PICADO ACÉTICO

Estación de Viticultura e Enoloxía de Galicia

• Microorganismos en la industria enológica y su relación con la calidad del vino

Pilar Blanco Camba

Las levaduras y el vino

CARACTERÍSTICAS GENERALES

•Hongos microscópicos unicelulares

•Células eucariotas

•Morfología variada: esféricas, elípticas , ovaladas, alargadas, apiculadas

•Reproducción vegetativa o asexual por gemación (algunas por bipartición)

•Reproducción sexual. Formación de esporas

•Responsables de la fermentación alcohólica (transformación de azúcar en alcohol +CO2)

•Alteraciones (flor, refermentaciones)

Organización de una célula procariota (A) y eucariota (B)

A B

Principales levaduras vínicas

Nombre: Saccharomyces cerevisiaeCaracterísticas:

•Morfología elípticas u ovoides

•Alta capacidad fermentativa

•Formadora de esporas (ascosporas con 4 esporas)

•No asimila nitratos ni escinde arbutina

•Crecimiento en presencia de etanol

•Fermenta y asimila glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa y rafinosa.

•No fermenta ni asimila lactosa


Nombre: Kloeckera apiculata

Hanseniaspora guillermondii•Morfología: apiculadas (forma de limón)

•Aparece al inicio de la fermentación

•Fermenta la glucosa

•Bajo poder fermentativo (4%)

•Fuerte producción de ácidos volátiles

•No esporula (Hanseniaspora si esporula)

•No asimila nitratos

•No escinde la arbutina


Nombre: Metschnikowia pulcherrima•Morfología: células ovoides aisladas o en parejas. A veces células grandes con un grueso gránulo central de grasa.

•Fermenta la glucosa

•Bajo poder fermentativo (1%)

•No asimila nitratos

•Escinde la arbutina

•Crece bien en presencia de alcohol

•No esporula

•En placa colonias blancas, brillantes con ligera coloración rojiza


Nombre: Schizosaccharomyces pombe•Morfología : Células alargada o cilíndricas aisladas o en parejas (3-5 X 6-16) µm

•División por fisión

•Esporulada

•No asimila nitratos ni escinde la arbutina

•Buena capacidad fermentativa

•Capacidad para degradar ácido málico a etanol y CO2 (fermentación maloalcohólica)

Otras levaduras vínicas

Debaryomyces hansenii

Brettanomyces

Torulaspora

Cryptococcus

Debaryomyces hansenii

Rhodotorula

Levaduras formadoras de velo

•Saccharomyces (flor)

•Candida

•Pichia

•Hansénula

•Zygosaccharomyces

Requerimientos nutricionales de las levaduras

•Fuente de carbono: azúcares•Fuente de nitrógeno•Sustancias minerales

•Factores de crecimiento (vitaminas)

El mosto reúne los requisitos adecuados para el desarrollo de las levaduras (Excepciones: maduración inadecuada, el ataque por botritis-falta de nitrógeno, etc). pH ácido-impide el desarrollo de muchas bacterias

Origen de las levaduras de vinificación

Uva (flora epifítica)

Material de bodega

Inóculo (LSA)

Sucesión de la población de levaduras a lo largo de la fermentación

Fase inicial

Predominio de levaduras apiculadas y de otras morfologías con baja producción de alcohol y elevada producción de ácidos volátiles (acético) Ex: Kloeckera apiculata, Metschnikowia pulcherrima, Candida sp,etc.

Fase tumultuosa

Saccharomyces invade el medio, acaba dominando la fermentación y desaparecen las levaduras de la fase inicial

Fase final

Predominio de especies del género Saccharomyces. Produce más alcohol y menos productos secundarios

Albariño

900

950

1000

1050

1100

1150

1 3 5 7 9 11 13 15

Tiempo (días)

Dens

idad

Evolución de la población de levaduras viables durante la fermentación

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00

0 5 10 15

Tiempo (días)Lo

g NL

VFase inicial : 104-105

Fase tumultuosa: 107-108

Fase final: 105

La fermentación alcohólica

Glucosa Acido pirúvicoGlucolisis

Acetaldehido

Etanol

Piruvato descarboxilasa

Alcohol deshidrogenasa

CO2

NADH2

NAD+

Fermentación alcohólica: Influencia del temperatura y O2

Rango de Temperatura para fermentación en blancos: 14-20ºCRango para fermentación en tintos: 25-30ºC

Temperatura crítica >35ºC

TREIXADURA

9801000102010401060108011001120

0 10 20

Tiempo (Días)

