PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/17951/2/108114014_full.pdf · sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar sarjana farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi,

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

FASE TERBALIK UNTUK PENETAPAN KADAR SALBUTAMOL

SULFAT DAN GUAIFENESIN DALAM SEDIAAN SIRUP MEREK “X”

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Agustinus Hendy Larsen

NIM: 108114014

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii




SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Agustinus Hendy Larsen

NIM: 108114014

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014


iii


iv


v

Halaman Persembahan

Aku dilahirkan bukan dengan tingkat kepintaran/kepandaian yang tinggi..,

tetapi dengan hoki yang cukup memuaskan.. (Larsen, 2014)

Skripsi itu... Ngga semudah apa yg kamu bayangkan... Ngga sesulit apa yg

kamu pikirkan... (Larsen, 2014)

Seorang ayah dapat dengan mudah memiliki anak.. Jauh lebih sulit bagi

seorang anak untuk dapat memiliki ayah yang sejati..

Mah.. Pah.. ndy minta maaf ya.. ndy minta bantu doa ne terus ya Mah,

Pah.. Biar ndy dapat menjadi orang sukses.. ndy cuma pengin mbuat

Mamah sama Papah bangga sama ndy, dan juga bahagia.. Amin..

Penyesalan selalu datang belakangan.., kalau di depan namanya

pendaftaran..

Real eyes.. Realize.. Real lies..

Kupersembahkan untuk:

Mamah, Alm. Papah, Oh Yus, Picky

Saudara, Sahabat, Teman, dan Almamaterku


vi


vii


viii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat dan anugerah yang telah diberikan sehingga penelitian dan penyusunan

skripsi yang berjudul “Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Fase Terbalik untuk Penetapan Kadar Salbutamol Sulfat dan Guaifenesin dalam

Sediaan Sirup Merek “X”” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun

sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar sarjana farmasi (S. Farm.) di Fakultas

Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,

penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena

itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku Dosen Pembimbing yang

bersedia membimbing, memberi masukan dan jalan keluar serta saran yang

sangat bermanfaat dalam menyelesaikan penelitian ini hingga penyusunan

naskah skripsi.

3. Jeffry Julianus, M.Si. dan Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku

dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membangun

dalam penyusunan skripsi.

4. Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing akademik atas

pendampingannya dari semester awal hingga akhir ini.


ix

5. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

yang telah mendampingi, membagi ilmu dan pengalamannya yang sangat

bermanfaat dalam bidang farmasi.

6. Seluruh Staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma terutama Mas Bimo, Mas Agung, Mas Kayat, Pak Parlan, Mas

Otok, Pak Mus, dan Pak Iswandi yang telah banyak membantu dan bersedia

untuk direpotkan selama penulis menyelesaikan penelitian skripsi ini.

7. PT. Ifars Pharmaceutical Laboratories yang telah bersedia memberikan

senyawa standar Salbutamol Sulfat yang berguna bagi penelitian.

8. Yani Ardiyanti, SF., Apt., M.Sc., yang telah bersedia memberikan senyawa

standar Guaifenesin yang berguna bagi penelitian.

9. Mamah Dra. Bernardine Susy Mayawati Soeharto, Alm. Papah Bernardus

Bambang Hermantodjojo, Ooh Vinsensius Julius Marco, S. Farm., Apt., dan

Yoseph Picky Martisen yang telah mendoakan dan terus memberikan

semangat agar cepat selesai skripsi dan kuliahnya.

10. JiKo Indah Susilowati/Souw Swan Ie dan keluarga yang telah membantu

membiayai perkuliahan dan kehidupan penulis selama kuliah serta

mendoakan dan juga memberikan semangat.

11. Um Ir. Laurentius Darmawan Soeharto yang telah memberikan laptop

kepada penulis, karena tanpa laptop ini penulis mengalami kesulitan selama

penyusunan skripsi dan perkuliahan.


x

12. Olivia Christie Anjalicca Endut wud wud yang selalu membantu, memberi

perhatian, menyemangati, menghibur di saat sedih, dan selalu ada untuk

penulis.

13. Ricardo Kenny Chandra, S. Farm. yang sangat banyak membantu,

mendukung, menyemangati, dan menghibur penulis di saat penulis

kehilangan semangat.

14. Christian Gunawan, S. Farm. (Master) yang sangat sabar dan baik hati

dalam membantu, mendukung, dan menyemangati penulis.

15. Aries Mulyawan dan Priscilla Novelia S. sebagai teman sekelompok

perjuangan skripsi.

16. Olek, Eng, Odex, Daniel, Ita Oki, Angel Endul, Cilla Ciun, DeKa, Harris,

Hanna HP, Ko Demas, Verica, Mba Astri, Desti, Tomas, Angga, Bakti,

Tora, serta teman-teman semua yang telah membantu, mendukung,

menyemangati penulis.

17. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih atas

dukungannya.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan di dalam skripsi ini.

Oleh karena itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis

harapkan. Semoga skripsi ini dapat membantu dan bermanfaat bagi pembaca dan

dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ……………………………………………………...

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING …………………………..

HALAMAN PENGESAHAN …………………………………………….

HALAMAN PERSEMBAHAN …………………………………………..

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA …………………………………..

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI ………………………………..

PRAKATA ………………………………………………………………..

DAFTAR ISI ……………………………………………………………...

DAFTAR TABEL ………………………………………………………...

DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………...

DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………...

INTISARI ………………………………………………………………....

ABSTRACT ………………………………………………………………..

BAB I PENDAHULUAN ………………………………………………..

A. Latar Belakang ……………………………………………………...

1. Permasalahan …………………………………………………..

2. Keaslian Penelitian ……………………………………………..

3. Manfaat Penelitian ……………………………………………..

B. Tujuan Penelitian …………………………………………………...

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA …………………………………….

A. Penyakit Saluran Pernapasan .............................................................

ii

iii

iv

v

vi

vii

viii

xi

xv

xvi

xxi

xxiii

xxiv

1

1

3

3

4

5

6

6


xii

B. Salbutamol Sulfat …………………………………………………...

C. Guaifenesin ………………………………………………………....

D. Spektrofotometri Ultraviolet ………………………………………..

E. Larutan Penyangga (Bufer) ………………………………………....

F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ………………………...

1. Tinjauan umum KCKT ………………………………………...

2. Instrumentasi ...............................................................................

G. Validasi Metode Analisis …………………………………………...

1. Tinjauan umum validasi metode analisis ……………………....

2. Parameter validasi metode analisis .............................................

H. Landasan Teori ……………………………………………………...

I. Hipotesis …………………………………………………………….

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ………………………………...

A. Jenis dan Rancangan Penelitian …………………………………...

B. Variabel Penelitian ………………………………………………...

C. Definisi Operasional ……………………………………………....

D. Bahan Penelitian …………………………………………………..

E. Alat Penelitian ..................................................................................

F. Tatacara Penelitian ...........................................................................

1. Pembuatan asam fosfat 0,1 M ………………………………….

2. Pembuatan bufer kalium dihidrogen fosfat 0,01 M ....................

3. Pembuatan fase gerak …………………………………………..

6

8

9

14

16

16

16

21

21

23

25

26

27

27

27

28

28

29

29

29

29

30


xiii

4. Pembuatan larutan baku salbutamol sulfat dan guaifenesin yang

digunakan untuk penentuan panjang gelombang pengamatan ....

5. Pembuatan larutan baku salbutamol sulfat ……………………..

6. Pembuatan larutan baku guaifenesin …………………………...

7. Pembuatan seri larutan baku campuran salbutamol sulfat dan

guaifenesin ……………………………………………………..

8. Penetapan panjang gelombang (λ) maksimum salbutamol sulfat

dan guaifenesin dengan spektrofotometer UV-Vis …………….

9. Preparasi sampel .........................................................................

10. Preparasi adisi baku dalam sampel .............................................

11. Validasi metode analisis ………………………………………..

12. Uji kestabilan larutan baku …………………………………….

G. Analisis Hasil ……………………………………………………...

1. Selektivitas ……………………………………………………..

2. Linieritas .....................................................................................

3. Akurasi ………………………………………………………....

4. Presisi …………………………………………………………..

5. Rentang ………………………………………………………...

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………....

A. Pembuatan Fase Gerak …………………………………………….

B. Pembuatan Larutan Baku ………………………………………….

C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan ……………………...

30

31

31

31

32

32

33

33

34

35

35

35

36

36

37

38

38

39

41


xiv

D. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR) Salbutamol

Sulfat dan Guaifenesin …………………………………………….

E. Pembuatan Kurva Baku Salbutamol Sulfat dan Guaifenesin ……..

F. Validasi Metode Analisis .................................................................

1. Selektivitas ……………………………………………………..

2. Linieritas .....................................................................................

3. Akurasi ………………………………………………………....

4. Presisi …………………………………………………………..

5. Rentang ………………………………………………………...

G. Uji Kestabilan Larutan Baku ...........................................................

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………….

A. Kesimpulan ………………………………………………………..

B. Saran ……………………………………………………………....

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………..

LAMPIRAN ……………………………………………………………....

BIOGRAFI PENULIS …………………………………………………….

45

49

53

53

56

56

58

59

59

62

62

62

63

66

114


xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I.

Tabel II.

Tabel III.

Tabel IV.

Tabel V.

Tabel VI.

Tabel VII.

Tabel VIII.

Tabel IX.

Tabel X.

Tabel XI.

Jenis bufer dalam analisis menggunakan KCKT …………....

Nilai UV cut-off pelarut dalam analisis menggunakan KCKT..

Kategori metode pengujian validitas ………………………....

Parameter validasi yang dipersyaratkan untuk validasi metode

analisis ………………………………………………………..

Kriteria rentang % Recovery yang diperbolehkan ………........

Kriteria KV atau % RSD yang diperbolehkan ………………..

Penentuan kurva baku guaifenesin ……………………….......

Nilai resolusi (Rs) campuran baku dan sampel …………........

Hasil penetapan % Recovery baku guaifenesin adisi ……........

Hasil persen perubahan (%) pada uji kestabilan guaifenesin ...

Hasil persen perubahan (%) pada uji kestabilan salbutamol

sulfat .........................................................................................

16

18

22

22

24

25

51

55

58

60

61


xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1.

Gambar 2.

Gambar 3.

Gambar 4.

Gambar 5.

Gambar 6.

Gambar 7.

Gambar 8.

Gambar 9.

Gambar 10.

Gambar 11.

Gambar 12.

Gambar 13.

Gambar 14.

Gambar 15.

Gambar 16.

Gambar 17.

Struktur salbutamol sulfat …………………………………….

Struktur guaifenesin ..................................................................

Gambaran eksitasi elektron …………………………………...

Penyerapan sinar UV oleh larutan ……………………………

Diagram skematis spektrofotometer UV-Vis ………………...

Monokromator ………………………………………………..

Diagram skematis sistem KCKT secara umum ………………

Kolom pada KCKT …………………………………………...

Spektra salbutamol sulfat 3 seri konsentrasi dengan pelarut

metanol ……………………………………………………….

Spektra guaifenesin 3 seri konsentrasi dengan pelarut metanol

Gugus kromofor dan auksokrom salbutamol sulfat …………..

Gugus kromofor dan auksokrom guaifenesin ...........................

Spektra tumpang tindih salbutamol sulfat dan guaifenesin ......

Kromatogram baku salbutamol sulfat (a), kromatogram baku

guaifenesin (b), dan kromatogram sampel (c) ..........................

Interaksi salbutamol sulfat dengan fase diam (a), interaksi

guaifenesin dengan fase diam (b) .............................................

Interaksi salbutamol sulfat dengan fase gerak (a), interaksi

guaifenesin dengan fase gerak (b) ............................................

Kurva baku guaifenesin ............................................................

7

8

10

11

13

14

17

20

42

42

43

43

44

46

47

48

51


xvii

Gambar 18.

Gambar 19.

Bentuk degradasi salbutamol sulfat ..........................................

Kromatogram pemisahan analit dalam campuran baku (a),

dalam sampel (b) .......................................................................

52

54

Gambar 20.

Gambar 21.

Gambar 22.

Gambar 23.

Gambar 24.

Gambar 25.

Gambar 26.

Gambar 27.

Gambar 28.

Gambar 29.

Gambar 30.

Gambar 31.

Gambar 32.

Gambar 33.

Gambar 34.

Gambar 35.

Gambar 36.

Gambar 37.

Gambar 38.

Gambar 39.

Kromatogram baku guaifenesin 36 μg/mL replikasi I ………..





Kromatogram baku guaifenesin 36 μg/mL replikasi II ………





Kromatogram baku guaifenesin 36 μg/mL replikasi III ……...





Kromatogram sampel 40 μg/mL replikasi I ..............................

Kromatogram sampel 40 μg/mL replikasi II ............................

Kromatogram sampel 40 μg/mL replikasi III ...........................



74

75

75

76

76

77

77

78

78

79

79

80

80

81

81

83

84

84

85

85


xviii

Gambar 40.

Gambar 41.

Gambar 42.




86

86

87

Gambar 43.

Gambar 44.

Gambar 45.

Gambar 46.

Gambar 47.

Gambar 48.

Gambar 49.

Gambar 50.

Gambar 51.

Gambar 52.

Gambar 53.

Gambar 54.

Gambar 55.

Gambar 56.

Gambar 57.

Gambar 58.

Gambar 59.

Gambar 60.

Gambar 61,


Kromatogram sampel rendah adisi replikasi I ..........................

Kromatogram sampel rendah adisi replikasi II .........................

Kromatogram sampel rendah adisi replikasi III .......................

Kromatogram sampel sedang adisi replikasi I .........................

Kromatogram sampel sedang adisi replikasi II ........................

Kromatogram sampel sedang adisi replikasi III .......................

Kromatogram sampel tinggi adisi replikasi I …........................

Kromatogram sampel tinggi adisi replikasi II ..........................

Kromatogram sampel tinggi adisi replikasi III .........................

Kromatogram baku guaifenesin 36 μg/mL 6 Maret 2014 ........









87

88

88

89

89

90

90

91

91

92

95

95

96

96

97

97

98

98

99


xix

Gambar 62.

Gambar 63.

Gambar 64.

Gambar 65.

Gambar 66.

Gambar 67.

Gambar 68.

Gambar 69.

Gambar 70.

Gambar 71.

Gambar 72.

Kromatogram baku salbutamol sulfat 0,8 μg/mL 5 Maret

2014............................................................................................


2014............................................................................................


2014............................................................................................


2014............................................................................................


2014............................................................................................


2014............................................................................................


2014............................................................................................


2014............................................................................................


2014............................................................................................

Kromatogram baku salbutamol sulfat 10 μg/mL 16 Januari

2014............................................................................................

Kromatogram baku salbutamol sulfat 10 μg/mL 8 Maret

2014............................................................................................

102

103

103

104

104

105

105

106

106

107

107


xx

Gambar 73.

Gambar 74.

Gambar 75.

Gambar 76.

Gambar 77.

Gambar 78.

Kromatogram baku campuran salbutamol sulfat 1,2 μg/mL

dan guaifenesin 80 μg/mL replikasi I .......................................


dan guaifenesin 80 μg/mL replikasi II ......................................


dan guaifenesin 80 μg/mL replikasi III .....................................

Kromatogram sampel 50 μg/mL untuk menunjukkan resolusi

replikasi I ..................................................................................


replikasi II .................................................................................


replikasi III ................................................................................

109

110

111

112

112

113


xxi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1.

Lampiran 2.

Lampiran 3.

Lampiran 4.

Lampiran 5.

Lampiran 6.

Lampiran 7.

Lampiran 8.

Lampiran 9.

Lampiran 10.

Lampiran 11.

Lampiran 12.

Lampiran 13.

Certificate of Analysis (CoA) salbutamol sulfat …………...

