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PLEGADO DE PROTEINAS
BIOQUIMICA DE PROTEINAS-UNSAM
Julio Caramelo
Laboratorio de Biología Estructural y Celular
Fundación Instituto Leloir
BIBLIOGRAFIA:
1) Fersht, A. Structure and mechanism in protein science (1999) Freeman Press.
Capitulos 1, 11, 17 y 18
2) Advances in Protein Chemistry (1995) Vol. 46.
Capitulo 3 (Free energy balance in protein folding)
3) Branden y Tooze. Introduction to Protein Structure (1999)
Garland Publishing, Inc.
4) Whitford, D. Proteins. Structure and function (2005)
Editorial John Wiley & Sons
5) Berg, Tymoczko y Stryer. Biochemistry (2006)
Editorial Freeman and Company
ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
Biología Estructural: ciencia que estudia la estructura y función de las biomoléculas.
Física Química
Biología
Biología Estructural
UNION PEPTÍDICA
H
COO-3HN+
R1 H
COO-3HN+
R2
N
H
C3HN+
R1
O
HH
COO-
R2+ H2O
N-terminal C-terminal
ALA
TYR
LYS
THR
Reacción endotérmica: H > 0 Las proteínas son químicamente metaestables respecto de la hidrólisis
N
H
CH3N+
R1
O
HH
COO-
R2
1.33 Å (unión simple C-N: 1.45 Å)
1.23 Å (más largo que un carbonilo típico)
Las longitudes de enlace no son las esperadas:
La unión peptídica es plana:N
H
CH3N+
R1
O
HH
COO-
R2
C
C
Estos 6 átomos está en un plano
N
H
CH3N+
R1
O
HH
COO-
R2N
H
CH3N+
R1
O
HH
COO-
R2-
+
La unión peptídica tiene carácter de doble enlace:
En la cadena solo dos enlaces pueden rotar:
C-CO
C-N
H3N+ N
H
C
R1
O
H
COO-
C
phi psi
C
HR2
NC
O
H
H
C
R3
¿Qué es un ángulo diédrico?N
CCi
Ci+1
Por lo general la unión peptídica presenta configuración trans.Repulsión de las cadenas laterales (en dipéptidos la forma trans es 1000 veces más abundante que la cis)
NC
Ci
Ci+1
NC
CiCi+1
N
H
C3HN+
R1
O
HH
COO-
R2
Trans: = 180 Cis: = 0
H
COO-N
R2H
C3HN+
R1
O H
La unión peptídica presenta solo dos posibles ángulos diédricos:
El trazado de la cadena se puede hacer sabiendo tres ángulos diédricos para cada aminoácido
N
H
C3HN+
R1
O
HH
C
R2
O NH
H
COO- R3
N
H
C3HN+
R1
O
HH
C
R2
O NH
H
COO- R3
NC
O
HH
C
R2
O NH
N
H
C3HN+
R1
O
HH
C
R2
O NH
H
COO- R3
Podemos graficar los pares de ángulos , de las proteínas que están cristalizadas
Gráfico de Ramachandran
α-helices : entre -40° y ~ -100°Ψ: entre -40° y -65°
Zona desfavorable
Hoja : entre - 80° y - 120°Ψ: entre 120° y 170°
La glicina posee una gran libertad conformacional:
CISTEINA
-+
-
+-
+
CISTINA
H
COO-3HN+
SH
H
-OOC +NH3
SH
COO-3HN+
S + 2 H+ + 2 e-
2
2
(OJO, esto es una reacción redox, NO una ácido/base)
Cisteína puede formar puentes disulfuro:
+ H2O+ ½ O2
¿Cómo se pliega una proteína que puede formar varios puentes disulfuro?
Supongamos que tenemos una proteína con 3 cisteínas:
SHSH
SH
12
3
SHS
S
S-S (1-2)
SH
S S
S-S (2-3)
SH
S S
S-S (1-3)
NATIVA E0S-S(2-3) E0
S-S(2-3), E0S-S(2-
3)
…Y A MEDIDA QUE AUMENTA EL NUMERO DE CYS LA PROBABILIDAD DE FORMAR LA COMBINACION ADECUADA DE PUENTES S-S ES MENOR.
Ribonucleasa: tiene 4 Prolinas LYS41-PRO42
ASN113-PRO114 TYR92-PRO93 VAL116-PRO117
trans
transciscis
Prácticamente todas las uniones peptídicas son trans. Repulsión estérica de las cadenas laterales.
Prolina: excepción
aa PRO
E
transcis
PRO
E
trans
cis
~ 7% uniones X-PRO43 % de las proteínas al menos tienen una cis PRO
Ea ~ 80-100 kJ/molt1/2 ~ 10-100 seg
¡ LENTO !
C
C
O
N
C+1
C
C
O
N
C+1
trans cis
SI. Retarda mucho la velocidad de plegamiento.In vitro una proteína con una unión cis-PRO por presenta al menos dos fases cinéticas de pegamiento
¿Porqué la prolina presenta más uniones cis que los demás aminoácidos?
¿Tiene alguna consecuencia?
En la unión X-Pro la diferencia energética entre cis y trans es
menor
Estructura terciariaSon las biomoléculas que presentan mayor variación estructural
anticuerpo
colágeno
Virus del dengue
barnasa colicina
fosfatasa
hemaglutinina
porinacalnexina
¿Tienen algo en común todas estas estructuras?
