PID 6082 Microscopia de Desconvolución Digital: Desarrollo ...€¦ · Digital Deconvolution Microscopy: Development, Evaluation and Utilization in 3D quantitative studies Abstract

Universidad Nacional de Entre Ríos. ISSN 2250-4559. Eva Perón 24; 3260 FIB Concepción del Uruguay, Entre Ríos, Argentina. Tel: 54-03442-421558/421530, http://www.revistacdyt.uner.edu.ar/suplemento/

PID 6082

Microscopia de Desconvolución Digital: Desarrollo, Evaluación y Utilización en estudios cuantitativos tridimensionales J. F. Adur, J. E. Diaz-Zamboni, N. B. Vicente, M. F. Izaguirre, V. H. Casco* Autores: *Laboratorio de Microscopia, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Entre Ríos (UNER). Ruta 11 km 10, Oro Verde, Entre Ríos, Argentina. Contacto: [email protected]

Resumen La utilización de algoritmos de desconvolución aplicados a imágenes de microscopia de fluorescencia tridimensional (3D) puede considerarse una alternativa económica si se compara con las modernas técnicas de microscopia 3D. Recientemente, nuestro grupo ha desarrollado un microscopio de desconvolución digital (MDD) sobre la base de un microscopio derecho de epifluorescencia. El sistema permite realizar un seccionamiento óptico preciso (captura de imágenes a diferentes planos focales) de la muestra. Las imágenes registradas son tratadas utilizando métodos computacionales, los que trabajan utilizando la información del proceso de formación de la imagen (desconvolución usando la función de esparcimiento puntual (PSF)). Las imágenes procesadas son luego utilizadas para realizar estudios de cuantificación y análisis 3D más precisos. El objetivo principal de este trabajo es evaluar los pasos de esta técnica haciendo hincapié en la metodología para obtener resultados útiles que puedan aplicarse a modelos biológicos. Se consideran los principales aspectos para realizar una adecuada y precisa cuantificación.

Palabras clave: Desconvolución, PSF, cuantificación 3D, análisis de imágenes 3D

Digital Deconvolution Microscopy: Development, Evaluation and Utilization in 3D quantitative studies

Abstract Deconvolution of three-dimensional (3-D) fluorescence microscopy images using computational restoration algorithms may be seen as a cheaper alternative to modern 3-D microscopy techniques. We have recently developed a digital deconvolution microscope based upon a standard upright fluorescence microscopy setup, which allows us to perform precise optical-sectioning procedures by positioning the sample at different focal depths. The acquired images are then treated using computational methods which make use of the information regarding the image-formation process (deconvolution using the Point Spread Function, PSF). The processed images are used to perform a more accurate 3-D quantification and analyses. The main goal of this work is to evaluate the technical steps, highlighting the methodology to analyze the usefulness of this approach with the aid of a biological model. In the present work we show the main aspects to be considered in order to obtain an adequate and precise quantification.

Keywords: Deconvolution, PSF, 3-D quantification, 3-D image analyses

Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento, Vol. 1 | Nº 1 (2011) ISSN 2250-4559

Introducción

En biología celular y molecular se intenta comprender las complejas funciones celulares y las interacciones de las células con su entorno. Para poder realizar esto, pocas evidencias son tan contundentes al investigador como los que pueden aportar las imágenes tridimensionales. Entre los métodos actuales que permiten obtener este tipo de imágenes podemos mencionar varios tipos de microscopía de fluorescencia 3-D (1, 31). Estas microscopias pueden ser consideradas únicas, por su capacidad de examinar bioestructuras y estados fisiológicos en células vivas, permitiendo el análisis de relaciones complejas entre funcionamiento y estructura de sistemas biológicos. Adicionalmente, la fluorescencia permite examinar funcionalmente la distribución espacial y temporal de componentes celulares específicos, integrando de esta manera todas las propiedades de la microscopía óptica.