Certificate of Analysis (CoA) guaifenesin ………………....

Data penimbangan baku …………………………………...

Skema pembuatan larutan baku guaifenesin dan contoh

perhitungan kadar larutan baku yang digunakan …………..

Kromatogram baku guaifenesin untuk kurva baku ………...

Data penentuan kurva baku guaifenesin …………………...

Persamaan dan gambar kurva baku guaifenesin …………...

Kromatogram sampel ……………………………………....

Kromatogram sampel adisi ………………………………...

Perolehan nilai AUC sampel dan sampel adisi, contoh

perhitungan konsentrasi terukur, perhitungan % Recovery,

dan KV baku guaifenesin adisi …………………………….

Kromatogram baku guaifenesin untuk uji kestabilan larutan

baku guaifenesin …………………………………………...

Perolehan nilai AUC baku guaifenesin, contoh perhitungan

konsentrasi terukur dan perhitungan % perubahan untuk uji

kestabilan larutan baku guaifenesin ………………………..

Skema pembuatan larutan baku salbutamol sulfat dan

contoh perhitungan kadar larutan baku yang digunakan

untuk uji kestabilan larutan baku salbutamol sulfat ……….

67

69

72

72

74

82

82

83

88

92

95

99

101


xxii

Lampiran 14.

Lampiran 15.

Lampiran 16.

Lampiran 17.

Kromatogram baku salbutamol sulfat untuk uji kestabilan

larutan baku salbutamol sulfat ……………………………..

Perolehan nilai AUC baku salbutamol sulfat, contoh

perhitungan % perubahan untuk uji kestabilan larutan baku

salbutamol sulfat …………………………………………...

Kromatogram untuk menunjukkan resolusi pemisahan

salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam larutan baku

campuran …………………………………………………...

Kromatogram untuk menunjukkan resolusi pemisahan

salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam sampel …………..

102

108

109

112


xxiii




INTISARI

Salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam sediaan biasanya digunakan

untuk mengobati penyakit batuk berdahak yang disertai dengan sesak napas

(bronkitis). Kombinasi kedua senyawa ini harus dapat menghasilkan efek

terapeutik yang diharapkan. Untuk menjamin keamanan dan keefektivannya,

maka perlu dilakukan analisis penetapan kadar kedua senyawa tersebut dengan

metode yang telah tervalidasi.

Penelitian yang dilakukan bersifat non eksperimental deskriptif.

Salbutamol sulfat dan guaifenesin dianalisis secara kuantitatif menggunakan

sistem KCKT fase terbalik yang optimal dengan fase diam C18 merek Shimadzu

(250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 μm), fase gerak metanol : 0,01 M bufer kalium

dihidrogen fosfat pH 3 (40:60) dengan kecepatan alir fase gerak 1 mL/min dan

detektor UV pada panjang gelombang 275 nm.

Parameter validitas yang digunakan adalah selektivitas, linieritas,

akurasi, presisi, dan rentang. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode KCKT

fase terbalik yang digunakan memiliki selektivitas yang baik dengan adanya

pemisahan sempurna dari peak kedua senyawa di atas dan linieritas yang baik

untuk guaifenesin dengan nilai (r) sebesar 0,9997. Akurasi, presisi, dan rentang

yang baik berada pada tingkat konsentrasi sedang/tengah (guaifenesin 50 μg/mL)

dengan nilai % Recovery sebesar 100,09-101,28% dan KV sebesar 0,59%.

Berdasarkan hasil tersebut, metode KCKT fase terbalik pada penetapan kadar

guaifenesin dalam sediaan sirup “X” memenuhi parameter validitas yang baik,

tetapi tidak untuk salbutamol sulfat.

Kata kunci: salbutamol sulfat, guaifenesin, KCKT, sirup, validasi


xxiv

VALIDATION METHOD OF REVERSE PHASE HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY TO PERFORM THE ASSAY OF

SALBUTAMOL SULFATE AND GUAIFENESIN IN THE SYRUP

DOSAGE FORM BRAND “X”

ABSTRACT

Salbutamol sulfate and guaifenesin dosage form is usually used to treat

productive cough that is accompanied by breathless (bronchitis). The combination

of both compounds should be able to produce a therapeutic effect to be expected.

To ensure the safety and effectiveness of the compounds, an analysis is needed to

determine the compounds with methods that have been validated.

Study was conducted with a non experimental descriptive. Salbutamol

sulfate and guaifenesin was analyzed quantitatively using reversed-phase HPLC

system with an optimal C18 stationary phase (250 × 4.6 mm, 5 μm particle size)

brand Shimadzu, mobile phase methanol : 0.01 M potassium dihydrogen

phosphate buffer pH 3 (40 : 60) with a flow rate 1 mL/min and UV detector at a

275 nm wavelength.

Parameter validity used were selectivity, linearity, accuracy, precision,

and range. The result of the study showed that the reversed-phase HPLC method

used had good selectivity in the presence of a perfect separation of the two

compounds above peak and good linearity for the guaifenesin with values (r) of

0.9997. Accuracy, precision, and a good range of concentration levels are at

moderate or middle (guaifenesin 50 μg/mL) with a value of % Recovery 100.09 to

101.28% and CV 0.59%. Based on these results, reversed-phase HPLC method to

determine of guaifenesin in syrup "X" meets the parameters of good validity, but

not for salbutamol sulfate.

Key words: salbutamol sulfate, guaifenesin, HPLC, syrup, validation


1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Asma adalah suatu penyakit pernapasan yang ditandai dengan inflamasi

saluran pernapasan yang menyebabkan aliran udara ke dan dari paru kurang

lancar, sehingga menimbulkan gejala-gejala khas yaitu batuk, mengi, dan sesak

napas (UBM Medica, 2011). Asma merupakan salah satu penyakit yang dapat

menyebabkan kematian. Berdasarkan penelitian International Study on Asthma

and Allergies in Childhood, diperkirakan 2-5% penduduk Indonesia menderita

asma, dan umumnya prevalensi asma di perkotaan lebih tinggi dibanding di

pedesaan (Oemiati dkk., 2010). Salah satu obat yang digunakan dalam pengobatan

asma adalah salbutamol sulfat.

Batuk adalah suatu respon alami tubuh untuk menjaga agar tenggorokan

dan saluran napas kita bersih. Selain itu, batuk juga dapat menandakan terjadinya

penyakit lain, misalnya asma. Perokok dewasa biasanya mengalami batuk kronik

yang disertai dengan sesak asma dengan angka kejadian sekitar 24-29%

(Dicpinigaitis, 2006). Batuk yang disertai asma terjadi karena pengentalan lendir

pada lapisan epitel di saluran pernapasan, sehingga jalannya udara menjadi

terhambat. Salah satu obat yang digunakan dalam pengobatan batuk seperti ini

adalah guaifenesin.

Penggunaan kombinasi salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam sediaan

obat ditujukan untuk pasien yang mengalami batuk berdahak disertai dengan

sesak napas (bronkitis). Kombinasi ini dapat berfungsi sebagai bronkodilator dan


2

ekspektoransia pada asma bronkial, bronkitis kronik dan emfisema, dengan

sputum pada saluran pernapasan (UBM Medica, 2011). Untuk menjamin

keamanan dan keefektivan obat tersebut, perlu dilakukan analisis berupa

penetapan kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin dengan teliti.

Penelitian mengenai penetapan kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin

pernah dilakukan oleh Walode dkk. (2013) menggunakan metode Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan fase gerak asetonitril dan bufer fosfat serta

Korany dkk. (2010) menggunakan KCKT dengan kecepatan alir fase gerak

1,5 mL/min. Penelitian tersebut dianggap kurang efisien dan ekonomis karena

menggunakan asetonitril (biaya mahal) serta membutuhkan jumlah fase gerak

yang cukup banyak, maka peneliti mencoba untuk mengembangkan metode yang

lebih efisien dan ekonomis.

Metode yang dipilih dalam penelitian ini yaitu metode KCKT fase

terbalik karena KCKT merupakan salah satu teknik pemisahan campuran yang

modern dan memiliki kelebihan dalam hal selektivitas dan sensitivitasnya untuk

pemisahan suatu campuran. Selain itu, KCKT juga dapat digunakan untuk

menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi (jika

dibandingkan dengan Gas Chromatography) karena dapat dilakukan pada suhu

kamar dan tidak terbatas pada senyawa organik saja (Kazakevich dan

Lobrutto, 2007).

Untuk dapat menetapkan kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam

sediaan sirup, diperlukan serangkaian penelitian terdahulu yaitu optimasi dan

validasi metode. Menurut Mulyawan (2014), kondisi KCKT yang optimal yaitu


3

dengan menggunakan fase diam C18 merek Shimadzu (250 x 4,6 mm, ukuran

partikel 5 μm), fase gerak metanol : 0,01 M bufer kalium dihidrogen fosfat pH 3

(40:60) dengan kecepatan alir fase gerak 1 mL/min.

Dalam hal ini, peneliti mengambil bagian pada tahap validasi metode.

Suatu metode analisis harus divalidasi ketika baru pertama kali dikembangkan dan

belum divalidasi. Tujuan validasi yaitu untuk memberikan jaminan bahwa metode

analisis yang digunakan memenuhi parameter-parameter validasi yang meliputi

selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang. Validasi metode merupakan

tahapan yang penting untuk dilakukan dalam suatu penetapan kadar senyawa agar

dapat memberikan hasil yang dapat dipercaya dan dipertanggungjawabkan.

1. Permasalahan

Apakah metode KCKT fase terbalik pada penetapan kadar salbutamol

sulfat dan guaifenesin dalam sediaan sirup merek “X” menggunakan fase diam

C18 merek Shimadzu (250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 μm), fase gerak metanol

: 0,01 M bufer kalium dihidrogen fosfat pH 3 (40:60) dengan kecepatan alir

fase gerak 1 mL/min, memenuhi parameter-parameter validasi yaitu

selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang?

2. Keaslian Penelitian

Penelitian pengembangan dan validasi metode kuantifikasi salbutamol

sulfat dan guaifenesin dengan menggunakan metode KCKT telah dilakukan

oleh:


4

a. Walode dkk. (2013) dengan penelitian penetapan kadar salbutamol

sulfat dan guaifenesin menggunakan fase diam C18 (250 x 4,6 mm), fase gerak

asetonitril : 50 mM bufer dinatrium hidrogen fosfat dan 0,1% trietilamin

pH 3,0 (36:64) dengan kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/min.

b. Korany dkk. (2010) dengan penelitian penetapan kadar salbutamol

sulfat dan guaifenesin menggunakan fase diam C18 (250 x 4,6 mm) dengan fase

gerak metanol : 0,01 M bufer natrium dihidrogen fosfat pH 3,2 (40:60) dengan

kecepatan alir fase gerak 1,5 mL/min.

Berdasarkan penelitian di atas, penelitian validasi metode penetapan

kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam sediaan sirup merek “X” dengan

metode KCKT fase terbalik fase diam C18 merek Shimadzu (250 x 4,6 mm,

ukuran partikel 5 μm) dan fase gerak metanol : 0,01 M bufer kalium dihidrogen

fosfat pH 3 dengan kecepatan alir fase gerak 1 mL/min belum pernah

dilakukan sebelumnya. Keunggulan dari penelitian yang dilakukan

dibandingkan penelitian sebelumnya yaitu lebih efisien dan ekonomis karena

tidak menggunakan asetonitril dan jumlah fase gerak yang lebih sedikit.

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat metodologis.

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmiah

tentang penggunaan metode KCKT fase terbalik dengan fase diam C18 merek

Shimadzu (250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 μm) dan fase gerak metanol :

0,01 M bufer kalium dihidrogen fosfat pH 3 (40:60) dengan kecepatan alir fase


5

gerak 1 mL/min (Mulyawan, 2014) pada penetapan kadar salbutamol sulfat dan

guaifenesin dalam sediaan sirup merek “X”.

b. Manfaat praktis.

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai

validitas metode (selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang), sehingga

metode KCKT fase terbalik yang telah optimal (Mulyawan, 2014) dapat

digunakan/diaplikasikan untuk penetapan kadar salbutamol sulfat dan

guaifenesin dalam sediaan sirup merek “X”.

B. Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode KCKT fase

terbalik pada penetapan kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin dengan fase diam

C18 merek Shimadzu (250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 μm) dan fase gerak

metanol : 0,01 M bufer kalium dihidrogen fosfat pH 3 (40:60) dengan kecepatan

alir fase gerak 1 mL/min, apakah memenuhi parameter-parameter validasi yaitu

selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang sehingga dapat digunakan

untuk penetapan kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam sediaan sirup

merek “X”.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Penyakit Saluran Pernapasan

Batuk dan asma merupakan penyakit yang mengganggu saluran

pernapasan. Batuk adalah suatu proses alami dan refleks proteksi pada individu

sehat untuk menjaga agar tenggorokan dan saluran napas tetap bersih. Adakalanya

batuk juga merupakan salah satu tanda dari penyakit lain seperti asma (UBM

Medica, 2011).

Menurut The National Asthma Education and Prevention Program, asma

merupakan gangguan inflamasi kronik jalannya udara pada saluran pernapasan.

Pada individu yang rentan, inflamasi dapat menyebabkan episode berulang dari

sesak napas, bengek, batuk, dan sempit dada (Sukandar dkk., 2009).

Penyakit batuk yang disertai dengan asma disebut juga penyakit

bronkitis. Secara garis besar bronkitis disebabkan karena saluran pernapasan yang

teriritasi terus-menerus, sehingga terjadi peradangan dan produksi mukus/dahak

yang berlebihan. Penyakit ini biasa diobati dengan menggunakan kombinasi

salbutamol sulfat dan guaifenesin (UBM Medica, 2011).

B. Salbutamol Sulfat

Salbutamol sulfat (bentuk garam salbutamol) mengandung tidak kurang

dari 98,5% dan tidak lebih dari 101,0% (C13H21NO3)2.H2SO4 dengan bobot

molekul 576,7 g/mol (Moffat dkk., 2005). Salbutamol sulfat mudah larut dalam

air, sukar larut dalam etanol, kloroform, dan eter. Zat ini lebih baik disimpan


7

dalam wadah tertutup baik dan tidak tembus cahaya (Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).

Gambar 1. Struktur salbutamol sulfat (Jyothi dkk., 2012)

Salbutamol sulfat (Gambar 1) dalam suasana asam memiliki λmax 276 nm

dengan nilai 71a dan dalam suasana basa memiliki λmax 245 nm dengan

nilai 510a; serta λmax 295 nm dengan nilai

133a. Salbutamol

sulfat memiliki nilai log P (oktanol/air) = 0,6 serta nilai pKa 9,3 dan 10,3

(Moffat dkk., 2011).

Penelitian mengenai analisis salbutamol sulfat dengan menggunakan

metode KCKT telah dilakukan oleh Martis dan Gangrade (2011) dengan

penelitian analisis salbutamol sulfat dan beklometason dipropionat menggunakan

fase diam C18, fase gerak air : asetonitril (40:60), dan panjang gelombang (λ)

230 nm. Jyothi, VenuGopal, dan Rao (2012) dengan penelitian analisis salbutamol

sulfat dan ipratropium bromida menggunakan fase diam C18, fase gerak 0,05 M

bufer fosfat pH 3,5 : metanol (40:60) dengan kecepatan alir 0,6 mL/min dan

λ 226 nm. Walode dkk. (2013) dengan penelitian penetapan kadar salbutamol

sulfat dan guaifenesin menggunakan fase diam C18, fase gerak campuran

asetonitril : 50 mM bufer dinatrium hidrogen fosfat dan 0,1% trietilamin pH 3,0

(36:64) dengan kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/min.


