de la resta entre X1 y X2.

n

RRDRRDRRD n... =Rp 21

Donde Rp es el valor promedio de RRD y n es el nmero de valores.

LCA = 3,27 * (Rp)

Donde LCA es el lmite de control para el rango relativo entre duplicados.

- Seleccionar como lmite mximo para el Rango Relativo entre Duplicados del mtodo el

mayor valor obtenido de dicho lmite calculado para cada nivel de concentracin de

muestras.

6.4.7. Recuperacin de muestras adicionadas

A) Preparacin de las muestras adicionadas

- Para cada nivel de concentracin de muestra, adicionar v mL de una solucin madre de

un estndar de concentracin conocida SM a un volumen V mL de la muestra de una

concentracin CM, de manera que la concentracin del analito de inters en dicha

muestra se incremente a un valor prefijado no mayor de 0,9C (C es la concentracin

mxima dentro del rango de aplicacin del mtodo establecido en las actividades

preliminares de la validacin). El volumen v no debe ser mayor de 0,05*V.


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Nota: Preparar suficiente volumen de muestra adicionada (V + v) para todo el proceso de

validacin.

Nota: Los valores de v, V y de SM deben ser tales que la concentracin del analito en la

solucin de muestra adicionada CMA (Muestra + Adicin) debe ser equivalente a la

concentracin de la muestra CM ms un incremento del 20% al 40% de su valor, es decir

CMA = CM + 0,2* CM hasta CMA = CM + 0,4* CM.

Nota: Para cada nivel de concentracin de las muestras, se sugiere adicionarla de la

siguiente manera:

CMAbaja = CMbaja + (0,2 a 0,3)* CMbaja = CMbaja + A1

CMAalta = CMalta + (0,3 a 0,4)* CMalta = CMalta + A2

Las siguientes relaciones pueden ser de utilidad para estimar el valor de alguna variable de

inters (normalmente la variable desconocida es SM):

v*SM + V* CMbaja = (v + V) * [ CMbaja + (0,2 a 0,3) * CMbaja ]

v*SM + V* CMalta = (v + V) * [ CMalta + (0,3 a 0,4) * CMalta ]

- Analizar las muestras adicionadas por duplicado teniendo en cuenta el diseo

experimental (Ver numeral 6.3.2.).

B) Clculos con los resultados de las muestras adicionadas



- Ubicarse en la pestaa Muestras RRD, ADIC.

- Para cada lote de muestras adicionadas analizadas, ingresar la siguiente informacin en

la Tabla 8. Datos experimentales con muestras adicionadas: Fecha de anlisis,

pendiente y coeficiente de correlacin (si el mtodo involucra curva de calibracin),

resultados del anlisis por duplicado de las muestras M1 y M2 adicionadas (en las filas

llamadas Muestra M1 + A1 (CMA) y Muestra M2 + A2 (CMA) respectivamente). No incluir

las parejas de muestras que involucren un valor como atpico.

- Ingresar los valores requeridos en las tablas Adicin muestra M1 y Adicin muestra

M2.

- Despus de ingresados todos los datos requeridos, Excel calcula para cada nivel de

concentracin de muestra el porcentaje de recuperacin promedio, el rango del


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porcentaje de recuperacin y la desviacin estndar de los porcentajes de recuperacin.

Estos clculos se realizan con base en las siguientes frmulas:

100C

CC%R

A

MMA

Donde: %R = Porcentaje de recuperacin

CM = Concentracin promedio de la muestra no adicionada

CMA = Medida de la concentracin del analito en la muestra adicionada

CA = Recuperacin esperada, la cual se calcula as:

vV

)C(SM * vC MA

Donde: CA = Concentracin esperada

v = Volumen tomado del patrn para adicionar

V = Volumen tomado de muestra a ser adicionada

SM = Concentracin de la solucin madre del patrn

CM = Concentracin promedio de la muestra que va a ser adicionada

n

%Ri...%R2%R1%

Rm

Donde: % Rm = Porcentaje de recuperacin promedio

Para establecer si el % Rm cumple con las metas propuestas (Ver numeral 6.3.3.2 y el