Entre las técnicas de fluorescencia más utilizadas para obtener imágenes 3-D podemos citar la Microscopía Láser Confocal (15, 29) y la Microscopía de Desconvolución Digital (6, 10). Ambas permiten realizar, aunque de maneras diferentes, un seccionamiento óptico de la muestra. Existen también diferencias en el modo en que cada una de ellas minimiza la contaminación que sufre la señal en foco (imagen del plano focal) debido a la señales fuera de foco (imágenes de planos vecinos no focales). La Microscopía Láser Confocal utiliza un filtro físico denominado pinhole, ubicado delante del detector, que rechaza la fluorescencia proveniente de los planos no focales. Por su parte, la Microscopía de Desconvolución Digital, registra tanto la fluorescencia en foco como la que esta fuera de foco. Esto resulta, en una imagen que esta formada por información proveniente del plano focal más la contaminación de la información fuera de foco proveniente de los restantes planos. Esta información fuera de foco es eliminada o restaurada por medios matemáticos, utilizando las técnicas de desconvolución, para lo cual se requiere conocer la función de transferencia del sistema óptico utilizado. Hay ventajas y desventajas en ambas metodologías, y la elección de cual utilizar depende de la naturaleza de la muestra, del tipo de dato requerido y de las aplicaciones. No obstante, los dos tipos de microscopía pueden brindar excelentes y similares resultados en cuanto a resolución (5, 16, 24).

Estas tecnologías requieren de personal especializado y equipamiento muy costoso. Con el objetivo de contar con este tipo de tecnologías, nuestro grupo ha trabajado sobre la actualización de los equipos de microscopía de fluorescencia existentes en nuestro laboratorio, habiendo completado la implementación de la técnica de Microscopia de Desconvolución Digital. En el presente trabajo se describe paso a paso la técnica mencionada, las estrategias de implementación llevadas a cabo en cada paso y la evaluación de las mismas. Finalmente se describen los resultados obtenidos al aplicar la técnica a diferentes modelos biológicos reales. Datos cualitativos y cuantitativos en tres dimensiones son analizados. Pasos de la técnica e implementación La Figura 1 presenta un diagrama con los diferentes niveles implicados en las aplicaciones de la Microscopia de Desconvolución Digital (MDD) relacionadas con la cuantificación de la expresión diferentes moléculas. Resumiendo, aplicar la técnica conlleva a ejecutar los siguientes pasos: seccionamiento óptico del espécimen, determinación de la función de esparcimiento puntual (PSF), desconvolución de las imágenes, visualización 3-D y cuantificación 3-D.

3 ADUR, J. F. y otros | Microscopía de Desconvulsión Digital…

Fig. 1 Diagrama donde se observan los diferentes niveles que son necesarios realizar en la Microscopia de Desconvolución Digital

Sistema de Microscopia El sistema desarrollado, utilizado para adquirir imágenes tridimensionales, fue implementado sobre un microscopio directo de epifluorescencia Olympus BX50, equipado con una lámpara de mercurio que brinda picos de luminancia en las siguientes longitudes de onda 365/366; 404,7; 435; 546,1 y 577/579,1 nm y una torreta que permite colocar diferentes configuraciones de cubos con filtros. Las lentes objetivas son del tipo plano-apocromáticas con corrección al infinito, logrando una imagen intermedia libre de aberraciones. El sistema de registro consta de una cámara monocromática digital CCD refrigerada de 14 bits de resolución (Apogee Co.). El sensor posee una superficie de 512x768 píxeles con un tamaño de píxel de 9 µm. Estos dispositivos poseen alta resolución, alta sensibilidad, amplio rango dinámico, seguridad fotométrica y estabilidad geométrica, especialmente apropiados para el análisis cuantitativo de alta calidad en estudios bi- y tridimensionales (17).

