Plegamiento de Proteinas

E. Macromoléculas. Rev 23/09/2003

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TEMA 7. PLEGAMIENTO DE PROTEINAS

La estructura tridimensional de las proteínas está implícita en su estructura

primaria (su secuencia aminoácidica). Este hecho queda demostrado por el gran número

de proteínas que pueden desnaturalizarse y después renaturalizarse in vitro sin la

presencia de ningún cofactor o coayudante. Los recientes descubrimientos de la

existencia de numerosas proteínas que facilitan el plegamiento de las proteínas in vivo

(rotamasas, disulfide-isomerases, chaperones) no cambian nada el “dogma” central del

campo que es “que las proteínas contienen la información necesaria para replegarse”.

Las proteínas facilitadoras del plegamiento lo que hacen es simplemente catalizar, hacer

más rápido y eficiente el plegamiento, llevarlo hacia su final de manera más eficiente, al

i) mejorar la cinética de la ruta productiva del plegamiento y ii) evitar la formación de

estructuras no nativas (véase Science, 258, 466, 1992 y Folding and Design, 1,27, o el

libro monográfico sobre el tema de Creighton (Protein Folding, Freeman NY, 1992)).

El hecho de que las proteínas se pliegen solas de una manera tan fidedigna es

una paradoja aún no resuelta, y formulada por primera vez por Levinthal. Esta paradoja

se formula de la siguiente manera. Una cadena polipeptídica pequeña tiene 100

residuos, solo contando los ángulos φ y ψ y contando que cada 30 grados se tiene una

conformación diferente tenemos para cada residuo tendremos 144 confórmeros y para la

proteína en su conjunto un total de 12200 confórmeros distintos. Si suponemos (y es una

suposición muy favorable) que cada 10 fs podemos cambiar de uno a otro confórmero

tendremos que para explorar todo el espacio conformacional la proteína necesitaría unos

10173 millones de años para plegarse. Un tiempo infinitamente superior a la edad del

universo. En realidad el tiempo de plegamiento de una proteína oscila entre el

microsegundo al minuto.

Como toda paradoja ésta no tiene una solución obvia, y durante muchos años ha

existido un fuerte debate al respecto. A lo largo de este capítulo veremos algunas ideas

de cómo pensamos hoy que que la proteína consigue resolverla.


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MECANISMO GENERAL DE PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS

FUERZAS QUE CONDICIONAN EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS

El plegamiento de una proteína debe conducir a un mínimo de energía libre, es

decir que la variación de energía libre a lo largo del plegamiento debe ser negativa:

∆Gfold) . Ignoramos si este mínimo es el más estable, o simplemente es uno muy estable

al que se llega de manera sencilla en el proceso de plegamiento.

La variación de energía libre en el proceso de plegamiento vendrá dada por el

balance de dos términos: el entálpico y el entrópico. El plegamiento debe por tanto

intentar optimizar al máximo la energía del sistema (i.e. debe mejorar las interacciones

del sistema proteína-solvente) y por otro lado debe hacer aumentar el desorden del

universo.

Empezaremos describiendo las interacciones que marcan la estabilidad de las

proteínas:

Interacciones de enlace

La forma nativa de las proteínas presenta todas las distancias y casi todos los

ángulos próximos a los valores de equilibrio. La gran mayoría de las torsiones están

también en sus zonas estéricamente más favorecidas (e.j. mínimos mapa de

Ramachandran). Respecto a los enlaces amida en general se encuentran en la

conformación trans, con la excepción de las prolinas que a veces se encuentran en la

conformación cis. Es de destacar que el cambio de prolinas de conformación cis a trans

es muy importante in vivo y que incluso existen enzimas dedicado a catalizar este

proceso (las peptidyl-proline-isomerases o rotamases).

Unos enlaces covalentes que merecen especial atención son los puentes

disulfuro. Estos puentes se forman entre 2 cisteinas cuyas cadenas laterales se

encuentran próximas en el espacio. Los puentes disulfuros estabilizan en general la

estructura de la proteína como lo demuestra que las proteínas de vida extracelular


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tengan una gran riqueza de los mismos. No obstante, en general los puentes disulfuro no

mejoran la cinética del plegamiento, ya que a lo largo del mismo se forman (y han de

romperse) puentes disulfuro no nativos y esto puede hacer muy lento el proceso de

plegamiento. De hecho, proteínas que se pliegan en microsegundos pueden tardar

minutos si existen posibilidades de formar puentes disulfuro no nativos en el

plegamiento. La naturaleza ha diseñado las Protein Disulfide Isomerases como un

mecanismo para facilitar la formación de los puentes disulfuro nativos y desestabilizar

los no nativos.