Dens

idad

nTT16

nTT19

nTT22

O2: Las levaduras requieren O2 para su multiplicación ya que interviene en la síntesis de AG y esteroles, constituyentes de la membrana celular y responsables de su permeabilidad (práctica de remontado)

Productos secundarios originados durante la fermentación alcohólica

•Glicerina – suavidad y aterciopelado

•Succínico- es el ácido que más impresiona el gusto (sabor a bebida fermentada, entre salado y amargo)

•Ácidos orgánicos (málico, cítrico, láctico, ácidos volátiles

• Acético y su éster, acetato de etilo- producido por las levaduras de la 1ª fase y levaduras oxidativas. Efecto negativo sobre el vino

•Metabolitos del ciclo diacetilo-acetoínico (a concentraciones elevadas son negativos)

glucosa Glicerina + pirúvico

Fermentación gliceropirúvica

BACTERIAS LÁCTICAS•Gram +, catalasa -, no esporuladas, no móviles

•División por bipartición

•Microaerófilas o anaerobias facultativas y fermentadoras de azúcares

•Morfología: cocos y bacilos

•Según el metabolismo de la glucosa pueden ser:

-Homofermentativas- ác. láctico

-Heterofermentativas-ác. láctico, acético, CO2 , etanol, acetaldehido, acetoína, diacetilo,etc

•Responsables de la fermentación maloláctica

•Bajo ciertas condiciones pueden causar alteraciones

•Metabolismo de aminoacidos-origina sustancias peligrosas para la salud

Oenococcus oeni

BACTERIAS LÁCTICAS

aldolasa

Metabolismo homofermentativo de la glucosa (vía glucolítica de Embden-Meyerhof)

BACTERIAS LÁCTICAS

Metabolismo heterofermentativo de la glucosa (ruta de Warburg-Dickens)

Clasificación de las bacterias lácticas

L. oeni (O.oeni)L. mesenteroides(ssp. mesenteroides)

HeterofermentativosLeuconostoc

No descritas en vino

L. caseiL. plantarum

L. brevisL. hilgardii

I. Homofermentativos estrictos(No fermentan pentosasGlucosa- 2 ác. Láctico)II. Heterofermentativ. facultativos(Fermenta las pentosas y la glucosa)II. Heterofermentativ. obligatorios(No poseen el enzima aldolasa, fermentan la glucosa mediante la vía de las pentosa fosfato)

LactobacillusBacilos

P. damnosusP. pentosaceous

HomofermentativosPediococcusCocos

EspeciesMetabolismo de la glucosaGéneroForma

Características de los principales géneros de bacterias lácticas

Algunas spcontienen ácidos teicoicos

Sin ácido teicoico

Sin ácido teicoico

Pared celular36-47%34-42%38-44%(G+C)%

NoNo Algunas cepasHidrólisis de la arginina

láctico, etanol, acético, CO2

DL ó L lácticoNo carbónico

CO2, láctico, etanol

Metabolismo de la glucosa

0,5-1,2 X 1,0-10 µm

1-2 µm ø0,5-0,7 µm øTamaño

Alargadas en pares e en cadenas

EsféricasDivisión en dos planos-tétradas

Esféricas o un poco alargadasEn pares o en cadenas

Morfología de las células

LactobacillusPediococcusLeuconostocCaracterística

BACTERIAS LÁCTICAS: ecología

Origen•Uva •Material de bodega•Inóculo (Cultivos iniciadores de Oenococcus oeni. Se trata de cultivos puros o mezclas de 2-3 cepas)Evolución durante la fermentación•En uva- población muy baja •Mosto- 102-104 UCF/ml. Disminuyen por proliferación de las levaduras durante la fermentación alcohólica•Fase final – Empieza a aumentar la población de bacterias lácticas (lisis de las levaduras), desaparecen los bacilos homofermentativos, luego los heterofermentativos y acaba predominando O. oeni, mejor adaptado a las condiciones de bajo pH y elevada concentración de etanol•La fermentación maloláctica se inicia cuando las UFC/ml= 106

FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA

Málico Láctico + CO2

Enzima maloláctica(Bacterias lácticas)

Repercusiones en el vino•Desadificación biológica del vino

•Disminuye la acidez total y el málico (sabor astringente)

•Aumenta el ácido láctico (suavidad)

•Protege al vino de las enfermedades por bacterias lácticas

•Otras: Producción de diacetilo (aroma a “mantequilla”)

•A bajas concentraciones –bouquet

•A elevadas concentraciones - rancio

Posibles rutas del ácido málico

BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón malolácticaFactores que influyen en la fermentación maloláctica