8

C. Guaifenesin

Guaifenesin mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari

102,0% C10H14O4 dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Pemerian: serbuk

hablur, putih sampai agak kelabu, bau khas lemah, rasa pahit. Larut dalam air,

etanol, kloroform, dan dalam propilen glikol, agak sukar larut dalam gliserin

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).

Gambar 2. Struktur guaifenesin (Moffat dkk., 2005)

Guaifenesin (Gambar 2) memiliki bobot molekul 198,2 g/mol; titik lebur

78-82oC; nilai log P (oktanol/air) = 1,4; dalam suasana asam memiliki panjang

gelombang maksimum (λmax) 273 nm dengan nilai 125a

(Moffat dkk., 2011).

Penelitian mengenai analisis guaifenesin dengan menggunakan metode

KCKT telah dilakukan oleh Korany dkk. (2010) dengan penelitian penetapan

kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin menggunakan fase diam C18, fase gerak

metanol : 0,01 M bufer natrium dihidrogen fosfat pH 3,2 (40:60) dengan

kecepatan alir fase gerak 1,5 mL/min. Walode dkk. (2013) dengan penelitian

penetapan kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin menggunakan fase diam C18,

fase gerak asetonitril : 50 mM bufer dinatrium hidrogen fosfat dan 0,1%

trietilamin pH 3,0 (36:64) dengan kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/min.


9

D. Spektrofotometri Ultraviolet

Spektrofotometri ultraviolet (UV) adalah pengukuran suatu interaksi

antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia pada

panjang gelombang (λ) 190-380 nm (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan RI, 1995).

Radiasi elektromagnetik pada sinar ultraviolet dan sinar tampak (visibel)

dianggap sebagai energi yang merambat dalam bentuk gelombang.

Panjang gelombang merupakan jarak linier dari suatu titik pada satu gelombang

ke titik yang bersebelahan pada gelombang yang berdekatan (Watson, 2000).

Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk

terjadinya transisi elektronik, maka spektra ultraviolet dan tampak dikatakan

sebagai spektra elektronik. Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis berdasarkan

interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan atom, ion, atau molekul. Serapan

atom menyebabkan peralihan atau transisi elektronik, yaitu peningkatan energi

elektron dari keadaan dasar (ground state) ke satu atau lebih tingkat energi yang

lebih tinggi atau tereksitasi (excited state) (Gambar 3). Transisi terjadi jika energi

yang dihasilkan oleh radiasi sama dengan energi yang diperlukan untuk

melakukan transisi (Watson, 2000).


10

Gambar 3. Gambaran eksitasi elektron (Watson, 2000)

Ada empat tipe transisi elektronik yang dapat terjadi yaitu: σ → σ*, n →

σ*, n → π*, dan π → π*. Transisi elektron (σ → σ*) pada suatu elektron di dalam

orbital molekul bonding akan dieksitasikan ke orbital antibonding sehingga

molekul berada dalam keadaan excited state (σ*). Untuk mengeksitasikan elektron

yang berada pada suatu ikatan kovalen tunggal terikat kuat (orbital σ) diperlukan

radiasi berenergi tinggi atau panjang gelombang pendek. Oleh karena itu, serapan

maksimum yang disebabkan oleh transisi ini tidak pernah teramati pada daerah

ultraviolet (Mulja dan Suharman, 1995).

Transisi elektron n → π* dan π → π* adalah transisi yang paling cocok

untuk analisis karena sesuai dengan panjang gelombang antara 200-700 nm, yang

secara teori dapat diaplikasikan pada spektrofotometer. Molekul organik harus

mempunyai gugus fungsional tak jenuh agar ikatan rangkap dalam gugus tersebut

memberikan orbital π yang diperlukan agar jenis transisi ini dapat terjadi

(Rohman, 2007). Kedua jenis transisi ini membutuhkan adanya kromofor dan


11

auksokrom dalam struktur molekulnya. Kromofor adalah gugus fungsional tak

jenuh yang menyediakan orbital π yang dapat memberikan serapan pada daerah

ultraviolet. Sedangkan auksokrom adalah gugus jenuh yang bila terikat pada

kromofor dapat mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum

(Sastrohamidjojo, 2001).

Dalam aspek kuantitatif spektrofotometer UV-Vis, suatu radiasi

dikenakan pada larutan (sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan

diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh sampel (Gambar 4) ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan yang diserap. Serapan

terjadi jika radiasi/foton yang mengenai sampel memiliki energi yang sama

dengan energi yang diperlukan untuk perubahan tenaga. Kekuatan radiasi dapat

mengalami penurunan dengan adanya penghamburan dan pemantulan cahaya

(Rohman, 2007).

Gambar 4. Penyerapan sinar UV oleh larutan (Watson, 2000)

Perhitungan besarnya serapan cahaya oleh suatu molekul dalam larutan

mengikuti Hukum Lambert-Beer dengan rumus:

Log I0/It = A = ε b c

Keterangan:

I0 = intensitas sinar awal

It = intensitas sinar setelah melalui larutan dengan ketebalan b

A = absorbansi terukur (besarnya/sejumlah cahaya yang diserap oleh sampel)

ε = konstante serapan tiap 1 M analit dalam larutan

b = ketebalan kuvet (biasanya 1 cm); dan c = konsentrasi analit (Watson, 2000).


12

Hubungan antara nilai dengan absorptivitas molar (ε) adalah:

ε = x

M

-1cm

-1

Keterangan:

ε = absorptivitas molar (M-1

cm-1

)

= absorptivitas molekul dalam satuan konsentrasi (g/100 mL)

BM = bobot molekul (g/mol) (Rohman, 2007).

Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa instensitas yang diteruskan oleh larutan

zat penyerap sebanding dengan tebal dan konsentrasi larutan. Dalam hukum ini

terdapat pembatasan yaitu: sinar yang digunakan dianggap monokromatis; tidak

terjadi fluoresensi atau fosforesensi; indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi

larutan; penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas

sama; dan senyawa yang menyerap tidak tergantung kepada senyawa lain dalam

larutan (Rohman, 2007).

Instrumen yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi

elektromagnetik sebagai fungsi panjang gelombang disebut spektrofotometer.

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer (Gambar 5) meliputi: (1)

sumber tenaga radiasi (stabil), (2) sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin, dan

celah, (3) monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen

panjang gelombang tunggal, (4) tempat cuplikan (transparan), dan (5) detektor

radiasi yang dihubungkan dengan pencatat (Sastrohamidjojo, 2001).


13

Gambar 5. Diagram skematis spketrofotometer UV-Vis (Watson, 2000)

Sumber energi pada spektrofotometer harus dapat memberikan intenitas

radiasi elektromagnetik secara stabil pada daerah spektrum elektromagnetik.

Sumber energi dibagi menjadi dua yaitu sumber energi continuum dan sumber

energi line. Sumber energi continuum merupakan sumber energi yang

memancarkan lebih dari satu panjang gelombang dengan intensitas bervariasi dari

masing-masing panjang gelombang. Sumber energi line merupakan sumber energi

yang memancarkan satu panjang gelombang yang selektif. Pada spektrofotometer

UV-Vis menggunakan sumber energi continuum, sehingga membutuhkan

monokromator (Gambar 6) sebagai selektor filter untuk membatasi jumlah

panjang gelombang radiasi elektromagnetik yang akan masuk (Harvey, 2000).


14

Gambar 6. Monokromator (Harvey, 2000)

Panjang gelombang radiasi yang masuk melalui monokromator akan

melewati sampel. Pada saat panjang gelombang radiasi melewati sampel akan

mengalami pengurangan sejumlah radiasi, sehingga panjang gelombang radiasi

yang keluar ditangkap oleh detektor akan lebih kecil dari panjang gelombang

radiasi yang masuk. Banyaknya jumlah radiasi yang berkurang berbanding lurus

dengan konsentrasi analit dalam sampel (Harvey, 2000).

E. Larutan Penyangga (Bufer)

Larutan penyangga/bufer adalah larutan yang dapat mencegah perubahan

pH walaupun ada penambahan sedikit asam atau basa. Larutan bufer biasanya

terdiri atas campuran asam lemah atau basa lemah dengan garamnya masing-

masing. Kerja bufer paling baik terjadi pada pH yang sama dengan pKa asam atau

basa yang membentuk larutan bufer tersebut. Jika perbedaannya terlalu besar,


15

ketahanan bufer terhadap pengaruh penambahan asam atau basa akan berkurang

(Cairns, 2008).

Larutan bufer sering digunakan dalam bidang kimia analisis seperti pada

pembutan fase gerak pada KCKT. Bufer memiliki peranan dalam pemisahan

senyawa yang bersifat asam dan basa. Bufer sebagai fase gerak akan memberikan

pH yang relatif konstan dan mengakibatkan waktu retensi senyawa selama

pemisahan menjadi lebih reprodusibel. Beberapa faktor yang harus diperhatikan

dalam penggunaan bufer pada sistem KCKT fase terbalik, antara lain:

1. Nilai pKa asam lemah atau basa lemah dan kapasitas bufer.

2. Kelarutan komponen bufer.

3. Stabilitas bufer.

4. Kompatibilitas bufer dengan komponen lain.

5. Serapan pada daerah UV bila menggunakan detektor UV pada sistem

KCKT (Snyder dkk., 2010).

Kapasitas bufer merupakan kemampuan suatu bufer untuk

mempertahankan pH, tergantung pada nilai pKa asam lemah atau basa lemah,

konsentrasi bufer, dan pH fase gerak. Asam lemah atau basa lemah sebagai

komponen penyusun bufer yang digunakan hendaknya memiliki nilai pKa dalam

rentang ± 1,0 unit dari pH fase gerak yang diinginkan. Larutan bufer yang ideal

untuk digunakan dalam sistem KCKT dengan detektor UV jika memiliki serapan

pada panjang gelombang di bawah 220 nm (Snyder dkk., 1997). Tabel I

menunjukkan beberapa jenis bufer yang sering digunakan dalam analisis

menggunakan KCKT.


16

Tabel I. Jenis bufer dalam analisis menggunakan KCKT (Kromidas, 2005)

F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

1. Tinjauan umum KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode

kromatografi cair yang dilengkapi dengan sistem pompa bertekanan tinggi untuk

mengalirkan fase gerak dan detektor yang sensitif sehingga pemisahan dapat

berlangsung dengan cepat dan memiliki efisiensi yang tinggi. Salah satu

keunggulan KCKT dibandingkan dengan kromatografi gas yaitu dapat untuk

menganalisis senyawa yang tidak menguap atau tidak tahan panas tanpa peruraian

atau tanpa perlunya membuat derivat yang dapat menguap (Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).

2. Instrumentasi

Instrumen KCKT (Gambar 7) terdiri dari: wadah fase gerak, pompa, alat

untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, dan suatu komputer

atau perekam data.


17

Gambar 7. Diagram skematis sistem KCKT secara umum (Ahuja dan Dong, 2005)

1. Wadah fase gerak dan fase gerak. Wadah fase gerak harus bersih dan

lembam (inert). Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur dan berpengaruh pada daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi

ditentukan oleh polaritas seluruh pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen

sampel. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk

menghilangkan partikel-partikel kecil. Adanya gas dalam fase gerak juga harus

dihilangkan, karena gas akan mengganggu analisis, terutama mengacaukan bagian

pompa dan detektor (Rohman, 2009).

Komposisi fase gerak akan mempengaruhi pemisahan dan waktu retensi

zat analit. Pemilihan fase gerak perlu mempertimbangkan beberapa hal, seperti:

a. Kelarutan analit dalam fase gerak. Analit harus larut dalam fase gerak

sehingga mencegah terjadinya pengendapan di dalam sistem KCKT.

b. Kompatibilitas terhadap komponen lain. Campuran fase gerak yang

kompatibel akan dapat bercampur dengan baik.

c. Polaritas fase gerak. Kepolaran fase gerak berpengaruh dalam hal

waktu retensi dan resolusi saat pengelusian analit.


18

d. Viskositas fase gerak. Semakin besar viskositas maka memerlukan

tekanan yang lebih besar pula.

e. Transmisi cahaya dari fase gerak. Setiap eluen memiliki nilai UV cut-

off yang berbeda, sehingga perlu diperhatikan agar tidak mengganggu

pembacaan hasil pada detektor UV.

f. Kestabilan dan pH fase gerak juga perlu dipertimbangkan agar

diperoleh hasil yang lebih baik (Kazakevich dan Lobrutto, 2007).

Tabel II menunjukkan beberapa nilai UV cut-off dari pelarut yang sering

digunakan dalam analisis menggunakan KCKT.

Tabel II. Nilai UV cut-off pelarut dalam analisis menggunakan KCKT

(Kazakevich dan Lobrutto, 2007)

No. Nama pelarut UV cut-off

(nm)

1 Asetonitril 190

2 Isopropil alkohol 205

3 Metanol 205

4 Etanol 205

5 THF 215

6 Etil asetat 256

7 DMSO 268

2. Pompa. Dalam sistem KCKT, pompa yang digunakan juga harus inert

terhadap fase gerak. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase

gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung tepat,

reprodusibel, dan konstan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT, yaitu pompa dengan

aliran fase gerak yang konstan (lebih umum digunakan) dan pompa dengan

tekanan konstan (Rohman, 2009).


19

3. Tempat penyuntikkan sampel. Sampel cair atau larutan disuntikkan

langsung dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom.

Injektor pada KCKT ada yang manual dan otomatis (auto sampler), keduanya

harus memiliki ketepatan volume penginjeksian yang baik dan presisi. Kelemahan

injektor manual yaitu kurang praktis dan ada kemungkinan terdapat gelembung

udara yang mengakibatkan volume sampel yang diinjeksikan tidak tepat dan

mengganggu pembacaan hasil pada detektor, sedangkan kelemahan auto sampler

bila pencucian jarum injeksi kurang bersih maka dapat memungkinkan terjadinya

carry over, yaitu adanya sampel dari penginjeksian sebelumnya yang terbawa dan

terbaca detektor pada penginjeksian sampel berikutnya (Ahuja dan Dong, 2005).

4. Kolom. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase

diam untuk berlangsungnya proses pemisahan analit. Kebanyakkan fase diam

pada KCKT adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak

dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika

adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Oktadesilsilan (ODS/C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan

karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran rendah, sedang,

dan tinggi (Rohman, 2009).

Seberapa cepat pemisahan analit tergantung pada panjang kolom dan

ukuran partikel fase diam. Panjang kolom yang biasa digunakan antara 10-25 cm,

dengan ukuran partikel sekitar 1,5-5 μm. Pemisahan analit berdasarkan interaksi

antara sampel dengan fase diam dan fase gerak. Pada sistem KCKT fase terbalik,

fase diam yang digunakan bersifat lebih nonpolar daripada fase gerak.


20

Analit yang bersifat lebih polar akan terelusi terlebih dahulu daripada analit yang

bersifat nonpolar (Snyder dkk., 2010). Gambar 8 merupakan gambaran kolom

pada KCKT.

Gambar 8. Kolom pada KCKT. (a) Kolom dengan partikel berbentuk bola; (b)

Partikel fase diam (C18), pori, dan fase gerak; (c) Gambar kolom yang lebih realistis

(berbentuk bola, berpori, dengan perbesaran 10 x) (Snyder dkk., 2010)

5. Detektor. Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan,

yaitu detektor universal (tidak spesifik dan tidak selektif) seperti detektor indeks

bias dan detektor spektrometri massa, dan golongan detektor yang spesifik dan

selektif, misalnya detektor UV-Vis, fluoresensi, dan elektrokimia. Detektor yang

ideal mempunyai karakteristik sebagai berikut: mempunyai respon terhadap analit

yang cepat dan reprodusibel, memiliki sensitivitas tinggi (mampu mendeteksi

analit dalam kadar kecil), stabil, tidak peka terhadap perubahan suhu dan

kecepatan alir fase gerak, signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan


21

konsentrasi analit. Detektor UV-Vis didasarkan pada adanya penyerapan radiasi

ultraviolet dan sinar tampak (Vis) pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm

oleh zat analit yang mempunyai struktur atau gugus kromoforik (Rohman, 2009).