Rojo: hidrofílicoAmarillo: hidrofóbicoNaranja: P, G, H
Estructura terciaria: disposición espacial de los residuos (si uno conoce la estructura terciaria con una resolución menor a 4-5 Å también sabe la secundaria)
hidrofóbicos
hidrofílicos
AL PLEGARSE UNA PROTEINA LOS RESIDUOS OCULTAN UNA
PROPORCIÓN DIFERENTE DE SU SUPERFICIE:
Área del residuo aislado
Área oculta al plegarse la proteína
UN
Proteína desnaturalizadaColección heterogénea de conformaciones con grado variable de compactación.Rápida velocidad de interconversión
Proteína nativaConjunto discreto de confórmeros muy parecidos entre sí.
Plegado
¿Qué determina la estructura terciaria de una proteína? ¿Existe un “código de plegado”?
Christian AnfinsenPremio Nobel de Química 1972
Ribonucleasa A (pdb: 1AFK)
C40-C95
C26-C84C58-C110
C64-C72
HOCH2
H2
CSH
S CH2
H2
C OHHOCH2
H2
CS
SH
SH
S
S
Betamercaptoetanol
72 65
58
1109540
26
84
DiálisisO2
Actividadenzimática
72 65
58
1109540
26
84
SHHS
SH
HS
HS
SHHS
HS
Urea 8 MBetamercaptoetanol
Actividadenzimática
NO hay actividadenzimática
Experimento de Anfinsen:
Conclusiones de Anfinsen:
La información necesaria para especificar la estructura está en la secuencia (las chaperonas complicaron un poco, pero se sigue manteniendo)
“Hipótesis termodinámica”: el estado nativo es la conformación de mínima energía libre (hay que considerar todo: solvente, ligandos, etc…)
G
ConfórmeroConfomación nativa
En principio se podría calcular cual es la conformación de mínima energía.Hay dos problemas: No conocemos la función potencial con suficiente precisión El número de conformaciones posibles es MUY grande Las predicciones con proteínas chicas están dando cada vez mejor
Desplegado de una proteína
El estado nativo es estable en un rango muy reducido de condiciones (temperatura, pH, co-solventes)
¿Como desnaturalizamos una proteína?
Aumento de temperatura (desnaturalización térmica) Cambios de pH Agentes químicos:
Disminución de temperatura (suena raro, pero pasa)
H2N NH2
C
O
H2N NH2
C
NH2
+ Cl-
UREA Cloruro de guanidinio
N U
Le estabilidad de una proteína se mide con el G de unfolding:
Coordenada de plegamiento
G
N
U
GN < GU
GU = GU – GN > 0
UREA
Coordenada de plegamiento
G
NU
GN > GU
GU = GU – GN < 0
[UREA]
GU
GN
La desnaturalización es un proceso cooperativo:
N U
[D]
[N]Ku =
fu + fn = 1fu
fnKu = =
fu
1 - fu
[D]
[N] + [D]fu = Fracción desnaturalizada:
[N]
[N] + [D]fn = Fracción nativa:
fu
0 [UREA] 8
[UREA]50
En [UREA]50:
fu = fn = 0.5
[N] = [U]
Ku = 1
GU = -RT ln(Ku) = 0[UREA]50
GU
GN
GU = 0
Químicamente una proteína es una entidad metaestable (hidrólisis) Se puede usar el formalismo de la termodinámica de sistemas en equilibrio
¿Qué significa que una mutación desestabiliza un proteína?
UNSilvestre
K folding = Kf = [N] / [U]
K unfolding = Ku = [U] / [N]
Gu = -RTln(Ku)
Coordenada de plegamiento
G
N
U
Gu‡
Gu
U*N*Mutante
K* folding = Kf* = [N*] / [U*]
K* unfolding = Ku* = [U*] / [N*]
Gu* = -RTln(Ku*)
Coordenada de plegamiento
G
N*
U*
Gu*
En el estado nativo de una proteína se forman cientos interacciones
¿Cuan estable es el plegado de una proteínas?
Los Gu típicamente caen en el rango de 20-60 kJ/mol
Esto es muy bajo !!! Del orden de 3 a 10 puentes hidrógeno
El estado nativo es marginalmente estable
¿Como puede ser?
Durante el plegado hay que tomar en cuenta TODAS las interacciones:
Proteína – proteína (p-p) Proteína – solvente (p-s) Solvente – solvente (s-s)
Y debemos tener en cuenta las contribuciones entálpicas y entrópicas al G
Valores enormes (varios miles de kJ/mol), pero similares en magnitud y
de signo opuesto.
Los grupos que forman puentes hidrógeno intracatenarios en el estado N
se encontraban formando puentes hidrógeno con el solvente en el estado
U. El balance entálpico es ligeramente favorable.
ENTALPIA: H
Se forman: intracatenarias (Hp-p < 0)
entre moléculas de solvente (Hs-s < 0)
Se rompen: proteína-solvente (Hp-s > 0)
ENTROPIA: S
Disminución de la movilidad de la cadena (Sp < 0)
Liberación de moléculas de solvente (Ss > 0)
¿Por qué una proteína se pliega?
Por el mismo motivo que se forma una micela o una bicapa lipídica
Porque está rodeada de agua
Si sumergimos una proteína en solvente orgánico lo más probable es que se desnaturalice
Polar
No lineal
¿Por qué los compuestos no polares son hidrofóbicos?
?