Interacciones no enlazantes

Son el conjunto de interacciones electrostáticas y de van der Waals que modulan

la interacción entre átomos no ligados por enlaces. Por tradición las interacciones no

enlazantes se clasifican en este campo en tres tipos en función de su teórica intensidad

en fase gas (medio anhidro).

Interacciones no específicas. Son un conjunto de interacciones de van der Waals

e interacciones electrostáticas débiles (en general interacciones de menos de 1 kcal/mol)

que per se contribuyen poco a la estabilidad de la proteína, pero que en su conjunto son

muy importantes ya que son muy abundantes.

Los puentes de hidrógeno son interacciones básicamente electrostáticas de una

intensidad moderada (menos de 10 kcal/mol). Son muy direccionales y su existencia es

clave en todos los fenómenos de reconocimiento molecular y en los de formación de

estructura secundaria.

Las interacciones iónicas. También denominadas puentes salinos se forman entre

cadenas laterales de residuos cargados. Son totalmente interacciones electrostáticas,

tienen mucha importancia en el reconocimiento molecular a largas distancias y pueden

ser extraordinariamente intensas (superiores a 10 kcal/mol en fases apolares).

De estas interacciones cual es la que marca el plegamiento de la proteína?


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Durante muchos años se pensó que como en otros sistemas químicos, los

términos de enlace eran los que determinaban la estructura tridimensional de las

proteínas. Esto fue refutado por Alfinsen a principios de los sesenta (PNAS, 47, 1309

(1961)) cuando realizó un experimento clave que demostró que son las interacciones

no-enlazantes y no las enlazantes (puentes disulfuro) las que guían el plegamiento. Para

este experimento Anfinsen cogió ribonucleasa, una proteína pequeña (14000 Daltons) y

que tiene 4 puentes disulfuro. Desnaturalizó el enzima con urea y b-mercaptoetanol la

solución resultante la dividió en dos alícuotas P1 y P2. A la alícuotas P1 le eliminó

primero el β-mercaptoetanol, dejo reposar y le eliminó luego la urea (alícuota resultante

P1bis). A la alícuotas P2 le eliminó primero la urea, y luego el β-mercaptoetanol

(alícuota resultante P2b). Una vez hecho esto miro la actividad enzimática de P1bis y

P2bis. Encontró que la alícuota P2b había mucha actividad enzimática, mientras que en

P1b prácticamente no había nada. Esto demostraba que eran las interacciones no-

enlazantes y no las interacciones enlazantes las que guiaban el plegamiento de las

proteínas.

Figura 1. Esquema del experimento de Anfinsen. Rojo significa alícuota no activa, azul

activa

-urea

β-Mercapto

-urea

−β-Mercapto

−β-Mercapto

-urea


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Así, queda demostrado que son la interacciones no enlazantes (aquellas que

rompe la urea) y no las de enlace (que rompe el β-mercaptoetanol) las que guían el

plegamiento de las proteínas. De las tres interacciones de no-enlace cual es la más

relevante?

En un principio se pensó que eran los puentes salinos dada su alta estabilidad los

responsables del plegamiento. Esta hipótesis está actualmente descartada por diversos

hechos: i) no todas las proteínas tienen puentes salinos, ii) el número de puentes salinos

que se forma en una proteína nativa es solo una porción de los que se podrían formar,

iii) los grupos cargados se encuentran mayoritariamente hacia el exterior de la proteína,

no hacia el interior que es donde prediciría la hipótesis de que son claves. Además,

cálculos teóricos han demostrado que la formación de puentes salinos en agua está

desfavorecida por el alto coste que supone desolvatar los iones que forman el par.

Recientemente, la mutagénesis dirigida ha demostrado que los puentes salinos no son

vitales para la estructura, ni aún en casos en los que están en el interior de la proteína.