Seccionamiento Óptico


Acoplado al microscopio BX50, se dispuso un sistema electromecánico (motor paso a paso y caja de reducción) que permite desplazar la platina en incrementos discretos a lo largo del eje focal del sistema de lentes. Esto permite realizar el seccionamiento óptico, es decir, capturar imágenes bidimensionales en cada posición focal que registra la lente al desplazarse por el espesor completo del espécimen. El motor paso a paso se seleccionó por permitir un control digital, que no requiere realimentación, posee fácil control de velocidad, larga vida útil, bajo costo, interfase sencilla y mantenimiento mínimo. La elección del mismo se definió teniendo en cuenta la resolución del sistema BX50. Se seleccionó el motor híbrido RS 440-436 de 1,8º por paso, lo que permite con dos pasos realizar el movimiento mínimo del equipo (3,6º), obteniéndose una resolución de 500 nm. Al motor, se acopló una caja reductora que permitió mejorar la resolución. Se selecciono la caja RS 718-896, que posee una relación 100 a 1, lo que permite obtener una resolución de 5 nm, suficiente para los estudios de seccionamiento. El acople entre el motor y la caja reductora se realizó con un kit de adaptación que es suministrado de fabrica. Por su parte, para realizar el acople de todo el conjunto (motor y caja reductora) al BX50, se extrajo la perilla del tornillo micrométrico y se construyó una pieza adaptadora, que la reemplaza y permite el acople con el eje de la caja reductora por su cara externa. El control, por simplicidad y versatilidad, se realiza desde el puerto paralelo de la PC. Esto ofrece la ventaja de poder conectar el sistema a cualquier PC; además de la posibilidad de escribir y leer datos en una forma sencilla. Se utilizaron cuatro líneas de salida del puerto (una por cada bobina del motor) para excitar las bobinas del motor paso a paso, los pulsos de excitación son generados por programa desde la PC. Para garantizar el total aislamiento del puerto (y de la PC) con respecto a los circuitos de potencia, se utilizaron optoacopladores entre las líneas del puerto y el resto de la electrónica. Para más detalle del diseño ver (2). El sistema está controlado en forma automática por un software especialmente diseñado por el grupo: SUMDD (Software para Usuarios de Microscopia de Desconvolución Digital), el cual, además de realizar las operaciones de seccionamiento, permite seleccionar los parámetros de adquisición, de almacenamiento y procesamiento (desconvolución y reconstrucción tridimensional) de las imágenes (14). En la Figura 2, se presenta el microscopio con los sistemas descriptos anteriormente.

Determinación de la Función de Esparcimiento Puntual (PSF) Con el seccionamiento óptico, se obtienen imágenes que contienen información en foco e información fuera de foco. A los efectos de obtener solo la información de interés, se debe eliminar la fluorescencia fuera de foco. Para ello, se debe conocer la función de esparcimiento puntual o función transferencia del sistema (PSF). La función nos describe exactamente como se distorsiona una fuente puntual de luz al pasar a través de las ópticas del microscopio. La determinación, se puede realizar por medio de la utilización de las leyes de la óptica geométrica o bien por un método empírico como el que se detalla en este trabajo. Para realizar el cálculo empírico, se necesita simular una fuente de luz puntual. Se debe tener en cuenta que la fuente no debe ser muy pequeña ya que no podría ser resuelta por el microscopio ni ser muy grande porque dejaría de representar a un punto. Como se trabaja en el modo fluorescencia, se decidió utilizar como fuente puntual a las microesferas fluorescentes del equipo F-8888 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Estas han sido diseñadas especialmente para alineación y calibración y son muy resistentes al fotodecaimiento (34). Están marcadas con fluoróforos excitables a la misma longitud que el fluoróforo amarillo/verde (505/515 nm) (FITC) utilizado en los experimentos. La solución madre fue diluida (1:100) de manera de obtener una solución con microesferas que no estén tan próximas (permitiendo aislar para el proceso microesferas individuales), ni tan separadas (pues la escases de éstas en el campo de visión, dificulta la intensidad de señal). Obtenida la dilución ideal, las muestras fueron colocadas sobre el portaobjetos hasta desecación y cubiertas con


cubreobjetos. Para facilitar la estabilidad del preparado, el mismo es sellado por los bordes con un esmalte acrílico.

Fig. 2: Sistema MDD diseñado en el Laboratorio de Microscopia de la FI-UNER para realizar estudios de microscopia en tres dimensiones. 1 - Microscopio de epifluorescencia Olympus BX-50. 2 - Cámara CDD. 3 - Control electromecánico. 4 - Modulo electrónico. 5 - PC de control. 6 - PC de procesamiento y análisis de imágenes.

Para que trabaje como fuente puntual (delta de Dirac), el tamaño de la microesfera se seleccionó considerando que el diámetro de la misma sea aproximadamente la mitad del tamaño del anillo del patrón de difracción de cada lente (resolución de la lente). Para ello se utilizó la fórmula que se presenta en la Eq. (1)

Diámetro de la microesfera ≤ 0,61 (λ/NA) (1)

donde: NA es la apertura numérica de la lente y λ la longitud de onda de la lámpara de fluorescencia. Seleccionado el diámetro, la PSF se obtuvo seccionando ópticamente la microesfera. Para ello, los desplazamientos en Z (eje del microscopio) se realizaron respetando la simetría y se repitieron barriendo la mayor cantidad de planos por encima y por debajo del plano focal. De esta manera, se puede capturar la distorsión introducida por el sistema y cuantificar plano a plano el patrón de Airy. Para obtener una buena relación señal/ruido, el seccionamiento se realiza de 3 a 5 veces en cada posición focal y la imagen final utilizada se promedia y normaliza. En la figura 3 se ejemplifica una galería de imágenes de una microesfera de la PSF determinada para el microscopio BX50. Es muy importante que se conserven las condiciones de captura de la PSF en la captura del espécimen a estudiar.