EFECTO HIDROFOBICO
La interpretación ha generado fuertes controversias.Veamos la interpretación clásica:
La presencia de una superficie no polar impide que las moléculas de agua formen todos los puentes hidrógenos El solvente se orientan formando clatratos ordenados (“icebergs”) Costo entrópico muy alto Al plegarse una proteína disminuye el área hidrofóbica expuesta, se liberan moléculas de agua. El aumento de entropía del solvente compensa por la pérdida de entropía al disminuir la movilidad la cadena
Acido graso en agua
Cluster de agua fluctuantes en el seno del solvente
Moléculas de agua altamente ordenadas formando una “jaula” que rodea la cadena alquílica
Disminuye el área hidrofóbica expuesta. El número de agua forzadas a ordenarse disminuye. Aumenta la entropía
Formación de bicapas y micelas
Una proteína en su estado nativo es como una micela muy venida a más.
Al formarse el core hidrofóbico disminuye la superficie accesible al
solvente (ASA), liberándo moléculas de agua
El cambio de ASA (ASA) en el plegamiento explica porqué la capacidad
calorífica del estado desplegado es mayor que la del estado nativo (CpU >
CpN). En unfolding: Cp = (CpU – CpN) es positivo
Por esto las proteínas se pueden desnaturalizar a bajas temperaturas
(“cold denaturation”)
-
+
OH
--
+
+
-
+
-
OH
HO
HO
-+ OH
- + - OH+ - OH +
- OH
Folding:ASA < 0
¿Cómo medimos Gu?
Debemos cuantificar [U] y [N]
Usamos algún método que los diferencie:
1) Absorbancia
2) Fluorescencia
3) Dicroismo circular
∆GN-U = -RT ln (KN-U) = -RT ln ([U]/[N])
PARA PODER RACIONALIZAR EL EFECTO DE UNA MUTACION HAYQUE VER COMO CAMBIA LA ESTABILIDAD RELATIVA DE N Y D
EJEMPLOS:
1) GLICINA: EN GENERAL DISMINUYE LA ESTABILIDAD ¿PORQUE?
DISMINUYE LA ENTROPIA DEL ESTADO D
CADA PUENTE PUEDEN CONTRIBUIR HASTA 4 kcal/mol
AUMENTA LA ENTROPIA DEL ESTADO D (ver Ramachandran)
2) PUENTES S-S: EN GENERAL AUMENTAN LA ESTABILIDAD ¿PORQUE?
Se puede jugar mucho más con los loops y residuos expuestos que con el “core” hidrofóbico.
En el caso de mutar residuos del core, se tolera la generacion de cavidades (ej ILE -> ALA), pero muy difícilmente lo inverso (ALA -> ILE)
¿PORQUE?
El grado de empaquetamiento del core es muy alto, similar a un cristal orgánico. Muy probablemente se generen choques.
¿COMO PODRIAN EVITAR ESTO?
Realizando dos cambios que se compensen
Sintetizamos una proteína de 100 aminoácidos con una secuencia al azar.¿Cuan probable es que adopte una estructura “nativa”?
Supongamos 10.000 x 106 especies y que cada genoma codifica para 30.000 genes (exageración supina).
Entonces tendríamos 3 x 1020 proteínas
(muchas están repetidas).
¿Cuántas posibles proteínas de 100 residuos se podrían hacer ?
20100 = 1.3 x 10130
(número de protones y neutrones del universo 1076)
¿Cuántas proteínas hay en la naturaleza?
Caminos de plegado y paisajes de energía
La mayor parte de las proteínas que conocemos adoptan una conformaciónnativa, entonces nuestra proteína debería plegarse correctamente.
Apliquemos el método inductivo:
Las proteínas que hay en la naturaleza ¿Son una muestra representativa?
¿Vale este razonamiento?
Secuencias posibles= 1.3 x10130
Secuencias en la naturaleza: como mucho 3 x 1020
Por cada secuencia seleccionada por la evolución hay 4.3 x 10109 secuencias que no aparecieron
Volvamos a nuestra pregunta inicial:
Sintetizamos una proteína de 100 aminoácidos con una secuencia al azar.¿Cuan probable es que adopte una estructura “nativa”?
En principio no podemos decir nada.
Seguro que luego de miles de millones de años de evolución nos llegó un muestreo ínfimo de todas las proteínas posibles.
¿Cuáles fueron las proteínas que nos llegaron?
¡¡¡Casualmente aquellas que se plegaron correctamente!!!
Las proteínas que SI nos llegaron, ¿siguen un camino al “azar” al plegarse?
Azar: la cadena va probando todas las conformaciones hasta llegar a N
¿Cuánto tiempo demandaría este proceso?
Imaginemos que cada aminoácido puede adoptar tres conformaciones posibles (, y L)
Cada conformación se puede interconvertir en 1 ps (10-12 seg)
Una cadena de 100 residuos puede adoptar 3100 = 5.2 x 1047 conformaciones
EXPLORAR TODAS LAS CONFORMACIONES REQUERIRIA:
10-12 seg * 5.2 1047 = 5.2 1035 seg (1.7 1028 AÑOS !)
(si supemos que en cada paso de busqueda los 100 residuos cambian, tardaría 1.7 1026 años)
PERO, LA MAYOR PARTE SE PLIEGA EN 0.1 - 1000 seg !!!
PARADOJA DE LEVINTHAL (1968)
Entonces ¿Es el plegado un proceso al azar?
NO
¿COMO PUEDE SER?
No hace una busqueda al azar de la conformación de mínima G.
Necesariamente deben existir “caminos” favorecidos que restrigen labúsqueda.
La evolución cumplió un papel fundamental.
Se seleccionaron aquellas secuencias cuya velocidad de plegado escompatible con la vida.