En el experimento (Nature Structural Biology, 2, 122 (1995)) los autores cogieron una

proteína represor Arc que posee un puente salino interno doble (Arg31, Glu36, Arg40) y

mutaron los tres residuos por tres residuos apolares, en concreto por Met, Tyr y Leu

(respectivamente). La proteína resultante que ganaba contactos hidropóbicos, pero que

perdia el puente salino resultó ser mas de 4 kcal/mol más estable que la proteína nativa!.

En resumen, los puentes salinos pueden ser importantes para mantener zonas

concretas de proteínas, claves en el reconocimiento, y pueden ser importantes en la guía

del plegamiento, pero parece que no son los determinantes del mismo.

Los puentes de hidrógeno son también candidatos razonables a tener un papel

clave en el plegamiento de las proteínas. Son abundantes, son claves en la estructura

secundaria, son relativamente intensos y muy direccionales. No obstante, parece

asumido que no son los puentes de hidrógeno los determinantes del plegamiento, a

pesar de su importancia. Esto es por dos razones fundamentales: i) son interacciones

demasiado direccionales y de corto alcance para organizar el plegamiento global de la

proteína, ii) si se cuentan los puentes de hidrógeno totales de una proteína (proteína-


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proteína, y proteína-agua) se ve fácilmente que el número de puentes de hidrógeno

totales no varia demasiado al producirse el plegamiento de la proteína:

Así pues, no existe una fuerza única responsable del plegamiento de la proteína,

sino que dicho plegamiento depende de un conjunto de interacciones muchas de ellas de

escasa intensidad. Más importante aún para entender el plegamiento de una proteína es

pensar que la proteína es una cadena polipeptídica sumergida en agua, y que la

estructura de la misma cambia drásticamente a lo largo del procesos de plegamiento.

TERMODINAMICA DEL PLEGAMIENTO

El proceso de plegamiento de una proteína implica un término entálpico que se

puede asociar a la variación de energía del sistema. La entalpía de plegamiento

dependerá pues del balance de la energía proteína-proteína, agua-proteína y agua-agua.

El término entrópico dependerá del grado de desorden que se consiga en el proceso de

plegamiento en la proteína y en el agua que la rodea.

Es sencillo ver que en el proceso de plegamiento se produce una mejora en las

interacciones proteína-proteína (p.ej se forman muchos puentes de hidrógeno entre los

residuos aminoacídicos) y que por el contrario el término entrópico es desfavorable ya

que la forma desnaturalizada “random-coil” está muy desordenada y la forma plegada

está muy ordenada. De hecho, las teoría más moderna para explicar el plegamiento lo

simula como un “embudo” o “cono” entrópico (entropy funel). De acuerdo a esta teoría

la proteína cuando se pliega se mueve como en un embudo, donde el diámetro del

embudo da idea de la entropía de la cadena y la profundidad determina la energética del

sistema. Así la proteína desplegada se asume que está en el borde superior del cono, con

energía (interna) poco óptima pero mucha entropía (interna). En el bode del embudo la

proteína puede pues moverse entre diferentes estado quasi degenerados

energéticamente. Al ir cayendo por el embudo cada vez hay menos entropía (el

diámetro del cono es más pequeño) y por lo tanto son accesibles menos estados, pero

estos son más estables energéticamente. Al fin se llega a la forma plegada donde la

energía será óptima y la entropía más pequeña.


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Un motivo de reflexión durante años ha sido cual es la entropía de la forma

desplegada. Si en principio tenemos 12200 estados (confórmeros) accesibles, el costo

entrópico de pasar a uno solo sería enorme (del orden de 200 kcal/mol) si todos

estuvieran poblados en la forma desnaturalizada. Esto no parece razonable, pero cual es

entonces el grado de desorden de la forma desplegada??. Tradicionalmente se suponía

que la forma desplegada estaba muestreando una gran región del espacio

configuracional accesible, pero trabajos recientes de dinámica molecular y

espectroscopía de NMR demuestran que de hecho el estado desplegado es una

combinación finita de un número limitado de estados. La interconversión entre ellos es

lo que da una imagen de desorden absoluto. Esta nueva hipótesis sobre la entropía del

estado desplegado tiene unas consecuencias claras: al ser el número de estados

accedidos por la forma desplegada más pequeño de lo que se esperaba, el coste

entrópico del plegamiento de la cadena es también más reducido.