•Características de la variedad (relación tartárico/málico), residuosfitosanitarios

•pH del medio (Actúan mejor a pH> 3.5; Tª óptima 4.2-4.5). El pH condiciona el crecimiento bacteriano y los sustratos que van a metabolizar(*enfermedades del vino). A mayor pH mayor facilidad para que sedesarrolle la FML pero también mayor peligro de que aparezcan enfermedades.•temperatura (19-25º)•Aireación (la presencia de una pequeña proporción de O2 es favorable)•Etanol (< 13%)•SO2 (no superior a 50 mg/L)

•Prácticas de vinificación (El tiempo de contacto del vino con los hollejos, contacto con las lías, trasiegos, etc. determinan la población de bacterias lácticas al final de la fermentación alcohólica) •Interacción de las bacterias con otros microorganismos

BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica

Aplicación de la fermentación maloláctica•En tintos Mejora gustativa

Color menos rojo vivoAroma evolucionado (menos a uva y más a vinosidad)

•En blancos Puede ser deseable:•Repercute en el equilibrio grado/acidez•Disminuye la sensación de dureza y verdor•Peligroso en vino dulce

BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica

Ventajas e inconvenientes de la fermentación maloláctica

Formación de aminas biógenas y carbamato de etilo

Mayor complejidad y atributos de envejecimiento

Aparición de olores y sabores anómalos

Reducción de amargor y astringencia

Incremento de acidez volátilIncremento aromático

Reducción de aromas varietalesGarantía de estabilidad

Reducción del colorReducción de la acidez y suavización organoléptica

InconvenientesVentajas

Metabolismo del cítrico

Bacterias acéticas•Gram negativas, Catalasa positivas, no esporuladas

•Morfología variable (células elípticas o con forma de bastón corto agrupadas en pares o en cadenas)

•Tamaño: 0.6-0.8 x 1-4 µm

•Inmóviles o móviles por flagelos:

polares (G. Gluconobacter)

peritricos (G. Acetobacter)•Aerobias estrictas*(sobrevive en barrica)•Oxidan el alcohol a ácido acético e incluso a CO2 y H2O•Producción de polisacáridos extracelulares (celulosa-afecta la filtrabilidad del vino) y pigmentos•Tolerancia a la acidez, al etanol y moderada al SO2

• Formación de velo

•En el vino pueden dar lugar al picado acético y su desarrollo esindeseable en todas las etapas de vinificación

.

Bacterias acéticasECOLOGÍA DE LAS BACTERIAS ACÉTICAS

•Muy extendidas en la naturaleza, especialmente en bebidas fermentadas alcohólicas como el vino, la cerveza o la sidra

•En uva la población de bacterias acéticas depende del estado sanitario de la vendimia.

En uva sana: 102-103 UFC/mL (G. oxydans)

En uva atacada por Botrytis: 105-106 (mezcla de Guconobacter y Acetobacter)

•Durante la fermentación alcohólica la adición de sulfuroso y el desarrollo de las levaduras no afecta la población de bacterias acéticas. Existe una sucesión de bacterias acéticas: G. oxydans predomina al inicio y va siendo reemplazado por A. pasteurianus y A. aceti.

•Durante la fermentación maloláctica se mantiene la población

•Durante la conservación la población de bacterias acéticas puede aumentar y causar enfermedades.

Clasificación de las bacterias acéticas

A. acetiA. pasteurianusA. liquefaciens

A. hansenii

G. oxydansEspecies

53-6556-64(G+C)%

+-Oxidación de acético hasta CO2

++Oxidación de etanol a acético

++Crecimiento a pH 4.5

peritricapolarFlagelación

AcetobacterGluconobacterCaracterística

Metabolismo de las bacterias acéticas

•Oxidación del etanol a ácido acético (Gluconobacter y Acetobacter)

etanol acetaldehido Ácido acético

Alcohol deshidrogenasa

Aldehidodeshidrogenasa

•Oxidación del ácido acético a CO2 (Acetobacter)

CO2+H2OÁcido acético

TCA

*Gluconobacter carece de algunos enzimas del TCA, la α-cetoglutaratodeshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa

Metabolismo de las bacterias acéticas

•Metabolismo de los azúcares

Oxidación de los azúcares vía hexosas monofosfato

Oxidación de azúcares a cetonas

Glucosa – ácido 2-5 dicetoglucónico

Fructosa-cetofructosa

Xylosa-cetoxylosa

•Metabolismo del ácido láctico

Oxidación a pirúvico, acetaldehido y acético

•Metabolismo del glicerol

Oxidación a dihidroxiacetona

ALTERACIONES DEL VINO DE ORIGEN MICROBIANO

•Introducción

•Alteraciones microbianas

Bacterias lácticas

Picado láctico

Amargor

Vuelta

Grasa o ahilado

Bacterias del ácido acético: Picado acético

Levaduras

Flor

Refermentaciones

Brettanomyces

•Sustancias tóxicas de origen microbiano

INTRODUCCIÓN•Las alteraciones microbianas del vino pueden aparecer durante laelaboración y/o durante la conservación del vino

• Se producen por el ataque de componentes del vino y/o formaciónde sustancias indeseables

•Evidencias: Turbidez, Gas, Transformación del color

•Factores a favor:

Composición del vino (ácidos orgánicos, azúcares, factores de crecimiento y sales minerales)

•Factores en contra:

Grado alcohólico elevado

pH bajo

Baja temperatura

Las bacterias lácticasProducen alteraciones graves porque atacan la totalidad de la masa del vino aunque haya sido bien elaborado

Microaerófilos o anaerobios facultativos

Importancia de la higiene en la bodega

Alteraciones producidas

Picado láctico- fermentación de azúcares residuales

Amargor- fermentación del glicerol

Vuelta – fermentación del tartárico

Grasa o ahilado –formación de polisacáridos en el vino

Bacterias lácticas: PICADO LÁCTICO

PICADO LÁCTICO

•Fermentación de azúcares residuales con formación de acético y láctico

•Puede aparecer en vinos con azúcares residuales por cese de la fermentación alcohólica (Ex. Por altas temperaturas)

•Efecto en el vino: sabor agridulce (por el acético y el azúcar) y aumento de la acidez volátil

•También tiene lugar la fermentación manítica – formación de manitol a partir de fructosa (Vuelta manítica)

• Prevenir las paradas fermentativas y envasado apropiado, sulfitadoracional control de la temperatura

Bacterias lácticas: AMARGOR

AMARGOR

•Fermentación del glicerol formando lactico, acético, ácidos grasos y acroleína (reacciona con compuestos fenólicos como los taninos dando sabores amargos)

•Efecto en el vino: sabor amargo

•Muy rara, aparece e casos de mala cosecha

•Afecta a vinos con poco grado y pH bajo (3.2-3.3); La fermentación de tartárico (vuelta) afecta a vinos de pH alto (3.5-3.3)

Bacterias lácticas: VUELTA

VUELTA• Origen: Fermentación del ácido tartárico para dar láctico, acético y CO2

•Efecto en el vino:No apto para el consumoDisminuye la acidez fija y aumenta la acidez volátil y el pHPierde sabor (insípido, flojo)Color apagadoTurbidez Formación de gas, vino con “aguja”“olor a ratón” (vuelta + otras causas-formación de 2-acetiltetrahidroxipìridina )

•Ataca a vinos poco ácidos, los mejores vinos son los más propensos

•No suele darse.

Bacterias lácticas: GRASA

GRASA O AHILADO

•Causa: formación de polisacáridos en el vino que le dan aspecto oleoso.

•Efectos en el vino: aspecto de aceite, vino pesado que se desliza sin ruido. La acidez volátil no siempre es elevada.

•Peligro: puede ir seguido de otras alteraciones

•Prevención: empleo racional de sulfuroso que no impida la Fermentación Maloláctica pero sí la formación de grasa

•Corrección: con sulfuroso y agitado

Bacterias lácticas: Otras alteraciones

Metabolismo de la argininaFormación de carbamato de etilo

Metabolismo de los aminoácidos del mostoFormación de aminas biógenas

Formación de 2-etoxi-3,5-hexadieno a partir del ácido sórbico

Olor a geranio

Formación de 2-acetil-tetrahidropiridinaOlor a ratón

Producción de diacetilo a partir del cítrico o del piruvato

Olor a mantequilla

CausaAlteración

Bacterias acéticas: PICADO ACÉTICO

PICADO ACÉTICO O AVINAGRAMIENTO

•Oxidación del alcohol a ácido acético- Necesitan O2

•Causado por las bacterias acéticas o del vinagre que constituyen parte de la microflora de la uva y pernanecen durante todo el procesado. Desaparecen tras el embotellado por las condiciones de anaerobiosis

•Picado- inicio del proceso , solo afecta a las capas superficiales

•Avinagramiento- afecta a más volumen

•Efecto en el vino:

En cata- olor a acetaldehido

Enturbiamento y formación de velo

Aumento de la acidez volátil (Máxima permitida 0,65 g/L)