G. Validasi Metode Analisis

1. Tinjauan umum validasi metode analisis

Validasi metode analisis merupakan suatu prosedur yang digunakan

untuk membuktikan apakah suatu metode analisis memenuhi persyaratan yang

ditentukan atau tidak, sehingga hasil analisis dapat dipertanggungjawabkan.

Tujuan utama validasi metode adalah untuk memberikan hasil analisis yang paling

baik. Banyaknya parameter yang harus divalidasi tergantung dari tujuan analisis

(United States Pharmacopeial Convention, 2007).

Suatu metode analisis harus divalidasi untuk memastikan bahwa

parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah analisis.

Suatu metode perlu divalidasi ketika:

1. Metode yang baru dikembangkan untuk analisis tertentu.

2. Revisi dari metode yang sudah baku, untuk menyesuaikan

perkembangan.

3. Penjaminan mutu.

4. Metode baku dilakukan di laboratorium berbeda, oleh analis berbeda,

atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.

5. Untuk membandingkan kesetaraan antar dua metode, misalnya metode

baku dan metode baru (Rohman, 2009).


22

United States Pharmacopeia (USP) dan International Conference on

Harmonization (ICH) menyatakan bahwa tidak selamanya semua parameter untuk

mengevaluasi validasi metode harus diuji. USP membagi metode-metode analisis

ke dalam kategori atau kelas seperti pada Tabel III berikut.

Tabel III. Kategori metode pengujian validitas (United States Pharmacopeial

Convention, 2007)

Kategori Keterangan

I Penentuan kuantitatif komponen-komponen utama obat atau zat aktif

(termasuk pengawet) di dalam produk obat jadi

II

Penentuan kemurnian/adanya pengotor (impurities) atau produk-produk

hasil degradasi. Kategori II ini dibagi lagi menjadi uji kuantitatif dan uji

batas

III Penentuan karakterisitik/sifat-sifat khusus kinerja produk obat jadi,

seperti kecepatan disolusi dan uji pelepasan obat

IV Uji identifikasi

Menurut The United States Pharmacopeia 30 dan The National

Formulary 25 tahun 2007, metode analisis dapat dikelompokkan menjadi 4

kategori di atas. Pengelompokkan kategori tergantung pada sifat tes yang

dilakukan untuk tujuan validasi metode analisis. Tabel IV menunjukkan parameter

validasi yang dipersyaratkan untuk validasi metode analisis.

Tabel IV. Parameter validasi yang dipersyaratkan untuk validasi metode analisis

(United States Pharmacopeial Convention, 2007)

Parameter Kategori I Kategori II Kategori III Kategori IV

Kuantitatif Uji

batas

Akurasi Ya Ya * * Tidak

Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak

Selektivitas Ya Ya Ya * Ya

Batas deteksi Tidak Tidak Ya * Tidak

Batas kuantitasi Tidak Ya Tidak * Tidak

Linieritas Ya Ya Tidak * Tidak

Rentang Ya Ya * * Tidak

* Mungkin dibutuhkan (tergantung sifat tes yang spesifik)


23

2. Parameter validasi metode analisis

a. Selektivitas. Kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan

akurat respon analit diantara seluruh komponen sampel yang berada dalam

matriks sampel. Selektivitas ditentukan dengan membandingkan hasil analisis

sampel yang mengandung pengotor, hasil degradasi, senyawa sejenis, atau

senyawa asing lain dengan hasil analisis sampel tanpa bahan-bahan tersebut

(Harmita, 2004).

Selektivitas dapat dibuktikan melalui pemisahan puncak-puncak

berdekatan dengan perhitungan nilai resolusi (Rs). Bila hasil perhitungan

menunjukkan angka 1,0 berarti puncak kromatogram baku tidak terpisah sampai

ke baseline, nilai Rs = 1,5 menunjukkan puncak telah terpisah sampai baseline,

dan nilai Rs > 1,5 menunjukkan pemisahan puncak telah sempurna satu sama lain

(Rohman, 2007).

b. Linieritas. Kemampuan metode analisis memberikan respon secara

langsung dan proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel dengan

rentang yang ada. Untuk mendapatkan linieritas antara konsentrasi dengan respon

analit, data yang diperoleh harus dimasukkan ke dalam persamaan matematika

(United States Pharmacopeial Covention, 2007). Persyaratan linieritas yang dapat

diterima adalah jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,998 (Kazakevich

dan Lobrutto, 2007).

c. Akurasi. Kedekatan antara nilai kadar terukur (nilai rata-rata hasil

analisis) dengan nilai kadar sebenarnya, baik nilai konvensi, nilai sebenarnya,

ataupun nilai rujukan. Akurasi juga dapat dijadikan sebagai petunjuk kesalahan


24

sistematik (Rohman, 2009). Akurasi metode analisis dinyatakan dengan nilai %

Recovery. Akurasi dikatakan baik bila memiliki nilai % Recovery antara 98,0-

102,0% untuk kadar analit 10-100% (Gonzalez dan Herrador, 2007). Tabel V

berikut menunjukkan kriteria rentang % Recovery yang diperbolehkan.

Tabel V. Kriteria rentang % Recovery yang diperbolehkan (Gonzalez dan

Herrador, 2007)

d. Presisi. Ukuran kedekatan antara serangkaian hasil analisis yang

diperoleh dari beberapa kali pengukuran sampel. Konsep presisi diukur dengan

koefisien variasi (KV) atau standar deviasi relatif (RSD). Presisi dikategorikan

menjadi 3 macam, yaitu: reproducibility, intermediate precision, dan repeatability

(Rohman, 2009). Menurut Gonzalez dan Herrador (2007), suatu metode analisis

dikatakan memiliki keterulangan/presisi yang baik jika memiliki nilai KV ≤ 2,0%

untuk kadar analit 100%. Tabel VI berikut menunjukkan kriteria KV atau % RSD

yang diperbolehkan.


25

Tabel VI. Kriteria KV atau % RSD yang diperbolehkan (Gonzalez dan Herrador,

2007)

e. Rentang. Menurut ICH, rentang/kisaran suatu prosedur analisis adalah

interval antara konsentrasi analit pada level bawah dan level atas dalam suatu

sampel, yang dapat ditunjukkan bahwa prosedur analisis tersebut mempunyai

level akurasi, presisi, dan linieritas yang sesuai (Rohman, 2009).

H. Landasan Teori

Penyakit batuk disertai asma merupakan penyakit gangguan saluran

pernapasan. Obat yang biasa digunakan untuk mengobati penyakit ini yaitu

kombinasi salbutamol sulfat (obat asma) dan guaifenesin (obat batuk). Untuk

menjamin keamanan dan efektivitasnya, maka perlu dilakukan analisis berupa

penetapan kadar kedua senyawa tersebut dalam sediaan obat.

Salbutamol sulfat dan guaifenesin memiliki gugus kromofor dalam

strukturnya sehingga dapat memberikan serapan pada daerah panjang gelombang

UV. Kedua senyawa tersebut memiliki kepolaran yang berbeda sehingga dapat


26

dipisahkan saat dilakukan analisis dengan menggunakan metode KCKT fase

terbalik detektor UV. Metode KCKT perlu dioptimasi dan divalidasi sebelum

digunakan untuk penetapan kadar.

Validasi metode penting dilakukan karena dapat memberikan jaminan

terhadap metode yang digunakan dan hasil analisis yang dapat dipercaya dan

dipertanggungjawabkan, sehingga dapat dilakukan penetapan kadar salbutamol

sulfat dan guaifenesin menggunakan metode yang telah optimal dan tervalidasi.

Peneliti bekerja pada validasi metode kategori I, sehingga parameter validasi yang

dibutuhkan meliputi selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang.

I. Hipotesis

Validasi metode KCKT fase terbalik dengan fase diam C18 merek

Shimadzu (250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 μm), fase gerak metanol : 0,01 M

bufer kalium dihidrogen fosfat pH 3 (40:60) dengan kecepatan alir fase gerak

1 mL/min, pada penetapan kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam sediaan

sirup merek “X” menghasilkan parameter-parameter validasi, yaitu selektivitas,

linieritas, akurasi, presisi, dan rentang yang memenuhi persyaratan yang

ditentukan.


27

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis dan rancangan penilitan ini adalah non eksperimental deskriptif,

karena pada penelitian ini tidak dilakukan manipulasi pada subjek uji dan hanya

menggambarkan keadaan yang ada.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah sistem KCKT yang telah

dioptimasi, meliputi komposisi fase gerak dan kecepatan alir yang digunakan.

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah parameter validasi,

meliputi selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang.

3. Variabel pengacau terkendali

a. Kemurnian pelarut yang digunakan, untuk mengatasinya digunakan pelarut

dengan kemurnian tinggi yaitu pelarut pro analysis.

b. Kemurnian baku pembanding salbutamol sulfat dan guaifenesin yang

digunakan, untuk mengatasinya digunakan baku yang telah terjamin

kualitasnya seperti tercantum pada Certificate of Analysis (CoA).


28

C. Definisi Operasional

1. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan terdiri dari fase diam berupa kolom

C18 merek Shimadzu (250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 μm) dan fase gerak

campuran metanol : 0,01 M bufer kalium dihidrogen fosfat pH 3 (40:60)

dengan kecepatan alir fase gerak 1 mL/min (Mulyawan, 2014).

2. Kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin dinyatakan dalam satuan mg/mL.

3. Penelitian yang dilakukan termasuk dalam validasi metode kategori I, yaitu

metode yang digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif komponen

utama dalam suatu matriks. Validasi metode yang dilakukan meliputi

pengukuran terhadap parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas, akurasi,

presisi, dan rentang.

D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah baku pembanding

salbutamol sulfat (Supriya Lifescience, No. batch SSL/SS/0312030, kemurnian

98,83%) (PT. Ifars Pharmaceutical Laboratories), baku pembanding guaifenesin

(No. kontrol 205158, kemurnian 99,88%) (Pusat Pengujian Obat dan Makanan

Nasional), metanol, kalium dihidrogen fosfat, dan asam fosfat p.a (E.Merck),

kertas saring Whatman 0,45 μm, akuabides hasil penyulingan di laboratorium

Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta, dan sediaan sirup merek “X”.


29

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah seperangkat alat KCKT

dengan detektor ultraviolet (UV) merek Shimadzu LC-2010C, kolom C18 merek

Shimadzu column Shim-pack (LC-C18 CM) (No. column 4252787 part. 228-

17874-92), seperangkat komputer (merek Dell B6RDZ1S Connexant system

RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000

625730), UV/Vis Spectrophotometer SP-3000plus merek OPTIMA dengan

deterktor silicon photo diode, millipore, alat ultrasonicator Refsch., Tipe : T460

(Schwing.1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83, HF-Frequ.:35 kHz), timbangan analitik

Ohaus Carat Series PAJ 1003 (max 60/120 g, min 0,001 g, d = 0,01/0,1 mg), alat

vakum, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis.

F. Tatacara Penelitian

1. Pembuatan asam fosfat 0,1 M

Larutan pekat H3PO4 dengan konsentrasi 85% diambil sejumlah

1,2 mL, kemudian diencerkan dengan akuabides hingga 100,0 mL sehingga

didapatkan konsentrasi H3PO4 sebesar 0,1 M.

2. Pembuatan bufer kalium dihidrogen fosfat 0,01 M

Sejumlah 0,68 g KH2PO4 ditimbang seksama dan dilarutkan dalam

akuabides hingga 500,0 mL sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 0,01 M,

kemudian pH diatur dengan penambahan asam fosfat 0,1 M hingga mencapai

pH 3.


30

3. Pembuatan fase gerak

Fase gerak dibuat dari campuran metanol : 0,01 M bufer kalium

dihidrogen fosfat pH 3 dengan perbandingan (40:60) (Mulyawan, 2014).

Campuran fase gerak tersebut disaring dengan kertas saring Whatman dengan

bantuan pompa vakum, kemudian didegassing dengan ultrasonicator selama

15 menit.

4. Pembuatan larutan baku salbutamol sulfat dan guaifenesin yang

digunakan untuk penentuan panjang gelombang pengamatan

a. Pembuatan larutan baku salbutamol sulfat. Sejumlah lebih kurang

10,0 mg salbutamol sulfat ditimbang seksama dan dilarutkan dalam metanol

hingga 10,0 mL sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 1000 µg/mL,

kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 100; 300; dan

600 µg/mL dengan mengencerkan 1,0; 3,0; dan 6,0 mL larutan stok tersebut

dengan metanol hingga 10,0 mL.

b. Pembuatan larutan baku guaifenesin. Sejumlah lebih kurang

20,0 mg guaifenesin ditimbang seksama dan dilarutkan dalam metanol hingga

50,0 mL sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 400 µg/mL, kemudian dibuat

larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 20; 60; dan 100 µg/mL dengan

mengencerkan 0,5; 1,5; dan 2,5 mL larutan stok tersebut dengan metanol

hingga 10,0 mL.


31

5. Pembuatan larutan baku salbutamol sulfat

a. Pembuatan larutan stok salbutamol sulfat. Sejumlah lebih kurang

10,0 mg salbutamol sulfat ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu takar

50,0 mL kemudian dilarutkan dengan metanol hingga tanda batas sehingga

didapatkan konsentrasi sebesar 200 μg/mL.

b. Pembuatan larutan intermediate salbutamol sulfat. Larutan stok

diambil sejumlah 0,5 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL kemudian

diencerkan dengan metanol hingga tanda batas sehingga didapatkan

konsentrasi sebesar 20 μg/mL.

6. Pembuatan larutan baku guaifenesin

Sejumlah lebih kurang 22,5 mg guaifenesin ditimbang seksama,

dimasukkan ke dalam labu takar 25,0 mL kemudian diencerkan dengan

metanol hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi sebesar

900 μg/mL.

7. Pembuatan seri larutan baku campuran salbutamol sulfat dan guaifenesin

Larutan intermediate salbutamol sulfat dan larutan baku guaifenesin

masing-masing diambil sejumlah 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; dan 0,8 mL, dimasukkan ke

dalam labu takar 10,0 mL secara berurutan dari volume kecil hingga besar,

kemudian diencerkan dengan metanol hingga tanda batas sehingga didapatkan

konsentrasi campuran salbutamol sulfat dan guaifenesin berturut-turut sebesar

(0,8 dan 36,0); (1,0 dan 45,0); (1,2 dan 54,0); (1,4 dan 63,0); dan


32

(1,6 dan 72,0) μg/mL. Larutan disaring dengan millipore dan didegassing

dengan ultrasonicator selama 15 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam

sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014).

8. Penetapan panjang gelombang (λ) maksimum salbutamol sulfat dan

guaifenesin dengan spektrofotometer UV-Vis

Masing-masing konsentrasi larutan seri baku salbutamol sulfat 100,0;

300,0; dan 600,0 μg/mL dan guaifenesin 20,0; 60,0; dan 100,0 μg/mL diukur

serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer

UV-Vis. Spektrum yang dihasilkan akan menunjukkan panjang gelombang

maksimum yang akan digunakan pada sistem KCKT.

