PHYSIOGENOMIQUE

Mathot F.

ISoSL

Novembre 2008

GENETIQUE = LIEN ENTRE BIOLOGIE ET COMPORTEMENTS.

DEFINITIONS

• PHARMACOGENETIQUE (Volgel 1957) : Lien entre gènes (ethnies ou population) et réponses aux médicaments.

• PHARMACOGENOMIQUE : lien entre génome (personne ou groupe) et réponse aux médicaments.

• EPIGENETIQUE : Influence de l’environnement sur nos gènes.

• PROTEOMIQUE : Etude des protéines (structures et fonctions). + complexe que génomique : génome = constant et protéome varie de cellules à cellules.

• METABOLOMIQUE : Etude systémique des empreintes chimiques que les processus cellulaires laissent derrière eux. Métabolome = collection de tous les métabolites (par ex d’une cellule).

EPIGENETIQUE : Exemple

PHARMACOGENETIQUE

• La pharmacogénétique permet d’établir un lien entre le polymorphisme de la structure génique (le génotype) et la variabilité de la réponse à l’effet d’un médicament (le phénotype)

• Objectifs => Améliorer la maîtrise de la variabilité interindividuelle

Individualiser le traitement médicamenteux : choix de la molécule mais aussi posologie et rythme d’administration

PHARMACOGENOMIQUE :

=Etude des variations interindividuelles à l’intérieur de génomes complets dans le but de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques ou d’identifier des différences entre l’expression des gènes et la réponse aux différents médicaments.

Grand intérêt pour la genèse de nouveaux médicaments. (plus de 100 médicaments produits par génie génétique sont déjà utilisés).

EMEA :

HARMONISATION AVEC FDA.

La pharmacogénomique désigne tous les éléments de modifications de l’expression des gènes qui altèrent la réponse aux médicaments.

CODE GENETIQUE.

Code universel inscrit dans le matériel génétique avec toutes les informations nécessaires à la fabrication des protéines.

Chaque triplet de nucléotides ou codon est spécifique pour un acide aminé. Le fondement de l‘hérédité repose sur la relation entre la séquence des nucléotides et la séquence des acides aminés.

Un codon (triplet) code pour un acide aminé.Un cistron code un polypeptide.Un exon code une chaîne polypeptidique indispensable à la

synthèse d’une protéine.Un intron est une séquence non codante située entre 2

fragments codants pour un polypeptide (exon) d’un gène.

CODE GENETIQUE / CODON.

En génétique, les codons sont des triplets de nucléotides (A-Tou U, C-G)

Il existe 4³ = 64 combinaisons possibles de ces 4 lettres en triplets. Il y a 3 codons « stop ». Aux 61 autres codons correspondent les 20 acides aminés. Ainsi, en moyenne, une mutation sur 3 affectant une séquence d’ADN codante n’nentraîne aucune modification de la protéine traduite.

Le code génétique permet la synthèse des protéines. L’ADN est transcrit en ARN messager (ARNm). Celui-ci est traduit par les ribosomes qui assemblent les Acides aminés sur des ARN-transfert (ARNt). L’ARNt contient un « anti-codon », complémentaire d’un codon et porte l’acide aminé correspondant au codon. Pendant la traduction, le ribosome lit l’ARNm codon par codon, met en relation un codon de l’ARNm avec l’anti-codon d’un ARNt et ajoute l’acide aminé porté par celui-ci à la protéine en cours de synthèse.

CCODE GENETIQUE.

POLYMORPHISME

-On estime que la génétique intervient pour 20 à 95% dans la variabilité des effets des médicaments.

-Ces différences sont dues à des variations dans les séquences des gènes codant soit: des enzymes métabolisants,

des transporteurs

des récepteurs.

-Le polymorphisme a surtout lieu sur des nucléotides particuliers (SNP) : on a identifié 1.400.000 SNP dont 60.000 se situent dans une région codante d ’un gène. Aujourd’hui, près de 3.000.000 SNP ont été identifié et la statistique projette 10.000.000 SNP environ.

-Influence polygénique sur les caractéristiques pharmacocinétiques et pharmacodynamiques.

SNP : Polymorphisme d’un nucléotide.

Un SNP peut mener à une substitution d’un acide aminé dans la séquence d’une protéine altérant celle-ci.

Par ex : le remplacement valine par glutamate en position 6 de la chaîne hémoglobine globule rouge plus rigide en forme de faux anémie falciforme.

Chaque individu possède une collection unique de SNP qui explique les variations notamment dans la réponse aux médicaments.

Chaque cellule contient 46 chromosomes et environ 30.000 gènes pour 6 milliards de bases.

La bio-statistique avance un SNP pour 1000 bases. 7 millions de SNP différents entre 2 individus non proches.

Hirokane, 1999, Halopéridol TDM (n:231) : la Css (conc. Plasma. Au steady state) ajustée varie de 11 fois.

De Leon 2004, T1/2 Halopéridol de 14,5 hr à 36,7 hr mais après administration chronique, il rapporte des T1/2 de 21 jours.

Castberg, 2005, TDM routine Risperdal Consta après 14 jours : 25mgr : 38 nmol/L, 37,5mgr : 67 nm, 50mgr : 99nm et 75mg : 148. C/D (conc plasma/dose/24hr) médiane est de 22,2 nmol/L/mgr/24hr pour le groupe IM (n:30) et de 18,6 pour le groupe oral (n:278).

Kramer 2000, Quetiapine, même dose, Css varie de 40 fois. 

Hasselstrom 2004, TDM Quetiapine (n:62) C/D varie de 238 fois.

Olesen 1999, TDM Olanzapine (n:56) C/D varie de 26 fois.

Gex 2003, TDM Olanzapine (n:250) : si : femme, âgée, non fumeuse et + fluvoxamine alors Css Olanzapine 4,6 fois plus élevée que si homme, jeune, fumeur et + carbamazépine.

La demi-vie plasmatique est différente de la demi-vie dynamique. (Kapur 2002).

-Olanzapine: demi-vie : plasma : 24,2 hrs

: striatum : 75,2 hrs (50% occupation D2)

-Rispéridone : plasma : 10,3 hrs

: striatum : 66 hrs

•Posologie et Psychiatrie.

•Dose-effet (plasma)

•Concentration-effet (site récepteur).

•La dose reste fixe tandis que la conc. varie en fonction de : durée-sujet-métabolite actif-isomère et la sensibilité des cibles varie aussi selon le sujet, la période, la pathologie, la comédication, l’environnement, alcool, tabac.

•Combien de fois?

Conséquences de la variabilité génétique

•50% des médicaments exercent leurs effets au niveau d’un récepteur membranaire.

•30% interagissent avec une enzyme.

•5% agissent sur un canal ionique.

•Transporteurs ?, Pompes P-gp ?

•On estime que 1% des bases du génome humain peut varier et qu’au moins 28% (50% ?) des enzymes humaines sont polymorphes.

Target Gene Drug Potential ADR

Dopamine D3 receptors DRD3 Antipsychotics (dopamine antagonists)

Drug-induced tardive dyskinesia

Delta Opioid receptors OPRM1 Methadone, Heroin, Fentanyl

Addiction

Potassium channel KCNH2 (HERG) cisapride, quinidine Drug-induced LQT/TdP

Potassium channel KCNE2 Clarithromycin Drug-induced arrhythmia

Ryanodine receptor RYR1 Halothane, suxamethonium Hyperthermia

Beta2-adrenergic receptor Beta2-AR Salbutamol Lack of efficacy

LQT, Long QT. TdP, torsades de pointes.

Examples of drug targets with identified genetic polymorphisms associated ADRs

RECEPTEURS : Exemples de Polymorphismes et ADRs.

Le remplacement de l ’arginine 1644 par une histidine au niveau S4 du domaine IV inactive le canal sodique.

FIG. 2. Selected transport mechanisms along the BBB. A general depiction of the polarized expression of transporters for drugs and essentialnutrients on a BBB endothelial cell. The arrows indicate the direction of transport. For a more descriptive representation of the major drug transportsystems in the BBB [organic cation and anion transporters, nucleoside transporters (N2, es, and ei), and efflux systems (P-gp and MRP)], please referto Figs. 4, 5, 6, and 7. Adapted from Betz et al., 1980; van Asperen et al., 1997.

ACIDES AMINES

Le cerveau est le seul organe où le transport des acides aminés est limité et même aux concentrations plasmatiques normales, il y a compétition pour le passage des membranes (BBB).

Tyr et Tryp sont en compétition avec val, leu, isoleu et phenylala.

Schizophrenie : Les 4 A.A. sont augmentés; les conc. plasma. en tyr sont inchangées mais compétition pour le transport vers le cerveau avec moins de tyrosine disponible càd de dopamine.

Une diminution de Tyr est aussi signalée dans l’autisme et chez des bipolaires.

On remarque une diminution de Tryp chez les non répondeurs aux AP atypiques; cette résistance pourrait être liée à un déficit de synthèse de 5HT dans le SNC.

FIG. 5. Organic anion transport systems in the BBB and CP. The proposed topology for rat OAT1 is shown. P, phosphorylation sites. In additionto the transport of a variety of organic anions across the brain barriers, the active uptake of digoxin across the BBB and the secretion of estrogenconjugates and opioid peptides across the CP have been reported. Only the OAT systems that have been experimentally localized to a specific side ofthe BBB endothelium and CP epithelium are shown. Arrows indicate the direction of transport. Adapted from Sekine et al., 2000.

FIG. 7. P-gp and MRP efflux systems in the BBB and CP. The predicted membrane topology models for MRP1 and P-gp are provided. MRP2, -3,and -6 have structures similar to MRP1 and are characterized by an extra N-terminal extension (i.e., five transmembrane segments connected to aP-gp-like core by a cytoplasmic linker). Both MRP4 and -5 lack this additional transmembrane domain but contain the cytoplasmic linker in additionto the P-gp-like core. ABD, ATP-binding domain. Only the efflux systems that have been experimentally localized to a specific side of the BBBendothelium and CP epithelium are presented. Arrows indicate the direction of transport. Adapted from Ueda et al., 1997; Borst et al., 1999.