Producen acético (retrogusto, final de boca áspero y agrio) y acetato de etilo (indicativo de mala calidad)

Bacterias acéticas: PICADO ACÉTICO

•Enfermedad muy corriente, perjudicial y difícil de corregir

•Prevención: Relleno de los depósitos y cierre hermético

Evitar trasiegos en períodos cálidos (la elevada temperatura aumenta la probabilidad de picado acético)

Sulfitado a dosis adecuadas (25-30 mg/l)

Higiene de la bodega y los depósitos

•Aparece con mayor frecuencia en uvas atacadas con Botritis

LEVADURAS: Flor

FLOR•Enmohecimiento de la superficie del vino, velo

•Causado por levaduras que requieren O2

Candida mycoderma

Pichia membranifaciens

Hansenula anómala

Zygosaccharomyces

•Crecen en vino con alcohol < 13º y no tienen capacidad fermentativa

•Saccharomyces-”flor” útil para crianza biológica de los vinos

•Diferenciación: morfología al microscopio, aspecto del velo, capacidad fermentativa

LEVADURAS: Flor

Buena. En mosto dan turbidez y carbónico

Nula o muy baja. En mosto forman velo

Capacidad fermentativa

Velo grueso, color crema y rugoso

Velo delgado, blanco o grisaceo, liso o poco plegado

Aspecto del velo

Células elípticas-ovoidesEn parejas o flóculos

Células cilíndricas, alargadas. A veces forman cadenas ramificadas

Observación a microscopio (forma y agrupación)

Saccharomyces “Flor”Levaduras de veloCaracterística

LEVADURAS: Flor

•Efectos en el vino:

Disminuye la acidez fija y volátil

Disminuye el alcohol

en caso exagerado da lugar a un sabor soso u acuoso del vino y origina turbidez

• La aparición de “flor” no es grave

•Recomendaciones para su prevención:

Filtración amicróbica

Cerrar bien los depósitos

Sulfitado adecuado

LEVADURAS: Refermentaciones

Refermentaciones

• Provocan enturbiamiento y formación de gas

•No se forma velo

•Causadas por Saccharomyces, vía anaerobia

•Ocurren cuando hay azúcares residuales (<2 g/L)

•Control microbiológico: observación directa a microscopio

•En vinos con pocos azúcares residuales puede aparecer sedimentos

en el fondo de la botella. Metabolismo de otros componentes del

vino.

LEVADURAS: Brettanomyces

Brettanomyces (forma asexual)/Dekkera (esporógena)

•Frecuente en barrica y vinos de crianza (rara en uva y fermentación)

•Se desarrolla en vinos de elevado grado alcohólico con o sin azúcares

•Especie más frecuente: Brettanomyces bruxellensis

•Origina fenoles volátiles

p-cumárico 4-vinil-fenol 4-etil-fenol

p-ferúlico 4-vinil-guayacol 4-etil-guayacol

VPR

*VRP-vinil fenol reductasa

descarboxilasa

LEVADURAS: Brettanomyces

•Afecta las características organoléptica del vino

•Defectos causados por Brettanomyces:

Olores fenólicos (cuero, sudor de caballo) *Debido al metabolismo de bacterias y levaduras

4-etil-fenol: bajo contenido- complejidad

Alto contenido-defecto

Gusto a ratón (más raro)- derivados de la tetrahidropirina.

*También originados por bacterias lácticas Lactobacillus y Pediococcus

Producción de aminas biógenas

•Puede causar acidez volátil elevada

•Prevención: limpieza y desinfección de las barricas

Sustancias tóxicas de origen microbiano

Origen de sustancias tóxicas en el vino

•Contaminantes (fungicidas, pesticidas, etc)

•Aditivos (SO2)

•Metabolismo microbiano

Etanol

Metanol

Aminas biógenas (descarboxilación de aminoácidos)

Carbamato de etilo (Metabolismo de la arginina)

Ocratoxina A

•Peligrosas para la salud humana

Aminas biógenas

•Se originan por descarboxilación de los aminoácidos•Principales aminas biógenas en el vino:

Histidina-HistaminaOrnitina-Putrescina (diaminobutano)Tirosina-TiraminaEtilaminaFeniletilaminaCadaverina

•Origen de las aminas biógenas:Bacterias lácticas Levaduras

Aminas biógenas

Efectos sobre la salud:

•Dolor de cabeza

•Problemas respiratorios

•Problemas de corazón (Palpitaciones)

•Hipertensión, hipotensión

•Cuadros de alergia

La sensibilidad a estos compuestos depende de cada individuo y puede alterarse con el consumo de alcohol y/o drogas.