Anexo 3), utilizar la Hoja de Clculo Validar 1.1 HC-02 elaborada por el Doctor SAUL

ANTONIO PEARANDA CANOSA qumico del Instituto Nacional de Salud INS, la Hoja de

Clculo Validar 1.1 HC-02, (La cual tiene proteccin de acceso del registro electrnico

especificado en el Listado Maestro de documentos RA-01), aplicando las siguientes

instrucciones:

- Abrir la Hoja de Clculo Validar 1.1 HC-02 y a travs de los mens Archivo - Guardar

como crear un archivo para el mtodo analtico de inters.

- En la Hoja de Clculo Validar 1.1 HC-02 correspondiente al mtodo, abrir la pestaa

MENU DE INICIO.

- Con la ayuda del puntero del mouse (con un solo clic), abrir el hipervnculo llamado 1.

PARAMETROS ESTABLES.


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- En la tabla de datos que aparece, ingresar la siguiente informacin: Resultados promedio

de los anlisis de las muestras (filas M1 y M2) y de las muestras adicionadas (filas M1 +

A1 y M2 + A2) correspondientes a cada lote analizado; el valor C de la concentracin

madre del patrn utilizado para el adicionado en cada muestra, el valor del volumen v de

solucin patrn adicionado a cada muestra y el valor del volumen V tomado de cada

muestra para ser adicionado (filas llamadas Constantes M1 y Constantes M2 ubicadas

en la parte superior e inferior de la tabla de datos). Despus de ingresada la informacin

Excel calcula el valor de U (Concentracin promedio de cada muestra sin adicionar).

- Volver a la pestaa MENU DE INICIO y con el puntero del mouse hacer clic sobre los

botones llamados R1/d1 y R2/d2 para establecer si las recuperaciones fueron

satisfactoria o no. Si los resultados no son satisfactorios, revisar los clculos y si es

necesario repetir los anlisis de las muestras adicionadas.

- Si para las dos muestras adicionadas se obtiene RECUPERACIN SATISFACTORIA,

expresar el porcentaje de recuperacin del mtodo analtico como el promedio de los

dos porcentajes de recuperacin.

Con la informacin obtenida en la Tabla 8. Datos experimentales con muestras

adicionadas Incluida en la pestaa Muestras adicionadas de la hoja de clculo Validacin

de mtodos analticos, establecer con los resultados de las dos muestras adicionadas el

rango de valores de porcentaje de recuperacin (es decir establecer el valor mximo y el

valor mnimo de porcentaje de recuperacin) que cumple con el criterio de aceptacin

indicado en el Anexo 3.

Nota 1: El clculo del porcentaje de recuperacin de muestras adicionadas no aplica para

aquellos mtodos en los cuales el mensurando es un conjunto de sustancias, su medicin

depende de varios factores simultneos y obtener un patrn que represente una

concentracin especfica es complejo o imposible, por ejemplo pH, conductividad, DBO5, etc.

6.4.8. Estndar de control del mtodo y lmites iniciales para su carta de control

Con los resultados de anlisis de patrones (Ebajo y Ealto) preparados en el laboratorio (ver

numeral 6.4.2) o con estndar definido como estndar de control, realizar las siguientes

acciones:



- Ubicarse en la pestaa Lmites CC.

- En la Tabla 1. Datos de patrones analizados, ingresar la siguiente informacin:


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Frente a las celdas llamadas Conc. terica Ct ingresar las concentraciones

tericas de los patrones de concentracin baja y alta respectivamente.

En la columna Fecha ingresar las fechas en que se realizaron los anlisis.