Fig. 3: Forma y geometría de la PSF determinada experimentalmente en el microscopio Olympus BX50. A) Secciones bidimensionales de 32x32 píxeles de una microesfera fluorescente de 0,46 µm de diámetro capturada con la lente de 40X/AN 0,85. Las secciones se hallan separadas entre sí por un ∆Z = 0,5 µm.

1

2

3

4

5 6


El recuadro en rojo representa la sección en foco. Al alejarse de esta posición (hacia derecha o izquierda) los anillos concéntricos (patrón de Airy) se hacen más notables. Para mejor visualización, las imágenes fueron aumentadas en tres veces. B) Proyección XZ, utilizando el método de máxima proyección de intensidades, donde la forma de reloj de arena se visualiza claramente

Desconvolución Todos los sistemas de imágenes causan un borroneo independientemente de las otras formas de degradación (ruido, dispersión y brillo). Éstas pueden deberse tanto al espécimen como a la electrónica del sistema. Es precisamente esta independencia del borroneo con respecto a los otros problemas la que hace posible su remoción por medio de la desconvolución. Dado que el borroneo es una función del microscopio y principalmente de la lente objetiva, éste puede ser modelado con relativa simplicidad. Los algoritmos utilizados derivan del análisis matemático que describe el proceso de formación de la imagen en un microscopio. Este proceso se conoce como la convolución de dos cantidades conocidas, la PSF tridimensional, PSF (x, y, z), y una cantidad desconocida que es la distribución tridimensional original de luz del espécimen o (x, y, z) (7, 20, 25). Este fenómeno óptico, en su forma más simple, se describe matemáticamente por la Eq. (2):

i (x, y, z) = PSF (x, y, z) ⊗ o (x, y, z) (2)

donde: i (x, y, z) es la imagen tridimensional capturada por seccionamiento óptico y ⊗ es el operador convolución tridimensional. Existen diferentes algoritmos de desconvolución (Tabla 1), diferenciándose por la forma en que trabajan con la fluorescencia fuera de foco que distorsiona las imágenes. Los algoritmos de eliminación (substraen la fluorescencia fuera de foco) y los de restauración (reasignan la fluorescencia a su posición original) (26, 32, 33). El software SUMDD (14) posee implementado entre sus opciones los siguientes métodos de desconvolución: Nearest Neighbor, Regularized Linear Least Square, Inverse Wiener Filter y Constraines Iterative Deconvolution.

Tabla 1. Métodos de Desconvolución. 2D: bidimensionales; 3D: tridimensionales

Nombre Tipo Categoría - Nearest Neighbor 2D/Lineal Eliminación - Multiples Neighbors 2D/Lineal Eliminación - Wiener Filter 2D/Lineal Restauración - Regularized Linear Least Square 3D/Lineal Restauración - No-Linear Least Square 3D/No Lineal Restauración - Constrained Iterative Deconvolution 3D/Iterativo Restauración - Maximum Likelihood 3D/Iterativo / estadístico Restauración - Constrained Maximum Likelihood 3D/Iterativo / estadístico Restauración - Blind Deconvolution 3D/Iterativo Restauración

El algoritmo Nearest Neighbor es fundamentalmente bidimensional y elimina información. Realiza una operación plano por plano para cada plano 2D de una pila 3D. Brevemente, opera tomando una sección “o” a la que se le sustrae la información fuera de foco de sus vecinos “o±1”. El volumen es procesado aplicando el algoritmo a cada plano de la pila. De esta forma, una estimación de la información fuera de foco es eliminada de cada plano. Son simples computacionalmente y rápidos, pero como desventaja aumentan el ruido y reducen el nivel de la señal fluorescente. Los algoritmos Regularized Linear Least Square e Inverse Wiener Filter son algoritmos de restauración y trabajan con toda la pila de secciones. Son algoritmos inversos que trabajan con la transformada de Fourier de una imagen y la dividen por la transformada de Fourier de la PSF. Dado que la división en el espacio de Fourier es equivalente a la


desconvolución en el espacio real, una simple división resuelve el problema del borroneo que es introducido por la convolución del objeto con la PSF (ver eq. 2). La utilidad de estos métodos está limitada por la amplificación del ruido. Durante la división en el espacio de Fourier, pequeñas variaciones del ruido en la transformada de Fourier son amplificados en el proceso de división. Para mejorar los métodos inversos, se utilizan los métodos iterativos con restricciones. Estos trabajan en ciclos sucesivos e incluyen restricciones a las posibles soluciones.