Caminos de plegado
Imaginemos que tenemos dos proteinas con los estos espacios conformacionales:
G
coordenada
U
N
coordenada
GU
N
En el primer caso el plegado se verá “fustrado” mucho más veces (trampas cinéticas)
La evolución seleccionó aquellas secuencias que presentan espacios conformacionales “lisos”, con pocos mínimos locales.
¿Cuál creen que se pliega con más eficiencia?
Tres modelos de plegado proteico
Difusión-condensación1) Estructura 2ria
2) Chocan entre si para formar la 3ria
Ejemplo: barnasa
Nucleación-condensación1) Un elemento de estructura 2ria
2) La 3ria se propaga desde allíEjemplo: CI2
Colapso-hidrofóbico1) Aglutinación del core hidrofóbico2) La 3ria se propaga desde allí
U
I I I
N
El embudo de plegado (“folding funnel”)
El mecanismo de plegado no esanálogo a una reacción de moléculaschicas (pocos enlaces de alta energía).
Es una búsqueda sesgada en unasuperficie de energía chata (muchasconformaciones con energía similar).
Superficie característica de unnúmero muy grande de interacciones debaja energía.
Análisis de la superficie de energía libre
Lenta
“Lenta y peligrosa” “¿ Funcional ?”
No tan mala“Chiche bombón”
El sesgo proviene porque en promedio aquellas conformaciones quepresentan más contactos “nativos” entre residuos son másestables.
Lo más probable es que no se pliegue.
¿Como “sabe” la proteína que un contacto es “correcto”?
¿Que ocurriría si sintetizamos una proteína con una secuenciacualquiera? Que no fue “filtrada” por millones de años deevolución. ¿Se plegaría con una estructura “única”?
No lo sabe. Aquellas estructuras que no presentaban estecomportamiento no fueron seleccionadas.
Un mono secretario…
DESNATURALIZACION POR AGENTES QUIMICOS
UREA o GUANIDINIO:
ALTERAN LA ESTRUCTURA DEL AGUA
INTERACCIONAN CON GRUPOS DE LA PROTEINA ( aromáticos, amidas)
G DE TRANSFERENCIA DE UN AMINOACIDO DESDE AGUA A UNA SOLUCIONDE DESNATURALIZANTE ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DEDESNATURALIZANTE
COMO EL ESTADO D ES MAS EXPUESTO QUE EL N, ENTONCES D ESESTABILIZADO POR EL DESNATURALIZANTE
GD-N = GD-N(H2O) - mD-N [desnaturalizante]
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 2 4 6 8
[UREA]
fu
H2NC
O
NH2 H2NC
NH2+
NH2
UREA GUANIDINIO
DIFERENCIAS DE ESTABILIDAD
GD-N = GD-N(H2O) - mD-N [desnaturalizante]
m: medida de ASA (superficie accesible al solvente) durante el desplegado
ASA
m
> estabilidad
Transiciones de dos estados
La transición medida por diversas técnicas debe ser idéntica (UV, fluorescencia, CD, etc)
Idealmente debería haber puntos isosbésticos e isodicroicos (¿PORQUE?)
G
[desnaturalizante]
G = 0
D
N
[desnaturalizante]
señal
nearUV CD
farUV CD
TRP
farUV CD
nearUV CD
TRP
señal
[desnaturalizante]
¿Qué ocurrió acá?
N
D N
D
¿Cómo seguimos el desplegado de una proteína?
Gel con gradiente de urea:
tamaño
0 M UREA 8 M
Migra
ción
N U
Dicroísmo circular (CD)
Nativa EX 292 nm
Desplegada EX 292 nm
Desplegada EX 275 nm
Espectroscopía de fluorescencia
Casi siempre el espectro de U aparece corrido hacia el rojoLa intensidad puede aumentar o disminuir
Atrapado de intermediarios de plegamiento ligados por puentes disulfuro:
La proteína completamente desplegada y reducida se vuelve a plegar sise elimina el desnaturalizante y los puentes disulfuro se forman poroxidación con O2.
Se pueden atrapar los intermediarios con diferentes puentes disulfuroya formados, de dos maneras principales: bajando el pH o pormodificación covalente (Iodoacetato):
SH
HS
SH
SH
SH
S-S
SH SCH2COO-
S-S
SCH2COO-ICH2COO-O2
Una de las pocas técnicas para ver folding in vivo
Inhibidor de tripsina de páncreas bovino (BPTI)
¿COMO CALCULAMOS GD-N?
Partimos de una señal espectroscópica a distintas [UREA].
Mezcla de las señales de N y D, pesadas por su concentración:
S =SN fN + SD fD = SN (1-fD) + SU fD
Con esto podemos calcular fU:
fD = (S – SN) / (SD-SN)
El cual se relaciona con KD-N = [D]/[N] = fD / (1-fD)
Podemos calcular KD-N para cada [UREA]
[UREA]
Long. Onda (nm)
F
¿Por qué KD-N depende de urea?¿Cómo calculamos KD-N en ausencia de urea?
Con KD-N podemos calcular GD-N para cada [UREA] y podemos extrapolar los valores en ausencia de urea:
GD-N = GD-N(H2O) + m [UREA]
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 2 4 6 8
[UREA]
fu
Para el caso de oligómeros la curva depende de la concentración total de proteína
¿Porqué?GD-N
GD-N = G1 + G2
G2G1
La posición del equilibriodepende de [PROT], por el principio de Le Chatellier
En las curvas de desnaturalización pueden observarse dos tipos de comportamiento:
fD
[Desnaturalizante]
[PROT]
[Desnaturalizante]
fD
[PROT]
¿Cómo están acopladas las estructuras terciaria y cuaternaria en cada caso?