9. Preparasi sampel

a. Pembuatan larutan stok sampel. Sediaan sirup merek “X”

mengandung 1,20 mg salbutamol sulfat dan 50,0 mg guaifenesin tiap 5,0 mL

sediaan, diambil sejumlah 0,25 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL


konsentrasi salbutamol sulfat dan guaifenesin sebesar (12,0 dan 500,0) μg/mL.

b. Pembuatan larutan sampel. Larutan stok sampel diambil sejumlah

0,4; 0,5; dan 0,6 mL, masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL


konsentrasi salbutamol sulfat dan guaifenesin berturut-turut sebesar (0,96 dan

40,0); (1,20 dan 50,0); dan (1,44 dan 60,0) μg/mL. Larutan disaring dengan

millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, kemudian


33

diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi

(Mulyawan, 2014).

10. Preparasi adisi baku dalam sampel

Larutan stok sampel diambil sejumlah 0,4; 0,5; dan 0,6 mL, masing-

masing dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL, kemudian ditambahkan

0,03 mL larutan intermediate salbutamol sulfat dan 0,03 mL larutan baku

guaifenesin ke dalam masing-masing labu takar dan diencerkan dengan

metanol hingga tanda batas. Larutan disaring dengan millipore dan didegassing

dengan ultrasonicator selama 15 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam

sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014).

11. Validasi metode analisis

a. Penentuan selektivitas. Sejumlah masing-masing 20,0 μL larutan

baku campuran salbutamol sulfat dan guaifenesin serta larutan sampel sediaan

merek “X” yang telah disaring dengan millipore dan didegassing selama

15 menit diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah

dioptimasi (Mulyawan, 2014). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

b. Penentuan linieritas. Sejumlah masing-masing 20,0 μL larutan

baku campuran salbutamol sulfat dan guaifenesin dengan konsentrasi (0,8 dan

36,0); (1,0 dan 45,0); (1,2 dan 54,0); (1,4 dan 63,0); dan (1,6 dan 72,0) μg/mL

yang telah disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit


34

diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi

(Mulyawan, 2014). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

c. Penentuan akurasi dan presisi adisi baku dalam sampel. Sejumlah

20,0 μL larutan sampel dan larutan sampel yang ditambah campuran baku

salbutamol sulfat dan guaifenesin (sampel adisi) yang telah disaring dengan

millipore dan didegassing selama 15 menit diinjeksikan ke dalam sistem

KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014). Replikasi

dilakukan sebanyak 3 kali.

d. Penentuan rentang. Rentang merupakan interval antara kadar

terendah sampai tertinggi analit yang dapat diukur secara kuantitatif

menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan linieritas, akurasi,

dan presisi yang baik (Rohman, 2009).

12. Uji kestabilan larutan baku

Larutan baku salbutamol sulfat dengan konsentrasi 0,8; 1,2; dan

1,6 μg/mL serta larutan baku guaifenesin dengan konsentrasi 36,0; 54,0; dan

72,0 μg/mL yang telah disaring dengan millipore dan didegassing dengan

ultrasonicator selama 15 menit, diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase

terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014) dalam hari yang berbeda

untuk dilihat seberapa besar perubahan respon yang dihasilkan dari masing-

masing larutan baku. Respon pada hari pertama digunakan sebagai acuan untuk

dibandingkan dengan respon pada hari berikutnya. Nilai % perubahan yang

diperbolehkan yaitu < 2,0% (Ahuja dan Dong, 2005).


35

G. Analisis Hasil

1. Selektivitas

Selektivitas ditentukan dengan daya resolusi dari puncak

kromatogram yang dihasilkan oleh baku campuran salbutamol sulfat dan

guaifenesin dan kemampuan metode KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi

untuk memisahkan salbutamol sulfat dengan guaifenesin dalam sampel sediaan

sirup merek “X”. Selektivitas ditentukan dengan parameter resolusi (Rs)

dengan rumus perhitungan:

Resolusi (Rs) = (tR2-tR1)

12⁄ (W1 W2)

Keterangan : Rs = resolusi

tR1 = waktu retensi puncak analit pertama

tR2 = waktu retensi puncak analit kedua

W1 = lebar dasar puncak pertama

W2 = lebar dasar puncak kedua

Nilai Rs = 1,0 menunjukkan puncak kromatogram baku tidak terpisah

sampai ke baseline, nilai Rs = 1,5 menunjukkan puncak telah terpisah sampai

baseline, dan nilai Rs > 1,5 menunjukkan pemisahan puncak telah sempurna

satu sama lain (Rohman, 2007).

2. Linieritas

Linieritas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Konsentrasi

larutan baku salbutamol sulfat dan guaifenesin yang diperoleh diplotkan

terhadap luas area pada kromatogram sehingga diperoleh nilai koefisien

korelasi (r) dari persamaan y = bx + a. Rentang ditentukan dari kadar larutan

baku konsentrasi terkecil hingga terbesar. Persyaratan linieritas yang dapat


36

diterima adalah jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,998 (Kazakevich

dan Lobrutto, 2007).

3. Akurasi

Akurasi metode analisis dinyatakan dengan nilai % Recovery yang

dihitung dari konsentrasi terukur dibandingkan dengan konsentrasi teoritis

(kadar sebenarnya) dikalikan 100%. Akurasi dikatakan baik bila memiliki nilai

% Recovery antara 98,0-102,0% untuk kadar analit 10-100% (Gonzalez dan

Herrador, 2007). Nilai % Recovery adisi baku dalam sampel dapat dihitung

dengan cara:

% Recovery = jumlah baku dan sampel terukur – jumlah sampel terukur

jumlah baku teoritis x 100%

4. Presisi

Presisi dihitung sebagai standar deviasi relatif (RSD) atau koefisien

variasi (KV), dengan rumus perhitungan:

KV = standar deviasi (SD)

rata-rata (X̅) x 100%

Keterangan : KV = koefisien variasi ̅ = rata-rata kadar

SD = standar deviasi

Suatu metode dikatakan memiliki keterulangan/presisi yang baik jika memiliki

nilai KV ≤ 2,0% untuk kadar analit 100% (Gonzalez dan Herrador, 2007).


37

5. Rentang

Rentang merupakan interval antara kadar terendah sampai tertinggi

analit yang dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode analisis

tertentu dan menghasilkan linieritas, akurasi, dan presisi yang baik

(Rohman, 2009).


38

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pembuatan Fase Gerak

Sistem kromatografi yang digunakan pada penelitian ini merupakan

sistem kromatografi fase terbalik, karena menggunakan fase gerak yang bersifat

lebih polar daripada fase diamnya (ODS/C18). Jenis dan komposisi fase gerak

yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol dan 0,01 M bufer

kalium dihidrogen fosfat pH 3 dengan perbandingan (40:60), kecepatan alir fase

gerak 1 mL/min, dan dengan indeks polaritas sebesar 8,16 (Mulyawan, 2014).

Sistem elusi pada penelitian ini adalah isokratik karena menggunakan campuran

lebih dari satu komponen fase gerak dengan perbandingan tetap selama proses

elusi berlangsung (komposisi dan polaritas fase gerak tetap).

Metanol dipilih sebagai fase gerak karena dapat melarutkan kedua zat

analit (salbutamol sulfat dan guaifenesin) dengan baik. Metanol juga merupakan

pelarut organik yang umum dan sering digunakan pada sistem KCKT fase

terbalik. Penggunaan bufer fosfat bertujuan untuk memberikan pH yang relatif

konstan dan mengakibatkan waktu retensi senyawa menjadi reprodusibel. Tujuan

fase gerak dikondisikan pada pH 3 adalah untuk mengubah seluruh salbutamol

sulfat ke dalam bentuk ion sehingga interaksinya dengan fase diam dan fase gerak

menjadi seragam. Apabila ada sebagian yang terion dan sebagian dalam bentuk

molekul dapat menyebabkan interaksi salbutamol dengan fase diam dan fase

gerak berbeda-beda, sehingga bentuk puncak kromatogram menjadi tailing.

Guaifenesin merupakan senyawa yang bersifat asam lemah dan pada pH 3 seluruh


39

guaifenesin dalam bentuk molekul, sehingga interaksinya dengan fase diam dan

fase gerak menjadi seragam dan waktu retensi yang relatif tetap dari kedua zat

analit tersebut.

Sebelum digunakan, komponen fase gerak disaring terlebih dahulu

menggunakan penyaring Whatman dengan bantuan pompa vakum untuk

menyaring partikel-partikel yang dapat menyumbat kolom, kemudian didegassing

dengan ultrasonicator untuk menghilangkan gelembung udara yang dapat

mengganggu pembacaan hasil dalam instrumen KCKT.

B. Pembuatan Larutan Baku

Baku salbutamol sulfat yang digunakan pada penelitian ini merupakan

working standard dengan kemurnian 98,83% yang didapatkan dari PT. Ifars

Pharmaceutical Laboratories. Baku guaifenesin yang digunakan juga merupakan

working standard dengan kemurnian 99,88% yang didapatkan dari Pusat

Pengujian Obat dan Makanan Nasional, sehingga kedua baku tersebut terjamin

kemurniannya.

Larutan baku salbutamol sulfat dan guaifenesin dibuat dalam konsentrasi

tertentu dengan menggunakan pelarut metanol. Pemilihan pelarut sangat penting

karena salah satu syarat utama pelarut yaitu dapat melarutkan analit dengan baik.

Syarat lainnya antara lain: inert, murni, dan dapat bercampur dengan fase gerak.

Metanol dipilih karena memenuhi syarat-syarat tersebut. Metanol yang digunakan

adalah metanol pro analysis (p.a) dengan kemurnian tinggi, sehingga diharapkan

mengurangi adanya pengotor yang mengganggu hasil analisis.


40

Larutan baku yang dibuat pada penelitian ini terdiri dari tiga macam,

yaitu: larutan stok, larutan intermediate, dan larutan seri baku. Pada penentuan

panjang gelombang, larutan stok salbutamol sulfat dibuat dengan konsentrasi

1000 μg/mL dan larutan seri dengan tiga konsentrasi berbeda yaitu 100, 300, dan

600 μg/mL. Pada guaifenesin dibuat larutan stok dengan konsentrasi 400 μg/mL

dan larutan seri dengan tiga konsentrasi berbeda yaitu 20, 60, dan 100 μg/mL,

kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang UV (200-400 nm).

Validasi sistem KCKT yang telah dioptimasi menggunakan larutan baku

dengan konsentrasi yang berbeda dari larutan baku pada penentuan panjang

gelombang. Larutan stok salbutamol sulfat dibuat dengan konsentrasi 200 μg/mL,

larutan intermediate 20 μg/mL, dan larutan seri baku dibuat dalam lima

konsentrasi berbeda yaitu 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; dan 1,6 μg/mL. Larutan stok

guaifenesin dibuat dengan konsentrasi 900 μg/mL dan larutan seri baku dengan

lima konsentrasi berbeda yaitu 36, 45, 54, 63, dan 72 μg/mL. Untuk selektivitas

digunakan baku campuran dengan konsentrasi salbutamol sulfat 1,2 μg/mL dan

guaifenesin 80 μg/mL. Untuk akurasi dan presisi adisi baku digunakan kedua

baku dengan konsentrasi salbutamol sulfat 0,12 μg/mL dan guaifenesin

5,4 μg/mL.

Larutan baku yang telah dipersiapkan, disaring dengan menggunakan

millipore dengan tujuan untuk menghilangkan partikel-partikel yang dapat

menyumbat kolom dan mengkontaminasi fase diam. Setelah disaring larutan baku

harus didegassing sebelum diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan tujuan


41

untuk menghilangkan gelembung udara yang dapat mengganggu pembacaan hasil

oleh detektor dalam instrumen KCKT.

C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan

Penentuan panjang gelombang (λ) pengamatan bertujuan untuk

mengetahui pada panjang gelombang berapa salbutamol sulfat dan guaifenesin

memberikan serapan yang maksimum. Penentuan panjang gelombang pengamatan

dilakukan dengan scanning λ maksimum kedua senyawa menggunakan tiga seri

konsentrasi yang berbeda yaitu 100, 300, dan 600 μg/mL untuk salbutamol sulfat

dan 20, 60, dan 100 μg/mL untuk guaifenesin. Penggunaan tiga seri konsentrasi

yang berbeda ini bertujuan untuk meyakinkan bahwa panjang gelombang

pengamatan yang didapat merupakan panjang gelombang milik salbutamol sulfat

dan guaifenesin, dimana semakin tinggi konsentrasi maka semakin tinggi spektra

yang dihasilkan (proporsional). Pelarut yang digunakan dalam penentuan panjang

gelombang pengamatan adalah metanol, yang juga digunakan pada sistem KCKT.

Bentuk pola spektra serta panjang gelombang pengamatan yang diperoleh dapat

dilihat pada Gambar 9 dan 10 berikut:


42

Gambar 9. Spektra salbutamol sulfat 3 seri konsentrasi dengan pelarut metanol

Gambar 10. Spektra guaifenesin 3 seri konsentrasi dengan pelarut metanol

278 nm

600 μg/mL

300 μg/mL

100 μg/mL

274 nm

100 μg/mL

60 μg/mL

20 μg/mL


43

Menurut Moffat dkk. (2011) panjang gelombang salbutamol sulfat dan

guaifenesin berturut-turut adalah 276 nm dan 273 nm, selain itu salbutamol sulfat

dan guaifenesin memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat

memberikan serapan pada panjang gelombang UV, maka penentuan panjang

gelombang pengamatan kedua senyawa ini dilakukan pada daerah panjang

gelombang UV (200-400 nm). Gugus kromofor dan auksokrom dari kedua

senyawa tersebut ditunjukkan dari Gambar 11 dan 12 berikut:

Gambar 11. Gugus kromofor dan auksokrom salbutamol sulfat

Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom guaifenesin

Hasil spektra menunjukkan bahwa panjang gelombang maksimum

salbutamol sulfat pada konsentrasi 100, 300, dan 600 μg/mL adalah 278 nm,

sedangkan panjang gelombang serapan maksimum guaifenesin pada konsentrasi

20, 60, dan 100 μg/mL adalah 274 nm. Menurut Farmakope Indonesia edisi IV

(1995) pergeseran panjang gelombang yang diijinkan sebesar 2 nm, jadi panjang


44

gelombang kedua senyawa dapat diterima karena bergeser 1-2 nm dari panjang

gelombang teoritis.

Berdasarkan pengamatan panjang gelombang salbutamol sulfat dan

guaifenesin yang diperoleh dapat diketahui panjang gelombang tumpang

tindih/overlapping kedua senyawa yang merupakan titik potong dari panjang

gelombang kedua senyawa. Panjang gelombang overlapping yang diperoleh

adalah 275 nm (Gambar 13), sehingga panjang gelombang tersebut digunakan

sebagai panjang gelombang pada sistem KCKT. Tujuan digunakan panjang

gelombang overlapping sebagai panjang gelombang pada sistem KCKT adalah

agar kedua senyawa dapat memberikan serapan yang optimum dan dapat dideteksi

oleh detektor pada sistem KCKT.

Gambar 13. Spektra tumpang tindih salbutamol sulfat dan guaifenesin

275 nm


45

D. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR) Salbutamol

Sulfat dan Guaifenesin

Waktu retensi (tR) tiap senyawa bersifat spesifik, sehingga dapat

digunakan sebagai data untuk analisis kualitatif. Tujuan pengamatan waktu retensi

kedua senyawa tersebut adalah untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan masing-

masing senyawa saat melewati fase diam dengan adanya bantuan fase gerak.

Waktu retensi salbutamol sulfat dan guaifenesin dipengaruhi oleh

interaksi kedua senyawa dengan fase diam dan fase geraknya, atau dipengaruhi

oleh koefisien partisi kedua senyawa terhadap fase diam dan fase gerak. Pada

penelitian ini digunakan sistem KCKT fase terbalik, dimana fase gerak yang

digunakan lebih polar daripada fase diamnya, maka senyawa yang cenderung

bersifat lebih polar akan terelusi terlebih dahulu daripada senyawa yang bersifat

non polar. Hal ini terjadi karena senyawa yang bersifat non polar akan lebih lama

tertahan dalam fase diam sehingga waktu retensinya lebih lama. Salbutamol sulfat

merupakan garam yang mudah terion sehingga lebih polar dibandingkan

guaifenesin yang berbentuk molekul utuh, hal ini mengakibatkan waktu retensi

salbutamol sulfat lebih pendek/cepat daripada waktu retensi guaifenesin.