Cual es el papel del agua?. Ciertamente la cantidad de agua en los alrededores de

la proteína es enorme, por lo que es de esperar que juegue un papel importante en el

plegamiento. De hecho el agua modula el plegamiento de las proteínas tanto a nivel

entálpico, como a nivel entrópico. El agua forma puentes de hidrógeno con ella misma y

con todos los grupos polares de la proteína. En principio se formarán más puentes de

hidrógeno proteína-agua en la forma desnaturalizada, lo que podría inducir a pensar que

el agua desfavorece el plegamiento. No obstante, sabemos que el agua favorece el

plegamiento y de hecho remover agua con agentes hidrofóbicos es uno de los

mecanismos para desnaturalizar proteínas. Por que?

Cuando una cadena polipeptídica esta desordenada en agua sus grupos polares y

apolares se encuentran rodeados de moléculas de agua. El agua cuando está cercana a

los grupos apolares expuestos (lo que pasa en la forma desnaturalizada) no puede

interaccionar intensamente con ellas y reacciona formando estructuras poliédrica

altamente ordenadas alrededor del soluto. Estas estructuras tienen por objeto maximizar

la estabilidad intrínseca del agua entorno al soluto, pero tiene como inconveniente su

gran orden que hace que cuando estas estructuras se forman aumente el orden del agua.

Cuando 2 grupos hidrofóbicos se encuentran en solución cada uno de ellos forma uno


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de estos poliedros de alta ordenación, con lo que la situación entrópica será peor. La

respuesta del sistema es la de comprimir los 2 grupos apolares (igual que 2 gotas de

aceite en agua) para que al juntarse el area accesible al solvente del conjunto se reduzca.

De esta manera los poliedros de alto orden se hacen más pequeños (que la suma de los 2

poliedros que existen antes de la fusión) liberándose en el proceso moléculas de agua

que aumentan el desorden del solvente. El efecto descrito se conoce como “efecto

hidrofóbico” y es el que hoy se asume que guía el plegamiento de la proteína hasta un

estado de colapso hidrofóbico (el molten globule), una forma compacta donde los

residuos apolares ya están hacia el interior. La evolución de este estado compacto a la

forma nativa es entonces mucho más sencilla, ya que implica solo movimientos locales.

CINETICA DEL PLEGAMIENTO

La termodinámica del plegamiento es compleja de estudiar, pero aún lo es más

la cinética del mismo. La razón es clara: la escala temporal del proceso es mucho más

rápida que nuestra capacidad de medida. Así, se cree que muchas proteínas se pliegan

en escalas de tiempo de micro al milisegundo, y en muchos casos las etapas más

importantes pueden pasar en el lapsus del microsegundo, tiempos estos demasiado

pequeños para permitir el seguimiento experimental del plegamiento.

Así pues, el mecanismo cinético del plegamiento de una proteína dista de estar

claro. Durante mucho tiempo se asumió como cierto que existian solo 2 estados: el

nativo y el desnaturalizado. El paso de uno a otro sería vía un estado de transición y no

existirían intermedios de ningún tipo. Los datos en los que este modelo se apoya son

sólidos, derivados fundamentalmente de datos de calorimetría, y a la fuerte

cooperatividad del plegamiento. Alternativamente se han desarrollado otros modelos

que dice que el plegamiento se da por núcleos. Es decir que no es un proceso de “todo o

nada” sino que el plegamiento se organizaría por una serie de puntos (centros de

nucleación) que se compactarían para dar una estructura que evolucionaría hacia la

terciaria. Este último modelo predice la existencia de formas intermediarias del

plegamiento. Alguna de ellas parece asumida como es el “molten globule” sugerido

teóricamente y encontrado experimentalmente en algunas proteínas. Este “molten


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globule” vendria a ser como una estructura nativa desordenada, con los elementos

fundamentales del empaquetamiento ya definidos, pero carente de la definición fina de

la estructura.

Realmente no se puede decir si existen o no intermediaros en el plegamiento de

proteínas. No obstante parece que los datos más recientes apoyan la existencia de

intermediarios en muchas proteínas, aunque sean de moderada estabilidad en frente de

los 2 estados mayoritarios. Se especula que la formación del molten globule es rápida y

que es la reorganización de este hasta dar la estructura terciaria lo que limita la

velocidad del proceso de plegamiento.

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