La presencia de un ligando aumenta la estabilidad:
Ejemplo: calreticulina Ca2+ Glc1Man9GlcNAc2
Estabilidad térmica seguida por far-UV
calcio
Glc1Man9GlcNAc2
> Glc1Man9GlcNAc2
> Glc1Man9GlcNAc2> [Calcio]
> [Calcio]+ Glc1Man9GlcNAc2
+ Glc1Man9GlcNAc2+ Glc1Man9GlcNAc2
GD-N
GD-N = G1 + G2G2G1 Binding Unfolding
Fluorescencia de TRP:
Denaturalización de proteínas oligoméricas:
SOYBEAN AGGLUTININ (SBA)
Tratamiento de SBA con urea
TRP
SEC
(en presencia de EDTA)
ANS
ANS
TRP
SEC
CD UV lejano CD UV cercano
2 TRANSICIONES
ANS
La desnaturalización de una proteína oligomérica puede ser más de 1 estado:
Terciaria
La detección del monómero va a depender del grado de cooperación entre estructura terciaria y cuaternaria
fu
Urea
fu
Urea
La posición de equilibrio de una proteína oligomérica depende de la concentración total de proteína:
fu
Urea
fu
Urea
> concentración> concentración
PLEGADO IN VIVO DE PROTEINAS
A1) Problemas a resolver: interacciones hidrofóbicas puentes disulfuro isomerización de prolinas adquisición de la estructura cuaternaria traslocación de membranas
A2) Familias de chaperonas: HSP70 HSP40 HSP60 HSP10 HSP90 small HSP (sHSP) HSP100 CRT/CNX PPIases PDI chaperonas intramoleculares
A3) Acción secuencial de chaperonas
PROBLEMAS A RESOLVER: INTERACCIONES HIDROFOBICAS
-
+
OH
--+
+
-
+
-
OH
HO
HO
ESTRUCTURA 3D MUY BASICA DE UNA
PROTEINA
UNA MICELA VENIDA MUY A MAS
PROBLEMA: SINTESIS PROTEICA Y TRASLOCACION DE MEMBRANAS ES LINEALLOS RESIDUOS HIDROFÓBICOS INTERACTUAN INESPECIFICAMENTE LA VELOCIDAD DE SINTESIS MUCHAS VECES ES MENOR QUE EL TIEMPO PARA EL PLEGAMIENTO
-+ OH
-+ - OH + - OH+- OH
PROBLEMAS A RESOLVER: PUENTES DISULFURO
SHSH
SH
1 23
SHS
S
S-S (1-2)
SH
S S
S-S (2-3)
SH
S S
S-S (1-3)
NATIVA E0S-S(2-3) E0
S-S(2-3), E0
S-S(2-3)
PROBLEMAS A RESOLVER: ISOMERIZACION DE PROLINAS
TRANS
CIS
PREVENIR LA SEGURA AGREGACION DE PROTEINAS, SU CORRECTO PLEGADO Y
ENSAMBLADO
PROBLEMA ADICIONAL
E.coli ~ 150 mg/mlCélula de mamífero ~ 180 mg/ml
EL MEDIO INTRACELULAR TIENE UNA CONCENTRACION ESCANDALOSAMENTE
ALTA DE PROTEINAS !!!
CHAPERONAS
PLEGAMIENTO IN VIVO DE PROTEINAS
Secundaria Terciaria Cuaternaria Puentes disulfuro Isomerizacion de prolinas Modificaciones postraduccionales
“VIA TERMODINAMICA”
“VIA CINETICA”
Reacción de molecularidad alta.Velocidad muy dependiente de concentración
CHAPERONAS: proteínas que ayudan a otros polipéptidos a adquirir la conformación apropiada o la localización celular adecuada sin formar parte de la estructura final.
CLASIFICACION FUNCIONAL:1) INTERACCIONAN CON RESIDUOS HIDROFOBICOS (previniendo agregación inespecífica durante la síntesis y la traslocación de membranas): HSP70 (DnaK) HSP40 (DnaJ) HSP60 (GroEL) HSP10 (GroES) HSP90 small HSP (sHSP) HSP100 chaperonas intramoleculares
2) CATALIZAN LA CORRECTA FORMACION DE PUENTES DISULFURO: PDI: protein disulfuro isomerasas
3) CATALIZAN LA ISOMERIZACION DE PROLINAS: PPIases: peptidilprolil isomerasas
4) INTERACCIONAN CON HIDRATOS DE CARBONO (lectinas): CRT/CNX: calreticulina / calnexina
CHAPERONAS
Algunas cosas generales:
EN GENERAL NO ACELERAN LA VELOCIDAD DE PLEGADO. AUMENTANLA EFICIENCIA DEL PROCESO AL EVITAR LA AGREGACIONINESPECIFICA Y RESCATAR PROTEINAS QUE ENTRARON A VIASMUERTAS
DURANTE EL PLEGADO IN VIVO SOLO UNA PEQUEÑA PROPORCIONDE UNA PROTEINA PARTICULAR INTERACCIONA CON LOS SISTEMASDE CHAPERONAS
LAS PROTEINAS PUEDEN SEGUIR MAS DE UNA VIA DE PLEGADO INVIVO. AL ELIMINARSE LA INTERACCION CON UNA CHAPERONA OTRASTOMAN SU LUGAR
HSP70 (DnaK) - HSP40 (DnaJ)
PRESENTES EN CITOSOL Y ORGANELAS
FUNCIONES:
PARTICIPAN EN LA SINTESIS PROTEICA (previenen agregación,ayudan en la adquisición de la estructura nativa, rompen agregados)
TRANSLOCACION DE MEMBRANAS
CONTROL DE PROTEINAS REGULATORIAS: receptores nucleares,quinasas (Raf, eIF2-quinase), factores de transcripción (HSF, 32, etc)
RECONOCEN SEGMENTOS HIDROFOBICOS DE PROTEINAS ENCONFORMACIONES EXTENDIDAS.
DnaK: HSP70 de E. coli (pdb: 2KHO)
Forma unida a ADP o APO
Dominio N-terminal:ATPasa
Dominio C-terminal:Unión de péptidos(forma cerrada)
HSP70 presenta dos conformaciones:
ABIERTA: en presencia de ATP, alta velocidad de entrada y salida del sustrato.
CERRADA: en presencia de ADP o sin nucleótido, entrada y salida lenta del sustrato. La unión del sustrato estimula la hidrólisis de ATP.
La clave es que la unión de ATP aporta la energía para romper los contactos entre la chaperona y el sustrato mal plegado. Esto es algo general de todas las “holdasas”.
LA CHAPERONA LO UNICO QUE HACE ES UNIR Y SOLTAR EL SUSTRATO, en un proceso acoplado a la hidrólisis de ATP. NO PLIEGA A LA PROTEINA DE FORMA “ACTIVA”. La consecuencia principal de su acción es evitar interacciones inespecíficas del sustrato con el entorno.Recuerden que la agregación es MUY dependiente de la concentración de proteína libre.
ADP boundApo form ATP bound
Sustrato
Entrada y salida rápida del sustratoEntrada y salida
lenta del sustrato
HSP70 (DnaK) - HSP40 (DnaJ) - GrpE
GrpE
ATPADPPi
Sustrato
HSP40GrpE
1) Hidrólisis de ATP inducida por la unión de sustrato
2) Cierre del dominio C-terminal
(sustrato atrapado)
1) Intercambio ADP por ATP o unión de ATP
2) Apertura del dominio C-terminal
Entrada y salida del sustrato
ADP bound Apo form
1) Intercambio de ADP por ATP
2) Apertura del dominio C-terminal
Dominio C-terminal cerrado
Unión del sustrato
HSP70: cambio conformacional desde la forma unida ATP hacia la forma APO o unida a ADP, gatillado por la unión del sustrato.
MUY IMPRESIONANTE
ATP bound APO or ADP bound
HSP60 (GroEL) - HSP10 (GroES)
(CHAPERONINAS)
Presente en Eubacteria, Cloroplasto y Mitocondria.
Dominio apical: expone parches hidrofobicos
Reconoce preferentemente intermediarios avanzados de plegamiento
En E. coli aprox. 10-15 % de las proteinas sintetizadas inteactua con GroEL-GroES.
ATPATP
7 ATP
7 ADP
ADP ADP ADP ADP
: folded protein: unfolded protein
HSP60 (GroEL) - HSP10 (GroES)
CICLO CATALITICO
ATP ATP
7 ATP
7 ADP
UNION DEL
POLIPEPTIDO
ENCAPSULAMIENTO DEL
POLIPEPTIDO
UNION DEL
POLIPEPTIDO TRANS
LIBERACION DE LA
CAVIDAD CIS
Dominio apical: expone parches hidrofóbicos. Luego de unirse el sustrato y GroES este dominio gira 90 grados y se ocultan los residuos hidrofóbicos. Se genera una cavidad hidrofílica (caja de Anfinsen) capaz de contener ligandos de hasta 60 kDa.
La HSP60 son un poco más vivas en las 70s:
Superficie más hidrofóbica
Superficie más hidrofílica
¿De qué forma las HSP60 (llamadas chaperoninas) ayudan al plegado?
Aislan al sustrato: evitan agregación
Despliegan al sustrato (¿?): rompiendo estructuras mal plegadas que cayeron en mínimos locales de energía. Esto puede darse de forma pasiva o activa (¿?)
Confinan al sustrato: restringiendo su libertad conformacional, y por ende el número de estados que puede explorar (disminuyen la entropía (ln ) del estado desplegado).
SS
PDI
SH SH
PROTEÍNA
S
S
SH
SH
PDI
PROTEÍNA
SH SH
PDI
SS
PROTEÍNA
MAQUINARIA DE RECICLADO
FORMACION DE PUENTES DISULFURO: PDI
LA PDI “NO SABE” SI UN PUENTE DISULFURO ES CORRECTO. HAY UN JUEGO ENTRE ESTABILIDAD Y CINETICA.
CITOSOL:
[GSH] : [GSSG] = 30:1 A 100:1
RETICULO ENDOPLASMICO:
[GSH] : [GSSG] = 1:1 A 1:3
Las PDIs cumplen varias funciones:
ESH
SH
S
HS
S
HS
ESH
S
S
HS
HS
HS
S
HS
S
S
S
S
S
HS
ES
S
ESH
SH
OXIDO-REDUCCIONOXIDO-REDUCCION
ISOMERIZACION
Y están altamente especializadas a determinados sustratos. En el RE hay unas 18 PDIs distintas.
PROTEASOMA
2.5 Mda, PORO INTERNO 5 nm
26S: 20S (CATALITICA) + 19S (REGULATORIA)
UBICUO Y ESENCIAL EN EUCARIOTAS. UBICUO Y NO ESENCIAL EN ARQUEA. RARO Y NO ESENCIAL EN BACTERIAS
FUNCIONES: DEGRADACION DE PROTEINAS DAÑADAS O MAL PLEGADAS. CONTROL DE LA VIDA MEDIA DE PROTEINAS REGULATORIAS (Péptidos para MHC !!!)