46

(a)

(b)

(c)

Gambar 14. Kromatogram baku salbutamol sulfat (a), kromatogram baku

guaifenesin (b), dan kromatogram sampel (c)

Salbutamol sulfat

Salbutamol sulfat

Guaifenesin

Guaifenesin


47

Kromatogram pada Gambar 14 menunjukkan bahwa baku salbutamol

sulfat memiliki tR 2,907 menit, sedangkan baku guaifenesin memiliki tR 7,985

menit. Pada kromatogram sampel terdapat dua peak yang berada pada tR 2,900

menit dan 8,016 menit. Kedua nilai tR dari sampel identik dengan tR baku

salbutamol sulfat dan tR baku guaifenesin, maka dapat disimpulkan bahwa di

dalam sampel sirup merek “X” terdapat salbutamol sulfat dan guaifenesin.

Salbutamol sulfat dan guaifenesin dapat berinteraksi dengan fase diam

dan fase gerak. Interaksi senyawa dengan fase diam (ODS/C18) merupakan

interaksi Van der Waals. Menurut Levita dan Mustarichie (2012), interaksi Van

der Waals merupakan interaksi tarik-menarik antar molekul non polar yang

mungkin mengalami tidak meratanya distribusi kerapatan elektron sehingga dapat

menimbulkan dipol, sementara yang dapat menginduksi dipol berlawanan dari

molekul yang mendekatinya. Interaksi salbutamol sulfat dan guaifenesin dengan

fase diam ditunjukkan pada Gambar 15 berikut:

OH

NH2

HO

H3C

H3C

Si

H3C

HO

CH3

CH3

CH3

HO

(a)


48

O

H3CO

SiH3C

HOCH

3

CH3

HO

HO

Interaksi Van der Waals

(b)

Gambar 15. Interaksi salbutamol sulfat dengan fase diam (a), interaksi guaifenesin

dengan fase diam (b)

Interaksi antara salbutamol sulfat dan guaifenesin dengan fase gerak

merupakan interaksi hidrogen. Menurut Levita dan Mustarichie (2012), interaksi

hidrogen merupakan jenis interaksi dipol-dipol yang terbentuk antara proton yang

terikat pada gugus yang memiliki atom elektronegatif dengan atom elektronegatif

lain yang memiliki pasangan elektron bebas. Interaksi salbutamol sulfat dan

guaifenesin dengan fase gerak ditunjukkan pada Gambar 16 berikut:

HO

NH2

HO

H3C

H3C

CH3

HO

H

O

H

O

H CH3

H

H

O

H

O

HH3C

O

H

H

O

CH3

(a)


49

O

OCH3

OH

OHH

O

HO

H

O

H

O

H CH3

H

O

H CH3

Interaksi hidrogen

O

H

H

O

H

H

O

CH3

H

CH3

(b)

Gambar 16. Interaksi salbutamol sulfat dengan fase gerak (a), interaksi

guaifenesin dengan fase gerak (b)

Berdasarkan interaksi salbutamol sulfat dan guaifenesin dengan fase

diam dan fase gerak dapat disimpulkan bahwa guaifenesin lebih banyak

berinteraksi dengan fase diam dibandingkan dengan salbutamol sulfat, hal ini

mengakibatkan waktu retensi guaifenesin lebih lama dari pada salbutamol sulfat.

E. Pembuatan Kurva Baku Salbutamol Sulfat dan Guaifenesin

Tujuan dari pembuatan kurva baku adalah untuk mendapatkan persamaan

regresi linier yang kemudian digunakan untuk analisis kuantitatif. Persamaan

regresi linier yang diperoleh menyatakan hubungan/korelasi yang linier

(proporsional) antara konsentrasi analit dengan respon Area Under Curve (AUC).


50

Persamaan regresi linier diperoleh dengan mengukur respon analit dalam beberapa

seri konsentrasi.

Menurut ICH topik Q2(R1) (2005), untuk membuat kurva baku yang

baik digunakan minimal lima seri konsentrasi baku, maka pada penelitian ini

digunakan lima seri konsentrasi baku salbutamol sulfat dan guaifenesin. Lima seri

konsentrasi baku salbutamol sulfat yang dibuat yaitu: 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; dan

1,6 μg/mL, sedangkan pada guaifenesin 36, 45, 54, 63, dan 72 μg/mL. Masing-

masing kurva baku dibuat sebanyak tiga kali replikasi dengan tujuan untuk

mendapatkan kurva baku dengan nilai koefisien korelasi (r) yang paling baik.

Menurut Kazakevich dan Lobrutto (2007), nilai koefisien korelasi (r)

yang baik apabila ≥ 0,998. Nilai r semakin mendekati satu menunjukkan linieritas

yang semakin baik, sehingga dapat digunakan untuk perhitungan kadar analit

dalam sampel. Beberapa pertimbangan lain yang perlu diperhatikan dalam

pemilihan kurva baku yaitu nilai intersept (A) dan slope (B). Nilai A merupakan

baseline error, dimana seharusnya pada konsentrasi nol respon yang ditimbulkan

juga nol, tetapi jika pada konsentrasi nol terdapat respon, maka ini akan

mengacaukan data yang ada sehingga nilai A yang diharapkan adalah yang

semakin kecil atau semakin mendekati nol. Slope/kemiringan yang diharapkan

adalah yang semakin besar atau mendekati sudut 45o, karena jika semakin kecil

semakin kurang proporsional atau dengan kata lain untuk mendapatkan respon

yang sedikit lebih besar harus meningkatkan konsentrasi dengan pergeseran yang

cukup besar. Tabel VII berikut menunjukkan data perolehan AUC seri baku

guaifensin dari tiga replikasi:


51

Tabel VII. Penentuan kurva baku guaifenesin

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

C (μg/mL) AUC

(mAU) C (μg/mL)

AUC

(mAU) C (μg/mL)

AUC

(mAU)

35,941 416750 35,957 430299 35,957 434389

44,926 542221 44,946 563166 44,946 565020

53,911 690626 53,935 674301 53,935 676218

62,896 779459 62,924 790499 62,924 791864

71,882 903167 71,914 913892 71,914 917741

A = - 59598,246 A = - 42280,037 A = - 39082,532

B = 13467,384 B = 13288,380 B = 13277,580

r = 0,9975 r = 0,9996 r = 0,9997 Keterangan:

C = konsentrasi seri baku guaifenesin (μg/mL)

AUC = Area Under Curve (mAU)

Berdasarkan hasil yang diperoleh pada tabel VII, data kurva baku

guaifenesin yang akan digunakan berasal dari replikasi 3 dengan nilai r sebesar

0,9997. Persamaan kurva baku yang digunakan untuk analisis kuantitatif

guaifenesin adalah y = 13277,580x – 39082,532.

Gambar 17. Kurva baku guaifenesin

y = 13277,580x - 39082,532 r = 0.9997

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

0 20 40 60 80

AU

C (

mA

U)

Konsentrasi guaifenesin (μg/mL)


52

Hubungan yang linier antara seri konsentrasi guaifenesin dengan respon

AUC ditunjukkan pada Gambar 17. Berdasarkan kurva tersebut dapat dilihat

bahwa respon AUC meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi. Nilai r

yang mendekati satu tersebut menggambarkan adanya korelasi yang baik antara

variabel bebas (konsentrasi) dan variabel tergantung (AUC).

Pada penelitian ini tidak dibuat kurva baku salbutamol sulfat karena

sudah kadaluwarsa, dimungkinkan salbutamol sulfat telah mengalami degradasi

sehingga kadar/jumlahnya berkurang dan menjadi tidak tepat digunakan untuk

melakukan kuantifikasi. Senyawa yang sudah terdegradasi dapat dikatakan

senyawa yang tidak stabil lagi, padahal kestabilan senyawa sangat penting

diperhatikan untuk melakukan kuantifikasi (Ahuja dan Dong, 2005), maka pada

penelitian ini tidak dapat dihitung kadar salbutamol sulfat dalam larutan baku

maupun sampel.

OH

OH

HN CH3

CH3

CH3

OH

2

H2SO4 OH

O

HN CH3

CH3

CH3

OH

2

H2SO4O2

Gambar 18. Bentuk degradasi salbutamol sulfat

Gambar 18 menunjukkan bentuk degradasi salbutamol sulfat akibat

mengalami oksidasi. Senyawa tersebut mengalami pemanjangan gugus kromofor

pada strukturnya, sehingga tidak dapat terdeteksi pada λ overlapping (275 nm)

dan kemungkinan dengan menggunakan sistem KCKT pada penelitian ini belum

dapat dipisahkan dari salbutamol sulfat karena kepolaran kedua senyawa yang

tidak berbeda jauh.

kromofor


53

F. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter analisis tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk

membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk

penggunaannya (Harmita, 2004). Parameter analisis tersebut terdiri dari ketepatan

(akurasi), ketelitian (presisi), selektivitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linieritas,

dan rentang (United States Pharmacopeial Convention, 2007). Validasi metode

analisis dilakukan untuk membuktikan dan menjamin bahwa metode analisis yang

digunakan memiliki validitas yang baik sehingga hasilnya dapat dipercaya dan

dipertanggungjawabkan.

Parameter-parameter analisis yang dibutuhkan dalam validasi metode

analisis ditentukan oleh kategori metode analisis yang digunakan. Pada penelitian

ini kategori analisis yang digunakan adalah kategori I karena merupakan metode

analisis untuk menganalisis komponen utama bahan baku atau senyawa aktif

(termasuk pengawet) dalam produk jadi sediaan farmasi. Dengan demikian,

parameter analisis yang dibutuhkan pada penelitian ini adalah selektivitas,

linieritas, akurasi, presisi, dan rentang.

1. Selektivitas

Selektivitas suatu metode merupakan kemampuan metode untuk

mengukur zat analit tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen

lain yang mungkin terdapat dalam matriks sampel. Penentuan selektivitas dalam

metode KCKT dapat diamati dari pemisahan peak analit (salbutamol sulfat dan


54

guaifenesin) yang dihasilkan dan dinyatakan sebagai nilai resolusi (Rs). Metode

KCKT dikatakan memiliki selektivitas yang baik jika memiliki nilai (Rs) > 1,5

(Rohman, 2007). Berikut merupakan kromatogram pemisahan analit dalam

campuran baku salbutamol sulfat dan guaifenesin serta sampel:

(a)


55

(b)

Gambar 19. Kromatogram pemisahan analit dalam campuran baku (a), dalam

sampel (b)

Pada Gambar 19 (a) dapat dilihat pemisahan peak salbutamol sulfat dan

guaifenesin dengan nilai Rs sebesar 10,451 yang berarti kedua senyawa terpisah

cukup baik dan tidak saling mengganggu antara peak yang satu dengan yang lain.

Pada gambar 15 (b) didapatkan nilai Rs antara salbutamol sulfat dan guaifenesin

sebesar 6,422 serta nilai Rs antara guaifenesin dengan peak di belakangnya

sebesar 3,763 yang berarti telah terjadi pemisahan yang cukup baik pula.

Tabel VIII berikut menunjukkan nilai resolusi yang diperoleh dari campuran baku

salbutamol sulfat dan guaifenesin serta sampel:

Tabel VIII. Nilai resolusi (Rs) campuran baku dan sampel

Replikasi Resolusi (Rs)

Campuran baku Sampel

1 10,462 6,402

2 10,451 6,422

3 10,429 6,401


56

Berdasarkan data pada Tabel VIII, dapat dilihat bahwa seluruh nilai

resolusi (Rs) dari ketiga replikasi, baik dalam campuran baku ataupun sampel,

seluruhnya memenuhi persyaratan yaitu Rs > 1,5. Hal ini menunjukkan bahwa

metode KCKT yang digunakan memiliki selektivitas yang baik.

2. Linieritas

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk

menunjukkan korelasi/hubungan yang proporsional antara konsentrasi analit

dengan respon yang dihasilkan. Linieritas ditunjukkan oleh besarnya nilai

koefisien korelasi (r) suatu kurva baku. Menurut Kazakevich dan Lobrutto (2007),

suatu metode dikatakan memiliki linieritas yang baik jika memiliki nilai koefisien

korelasi (r) ≥ 0,998. Berdasarkan pembuatan kurva baku guaienesin diperoleh

nilai r sebesar 0,9997 sehingga dapat disimpulkan bahwa metode KCKT yang

digunakan memiliki linieritas yang baik untuk guaifenesin, tetapi belum dapat

diketahui pada salbutamol sulfat karena ketidakstabilan senyawanya, maka pada

penelitian ini tidak ada nilai r untuk kurva baku salbutamol sulfat.

3. Akurasi

Akurasi merupakan ukuran yang menunjukkan kedekatan hasil analisis

dengan konsentrasi analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen

perolehan kembali (% Recovery) konsentrasi analit yang terukur terhadap

konsentrasi analit yang sebenarnya. Metode penentuan % Recovery yang

dilakukan pada penelitian ini adalah metode penambahan baku (standard addition


57

method). Menurut Gonzalez dan Herrador (2007), akurasi dikatakan baik bila

memiliki nilai % Recovery antara 98,0-102,0% untuk kadar analit 10-100%.

Menurut ICH topik Q2(R1) (2005), akurasi sebaiknya dilakukan minimal

9 kali penentuan mencakup range tertentu, misal dengan 3 macam tingkat

konsentrasi dan setiap tingkat konsentrasinya dilakukan replikasi 3 kali. Pada

penelitian ini dibuat tiga tingkat konsentrasi sampel dengan rentang 80, 100, dan

120%, kemudian masing-masing tingkat konsentrasi ditambahkan baku dengan

konsentrasi tertentu sebagai sampel adisi. Perhitungan % Recovery didapatkan

dari selisih hasil analisis sampel adisi dengan sampel, kemudian dibandingkan

dengan konsentrasi baku adisi yang sebenarnya.

Tingkat konsentrasi 80% dapat dikatakan sebagai konsentrasi rendah

dimana secara teoritis dalam sampel terdapat 0,96 μg/mL salbutamol sulfat dan

40 μg/mL guaifenesin. Konsentrasi 100% disebut juga konsentrasi sedang dimana

secara teoritis dalam sampel terdapat 1,20 μg/mL salbutamol sulfat dan

50,0 μg/mL guaifenesin. Pada konsentrasi 120% disebut juga konsentrasi tinggi

dengan 1,44 μg/mL salbutamol sulfat dan 60,0 μg/mL guaifenesin. Konsentrasi

baku guaifenesin yang ditambahkan ke dalam sampel sebesar 5,391 μg/mL,

sedangkan tidak dilakukan penambahan baku salbutamol sulfat karena tidak dapat

dilakukan kuantifikasi. Tabel IX berikut menunjukkan hasil pengukuran

% Recovery larutan baku adisi pada 3 tingkat konsentrasi yang berbeda:


58

Tabel IX. Hasil penetapan % Recovery baku guaifenesin adisi

Replikasi Tingkat

konsentrasi

Konsentrasi guaifenesin

%

Recovery Sampel

(μg/mL)

KV

(%)

Sampel

adisi

(μg/mL)

KV

(%)

Baku

adisi

(μg/mL)

KV

(%)

1 Sampel

rendah

39,834

1,34

43,488

1,99

3,654

29,86

67,78

2 39,435 43,396 3,961 73,47

3 38,789 44,958 6,169 114,43

1 Sampel

sedang

48,963

0,42

54,393

0,32

5,430

0,59

100,72

2 48,649 54,109 5,460 101,28

3 49,029 54,425 5,396 100,09

1 Sampel

tinggi

58,578

1,04

64,823

2,97

6,245

33,17

115,84

2 58,551 62,128 3,577 66,35

3 57,521 61,250 3,729 69,17

Berdasarkan Tabel IX dapat diketahui bahwa rentang % Recovery baku

guaifenesin dalam sampel adisi pada konsentrasi rendah sebesar 67,78-114,43%,

pada konsentrasi sedang sebesar 100,09-101,28%, dan pada konsentrasi tinggi

sebesar 66,35-115,84%. Berdasarkan hasil dari ketiga tingkat konsentrasi tersebut,

hanya pada konsentrasi sedang saja yang masuk rentang 98,0-102,0%, maka dapat

dikatakan bahwa metode KCKT yang digunakan memiliki akurasi yang baik pada

konsentrasi sedang saja.