Los resultados de los rendimientos y eficiencias de los algoritmos implementados en nuestro grupo han sido presentados en diferentes estudios (8, 12, 13). Estos son coincidentes con los reportados en la literatura (4, 9, 28); se ha demostrado que los métodos de substracción eliminan información, y dada la característica aleatoria de la imagen del espécimen, es difícil conocer en qué proporción se eliminan las intensidades, lo que los convierte en inadecuados para utilizarlos en los procesos de cuantificación. Por tal motivo, en los estudios presentados en adelante se utiliza el algoritmo de restauración denominado Método Iterativo con Restricción de Positividad.

Representación Tridimensional y Cuantificación Una vez que las imágenes son desconvolucionadas y su fluorescencia restaurada, las mismas son apiladas para representar una vista 3D. Con el software SUMDD, la representación tridimensional se realiza a través del método de proyección de máximas intensidades (PMI), que se halla entre las opciones de graficación. El siguiente paso es realizar la cuantificación en el volumen completo. La cuantificación puede realizarse sobre pilas de n secciones de 256x256 o de 512x512 píxeles. Para identificar los objetos estudiados se trabajó con un algoritmo que utiliza un método basado en modelos (11). El algoritmo implementa un modelo geométrico del proceso a estudiar, estableciendo parámetros de acuerdo a las características de la señal fluorescente y la geometría del objeto. Estos son: radio mínimo y máximo; valores de intensidad mínima y máxima integrada en todo el volumen seleccionado y rango dinámico de la señal. El umbral inferior de este rango se considera de forma tal que el background de fondo (conocido por inspección de todos los planos) no sea cuantificado como señal y el umbral superior es el valor máximo que puede capturar la cámara CCD sin llegar a saturación. El algoritmo fue implementado en Matlab 6.5 (MathWorks, Inc.), que permite cargar las secciones completas de todo el volumen a estudiar. En forma resumida, en el volumen se analiza la existencia de un punto (voxel) dentro del rango de umbrales definidos como señal. Si dicho elemento existe, el algoritmo analiza la intensidad integrada en una esfera considerada según los radios mínimo y máximo. Si se cumple, dicho elemento es reconocido como tal, contabilizado y almacenado con sus tres coordenadas (x,y,z). Evaluación Desarrollado el control electro-mecánico (responsable de la realización del seccionamiento óptico), el software SUMDD (controla todo el sistema) y puesta a punto la determinación empírica de la PSF; el siguiente paso fue evaluar el funcionamiento de la técnica. Registro y geometría de la PSF Para obtener una buena imagen 3D con estos sistemas convencionales, a priori no diseñados para esta finalidad, se debe lograr un arreglo en el que el camino óptico no sea alterado significativamente. Para ello es necesario que los especímenes sean observados en sistemas donde el índice de refracción del medio de montaje, del


cubreobjetos y del medio de inmersión sea idéntico para todas las longitudes de ondas de interés. En la práctica, durante la observación de un espécimen biológico no siempre es posible lograr las condiciones antes mencionadas. El análisis tridimensional de especímenes gruesos, desafortunadamente, dificulta aún más el problema. Por lo tanto, las condiciones óptimas deberán ser determinadas para cada tipo de espécimen. Recientemente, hemos demostrado (3) que una forma práctica y sencilla de obtener dichas condiciones consiste en variar los parámetros hasta obtener la PSF con mayor nivel de simetría en los tres ejes.