La histamina es la más tóxica.

Aminas biógenas: papel de las bacterias lácticas

•Histamina, tiramina y putrescina son las principales aminas biógenas presentes en el vino.

•Baja concentración después de la F. Alcohólica

•El contenido aumenta durante la FML

•El contenido de aminas en vino varía de unas zonas a otras

•Depende de la microflora (varía con la cepa bacteriana) y de la presencia de aminoácidos en el vino (composición del mosto, metabolismo levaduras, prácticas enológicas-contacto con las lías)

•La microflora es más compleja cuanto más alto es el pH

•Pedioccocus, Oenoccocus, Lactobacillus ,

•La descarboxilación de aminoácidos tiene lugar en condiciones de estrés, como vía alternativa para obtención de energía

Carbamato de etilo

• Se forma en el vino por reacción entre:Etanol+compuesto carbamílico

• El precursor en el vino es la urea que procede del metabolismo de la arginina, relacionado con la actividad arginasa de las cepas de levaduras que conducen la fermentación. Las bacterias lácticas también degradan la arginina

• También se forma urea a partir de la degradación de ácidos nucleicos o de componentes de la uva

PrevenciónLimitar el contenido de nitrógeno en los mostos (evitar abonos nitrogenados y terrenos muy fértiles)Limitar activadores de fermentación y controlar las levaduras utilizadasControl de la temperatura durante las fermentacionesEliminación de la urea con ureasa ácidaBaja acidez y alta temperatura inducen aumento de carbamato de etilo

Alteraciones causadas por mohos

•Los mohos atacan el grano de uva, especialmente durante la maduración

•Botrytis cinerea, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Cladosporium, otros

•Efectos causados en el mosto y/o vino:

Reducción de la cosecha

Afecta el contenido de nitrógeno

Presencia de enzimas como la lacasa (oxidasas)-quiebra oxidásica

Alteraciones organolépticas

Afecta la estabilidad fisico-química del vino

Olor y sabor a moho

Aspergillus niger

Penicillium citroviride

Ocratoxina A

•Micotoxina producida por sp de Aspergillus y Penicillium (A. ochraceous, P. verrucosum, A. carbonarum)

•Efectos sobre la salud: Persistencia en sangre- 35 días

Nefrotóxico

Cancerígeno (Grupo 2B-IARC “International Agency for Research on Cancer”

•Nivel tolerado establecido OMS: 100 ng/Kg peso y semana (1995); 5 ng/Kg dia (1998).

•Contenido máximo en vinos para el 2005 (2µg/L). (Propuesto en la 82 asamblea de la OIV)

•Detección : ELISA ó HPLC

•Incidencia:

Mayor en los países calidos, mediterráneos que en zonas frías

Mayor en vinos tintos que blancos

Ocratoxina A

Presencia de Ocratoxina A en mostos y vino

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS EN ENOLOGÍA

•Toma de muestras

•Tratamiento de las muestras

•Siembra en medios de cultivo adecuados

•Recuento de células viables

•Aislamiento de microorganismos en cultivo puro

•Identificación de los microorganismos aislados

Controles microbiológicos: Toma de muestras

•Viña (de uva, suelo, madera...)

•Bodega (suelo, paredes, material de bodega, agua...)

•Mosto (antes y después de sulfitar)

•Fermentación (diariamente o en las distintas fases)

•Vino (después de la estabilización, clarificación, filtrado, embotellado...)

NOTA: Utilizar un recipiente estéril y manipular todo lo más asépticamente posible

Tratamiento de las muestras

•Uva-Incubación en medio líquido apropiado durante 1h y siembra en placa para el recuento de células

•Mosto- Recuento al microscopio y cálculo de la dilución adecuada para siembra en placa y recuento de células

•Muestras de fermentación-Recuento, dilución apropiada y siembra

•Vino-filtración

Recuento del nº de células viables por mL

Medios de cultivo•Generales (YEPD, Agar mosto, WL)

•Selectivos- suplementados con compuestos que inhiben el crecimiento de los distintos grupos microbiano

Bacterias-antibióticos como el cloranfenicol

Bacterias lácticas- estreptomicina, penicilina, nisina

Levaduras-cicloheximida, pimaricina

Hongos- propionato sódico

•Microorganismos viables, no cultivables (Seguimiento mediante microscopía con epifluorescencia)

•Conservación de las cepas (a -80ºC)

Bacterias: (medio de cultivo+ 40% glicerol)