4. Presisi

Presisi/keterulangan merupakan ukuran kedekatan nilai data satu dengan

data lainnya dalam suatu pengukuran pada kondisi analisis yang sama. Presisi

dinyatakan sebagai koefisien variasi (KV). Semakin kecil nilai KV, maka presisi

suatu metode dikatakan semakin baik. Menurut Gonzalez dan Herrador (2007),

suatu metode analisis dikatakan memiliki presisi yang baik jika memiliki nilai

KV ≤ 2,0% untuk kadar analit 100%.


59

Berdasarkan Tabel IX pula dapat dilihat bahwa baku guaifenesin dalam

sampel adisi pada konsentrasi rendah dan tinggi memiliki nilai KV yang lebih

besar dari 2%, yaitu 29,86% untuk konsentrasi rendah dan 33,17% untuk

konsentrasi tinggi. Pada konsentrasi sedang didapatkan nilai KV yang lebih kecil

dari 2% yaitu 0,59%, maka dapat dikatakan bahwa metode KCKT yang

digunakan memiliki presisi yang baik untuk guaifenesin pada konsentrasi sedang.

5. Rentang

Berdasarkan hasil dari perhitungan linieritas, akurasi, dan presisi dapat

dikatakan bahwa parameter rentang didapatkan pada daerah konsentrasi sedang

(guaifenesin 50 μg/mL).

G. Uji Kestabilan Larutan Baku

Salah satu hal penting yang harus diperhatikan selama kegiatan analisis

berlangsung yaitu kestabilan senyawa yang akan dianalisis, terutama kestabilan

larutan baku yang digunakan untuk kuantifikasi. Uji kestabilan dilakukan dengan

menginjeksikan larutan baku yang sama dalam hari yang berbeda, kemudian

dilihat apakah hasil yang diberikan mengalami perubahan lebih dari yang

dipersyaratkan atau tidak. Suatu larutan dikatakan stabil apabila perubahan yang

dihasilkan tidak lebih dari 2% (Ahuja dan Dong, 2005).

Pada penelitian ini digunakan larutan baku salbutamol sulfat dan

guaifenesin, maka keduanya harus diuji kestabilannya agar dapat digunakan

secara pasti dalam kuantifikasi. Pada larutan baku salbutamol sulfat dibuat tiga


60

seri konsentrasi yaitu 0,8; 1,2; dan 1,6 μg/mL, sedangkan pada guaifenesin juga

dibuat tiga seri konsentrasi yaitu 36, 54, dan 72 μg/mL. Penentuan konsentrasi

masing-masing senyawa adalah untuk mewakili keseluruhan konsentrasi yang

dibuat pada kurva baku, dimana untuk salbutamol sulfat antara konsentrasi 0,8

sampai 1,6 μg/mL dan untuk guaifenesin antara konsentrasi 36 sampai 72 μg/mL.

Perubahan hasil pada kestabilan dapat dilihat dari kadar/konsentrasi

analit yang terdapat dalam suatu larutan tersebut. Pada guaifenesin didapatkan

kurva baku dengan nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan kurva

baku yang baik (r = 0,9997), maka perubahan hasil pada kestabilan larutan baku

guaifenesin dapat dilihat berdasarkan konsentrasinya. Tabel X berikut

menunjukkan besarnya persen perubahan (%) pada uji kestabilan larutan baku

guaifenesin:

Tabel X. Hasil persen perubahan (%) pada uji kestabilan guaifenesin

Kadar

teoritis

(μg/mL)

Kadar terukur (μg/mL) pada tanggal persen perubahan (%)

6 Maret 7 Maret 8 Maret 6 - 7 Maret 6 - 8 Maret

35,957 35,351 35,200 35,507 0,43 0,44

53,935 53,728 53,769 53,712 0,08 0,03

71,914 71,773 71,803 71,710 0,04 0,09

Uji kestabilan guaifenesin dilakukan pada tanggal 6 Maret sampai

8 Maret 2014. Berdasarkan data di atas dapat dilihat bahwa dalam dua hari yang

berbeda perubahannya tidak lebih dari 2%, maka dapat dikatakan bahwa larutan

baku guaifenesin yang digunakan stabil sehingga dapat digunakan untuk validasi

metode analisis dan kuantifikasi atau penetapan kadar guaifenesin dalam sampel.


61

Pada salbutamol sulfat tidak dilakukan pembuatan kurva baku karena

diduga tidak stabil (sudah kadaluwarsa) dan dari hasil yang telah dilakukan tidak

didapatkan kurva baku yang baik, dimana semua nilai koefisien korelasinya

(r) < 0,998 sehingga dalam mengamati kestabilan larutan baku salbutamol sulfat

dilihat dari respon AUC karena tidak dapat dilakukan perhitungan konsentrasi

terukur. Tabel XI berikut menunjukkan besarnya persen perubahan (%) pada uji

kestabilan larutan baku salbutamol sulfat:

Tabel XI. Hasil persen perubahan (%) pada uji kestabilan salbutamol sulfat

Kadar teoritis

(μg/mL)

persen perubahan (%) Kadar teoritis

(μg/mL)

persen

perubahan (%)

(16 Jan - 8 Mar) 5 - 6 Maret 5 - 7 Maret

0,791 4,66 5,70

9,883 25,78 1,186 0,06 9,63

1,581 8,66 7,47

Uji kestabilan salbutamol sulfat dilakukan pada tanggal 5 Maret sampai 7

Maret 2014. Berdasarkan data di atas dapat dilihat bahwa dalam dua hari yang

berbeda perubahannya lebih dari 2%, maka dapat dikatakan bahwa larutan baku

salbutamol sulfat yang digunakan tidak stabil sehingga tidak digunakan untuk

validasi metode analisis dan kuantifikasi. Ketidakstabilan salbutamol sulfat

didukung dengan adanya data salbutamol sulfat dengan konsentrasi 10 μg/mL

yang diinjeksikan saat optimasi (16 Januari 2014) kemudian diinjeksikan kembali

pada tanggal 8 Maret 2014 dan didapatkan perubahan sebesar 25,78%.


62

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Metode KCKT fase terbalik pada penetapan kadar guaifenesin dalam

sediaan sirup merek “X” dengan fase diam C18 merek Shimadzu (250 x 4,6 mm,

ukuran partikel 5 μm) dan fase gerak metanol : 0,01 M bufer kalium dihidrogen

fosfat pH 3 (40:60) dengan kecepatan alir fase gerak 1 mL/min memenuhi

parameter validitas yang baik, meliputi selektivitas dengan Rs > 1,5, linieritas

guaifenesin dengan r = 0,9997 pada rentang 36-72 μg/mL, akurasi, presisi, dan

rentang pada tingkat konsentrasi sedang (guaifenesin 50 μg/mL), tetapi tidak

untuk salbutamol sulfat karena baku salbutamol sulfat dalam penelitian ini

mengalami kadaluwarsa sehingga tidak dapat digunakan untuk kuantifikasi.

B. Saran

Penelitian ini perlu diaplikasikan dalam bentuk penetapan kadar

guaifenesin (pada tingkat konsentrasi sedang) dalam sediaan sirup merek “X”

dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik yang telah tervalidasi.


63

DAFTAR PUSTAKA

Ahuja, S. dan Dong, M.W., 2005, Handbook of Pharmaceutical Analysis by

HPLC, Vol. 6, Elsevier Inc., USA, hal. 49, 58-62, 210-211

Cairns, D., 2008, Intisari Kimia Farmasi, Edisi 2, EGC, Jakarta, hal. 10-12, 17

Dicpinigaitis, P.V., 2006, Chronic Cough Due to Asthma ACCP Evidence-Based

Clinical Practice Guidelines, No. 129, American College of Chest

Physicians, Maryland City, hal. 755-759

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope

Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, hal. 421, 751-

752, 1009, 1061

Gonzalez, A.G. dan Herrador, M.A., 2007, A Practical Guide to Analytical

Method Validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy

Profiles, Vol. 26, No. 3, Trends in Analytical Chemistry, Department of

Analytical Chemistry, Spain, hal. 227-238

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,

Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No. 3, Departemen Farmasi FMIP,

Universitas Indonesia, Jakarta, hal. 117-134

Harvey, D., 2000, Modern Analytical Chemistry, McGraw-Hill Companies, Inc.,

USA, hal. 372-376, 385, 578

ICH, 2005, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, Topic

Q2(R1), ICH Harmonised Tripartite Guideline, hal. 8-10

Jyothi, N., VenuGopal, K., dan Rao, JVLN, S., 2012, Development and

Validation of an HPLC method for the Simultaneous Estimation of the

Salbutamol Sulphate and Ipratropium in Inhalation Dosage Forms,

International Journal of Pharma Sciences, Vol. 2, No. 4, Aize Publisher,

India, hal. 79-83

Kazakevich, Y. dan Lobrutto, R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientist, John

Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, hal. 9-13, 23, 94-101, 461-

462, 465

Korany, M.A., Fahmy, O.T., Mahgoub, H., dan Maher, H.M., 2010, High

Performance Liquid Chromatographic Determination of Some

Guaiphenesin – Containing Cough – Cold Preparations, No. 2,

Department of Pharmaceutical Analytical Chemistry, Egypt, hal. 121-

130

Kromidas, S., 2005, More Practical Problem Solving in HPLC, Wiley-VCH

Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Germany, hal. 34


64

Levita, J. dan Mustarichie, R., 2012, Pemodelan Molekul dalam Kimia Medisinal,

Graha Ilmu, Yogyakarta, hal. 22-25

Martis, E. A. dan Gangrade, D. M., 2011, Reverse Phase Isocratic HPLC Method

for Simultaneous Estimation of Salbutamol Sulphate and

Beclomethasone Dipropionate in Rotacaps Formulation Dosage Forms,

International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, Vol. 3,

Issue 1, India, hal. 64-67

Moffat, A.C., David, M.O., dan Brian, W., (Eds.), 2005, Clarke’s Analysis of

Drugs and Poisons, 3rd

edition, The Pharmaceutical Press, London,

monograph on Guaifenesin, Salbutamol

Moffat, A.C., David, M.O., dan Brian, W., (Eds.), 2011, Clarke’s Analysis of

Drugs and Poisons, Pharmaceutical press, London, hal. 1468-1469,

2038-2039

Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,

Surabaya, hal. 6-11, 26, 31-34

Mulyawan, A., 2014, Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak Sistem

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik pada Pemisahan

Salbutamol Sulfat dan Guaifenesin dalam Sediaan Obat Sirup “Merek

X”, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Oemiati, R., Sihombing, M., dan Qomariah, 2010, Faktor-Faktor yang

Berhubungan dengan Penyakit Asma di

Indonesia, Media Litbang Kesehatan, Vol. XX, No. 1, Puslitbang BMF,

Jakarta, hal. 41-49

Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, cetakan I, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, hal. 220-225, 228-243, 339

Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta,

hal. 111-116, 217, 223-226, 232, 380

Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, cetakan II, Liberty, Yogyakarta, hal. 9-

15, 22-26, 39

Snyder, L.R., Kirkland, J.J, dan Glajh, J.L., 1997, Practical HPLC Method

Development, 2nd

edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, hal. 296-

300

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., dan Dolan, J.W., 2010, Introduction to Modern

Liquid Chromatography, 3rd

edition, John Wiley & Sons, Inc., New

York, hal. 20-23, 309-312


65

Sukandar, E.Y., Andrajati, R., Sigit, J.I., Adnyana, I.K., Setiadi, A.P., dan

Kusnandar, 2009, ISO Farmakoterapi, PT. ISFI Penerbitan, Jakarta, hal.

446-448

UBM Medica, 2011, MIMS Indonesia Petunjuk Konsultasi, Edisi 11 2011/2012,

PT Bhuana Ilmu Populer, Jakarta, hal. A24, A34, A40, 85

United States Pharmacopeial Convention, 2007, United States Pharmacopeia,

Edisi 30 (monograph on CD-ROM), United States Pharmacopoeial

Convention, Inc.

Walode, S.G., Deshpande, S.D., dan Deshpande, A.V., 2013, Stability Indicating

RP-HPLC Method for Simultaneous Estimation of Salbutamol Sulphate

and Guaifenesin, Vol. 4, No. 2, Department of Pharmaceutical

Chemistry, Der Pharmacia Sinica, India, hal. 61-67

Watson, D.G., 2000, Pharmaceutical Analysis, A Textbook for Pharmacy Students

and Pharmaceutical Chemists, Churchill Livingstone, Edinburgh,

London, hal. 76-80


LAMPIRAN


67

Lampiran 1. Certificate of Analysis (CoA) salbutamol sulfat


68


69

Lampiran 2. Certificate of Analysis (CoA) guaifenesin


70


71


72

Lampiran 3. Data penimbangan baku

1. Baku guaifenesin untuk pembuatan kurva baku

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Berat wadah (g) 8,58440 8,58434 8,58421

Berat wadah+zat (g) 8,60689 8,60684 8,60671

Berat zat (g) 0,02249 0,02250 0,02250

2. Baku guaifenesin untuk sampel adisi

Penimbangan

Berat wadah (g) 8,58440

Berat wadah+zat (g) 8,60689

Berat zat (g) 0,02249

3. Baku guaifenesin untuk uji kestabilan larutan baku guaifenesin

Penimbangan




4. Baku salbutamol sulfat untuk uji kestabilan larutan baku salbutamol sulfat

Penimbangan




Lampiran 4. Skema pembuatan larutan baku guaifenesin dan contoh

perhitungan kadar larutan baku yang digunakan

1. Skema pembuatan larutan baku guaifenesin

Timbang seksama lebih kurang 22,5 mg guaifenesin

↓


73

Larutkan dengan metanol dalam labu takar 25,0 mL hingga tanda, sehingga

didapatkan konsentrasi 900 μg/mL (sebagai larutan stok)

↓

Ambil atau pipet larutan stok sejumlah 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; dan 0,8 mL

↓

Encerkan dengan metanol dalam labu takar 10,0 mL hingga tanda, sehingga

didapatkan konsentrasi seri larutan baku 36,0; 45,0; 54,0; 63,0; dan 72,0 μg/mL

2. Contoh perhitungan kadar larutan baku guaifenesin yang digunakan

Perhitungan seri baku guaifenesin (hasil dari penentuan kurva baku Replikasi 3)

Berat baku guaifenesin hasil penimbangan = 0,02250 gram = 22,5 mg

Konsentrasi baku guaifenesin dalam larutan stok = 22,5 mg/25,0 mL = 0,9 mg/mL

= 900 μg/mL

Kemurnian baku pembanding guaifenesin 99,88%, maka konsentrasi baku

guaifenesin dalam larutan stok sebenarnya = 900 μg/mL x 99,88% =

898,92 μg/mL

Konsentrasi seri larutan baku guaifenesin =

V1 x C1 = V2 x C2

0,4 mL x 898,92 μg/mL = 10,0 mL x C2

C2 = 35,957 μg/mL

Seri baku V1 (mL) C2 (μg/mL)