En este trabajo, se corroboró que la PSF se comporta como un conjunto de anillos concéntricos en el plano XY (Fig. 3A) y en los planos XZ o YZ exhibe un perfil de “reloj de arena” (Fig. 3B). Estos resultados concuerdan con los hallados en otros tipos de sistemas ópticos (27). Dicha determinación fue realizada, respetando las características ideales para las que fueron diseñadas las lentes objetivas. Se utilizó un cubreobjetos de vidrio (índice de refracción 1,51 y espesor 170 µm), así como un medio de montaje específicamente desarrollado para tal fin (Vectashield). En el caso de la lente de inmersión (100X), para la determinación de la PSF se utilizó el aceite de inmersión provisto por la empresa fabricante de las lentes, cuyo índice de refracción es de 1,518. Los resultados obtenidos para esta lente (no mostrados aquí), fueron similares a los representados en la figura 3.

Podemos concluir que las PSFs empíricas del sistema BX50 (lente de 40X y lente de 100X) no presentan simetría perfecta (Fig. 3). Como regla general, cuanto mejor es la calidad de la lente y la alineación, la PSF empírica tiende a acercarse a su forma simétrica ideal. Puesto que el microscopio usado posee lentes plano-apocromáticas que están corregidas para aberraciones cromáticas, esféricas y de curvatura; y sumado al hecho de que la alineación es una práctica rutinaria que no produce mayores problemas; se deduce que el problema de la asimetría debe atribuirse a los problemas introducidos por el arreglo óptico que se forma al considerar un espécimen de gran espesor (arreglo tridimensional). Esto se verificó evaluando la PSF cambiando diferentes parámetros del arreglo óptico tridimensional. En la Figura 4A se presenta la PSF determinada variando los espesores de los cubreobjetos, en tanto que la Figura 4B representa las mismas imágenes de la 4A pero con el valor de la resolución para cada condición y en la Figura 4C la PSF determinada variando el collar de corrección de la lente de 40X. Los resultados obtenidos al variar otros parámetros se pueden analizar en (3).

Cubreobjetos N° 0 Cubreobjetos N° 1 Cubreobjetos N° 1.5 Cubreobjetos N° 2

Fig. 4A: Vista XZ de la proyección 3D de las PSF calculadas con la lente de 40X/AN 0,85 utilizando diferentes espesores en los cubreobjetos. En cada caso se pueden observar las distintas figuras bi-cónicas con sus respectivas asimetrías respecto al plano focal.


Fig. 4B: Variación de la resolución lateral (negro) y axial (rojo) en función del espesor del cubreobjeto para la lente objetiva de 40X/0,85. La resolución fue computada midiendo el FWHM para los siguientes cubreobjetos: N°0: ≈ 100 µm, N°1: ≈ 145 µm, N°1.5: ≈ 175 µm, N° 2: ≈ 220 µm y N°3: ≈ 300 µm. Los valores son representados como su valor medio ± el desvío estándar (M ± DE), n=10.

Collar en 0,11 Collar en 0,14 Collar en 0,17 Collar en 0,20 Collar en 0,23

Fig. 4C: Vista XZ de la proyección 3D de las PSF calculadas con la lente de 40X/AN 0,85, colocando el collar de corrección en los diferentes valores admitidos. En cada caso se pueden observar las distintas figuras cónicas con sus respectivas asimetrías respecto al plano focal.

En todos los casos evaluados, se verificó que la geometría más simétrica de las PSF se obtiene cuando las lentes se utilizan según los parámetros para los cuales han sido diseñadas.

Restauración utilizando Desconvolución En el proceso de seccionamiento, y debido a los problemas de difracción, la pila de imágenes de las secciones registradas de una esfera luego de pasar por un sistema de lentes se visualizará con una cierta elongación a lo largo del eje Z. Con el proceso de desconvolución, se procura reducir esta elongación y restaurar las dimensiones y forma de las esferas a sus valores originales. Para cuantificar la elongación en el eje Z (eje óptico del microscopio) cuando se realiza la reconstrucción 3D y la reducción de la misma luego del proceso de desconvolución; se trabajó con un espécimen patrón de forma y tamaño conocidos (Figura 5). Se eligió una esfera fluorescente como las mencionadas anteriormente, pero de 4µm de diámetro. Esta ya no es una fuente puntual sino nuestro espécimen control. La elongación fue cuantificada utilizando el

LENTE 40X: AN0.85

Espesor de Cubre Objetos (µm)

50 100 150 200 250 300 350

Res

olu

cion (µm

)

-2

0

2

4

6

8Res. XY

Res. XZ


FWHM (23). En todos los casos se aplicó el mismo algoritmo de desconvolución. Se presentan dos gráficos por cada experiencia. En el primero se mide la elongación a lo largo del eje Z; la primera columna presenta el valor de la elongación que experimenta la esfera cuando es observada en el modo convencional (sin desconvolucionar). Este valor fue utilizado para las comparaciones estadísticas. En el segundo grafico se presenta el porcentaje de reducción de la elongación para cada arreglo óptico. Es decir se cuantifica el grado de restauración logrado.