Levaduras: YEPD+15% glicerol

Aislamiento de levaduras

Toma de muestras• Uva• Mosto (sulfitado y sin sulfitar)• Fermentación

– Fase inicial– Fase tumultuosa– Fase lenta o final

Recuento y dilución adecuada de la muestraSiembra en un medio de cultivo (suplementado con un inhibidor de

crecimiento bacteriano y de hongos)– YEPD– Agar malta– Agar Mosto– WL nutrient agar

Aislamiento en cultivo puro y conservación– Aislamiento: YEPD // Conservación: YEPD+15% glicerol

Identificación de levaduras•Pruebas de identificación:

•Morfológicas (en placa, medio líquido y al microscopio)

•Esporulación

•Fisiológicas y Bioquímicas (dependen del estado fisiológico y del medio de cultivo)

Asimilación y fermentación de azúcares

Asimilación de compuestos nitrogenados

Producción de enzimas

Requerimiento de factores de crecimiento

Resistencia a cicloheximida,etc

Identificación de levaduras

Pruebas de biología molecular:•Análisis del cariotipo•Análisis de DNA mitocondrial•Secuenciación y análisis de restricción del rDNA•PCR

Métodos rápidos de detección y cuantificación:(Especialmente útiles para microorganismos de crecimiento lento o para células viables pero no cultivables)

•Bioluminiscencia: (actividad metabólica; Ex. luciferasa)•Epifluorescencia: (tinción con un colorante fluorescente, Ex. Naranja de acridina)•PCR a tiempo real: seguimiento de mRNA mediante RT-PCR•Hibridación in situ con sondas específicas marcadas con un fluorocromo

Análisis del cariotipo

•Mediante electroforesis de campo pulsante

•Detecta polimorfismo del DNA genómico

•Diferenciación entre especies y cepas, mediante diferencias de número y tamaño de los cromosomas (S. cerevisiae- 16 cromosomas de tamaño entre 250 y 2500 Kpb)

•Equipamiento específico, costoso y largo

•Requiere personal especializado y cepas aisladas

•Más discriminante que la técnica de PCR y DNA mitocondrial

Schuller et al. 2003

Análisis del DNA mitocondrial

•Análisis del polimorfismo del DNA mitocondrial (muy polimorfo y estable)

•Requiere poca infraestructura de laboratorio

•Relativamente rápida y económica

•Diferenciación entre especies

•Diferenciación entre cepas de S. cerevisiae

•Requiere cepas aisladas y personalespecializado

EVEGA 2004

Análisis de restricción del rDNA

•Implica la comparación de secuencias de genes que codifican el rRNA y de los espaciadores entre ellos (ITS

Comparación de secuencias

Comparación de fragmentos de restricción (PCR-RFLP)

•Requiere previa amplificación mediante PCR

PCR

•Amplificación de secuencias específicas utilizando un termociclador

•Equipamiento costoso, personal especializado

•Técnica rápida que permite actuar en caso de necesidad

•Seguimiento de implantación de levaduras inoculadas en fermentación (Permite diferenciar LSA)

Schuller etal. 2003

•RAPDs- amplificación de regiones genomicas al azar utilizando primerscortos e inespecíficos (poco reproducible)

•ITS

•Amplificación de secuencias delta- flanquean el retrotransposón Ty

Aislamiento e identificación de Brettanomyces

•Filtración de la muestra

•Siembra en un medio específico (crecimiento lento, en medios

convencionales las otras levaduras crecen más rápido)

Medio DBDM

Crecimiento 25º C, 2 semanas

•Identificación : métodos convencionales

•Métodos moleculares: PCR, hibridación in situ con fluorescencia,

PCR a tiempo real

Aislamiento e identificación de bacterias acéticas

•Medios de cultivo

•Suplementados con inhibidor del crecimiento de levaduras y de bacterias lácticas

WL+ 2% etanol (ó 10% de vino estéril). Colonias color verde

GYC (Glucosa 5%, extracto de levadura 1%, , CaCO33%, agar %)

Mannitol medium (manitol 2,5%, extracto de levadura 1%, agar 1,5%)

MRS + 2% etanol

•Temperatura de incubación: 25-28º C (5-7 días)

•Condiciones aeróbicas

Aislamiento e identificación de bacterias acéticas

•Pruebas de identificación

Gram +, Catalasa –

Oxidación del etanol, glicerol y lactato

Formación de compuestos cetónicos

Crecimiento en acetato sódico o etanol como única fuente de carbono

Crecimiento en dulcitol

Producción de pigmentos marrones en GYC

Producción de celulosa (filtrabilidad del vino)

•Métodos moleculares (PCR y secuenciación de rRNA 16S)