1 0,4 35,957

2 0,5 44,946

3 0,6 53,935

4 0,7 62,924

5 0,8 71,914


74

Lampiran 5. Kromatogram baku guaifenesin untuk kurva baku

1. Replikasi I

Gambar 20. Kromatogram baku guaifenesin 36 μg/mL replikasi I

Fase diam : C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm

Fase gerak : metanol : 0,01M bufer fosfat pH 3 (40:60)

Kecepatan alir : 1,0 mL/min

Volume injeksi : 20 µL

Detektor : UV-275 nm


75

Gambar 21. Kromatogram baku guaifenesin 45 μg/mL replikasi I






Gambar 22. Kromatogram baku guaifenesin 54 μg/mL replikasi I Fase diam : C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm






76












77

2. Replikasi II

Gambar 25. Kromatogram baku guaifenesin 36 μg/mL replikasi II













78














79







3. Replikasi III

Gambar 30. Kromatogram baku guaifenesin 36 μg/mL replikasi III







80














81














82

Lampiran 6. Data penentuan kurva baku guaifenesin

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

C (μg/mL) AUC

(mAU) C (μg/mL)

AUC

(mAU) C (μg/mL)

AUC

(mAU)

35,941 416750 35,957 430299 35,957 434389

44,926 542221 44,946 563166 44,946 565020

53,911 690626 53,935 674301 53,935 676218

62,896 779459 62,924 790499 62,924 791864

71,882 903167 71,914 913892 71,914 917741

A = - 59598,246 A = - 42280,037 A = - 39082,532

B = 13467,384 B = 13288,380 B = 13277,580

r = 0,9975 r = 0,9996 r = 0,9997 Keterangan:

C = konsentrasi seri baku guaifenesin (μg/mL)

AUC = Area Under Curve (mAU)

Lampiran 7. Persamaan dan gambar kurva baku guaifenesin

1. Persamaan kurva baku guaifenesin yang digunakan berasal dari replikasi 3

dengan persamaan sebagai berikut:

y = 13277,580x – 39082,532

2. Gambar kurva baku guaifenesin

y = 13277,580x - 39082,532 r = 0.9997

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

0 20 40 60 80

AU

C (

mA

U)

Konsentrasi guaifenesin (μg/mL)


83

Lampiran 8. Kromatogram sampel

1. Sampel rendah

Gambar 35. Kromatogram sampel 40 μg/mL replikasi I







84

Gambar 36. Kromatogram sampel 40 μg/mL replikasi II






Gambar 37. Kromatogram sampel 40 μg/mL replikasi III







85

2. Sampel sedang














86







3. Sampel tinggi








87














88

Lampiran 9. Kromatogram sampel adisi

1. Sampel rendah adisi

Gambar 44. Kromatogram sampel rendah adisi replikasi I






Gambar 45. Kromatogram sampel rendah adisi replikasi II







89

Gambar 46. Kromatogram sampel rendah adisi replikasi III






2. Sampel sedang adisi

Gambar 47. Kromatogram sampel sedang adisi replikasi I







90

Gambar 48. Kromatogram sampel sedang adisi replikasi II






Gambar 49. Kromatogram sampel sedang adisi replikasi III







91

3. Sampel tinggi adisi

Gambar 50. Kromatogram sampel tinggi adisi replikasi I






Gambar 51. Kromatogram sampel tinggi adisi replikasi II







92

Gambar 52. Kromatogram sampel tinggi adisi replikasi III






Lampiran 10. Perolehan nilai AUC sampel dan sampel adisi, contoh

perhitungan konsentrasi terukur, perhitungan % Recovery, dan KV baku

guaifenesin adisi

1. Nilai AUC sampel dan sampel adisi

Replikasi Tingkat konsentrasi AUC (mAU)

Sampel Sampel adisi

1

Sampel rendah

489817 538335

2 484516 537117

3 475948 557849

1

Sampel sedang

611026 683119

2 606857 679353

3 611906 683544

1

Sampel tinggi

738696 821605

2 738337 785825

3 724654 774172


93

2. Contoh perhitungan konsentrasi terukur baku guaifenesin

Diketahui AUC sampel guaifenesin sebesar 611026 dan AUC sampel adisi

sebesar 683119, maka:

Konsentrasi guaifenesin dalam sampel:

y = 13277,580x – 39082,532

611026 = 13277,580x – 39082,532

x = 48,963 μg/mL

Konsentrasi guaifenesin dalam sampel adisi:

y = 13277,580x – 39082,532

683119 = 13277,580x – 39082,532

x = 54,393 μg/mL

Konsentrasi baku guaifenesin adisi = konsentrasi guaifenesin dalam sampel

adisi – konsentrasi guaifenesin dalam sampel

Konsentrasi baku guaifenesin adisi = (54,393 – 48,963) μg/mL

Konsentrasi baku guaifenesin adisi = 5,430 μg/mL

3. Contoh perhitungan % Recovery baku guaifenesin adisi

Diketahui konsentrasi terukur baku guaifenesin adisi sebesar 5,430 μg/mL dan

konsentrasi sebenarnya sebesar 5,391 μg/mL, maka:

% Recovery = konsentrasi baku dan sampel terukur – konsentrasi sampel terukur

konsentrasi baku teoritis x 100%

% Recovery = 5,430 μg/mL

5,391 μg/mL x 100%

% Recovery = 100,72%

4. Contoh perhitungan KV baku guaifenesin adisi

Diketahui konsentrasi terukur rata-rata (x̅) baku guaifenesin adisi sebesar 5,429

μg/mL dengan standar deviasi (SD) sebesar 0,032, maka:


94

KV = standar deviasi (SD)

rata-rata (X̅) x 100%

KV = 0,032

x 100%

KV = 0,59%

Replikasi Tingkat

konsentrasi

Konsentrasi guaifenesin

%

Recovery Sampel

(μg/mL)

KV

(%)

Sampel

adisi

(μg/mL)

KV

(%)

Baku

adisi

(μg/mL)

KV

(%)

1 Sampel

rendah

39,834

1,34

43,488

1,99

3,654

29,86

67,78

2 39,435 43,396 3,961 73,47

3 38,789 44,958 6,169 114,43

1 Sampel

sedang

48,963

0,42

54,393

0,32

5,430

0,59

100,72

2 48,649 54,109 5,460 101,28

3 49,029 54,425 5,396 100,09

1 Sampel

tinggi

58,578

1,04

64,823

2,97

6,245

33,17

115,84

2 58,551 62,128 3,577 66,35

3 57,521 61,250 3,729 69,17


95

Lampiran 11. Kromatogram baku guaifenesin untuk uji kestabilan larutan

baku guaifenesin

6 Maret 2014

Gambar 53. Kromatogram baku guaifenesin 36 μg/mL 6 Maret 2014













96







7 Maret 2014








97














98

8 Maret 2014














99







Lampiran 12. Perolehan nilai AUC baku guaifenesin, contoh perhitungan

konsentrasi terukur dan perhitungan % perubahan untuk uji kestabilan

larutan baku guaifenesin

1. Nilai AUC baku guaifenesin

C teoritis

(μg/mL)

AUC (mAU) pada tanggal

6 Maret 7 Maret 8 Maret

35,957 430299 428289 432367

53,935 674301 674835 674079

71,914 913892 914290 913048

2. Contoh perhitungan konsentrasi terukur baku guaifenesin

Diketahui AUC baku guaifenesin konsentrasi 35,957 μg/mL tanggal 6 Maret

sebesar 430299, 7 Maret sebesar 428289, dan 8 Maret sebesar 432367, maka:

Konsentrasi terukur baku guaifenesin tanggal 6 Maret:

y = 13277,580x – 39082,532

430299 = 13277,580x – 39082,532

x = 35,351 μg/mL


100


y = 13277,580x – 39082,532

428289 = 13277,580x – 39082,532

x = 35,200 μg/mL


y = 13277,580x – 39082,532

432367 = 13277,580x – 39082,532

x = 35,507 μg/mL

3. Contoh perhitungan % perubahan untuk uji kestabilan larutan baku guaifenesin

% perubahan = konsentrasi terukur – konsentrasi terukur

konsentrasi terukur awal x 100%

Tanggal 7 Maret, % perubahan = konsentrasi terukur – konsentrasi terukur


% perubahan = 35,200 – 35,351

35,351 x 100%

% perubahan = 0,43%

Tanggal 8 Maret, % perubahan = konsentrasi terukur – konsentrasi terukur


% perubahan = 35,507 – 35,351

35,351 x 100%

% perubahan = 0,44%

Kadar

teoritis

(μg/mL)

Kadar terukur (μg/mL) pada tanggal persen perubahan (%)

6 Maret 7 Maret 8 Maret 6 - 7

Maret

6 - 8

Maret

35,957 35,351 35,200 35,507 0,43 0,44

53,935 53,728 53,769 53,712 0,08 0,03

71,914 71,773 71,803 71,710 0,04 0,09


101

Lampiran 13. Skema pembuatan larutan baku salbutamol sulfat dan contoh

perhitungan kadar larutan baku yang digunakan untuk uji kestabilan

larutan baku salbutamol sulfat

1. Skema pembuatan larutan baku salbutamol sulfat

Timbang seksama lebih kurang 10,0 mg salbutamol sulfat

↓

Larutkan dengan metanol dalam labu takar 50,0 mL hingga tanda, sehingga

didapatkan konsentrasi 200 μg/mL (sebagai larutan stok)

↓

Ambil atau pipet 0,5 mL larutan stok, masukkan ke dalam labu takar 5,0 mL

dan encerkan dengan metanol hingga tanda, sehingga didapatkan konsentrasi

20 μg/mL (sebagai larutan intermediate)

↓

Ambil atau pipet larutan intermediate sejumlah 0,4; 0,6; dan 0,8 mL

↓

Encerkan dengan metanol dalam labu takar 10,0 mL hingga tanda, sehingga

didapatkan konsentrasi seri larutan baku 0,8; 1,2; dan 1,6 μg/mL

2. Perhitungan kadar larutan baku salbutamol sulfat yang digunakan untuk uji

stabilitas larutan baku salbutamol sulfat

Berat baku salbutamol sulfat hasil penimbangan = 0,01000 gram = 10,0 mg

Konsentrasi baku salbutamol sulfat dalam larutan stok = 10,0 mg/50,0 mL = 0,2

mg/mL = 200 μg/mL

Konsentrasi baku salbutamol sulfat dalam larutan intermediate =

V1 x C1 = V2 x C2

0,5 mL x 200 μg/mL = 5,0 mL x C2

C2 = 20 μg/mL


102

Kemurnian baku pembanding salbutamol sulfat 98,83%, maka konsentrasi baku

salbutamol sulfat dalam larutan intermediate sebenarnya = 20 μg/mL x 98,83% =

19,766 μg/mL

Konsentrasi seri larutan baku salbutamol sulfat =

V1 x C1 = V2 x C2

0,4 mL x 19,766 μg/mL = 10,0 mL x C2

C2 = 0,791 μg/mL

Seri baku V1 (mL) C2 (μg/mL)

1 0,4 0,791

3 0,6 1,186

5 0,8 1,581

Lampiran 14. Kromatogram baku salbutamol sulfat untuk uji kestabilan

larutan baku salbutamol sulfat

5 Maret 2014

Gambar 62. Kromatogram baku salbutamol sulfat 0,8 μg/mL 5 Maret 2014







103














104

6 Maret 2014














105







7 Maret 2014








106














107

16 Januari 2014 (Konsentrasi 10 μg/mL)

Gambar 71. Kromatogram baku salbutamol sulfat 10 μg/mL 16 Januari 2014






8 Maret 2014 (Konsentrasi 10 μg/mL)

Gambar 72. Kromatogram baku salbutamol sulfat 10 μg/mL 8 Maret 2014







108

Lampiran 15. Perolehan nilai AUC baku salbutamol sulfat, contoh

perhitungan % perubahan untuk uji kestabilan larutan baku salbutamol

sulfat

1. Nilai AUC baku salbutamol sulfat

C teoritis

μg/mL)


5 Maret 6 Maret 7 Maret

0,791 12429 13008 11721

1,186 14296 14288 12919

1,581 16943 18411 18209

C teoritis

(μg/mL)


16 Januari 8 Maret

9,883 72363 91019

2. Contoh perhitungan % perubahan untuk uji kestabilan larutan baku salbutamol

sulfat. Pada penelitian tidak didapatkan kurva baku (tidak dapat menghitung

kadar), maka digunakan respon AUC untuk menghitung % perubahannya.

% perubahan = respon – respon

respon awal x 100%

Tanggal 6 Maret, % perubahan = respon – respon

respon awal x 100%

% perubahan = 13008 – 12429

12429 x 100%

% perubahan = 4,66%

Tanggal 7 Maret, % perubahan = respon – respon

respon awal x 100%

% perubahan = 11721 – 12429

12429 x 100%

% perubahan = 5,70%

Kadar

teoritis

(μg/mL)

persen perubahan (%) Kadar

teoritis

(μg/mL)

persen

perubahan (%)

(16 Jan - 8 Mar) 5 - 6 Maret 5 - 7 Maret

0,791 4,66 5,70

9,883 25,78 1,186 0,06 9,63

1,581 8,66 7,47


109

Lampiran 16. Kromatogram untuk menunjukkan resolusi pemisahan

salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam larutan baku campuran

Replikasi I (Rs = 10,462)

Gambar 73. Kromatogram baku campuran salbutamol sulfat 1,2 μg/mL dan guaifenesin 80

μg/mL replikasi I







110

Replikasi II (Rs = 10,451)


μg/mL replikasi II







111

Replikasi III (Rs = 10,429)


μg/mL replikasi III







112

Lampiran 17. Kromatogram untuk menunjukkan resolusi pemisahan

salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam sampel

Gambar 76. Kromatogram sampel 50 μg/mL untuk menunjukkan resolusi replikasi I






Gambar 77. Kromatogram sampel 50 μg/mL untuk menunjukkan resolusi replikasi II







113

Gambar 78. Kromatogram sampel 50 μg/mL untuk menunjukkan resolusi replikasi III







114

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Validasi Metode Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik untuk Penetapan Kadar

Salbutamol Sulfat dan Guaifenesin dalam Sediaan Sirup

Merek “X”” memiliki nama lengkap Agustinus Hendy

Larsen. Penulis lahir di Tegal pada 3 Agustus 1992

sebagai anak kedua dari tiga bersaudara pasangan Dra.

Bernardine Susy Mayawati Soeharto dan Alm. Bernardus

Bambang Hermantodjojo. Pendidikan formal yang telah

ditempuh penulis adalah TK Pius Tegal (1995-1998), SD

Pius Tegal (1998-2004), SMP Pius Tegal (2004-2007),

SMA Pius Tegal (2007-2010), kemudian tahun 2010 penulis melanjutkan kuliah

di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah

penulis pernah menjadi asisten dosen pada mata kuliah praktikum Kimia Dasar

(2013), praktikum Bentuk Sediaan Farmasi (2013), praktikum Biofarmasetika

(2014), praktikum Formulasi dan Teknologi Sediaan Farmasi I (2014), dan

praktikum Farmasi Fisika (2014). Selain itu, penulis juga pernah mengikuti

beberapa kegiatan dan organisasi antara lain: panitia Pelepasan Wisuda (2011),

panitia Tiga Hari Temu Akrab Farmasi/Titrasi (2011 dan 2012), panitia Hari Anti

Tembakau (2011), dan pernah mengikuti beberapa seminar (baik yang

diselenggarakan di dalam ataupun di luar kampus).


Documents

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/17951/2/108114014_full.pdf · sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar sarjana farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi,