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Physiopathologie des syndromes
myélodysplasiques
M. Fontenay, DES, Octobre 2011
Une classification difficile
MDSAAMPN/MDS
CMML
RARS-TFormes frontièresHLA-DR2
Anomalies caryotype Tris 8, Chr 7, 13
Clone HPN
Bases moléculaires et cellulaires
• Anomalie intrinsèque ?
– Facteurs de transcription– Voies de signalisation– Réparation de l’ADN– Régulation du cycle cellulaire
• Altération de la réponse immune et/ou du microenvir onnement ?
→ Etudier l’hématopoïèse
Hématopoïèse MDS
Progéniteur multipotentProgéniteurlymphoïde
CFU-GEMM
Plaquettes EosinophilesNeutrophiles
Monocytes
BFU-E
Hématies
CFU-E
SCFEpo
GM-SCF
IL-3
Megakaryocyte
BasophilesB T
Sang
Moelle
Lymphocytes
Tpo
MEP
CFU-Mk CFU-GM
Dysplasie myéloïde & apoptose
CD34+38-Lin -
LT-HSC
ST-HSC
ProgéniteurLymphoïdeCFU-GEMM
Plaquettes Eosinophiles
Neutrophiles
Monocytes
BFU-E
Hématies
CFU-E
SCFEpo
GM-SCF
IL-3
Megakaryocyte
BasophilesB T
Sang
Moelle
Lymphocytes
Tpo
LTC-IC:Quantité et taillediminuéesNOD-SCID ou NOD-SCID ββββ2-/-
CD34+ CD38- (del5q, tris 8)±±±± IL3/GM-CSF
Nilsson et al, Blood, 2000, 2002Thanopoulou, Eaves et al, Blood 2004Pas de prise de greffe ou expansion préférentielle des granuleux
Progéniteurmultipotent
Cellule souche
LT-HSC
ST-HSC
5q-
5q-
5q-
5q-
5q-
• « Phénotype » MDS– Apoptose
– Dysplasie érythroïde (80%)
Apoptose des précurseurs différenciés
TUNEL
Raza, 1995 50
Hellström, 1997 51
Bouscary, 1997 54
n75 12
56 16
34 12
MDS Control
% cellules TUNEL (+)
BOM
Frottis
MDS Control
Les récepteurs à domaine de mort
Fas
TRAILR1
TRAILR2
TNFR1TRAMP
DR3
DR6
EDAR
Apoptose Fas-dépendante
Bcl-2
Bax/Bakn
Bid
Fas
FADDFADDProCaspProCasp--88
Caspase-8
Apoptose
Cytochrome c Caspase-3Apaf-1Caspase-9
Type II
Type I
+ Fas agonist Ab CH11
0
10
20
30
40
%an
nexi
nV
+/7
-AA
D-ce
lls *
*
VectorWT-Bcl-2
ER-Bcl-2
Gyan et al, 2008
Anémies sidéroblastiques
Tehranchi R et al, 2003
Accumulation de fer pardownregulation du transporteur ABCB7
Trisomie 8
Sloand E M et al. Blood 2002;100:4427-4432
→ Growth advantage and resistance to apoptosis
• >60% des « early MDS » : surexpression de Fas
• Variantes :
– Anémie sidéroblastique : apoptose précoce aggravée en fin de maturation par atteinte mitochondriale
– Trisomie 8 : progéniteurs sensibles à l’apoptose Fas-dépendante résistent par induction de protéines anti-apoptotiques (sélection clonale au cours de l’évolution d’une AA ?)
Take home messages (1)
- Cytologique- MoléculaireDysérythropoïèse
Control MDS
Glycophorin A
Band.3 like1Carbonic anhydrase
Acylphosphatase ery.
Downregulated:
d<5 d7 d10 d140
20
40
60
80
100 Controls
MDS
*
*
% G
PA
-pos
itive
cel
ls
Cultured erythroblasts derived from CD34+ cells
GATA-1
Casp-3
Casp-3
Nucleus
Cytoplasm
Differentiation
Hypothesis
Functional inactivation of GATA-1 in MDS ?
GATA-1
Casp-3
Casp-3
Nucleus
Cytoplasm
Defective differentiation
Casp-3
Casp-3
Casp-3Casp-3
Normal MDS
Hsp70
No nuclear colocalization of Hsp70 and GATA-1
MDS#8Control#2
Hsp70
GATA-1
Merge
MGG
DAPI
Nuclear targeted Hsp70 rescues GATA-1 expression, and erythroid differentiation
mut
Hsp
70
-S4
00
A
Hsp
70
-S4
00
A
Ve
cto
r
Hsp
70
-WT
Ve
cto
r
Hsp
70
-WT
0
20
40
60
80
**
Controls MDSd
iffe
ren
tia
ted
cell
s(%
)
Take home message (2) : la signalisation apoptotique contribue à la dysplasie érythroïde
Cytochrome c
Caspase-3
Apaf-1Caspase-9
GATA-1
FasFasL
Hsp70
X GPA
Délétions 5q
Van den Berghe et al, Nature. 1974; 251:437List A, al. N Engl J Med 2006; 355: 1456-65.Boultwood J, et al. Blood 2002; 99 :4638-41.Fairman J,. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1995;92:7406-10Zhao N, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1997;94:6948-53
Pellagatti et al. Proc Natl AcadSci USA 2007; 104:11406-11.
Ebert et al, Nature, 2008
IL9TGFB1MADH5TRPC7SPOCKHRNPA0TTIDWNTBD CDC23GFRA3CDC25CFAM53CEGR1ETF1HSPA9B CTNNA1MATR3UBE2D2
CSF1R PDGFRBTCOF1CD74RPS14NDST1
TNIP1SPARCATOX1GLRA1
5q5q
q11.2q11.2
q23q23
q13q13
q14q14q15q15q21q21q22q22
q12q12
q31q31
q32q32q33.1q33.1
q34q34q35q35
Liu XT et al, Nature Med, 2007
Joslin JM et al, Blood;110:719, 2007
AML/MDS del(5q)Haploinsuffisance ou
Inactivation bi-allélique (TSG)
5q- syndrome(q32-q33.1)
40 genes entre D5S413et GLRA1
Haploinsuffisance
3.7 Mb
1.5 Mb
ShRNA RPS14 reproduit la dysérythropoïèse
Ebert BL, et al, Nature 2008 ;451 :335-40.
Meg
/ery
ratio
ShRNA screening of the CDR 5q-
5q- Non 5q-
Surexpression de RPS14 restore la différenciationérythroïde des CD34+ 5q-
Biogénèse des ribosomes et érythropoïèse
• RPS14 composant de la sous-unité ribosomale 40S • 5q- : Inhibition de la biogénèse (augmentation du ratio 30S/18S)• Blackfan-Diamond : mutations hétérozygotes de RPS19 (25%)
• Liu JM, Ellis SR. Blood 2006; 107: 4583-88
p53 stabilization and cell cycle arrest
D’après G Thomas Nat Cell Biol, 2010
G0/G1G0/G1
Dutt et al, Blood 2011
Activation of the p53 pathway in 5q- MDS
• Upregulation of 10 genes of the p53 pathway in CD34+ FAS, CD82, WIG1, CASP3, SESN3, TNFRSF10B, MDM4, BAX, DDB2, BID
Pellagatti A, et al. Blood. 2010;115(13):2721-2723Boultwood J, et al. Br J Haematol. 2007;139(4):578-589.Pellagatti A, et al.. Br J Haematol. 2008;142(1):57-64.
Murine model of 5q- syndrome
• Deletion of Cd74-Nid67 regionsyntenic to human CDR chr5q including RPS14
• Erythroid and megakaryocyticphenotype
• Increased apoptosis and expression of p53
• Rescue by backcrossing in p53 -/- mice
Barlow JL, Drynan LF, Hewett DR, et al. A p53-dependent mechanism underlies macrocyticanemia in a mouse model of human 5q- syndrome. Nat Med. 2010;16(1):59-66.
1. Starczynowski DT, Kuchenbauer F, Argiropoulos B, et al. Identification of miR- 145 and miR-146a as mediators of the 5q- syndrome phenotype. Nat Med. 2010;16(1):49-58.
2. Kumar et al, Blood 2011, august 28.
49.0
5q13
.1
5q23
.1
5q31
.1
miR
-886
miR
-874
miR
-584
miR
-143
miR
-145
miR
-146
a
miR
-103
-1
miR
-218
- 2
miR
-585
miR
-340
miR
-378
5q33
.15q
33.2
5q33
.3
5q34
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180.5
miR-145 & miR146a
miRNA 145 targets TRAF6 and Fli-1.
KO miR-145 in mice: increase TRAF6 induces thrombocytosis & dysplastic MK.
Inhibition of miRNA145 or overexpression of Fli-1 increases the production of MK relative to erythroid cells
Trisomie 8
Chen et al, 2004
Diminution de l’activité NK
Team : E Sloand, NS Young
Restriction du répertoire T
Team : E Sloand, NS YoungSloand Blood Mar 3, 2011
Surexpression de WT1: significant CD4(+) and CD8(+) T-cell responses directedagainst WT1
WT1 is one of the antigens thattriggers T cell-mediatedmyelosuppression in MDS
Réponse à l’immunosuppression
Team : E Sloand, NS Young
– Del(5q) syndrome : ribosomopathie acquise avec hypoplasie érythroïde et thrombocytose
– Trisomie 8 : réponse immune inadéquate (WT1)
Take home messages (3)
→ Multiplicité des phénotypes
• « Génotype » MDS– Pas d’anomalie moléculaire unique pour
expliquer le phénotype dysplasique et apoptotique
Progéniteurmultipotent Progéniteur
lymphoïde
CFU-GEMM
Plaquettes Eosinophiles
Neutrophiles
Monocytes
BFU-E
Hématies
CFU-E
SCFEpo
GM-SCF
IL-3
Megakaryocyte
BasophilesB TSang
Moelle
Lymphocytes
Tpo
Nilsson et al, Blood, 2000 & 2002
CFU-GMCFU-Mk
MEP
CSH clonale
FISH5q-tris 8
HSCCD34+ CD38-
CD34+ CD38+
+8
+8
+8
+8
LT-HSC
ST-HSC 5q-
5q-
5q-
5q-
5q-
5q-
5q-
5q-
5q-
5q-
MDS et altérations géniques
Haploinsuffisance
DeletionCHCH33
Mutation Méthylation
CHCH33
CHCH33
Deletion Deletion
Perte d’hétérozygotie (LOH)
Syndrome 5q-
SNP arrays
Variations du nombre de copies, mais pas les UPD
corrèlent avec pronostic défavorable
Mohamedali et al, Blood 2007
UPD Délétion
Amplification
AML-M4MutationG -> T
R 1917 M
Ex11After BMT
↓↓
↓ ↓
WT
R I
M I
WT
wt/mut
wt/wt
mut/wt
sequences from bacterial clones
MDS42
TET2: potentiel gène suppresseur de tumeur
Mutations somatiquesAcquises
22% des MDS
Anomalies Bi-alléliques fréquentes
Fra
ctio
n of
clo
nes
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
CD34+
CD38-CD34+
CD38+
8
24
18
12
mutated TET2wild-type TET2
MDS09
Mutation présente dans les
progéniteurs immatures – Avantage de croissance
Delhommeau et al, NEJM, 2009
By courtesy Dr. K. GronbaekScience 2009, Nature 2010Cell April 2011
TET epigenetic functions
TET1/2
CH
CH
CH
CN CCCC
CC
CC
CN
CH
CO
CHCH
CH
CN
CC
CH
CH
CH
CN CCCC
CC
CC
CN
CH
CO
CHCH
CH
CN
CC
CH
CH
CN CCCC
CC
CC
CN
CH
CO
CHCH
CH
CN
CC
CH
CH
CN CCCC
CC
CC
CN
CH
CO
CHCH
CH
CN
CC
OH
CN CC
CC
CC
CN
CH
CO
CHCHCN
CC
CN CC
CC
CC
CN
CH
CO
CHCH
CHCH
CN
CC
CHCH
TET1: hmC→ DNA demethylationmTET: no hmC→ DNA hyper or hypomethylation ?
?
Cytosine (C) 5hmC5mCDNMT
TET1/2/3 are methylcytosine hydroxylases depending on 2-oxoglutarate and Fe2+
Catalytic domainConserved regions
1 2002
Ac AcAc
Ac
Ac AcAc
Ac Ac
MBD
MBD
MBD
MBD
HDACHDAC
HMTHMT
HMT
AcH3
H3K4me2
Methylated DNA
H3K9me2
H3K27me3
mememe
meme meme
me
mememe
mememe
mememe
meme me
me
meme
meme
meme
HAT
AcAc
Ac Ac
DNMTs
Regulation of chromatin state
Unmethylated DNA
EZH2 (enhancer of zeste homolog2, H3K27 methylase),ASXL1 (Additional sex combs-like 1, repressor of the Polycomb repressor group), UTX (H3K27 demethylase)
ASXL1UTX↑H3K27me3
TET2DNMT3A↓ 5mC
EZH2↓H3K27me3
Mutations
Bilan des mutations
TET2 are the most frequent,and co-occur with every other type of mutations
TP53 mutations associate with complex karyotype
TK mutations are highly exclusive
Bejar, Ebert, NEJM in press
439
Mutations and survival
Figueroa M, Blood 2009
HELP (14,000 promoteurs) : MDS vs normal CD34+
- méthylésdans les MDS
+ méthylésdans les MDS
HELP (HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR) assayHELP (HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR) assay
Méthylation p15INK4b, FZD9 est corrélée à- la blastose médullaire - un mauvais pronostic
Methylation of the p15INK4b gene in MDS is frequent acquired during disease progressionQuesnel et al. Blood, 1998; 91 : 2985-2990
Jiang et al, Blood 2008
Hyperméthylation de l’ADN
Modified from Feinberg Nat Rev Gen, 2006 and Gronbaek, 2009
TET2*TET2* metC ↓↓↓↓
Expansion of epigeneticallyaltered MDS stem cell or progenitor
Stem cell
Progenitor
metH3 ↑↑↑↑
Apoptosis↑Dysplasia
Apoptosis↓mC ↑↑↑ (p15)
TP53
Low risk MDS
High risk MDS
AML
Take home message (4)
Yoshida et al, Nature 11 sept 2011
Modified from Feinberg Nat Rev Gen, 2006 and Gronbaek, 2009
TET2*TET2* metC ↓↓↓↓
Expansion of MDS stem cellor progenitorwith altered
transcription and/or
translation
Stem cell
Progenitor
metH3 ↑↑↑↑
Apoptosis↑Dysplasia
Apoptosis↓mC ↑↑↑ (p15)
TP53
Low risk MDS
High risk MDS
AML
Take home message (5)
Département d’Hématologie,Institut CochinINSERM U1016, CNRS UMR8401
Olivier KosmiderEmilie FrisanCécile Pierre-EugèneCélia FloquetCatherine LacombePatrick MayeuxFrançois Dreyfus
Service d’Hématologie BiologiqueMartine GuesnuValérie BardetFranck Viguié
Erythropoïèse CNRS UMR8147, NeckerJulie VandekerckoveGenevieve CourtoisJB ArletOlivier Hermine
INSERM CRI866, IFR100, DijonCarmen Garrido
TET2INSERM U985, IGR, VillejuifVéronique DellaValleSeverine Trannoy Olivier Bernard
INSERM U1009, IGR, VillejuifFrançois DelhommeauWilliam Vainchenker,Eric Solary