En las Figuras 6 y 7 se observa la cuantificación obtenida para la lente de 100X, trabajando con PSF determinadas para diferentes espesores de cubre objetos (Fig. 6) y trabajando con PSF determinadas utilizando diferentes medios de inmersión (Fig. 7). Se observó una reducción de la elongación extremadamente significativa para todos los cubreobjetos. Si bien entre ellos no hay diferencias significativas en la reducción que producen, las mayores reducciones (30% y 32%) se produjeron usando los cubreobjetos N°1.5 y N°2 (Fig. 6). La disminución de la elongación luego del proceso de desconvolución fue extremadamente significativa para los diferentes medios de inmersión. Si bien entre los diferentes medios no se registraron diferencias significativas, la mejor reducción (32%) se logró utilizando aceite de inmersión, con índice de refracción 1,51 (Fig. 7).

De los resultados, se desprende que el algoritmo iterativo esta trabajando correctamente. La fluorescencia fuera de foco que alargaba la imagen (mas de 3 µm respecto al tamaño original), fue reestablecida a sus posiciones originales logrando una mejora en el diámetro de la esfera (inferior a 1µm respecto al tamaño original).

Fig. 5: Máxima proyección de intensidades de 20 secciones ópticas de 64 x 64, separadas 0,5 µm entre sí. A) Reconstrucción 3D de una esfera de 4 µm capturada en modo convencional por un microscopio de epifluorescencia. B) Reconstrucción 3D de la misma esfera que en A, pero luego de aplicada la desconvolución. Las flechas amarillas marcan la elongación en el eje Z. En B se puede observar visualmente una reducción de la elongación luego del proceso de restauración.


Cubreobjetos / Diferentes espesores

0 1 2 3 4 5 6 7

Elo

ngac

ión e

n Z

(m

m)

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

Fig. 6: Cuantificación 3D de la elongación en Z. Barra 3: PSF calculada con el cubreobjetos N°0: (80 – 120 µm de espesor). Barra 4: PSF calculada con el cubreobjetos N°1: (130 – 160 µm de espesor). Barra 5: PSF calculada con el cubreobjetos N°1.5: (160 – 190 µm de espesor). Barra 6: PSF calculada con el cubreobjetos N°2: (190 – 220 µm de espesor). La línea azul indica el diámetro real de la esfera visualizada. Los valores son representados como su valor medio ± el desvío estándar (M ± DE), n = 4. Los datos fueron evaluados con un análisis ANOVA utilizando el test a posteriori de Tukey-Kramer: ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,01; ∗∗∗ p<0,001.

Indice de Refraccion

0 1 2 3 4 5 6 7

Elo

ngac

ion e

n Z (m

m)

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

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6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

Fig. 7: Cuantificación 3D de la elongación en Z. Barra 3: PSF calculada utilizando como medio de inmersión aire η=1. Barra 4: PSF calculada utilizando como medio de inmersión agua η=1,33. Barra 5: PSF calculada utilizando como medio de inmersión glicerina η=1,47. Barra 6: PSF calculada utilizando como medio de inmersión aceite η=1,51. La línea azul indica el diámetro real de la esfera visualizada. Los valores son representados como su valor medio ± el desvío estándar (M ± DE), n=4. Los datos fueron evaluados con un análisis ANOVA utilizando el test a posteriori de Tukey-Kramer: ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,01; ∗∗∗ p<0,001. Aplicación sobre un modelo biológico Como ejemplo de validación experimental del sistema se trabajó, entre otros modelos, con la piel de embriones de Rhinella (=Bufo) arenarum de diferentes estadios para analizar el patrón de expresión de las moléculas de adhesión celular sobre la

∗∗∗ ∗∗∗

∗∗∗

∗∗∗

MDD

∗∗∗ ∗∗∗

∗∗∗

MDD

∗∗∗


membrana plasmática de las células. Particularmente se analizó la proteína Cadherina-E, la que permite identificar las uniones célula-célula en el epitelio. Expresión 3D de Cadherina-E En relación a este estudio, análisis previos realizados por nuestro grupo (30), han permitido identificar un patrón de distribución lineal y uniforme de dichas moléculas sobre el perímetro de las células. El interés e importancia de estos estudios, es que muchas funciones de las células dependen de la regulación espacial y temporal de las moléculas de adhesión celular (18, 21, 22, 30). Al presente, todos los estudios han sido realizados sobre imágenes bidimensionales y dado que para dilucidar su rol en este sistema particular es necesario conocer la regulación de su localización espacial, la aplicación de la técnica aquí presentada nos permitió realizar por primera vez un abordaje tridimensional al problema. Se presentan a continuación (Figuras 8, 9, 10 y 11) algunas representaciones 3D de diversos estadios analizados y dos diferentes estudios cuantitativos en 3D (Figura 12 y 13).

Fig. 8: Máxima proyección de intensidades de secciones ópticas reconstruidas en 3D de la piel de Bufo Arenarum, embrión de estadio 19. Volumen crudo y volumen luego del proceso de desconvolución.





Fig. 12: Histograma de la intensidad media de fluorescencia que compara la expresión tridimensional de cadherina E en la piel dorsal de las regiones cefálica y troncal, a lo largo del desarrollo de Bufo arenarum.


Fig. 13: Histogramas que representan la forma de las células epidérmicas apicales a lo largo del desarrollo de Bufo arenarum. ANOVA con test de Dunn de comparación múltiple a posteriori. Conclusiones La MDD permitió cuantificar tridimensionalmente cadherina E a partir del St. 17 y hasta el St. 40, aportando valiosa información sobre los cambios en el patrón de expresión en las uniones intercelulares, a lo largo del desarrollo. Se verificó la transición desde un patrón “discontinuo o segmentado” a uno “continuo”, incremento en el espesor de la banda adhesiva, del tamaño de las puncta y de la densidad molecular. Estudios morfométricos futuros, aplicando MDD, permitirán obtener mayor información en relación a la densidad molecular en los puntos de contactos entre dos o más células.

El contar con las representaciones 3-D y 4-D de la molécula bajo estudio, así como con la posibilidad de rotar las imágenes, puso claramente en evidencia la desorganización de los complejos adhesivos cuando se utilizó un inhibidor de fosfatasas de tirosina (ortovanadato sódico). Los estudios morfométricos preliminares aquí presentados intentan dar cuenta de la relación existente entre la forma y la estabilización mecánica de las células. Hasta el momento, nuestro modelo de alteración de la expresión de cadherina E no parece aportar evidencias directas entre el nivel de expresión de cadherina E y el fenotipo epitelial epidérmico.

La técnica aquí descripta e implementada por nuestro grupo sobre un microscopio de epifluorescencia demuestra ser una alternativa excelente y económica para realizar estudios tridimensionales. Las adaptaciones mecánicas propuestas (con menores modificaciones) podrían ser implementadas en cualquier otro tipo de microscopio; lo que justifica el desarrollo presentado.

Comparada con la microscopia confocal, podemos mencionar como ventaja que la herramienta aquí implementada tiene una mejor eficiencia en la detección dado que utiliza una cámara CCD como sensor en lugar de un tubo fotomultiplicador como poseen la mayoría de los microscopios confocales. Por otro lado, si bien la atenuación de las altas frecuencias es similar en las imágenes capturadas utilizando ambas técnicas, con el proceso de desconvolución la atenuación puede ser corregida y por lo


tanto puede lograrse una resolución efectiva mayor, comparada con las imágenes confocales sin procesar. Como desventaja, podemos mencionar que los resultados obtenidos con la Microscopia de Desconvolución Digital son fuertemente dependientes de la correcta determinación de la función PSF y de los algoritmos de desconvolución utilizados, por lo que se requiere una inversión de tiempo y personal entrenado específicamente en estas áreas.

La implementación de esta tecnología nos ha permitido abordar estudios tridimensionales antes impensados, lo que ha llevado a que nuestro equipo revea y discuta nuevas metodologías de representación y cuantificación. Las modalidades de representación 3D utilizando rendering de superficies, animaciones y máximas proyecciones permiten obtener visiones de estructuras en referencia a su posición espacial. El proceso de cuantificación presenta nuevos desafíos, por lo que actualmente se están realizando diferentes modelizaciones que representen mejor la distribución de las moléculas de adhesión celular en la piel y sean congruentes con su función biológica. Referencias bibliográficas

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