En las columnas Valor 1 y Valor 2 ingresar los resultados correspondientes al

anlisis de los duplicados de los estndares de concentracin baja y alta.

- Despus de ingresados todos los resultados, Excel calcula los atributos definidos en las

Tabla 2. Lmites iniciales para la carta de control, Tabla 3. Coeficiente de variacin y

Tabla 4. Porcentaje de recuperacin promedio de patrones. Los valores de la Tabla 4 se

pueden utilizar como criterios para una grfica de control de calidad. Desplegar el men

Archivo y seleccionar el men Guardar.

- Seleccionar convenientemente como Estndar de control del mtodo, el estndar cuya

concentracin represente mejor el rango de concentraciones que se manejan

rutinariamente en el laboratorio o aquel cuyos resultados presenten un mayor coeficiente

de variacin. Los lmites determinados para el estndar seleccionado sern los Lmites

iniciales para la carta de control del mtodo.

Nota: Si el mtodo de referencia propone un estndar de control, este se debe analizar

dentro del proceso de validacin para establecer los lmites iniciales para su carta de control.

6.5. REGISTRO DE LOS RESULTADOS DE LA VALIDACIN

Registrar los resultados de la validacin de los mtodos en el Formato atributos de los

mtodos validados RO-09.

6.6. VERIFICACIONES DE LA VALIDACIN

Cuando se presente un cambio que pueda afectar la idoneidad del mtodo analtico

establecido por la validacin se proceder hacer una verificacin de la validacin, con el fin

de establecer si se mantienen los atributos inciales del mtodo (con respecto a propiedad

medida, matriz, rango, equipos utilizados, repetibilidad, etc.). Este estudio ser

fundamentado en un diseo experimental el cual se planteara cuando esta situacin se

presente. Si se comprueba que las variaciones con respecto a los atributos inciales son

significativos ser necesario volver a validar el mtodo para considerar las condiciones

actuales de trabajo. Lo anterior se aplicara si existen cambios reales o posibles en su

ejecucin, de acuerdo a los siguientes casos:


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Con Cambios esperados como la sustitucin de lotes de reactivos, la modificacin del

tamao de la muestra (por slo citar algunos ejemplos) y no se puede demostrar que

sistema analtico permanece bajo control tras los cambios a travs de grficos de

control o herramientas equivalentes.

Si un mtodo deja de utilizarse durante un perodo prolongado (mayor a un ao) se

requerir una demostracin del desempeo del mtodo antes de utilizarlo nuevamente

con fines rutinarios.

Si existen cambios significativos como la sustitucin de equipos, cambios de personal,

cambios de formulas, cambios de las condiciones ambientales de trabajo o cambios

en el alcance (aplicacin a matrices que no se especifican o rangos de muestras

ensayadas no contempladas en la validacin inicial).

7. FORMATOS RELACIONADOS

Formato atributos de los mtodos validados RO-09.

Hoja de clculo validacin de mtodos fisicoqumicos, HC-01.

Hoja de clculo validar 1.1. HC-02.

Listado Maestro de documentos RA-01.

8. ANEXOS

ANEXO 1.Directrices especificas para la validacin de la Demanda Bioqumica de Oxgeno.

ANEXO 2.Directrices especificas para la validacin de grasas y aceites.

ANEXO 3.Descripcin de la hoja de clculo VALIDAR 1.1 del Instituto Nacional de Salud.

ANEXO 4. Valores de la distribucin t para un nivel de confianza del 95 %.

ANEXO 5. Clculo del lmite de deteccin del mtodo con blancos dopados.

ANEXO 6. Tabla de datos para el estadstico G (Test de Cochran).

ANEXO 7. Rechazo de datos atpicos.


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ANEXO 1.

DIRECTRICES ESPECFICAS PARA LA ESTANDARIZACIN DE LA DEMANDA BIOQUMICA DE

OXGENO.

- Preparar blancos con el agua de dilucin aireada sin inculo y con inculo.

- Analizar 10 fracciones de cada blanco en un mismo da.

- Calcular la desviacin estndar, el coeficiente de variacin, el LDM y el LCM.

- Analizar 10 fracciones del patrn de 1 mg O2/L (Estndar E1) sin inculo y con 2 ml de

inculo en un mismo da, obtenido por dilucin de una solucin madre. Se prepara

tomando 10 mL del estndar de control y aforar a 2000 mL con agua destilada.


- Analizar 10 fracciones del patrn de 50 mg O2/L (Estndar E2) sin inculo y con 2 ml de

inculo en un mismo da, Se prepara pesando 37,5 mg de cido glutmico y 37,5 de

Glucosa, disolver en agua destilada y aforar a 1 Litro (baln volumtrico clase A) con

agua destilada.

- Calcular la desviacin estndar el coeficiente de variacin y el porcentaje (%) de error

relativo.

- Teniendo en cuenta que las muestras cambian durante el tiempo de su almacenamiento,

la estandarizacin de la DBO5 no se puede realizar durante un periodo de 6 das, por lo

tanto se deben analizar dos muestras naturales con valores de DBO5 frecuentes en el

laboratorio. Analizar mnimo 10 fracciones de cada muestra seleccionada sin inculo y

con inculo (2 mL) en un mismo da y determinar los siguientes atributos del mtodo:

Promedio de la DBO5, desviacin estndar y el coeficiente de variacin de los resultados.

- Preparar en el laboratorio el estndar de control as: Disolver 150 mg de glucosa y 150

mg de Acido Glutmico en agua destilada y diluir a 1L. Analizar mnimo 10 fracciones del

patrn preparado sin inculo y con inculo en un mismo da, determinar los siguientes

atributos del mtodo: Promedio de la DBO5, desviacin estndar y el coeficiente de

variacin de los resultados.

- Analizar mnimo 10 fracciones de un material de referencia certificado (si est disponible)

sin inculo y con inculo en un mismo da y determinar los siguientes atributos del

mtodo: Promedio de la DBO5, desviacin estndar, exactitud y el coeficiente de variacin

de los resultados.

- A travs del anlisis de agua de dilucin y del patrn de 1 mg O2/L establecer como LDM

y LCM del mtodo el valor ms bajo obtenido para estos atributos y para los cuales se

cumple el criterio de precisin establecido para el mtodo.

- A travs del anlisis de las dos muestras de agua natural establecer como Coeficiente de

variacin del mtodo el valor ms alto obtenido para este atributo y que sea menor que el

criterio establecido (Ver Standard Methods), el criterio establecido est expresado como

desviacin estndar, por lo tanto los resultados experimentales primero se calculan en


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desviacin estndar, se comparan con el criterio y los que cumplan se convierten a

coeficiente de variacin para expresar la precisin del mtodo.

- A travs del anlisis de los estndares preparados en el laboratorio, establecer como

exactitud estimada del mtodo el valor ms alto obtenido para el porcentaje (%) de error

relativo y que sea menor que el criterio establecido (Ver Standard Methods).

- A travs del anlisis del Material de Referencia Certificado establecer como exactitud del

mtodo el valor ms alto obtenido para el porcentaje (%) de error relativo y que sea

menor que el criterio establecido (Ver Standard Methods). Tambin se puede determinar

el porcentaje (%) error relativo del mtodo a partir del porcentaje (%) de error relativo

obtenido en el ejercicio Interlaboratorio ms reciente y para el cual se hayan obtenido

resultados satisfactorios.

Nota: Antes de realizar los clculos estadsticos para obtener los atributos del mtodo,

realizar una prueba de datos atpicos; realizar como mximo dos rechazos.

Preparacin de las muestras naturales:

Preparar 500 ml de las muestras naturales con valores de DBO dentro del rango normal de

trabajo en el laboratorio, una baja y otra alta. Mantener refrigeradas las muestras a 4 C y

sembrar antes de 24 horas.

Preparacin de los patrones:

Prepararlos el mismo da que se va a realizar la siembra. Volumen de siembra: 6 ml de la

solucin de Glucosa Acido Glutmico.


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ANEXO 2. DIRECTRICES ESPECFICAS PARA LA ESTANDARIZACIN DE GRASAS Y ACEITES

- Preparar en recipientes volumtricos diferentes 12 soluciones de concentracin baja

(aproximadamente de 1 mg cido esterico/L) disolviendo el cido esterico en un volumen

pequeo de Hexano o ter de petrleo y aforar con agua destilada.

- Analizar las 12 soluciones en un mismo da.


- Preparar en recipientes volumtricos diferentes 12 soluciones patrn con una concentracin

aproximada a 0,09*C mg cido esterico/L.

- Analizar las 12 soluciones del patrn en un mismo da.

- Calcular la desviacin estndar, el coeficiente de variacin y el % error relativo.

- Preparar en recipientes volumtricos diferentes 12 soluciones patrn con una concentracin

aproximada a 0,9*C mg cido esterico/L.

- Analizar las 12 soluciones del patrn en un mismo da.

- Calcular la desviacin estndar, el coeficiente de variacin y el % error relativo.

- Recolectar, homogenizar y generar 12 fracciones de una muestra rutinaria M1 de

concentracin baja y 12 fracciones de una muestra rutinaria M2 de concentracin alta.

- Analizar las 12 fracciones de cada una de las muestras en un mismo da.

- Calcular la desviacin estndar, el coeficiente de variacin.

- A travs del anlisis del patrn de 1 mg/L establecer como LDM y LCM del mtodo

considerando si se cumple el criterio de precisin establecido para el mtodo. Si no se

cumple el criterio, incrementar la concentracin del patrn hasta cuando se cumpla el criterio

de precisin.

- A travs del anlisis de las dos muestras rutinarias establecer como Coeficiente de variacin

del mtodo el valor ms alto obtenido para este atributo y que sea menor que el criterio

establecido para error aleatorio, el criterio establecido est expresado como desviacin

estndar, por lo tanto para los resultados experimentales la precisin primero se calcula como

desviacin estndar luego se compara con el criterio y los valores de precisin que cumplan

se convierten a coeficiente de variacin para expresar la precisin del mtodo.

- A travs del anlisis de los estndares preparados en el laboratorio, establecer como

exactitud estimada del mtodo el valor ms alto obtenido para el % de error relativo y que sea

menor que el criterio establecido para el error sistemtico.

- A travs del anlisis del Material de Referencia Certificado establecer como exactitud del

mtodo el valor ms alto obtenido para el % de error relativo y que sea menor que el criterio

establecido para el error sistemtico. Tambin se puede determinar el % error relativo del

mtodo a partir del % error relativo obtenido en el ejercicio Interlaboratorio ms reciente y

para el cual se hayan obtenido resultados satisfactorios.

Nota: Antes de realizar los clculos estadsticos para obtener los atributos del mtodo, realizar

una prueba de datos atpicos; realizar como mximo dos rechazos.


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ANEXO 3

DESCRIPCIN DE LA HOJA DE CLCULO VALIDACIN 1.1 DEL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Desarrollo GRUPO DE SALUD AMBIENTAL-INS (Colombia)

Fundamento estadstico: Anlisis de varianza (ANOVA).

Fundamento

Tcnica estadstica usada para separar y calcular la variacin debida a los errores aleatorios de la medicin de la variacin causada por cualquier otro factor que podra introducir cambios en la medida de la concentracin de la muestra.

Normas nacionales e internacionales en que se apoyan.

NTC-ISO 5725, parte 2; NTC-ISO 3534 Otras: IEC,OIML,IUPAP

Equipo humano que intervino en el desarrollo.