Aislamiento e identificación de bacterias lácticasAISLAMIENTO• Medios de Cultivo

AGB (acidic grape broth, pH4,8) (O. oeni)MRS

• Incubación en estufa de anerobiosis• Temperatura y tiempo de incubación. 30º durante 48 h• Pruebas de Identificación

– Gram +– Morfología (coco o bacilo)– Homofermentativa o heterofermentativa– Fermentación de azúcares– Crecimiento en determinadas condiciones de pH, Tª

• Técnicas moleculares–PCR específica (primers del gen-enzima maloláctica) (O. oeni)

Aislamiento e identificación de bacterias lácticas

Características identificativas de Oenoccocus oeni

Control microbiológico de vinos embotellados

Filtración de una cantidad de vino conocida utilizando un sistema adecuado

Colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuado

Crecimiento a temperatura adecuada

Recuento de microorganismos viables presentes en la muestras

Identificación de los microorganismos encontrados

Evaluación del riesgo

Como prevenir las enfermedades microbianas de los vinos

•Mantener unas condiciones higiénicas adecuadas en la bodega

•Procurar que la uva entre en buenas condiciones

•Evitar paradas fermentativas procurando obtener vinos con una concentración de azúcar < 2g/l

•Sulfitado adecuado (25-30 mg/L)

•Conservación adecuada: Mantener los depósitos llenos y cerrados y a baja temperatura

•Filtración amicróbica de los vinos antes del embotellado

Selección de levaduras y bacterias en enología

• Papel en la calidad del vino

• Bacterias

Criterios de selección

Uso de bacterias seleccionadas

• Levaduras

Criterios de selección

Levaduras seleccionadas

Levaduras autóctonas: ventajas e inconvenientes

Selección de bacteriasCaracterísticas deseables para cultivos iniciadores de bacterias lácticas

•Elevada degradación de ácido L-málico

•Resistencia a grado alcohólico elevado (en torno al 15%)

•Resistencia a SO2 (a concentración 50 mg/L)

•Capacidad de crecimiento a bajo pH (Resistencia a la acidez)

•Capacidad de crecimiento a bajas temperaturas

•Baja producción de acidez volátil

•Buenas propiedades organolépticas (ausencia de caracteres sensoriales -)

•Metabolismo limitado de azúcares

•Resistencia al ataque de bacteriofagos

•No producción de polisacáridos extracelulares

•No producción de compuestos tóxicos (Ej: aminas biógenas)

•Fácil obtención de biomasa y resistencia a los procesos de congelación y liofilización

Selección de bacterias

Obtención de cultivos iniciadores de bacterias

Obtención de biomasa, centrifugado y liofilización

Utilización de bacterias comerciales

Siembra directa o con rehidratación y/o reactivación previa

Control de calidad de las cepas comerciales

•Caracterización de la especie

•Viabilidad (UFC/g)

•Determinación de la actividad maloláctica

•Verificación de la ausencia de contaminantes (coliformes, estreptococos, sulfitoreductores, leavduras y mohos)

•Verificación de caracteres fisiológicos sobre medios sintéticos y vinos

•Verificación de la ausencia de fagos

Selección de levaduras autóctonas

Criterios generales:•Ser autóctona•Buena capacidad fermentativa (rápido arranque y acabado)•Alta producción de etanol y regularidad fermentativa• Alta tolerancia al etanol•Producción baja de acidez volátil•No formación de espuma•Resistencia a sulfuroso •Baja producción de sulfhídrico•Otras: fenotipo killer


Levaduras seleccionadas para elaboración de blancos•Tolerancia a bajas temperaturas•Potenciación de aromas varietales y expresión de aromas secundarios•Capacidad de acidificación y desacidificación biológica•Crecimiento disperso en medio líquido

Levaduras seleccionadas para tintos•Alta producción de acetaldehido y pirúvico-estabilización del color•Baja capacidad de adsorción de antocianos a la PC•Producción de glicerol- suavidad•Degradación del ácido málico


Uso de levaduras comerciales (LSA)Ventajas

•Calidad más uniforme, garantiza repetitividad

•Ayuda a resolver problemas de posible arranque, ralentización o

paradas de fermentación

•Homogeneidad en los vinos

Inconvenientes

•Pérdida de complejidad en el vino final

•No son propias de la región

•Pueden no implantarse por competencia entre las levaduras

presentes en el mosto


Ventajas de las levaduras autóctonas

•Específicas del área

•Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona

•Totalmente adaptada al tipo de mosto

•Responsables de características únicas de los vinos (tipicidad)

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PICADO ACÉTICO