7 7 7 7
¿CUAN GENERAL ES LA DEGRADACION PROTEICA?
DEPENDE DE CADA PROTEINA.
Ej.: CFTR MAS DEL 90 % SE DEGRADA VIA PROTEASOMA, PARA EL CASO DE LA MUTANTEF508 LA PROPORCION ES MUCHO MAYOR
ES LA SUBUNIDAD CATALITICA. SE SINTETIZA CON UNPROPEPTIDO QUE SE CLIVA AUTOCATALTICAMENTE EN PARALELOCON EL ENSAMBLADO. ¿CUAL SERIA LA VENTAJA DE ESTO?
MECANISMO PROCESIVO. GENERA PEPTIDOS DE 6-10 RESIDUOS.
80-90% DE LA DEGRADACION PROTEICA ES VIA PROTEASOMA
TF: trigger factor. Miembro de la familia FBP
DnaKDnaJ
TF
PROTEINA NATIVA
+ GroEL+ ATP+ GroES
ACCION SECUENCIAL DE CHAPERONAS
SINTESIS PROTEICA EN E. coli
ACCION SECUENCIAL DE CHAPERONAS
SINTESIS PROTEICA EN EUCARIOTES
+ TRiC+ ATP
PROTEINA NATIVA
Hdj1
Sis1p
NACSsb1p/2p
ENFERMEDADES DE PLEGAMIENTO
MAL DE ALZHEIMER (2.000.000 EN USA)
MAL DE PARKINSON (500.000 EN USA)
ENFERMEDADES POR POLIGLUTAMINAS (HUNTINGTON, KENNEDY, ATAXIA, ETC)
MAL DE LA VACA LOCA (BSE)
¿Qué ocurre cuando una proteína no puede plegarse correctamente y no es degradada?
OBSERVACION EN CEREBROS CON BSE:
DEPOSITOS FIBRILARES: AMILOIDES
ENFERMEDADES DE PLEGADO
ENFERMEDAD COMPONENTE PRINCIPAL DEL AGREGADO
Alzheimer’s disease Aβ peptides (plaques); tau protein (tangles)
Spongiform encephalopathies Prion (whole or fragments)
Parkinson’s disease α-synuclein (wt or mutant)
Primary systemic amyloidosis Ig light chains (whole or fragments)
Secondary systemic amyloidosis Serum amyloid A (whole or 76-residue fragment)
Fronto-temporal dementias Tau (wt or mutant)
Senile systemic amyloidosis Transthyretin (whole or fragments)
Familial amyloid polyneuropathy I Transthyretin (over 45 mutants)
Hereditary cerebral amyloid angiopathy Cystatin C (minus a 10-residue fragment)
Haemodialysis-related amyloidosis β2-microglobulin
Familial amyloid polyneuropathy III Apolipoprotein AI (fragments)
Finnish hereditary systemic amyloidosis Gelsolin (71 amino acid fragment)
Type II diabetes Amylin (fragment)
Medullary carcinoma of the thyroid Calcitonin (fragment)
Atrial amyloidosis Atrial natriuretic factor
Hereditary non-neuropathic systemic amyloidosis Lysozyme (whole or fragments)
Injection-localised amyloidosis Insulin
Hereditary renal amyloidosis Fibrinogen α-A chain, transthyretin, apolipoprotein AI, apolipoprotein AII,
lysozyme, gelsolin, cystatin C
Amyotrophic lateral sclerosis Superoxide dismutase 1 (wt or mutant)
Huntington’s disease Huntingtin
Spinal and bulbar muscular atrophy Androgen receptor [whole or poly(Q) fragments]
Spinocerebellar ataxias Ataxins [whole or poly(Q) fragments]
Spinocerebellar ataxia 17 TATA box-binding protein [whole or poly(Q) fragments]
¿ QUE OCURRE CUANDO UNA PROTEINA MAL PLEGADA NO ES DEGRADADA ?
EJEMPLO: MAL DE LA VACA LOCA (BSE)
….y a mediados de los 90s
NUEVA VARIANTE DE LA ENFERMEDAD DE CREUTZFELDT-JAKOB (vCJD)
CASOS vCJD
0
2
4
6
8
10
12
95
96
97
AÑO
….en los 80s
CASOS BSE
0
10000
20000
30000
40000
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
AÑO
PRION (PrP)
• SE ENCUENTRA NORMALMENTE EN MUCHOS TEJIDOS
• FUNCION: DESCONOCIDA (!)
• LOCALIZACION: EN LA MEMBRANA CELULAR, DEL LADO EXTERNO
PROBLEMA: NO DA AMILOIDES !!!
PrPC PrPScAMILOIDE
(SIN EMBARGO NO ES TAN SIMPLE)
LA DOBLE VIDA DE PrP
(“El extraño caso del Dr. Jekyll y Mr. Hyde” R.L. Stevenson)
UN MODELO POSIBLE PARA LA GENERACION DE AMILOIDES
Stanley Prusiner
Premio Nobel de Medicina 1997
INDUCCION PROPAGACION
AMILOIDE
MODELO DE PRUSINER
CONVERSION
PrPC PrPSc
INFORMACION “NO GENETICA”
INDUCCION CONFORMACIONAL
OVEJA
SCRAPIE (200 años)
¿ES NUEVA? SIMILAR AL KURU
GRUPO LINGUISTICO “FORE” DE PAPUA NUEVA GUINEA POR CANIBALISMO
HUMANOVACA
CARNIVORA !!!
¿PORQUE APARECIO LA vCJD AHORA?