Saul Antonio Pearanda Canosa - GRSA-INS

Software utilizado como plataforma para el desarrollo y para la ejecucin de la aplicacin.

MS-WINDOWS Hoja electrnica EXCEL

El validar 1.1 asume: St2 = Sd

2 + Se2 , se cumple para Sd

2 = 0, y, Se2 Por lo tanto en el

validar 1.1 se puede ver que el error entre los lotes es mayor que el error dentro del lote,

para todos los niveles de concentracin exceptuando el blanco estadsticamente esto

significa:

Varianza dentro del lote < Varianza entre los lotes

Para que se cumpla en el validar 1.1: St2 = Sd

2 + Se2 , en todos los niveles de concentracin

se debe cumplir: Sd2 0 y Sd

2 sea un mnimo.

Con este requerimiento matemtico se empieza a buscar un valor critico (W): a una cola,

a un nivel de confianza de 95% con un error tipo I de 0.05

El validar calcula el nmero de replicas necesarias para detectar alguna diferencia

predeterminada entre dos medias basadas en el estadstico de prueba F y se cumple:

2

2

05.0W

SF t


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El validar 1.1 asume 105.0 F para todos los niveles de concentracin a excepcin del

blanco (ver TABLA DE DATOS), por lo tanto:

2

2

1W

S t que es lo mismo que 12

2

W

S t

Despejando tenemos: 22 WSt es decir: WSt

Esto implica que en la prctica analtica todos los valores de St son menores que los valores

fijados como meta (W). Si los valores de St no son mayores que el valor fijado como meta,

entonces se ha obtenido la precisin requerida, designada como W y no se necesitan ms

clculos. Si los valores de St son mayores que los valores fijados como meta, antes de

comprobar si las desviaciones estndares totales son aceptables, es necesario obtener el

valor de la prueba F (para v1, v2 grados de libertad y 0.05 de error tipo I).

Para evaluar el porcentaje de recuperacin de muestras adicionadas, es necesario demostrar

que el promedio de recuperacin R, no difiere significativamente (con un nivel de

probabilidad de 0.05) del 95-105 % de la recuperacin esperada d. La recuperacin

promedio R es aceptable s:

0.95 R/d 1.05

La recuperacin tambin es aceptable si R se encuentra dentro del siguiente intervalo:

R = 0.95 * d s * tm-1 / m1/2 (para valores de R/d < 0.95)

R = 1.05 * d + s * tm-1 / m1/2 (para valores de R/d > 1.05)

tm-1 es la t estadstica de doble cola (bilateral) a un nivel de probabilidad de 0.10 y m1

grados de libertad. Aqu m (nmero de lotes) = 6 y tm-1 = 2.01.

Donde s se calcula con base en el siguiente diagrama:


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De acuerdo al programa validar 1.1. se hace el clculo de la recuperacin del adicionado en

las muestras 1 y 2 usando el esquema estadstico propuesto de doble cola ( bilateral).


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ANEXO 4

VALORES DE LA DISTRIBUCIN T PARA UN NIVEL DE CONFIANZA DEL 95 %

gl 95%

1 12,71 2 4,3 3 3,18 4 2,78

5 2,57

6 2,45 7 2,36 8 2,31 9 2,26 10 2,23 11 2,2

12 2,18

13 2,16 14 2,14 15 2,13 16 2,12 17 2,11

18 2,1

19 2,09

20 2,09 21 2,08 22 2,07 23 2,07 24 2,06 25 2,06

26 2,06

27 2,05 28 2,05 29 2,05

30 2,04

gl: grados de libertad


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ANEXO 5

CLCULO DEL LMITE DE DETECCIN DEL MTODO CON BLANCOS DOPADOS

Preparar una solucin con una concentracin aproximada a la sugerida a continuacin (en

algunos casos la concentracin deseada de la solucin no se puede

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Po-04 Procedimiento de Validacion de Metodos Analiticos