ALGUNAS COSAS IMPORTANTES
EVOLUCION TEMPORAL DE LA FORMACION DE AGREGADOS:
AGREGACION
TIEMPO
FASE LAG FASE DE ELONGACION
RAPIDOLENTO
CAMBIOCONFORMACIONAL
SIEMBRA
Y EN BASE A ESTO PODEMOS ENTENDER ALGUNAS COSAS:
¿POR QUE MUTACIONES QUE DISMINUYE LA ESTABILIDAD DE UNA PROTEINA PUEDEN FACILITAR LA FORMACION DE AMILOIDES? CJD
¿COMO SE PRODUJO LA vCJD?
Y ACA HAY DOS MODELOS CINETICOS MUY DIFICILES DE DISCRIMINAR:
EFECTO “INDUCTIVO”
EFECTO RESERVORIO
Ambos dan cinéticas similares
MAS COSAS IMPORTANTES:
EN PRINCIPIO LA FORMACION DE AMILOIDES ES UNA PROPIEDAD INTRINSECA DE TODAS LAS PROTEÍNAS. ES UN PROCESO INEVITABLE DADA LAS CARACTERISTICAS FISICAS Y QUIMICAS DE UNA CADENA DE ALFA-AMINOACIDOS (Dobson)
SIMPLIFICANDO LAS COSAS: LAS CADENAS LATERALES CODIFICAN LA INFORMACION PARA LA ESTRUCTURA TERCIARIA, Y EL BACKBONE CODIFICA LA INFORMACION PARA AMILOIDES
SI EN UN CULTIVO SE EXPRESA UNA PROTEINA QUE FORMA AMILOIDES NO RELACIONADA A NINGUNA PATOLOGIA CONOCIDA, POR LO COMUN RESULTA DELETEREA
HAY UNA RELACION BASTANTE DIRECTA ENTRE ESTABILIDAD CONFORMACIONAL Y TENDENCIA A FORMAR AMILOIDES
(HSP´)
INTERMEDIARIOSAVANZADOS
ENSAMBLADOSGLOBULARES
AGREGADOSTEMPRANOSEN FORMADE PORO
PORO DE MEMBRANA
FIBRA MADURA
¿CUAL ES LA ESPECIE TOXICA?
EN UN PRINCIPIO SE CREYO QUE LA ESPECIE TOXICA ERAN LOS AMILOIDES. SIN EMBARGO LUEGO SE VIO QUE NO HAY UNA CORRELACION ENTRE EL NIVE DE DAÑO CELULAR Y LA FORMACION DE AMILOIDES.
¿PORQUE ES TOXICA?
ACA HAY DEMASIADAS TEORIAS Y POCAS RESPUESTAS:
1) POROS2) TEORIA DE SECUESTRO3) INHIBICION DEL PROTEASOMA
SI LAS ESPECIES TOXICAS SON LOS AGREGADOS PREVIOS AL AMILOIDE,¿SE IMAGINAN QUE HUBIERA PASADO DE HABERSE APLICADO TERAPIAS TENDIENTES A DESTRUIR LOS AMILOIDES?
DE HECHO HAY UN CONSENSO CADA VEZ MAYOR DE QUE EN ALGUNOS CASOS LOS AMILOIDES SERIAN UNA FORMA DE RESPUESTA PROTECTIVA
CUERPOS DE INCLUSION (IB: INCLUSION BODIES)
Problema muy común al expresar proteínas recombinantes.
Al expresar proteínas humanas en E. coli:
- SOLUBLES: 15-20 %
- CUERPOS DE INCLUSION 20-40 % - el resto no se expresa!!! (se degradan)
Masas amorfas densamente empaquetadas, formadas por proteínamal plegada (en general un 70 % o más corresponde a la proteínarecombinante, siendo el resto proteínas bacterianas).
En E. coli se observa en general uno solo por célula, con un tamaño en el orden de 0.2 a 1.5 m. Pueden llegar a distorsionar la pared celular.
¿Porqué se
forman?
Maquinaria inadecuada o insuficiente de chaperonas
Falta de modificaciones postraduccionales (ej. glicosilación)
Síntesis demasiado rápida para la cinética de plegamiento de la proteína
¿Como lo evitamos?
Bajar la temperatura (28ºC)
Usar niveles de expresión más bajos: menos inductor, medios de cultivo menos ricos o cambio de vector.
A veces se puede co-expresar una chaperona ausente en el sistema heterólogo
¿Se puede recuperar la proteína de un IB de forma funcional?
Muchas veces sí:
1) Limpiar los IB (urea a baja cc, tritón X-100, NaCl, etc. Todo a baja T). A veces se puede tener la proteína con una pureza mayor del 90 %.
2) Resuspenderlos (urea 6-8 M, guanidinio-HCl 6 M, con o sin DTT)
3) Plegar la proteína: -diálisis de a poco
-dilución brusca
-unida a una columna (ej. IMAC)
4) Caracterizar la proteína: dicroísmo far-UV y near-UV, actividad biológica, etc
UNA VISION GOBAL DEL PLEGADO DE LAS PROTEINAS:
SINTESIS
(HSP)
INTERMEDIARIOSTEMPRANOS
(HSP´)
INTERMEDIARIOSAVANZADOS NATIVA
CRISTALOLIGOMERO
HETEROCOMPLEJO
DIMEROSTRIMEROSFIBRAS
AGREGADODESORDENADO
(IB)
AGREGADOORDENADOPREFIBRILAR
FIBRAAMILOIDE
DEGRADACIONPROTEASOMAL