Le gène MDR-1 (multidrug resistance)• Code pour une protéine appelée « P-glycoprotein » (PGP)• PGP exprimée dans divers types cellulaires : produit

l ’extrusion de diverses molécules de l ’intérieur de la cellule vers l ’extérieur

• PGP impliquée au départ dans le développement de la résistance de tumeurs à divers médicaments cytostatiques (par de la concentration intracellulaire de ceux-ci)

• PGP exprimée notamment au niveau de l ’intestin et de la BHE : divers médicaments non-cytostatiques (p.e. digoxine, ciclosporine, vérapamil, terfénadine, inhibiteurs de la protéase du HIV) sont des substrats

• gène MDR-1 très polymorphique :1 polymorphisme (C3435T) corrélé avec Cmax de la digoxine

• PGP induite par la rifampicine : nouveau mécanisme d ’interaction médicamenteuse

Figure 3. Functional Consequences of Genetic Polymorphisms in the Human P-Glycoprotein Transporter Gene ABCB1 (or MDR1).

The schematic diagram of the human P-glycoprotein was adapted from Kim et al.,18 with each circle representing an amino acid and each color a different exon encoding the corresponding amino acids. Two single-nucleotide polymorphisms in the human ABCB1 gene have been associated with altered drug disposition (Panels A, B, C, and E) or altered drug effects (Panel D). The synonymous single-nucleotide polymorphism (a single-nucleotide polymorphism that does not alter the amino acid encoded) in exon 26 (the 3435C" border=0 src="/math/rarr.gif"T single-nucleotide polymorphism) has been associated with higher oral bioavailability of digoxin in patients homozygous for the T nucleotide (Panel A [Cmax denotes maximal concentration])19 but lower plasma concentrations after oral doses of fexofenadine (Panel B)18 and nelfinavir (Panel C).20 This single-nucleotide polymorphism has also been linked to better CD4 cell recovery in HIV-infected patients who are treated with nelfinavir and other antiretroviral agents (Panel D).20 The single-nucleotide polymorphism at nucleotide 2677 (G" border=0 src="/math/rarr.gif"T) has been associated with lower plasma fexofenadine concentrations in patients homozygous for the T nucleotide at position 2677 (Panel E).18 The panels have been adapted from Kim et al.,18 Hoffmeyer et al.,19 and Fellay et al.20

Génotype TT et passage placentaire.

Le génotype maternel régule (foie) le métabolisme des médic. jusqu’au placenta mais les caractéristiques génétiques du placenta sont déterminées par le fœtus.

Difficultés de prédiction de l’exposition médic. du fœtus du fait de la juxtaposition de 2 génotypes.

Ex. : génotypes P-gp CC, CT ou TT : un double TT (mère et fœtus) amène une exposition accrue pour le fœtus car moins de P-gp.

Le génotypage de la mère et du fœtus (amniocentèse) pourrait aider le choix d’un médicament afin de minimiser les ADR potentiels.

Ex : Sertraline : P-gp inhibiteur, augmente la conc. et la 1/2vie de rispéridone et 9OH-risp. et la sertraline est un substrat CYP 2D6, 3A4, 2C9, 2C19.

Importance des CYP et des P-gp importance d’une TDM chez la femme enceinte sous sertraline

P-gp et rispéridone :

La rispéridone est un substrat à forte affinité pour les P-gp :

Le rapport conc. Risp et 9-OH risp. dans le cerveau et le plasma de souris KO ou normales est de 14 et 11 respectivement.

P-gp et Méthadone (R et S) (P-gp substrat) :

Tt méthadone : grandes variabilités interindividuelles.

Les conc. cérébrales de R et S-Méthadone sont 15 et 23 x plus élevées chez les souris KO.

Les P-gp limitent fortement l’entrée de la méthadone dans le cerveau et elles peuvent être source de variation de ses effets dans le cerveau.

Slide 58. Regulatory Mechanisms of CYP3A and MDR1 Expression

The pregnane X receptor (PXR), also known as steroid and xenobiotic-sensing receptor (SXR), heterodimerizes with the retinoid X receptor (RXR). This heterodimer binds response elements upstream of the MDR1 and CYP3A genes. In this way, PXR can increase the transcription of CYP3A[37] and MDR1.[38] Moreover, binding motifs for the PXR have been identified on multiple rat CYP enzymes (CYP3A1, -3A2, -1A6, -2A1, -2A2, -2C6) as well as a P450 coenzyme, NADPH reductase.[39]

CYP 450 ET POLYMORPHISME GENETIQUE DU METABOLISME D’OXYDATION

Distribution de fréquence d’allure trimodale

3 phénotypes

métaboliseurs lents (PM) : indice de métabolisation (MR) > 12,6 5-10 % population “ caucasienne ”

intermédiaires (EM) : 0,2 < MR < 12,6

ultrarapides (UM) : MR < 0,2

LE POLYMORPHISME GENETIQUE DU METABOLISME D’OXYDATION

Conséquences cliniques

- Métaboliseurs lents

accumulation de la molécule, plus sujets aux effets indésirables

pas d’effet thérapeutique des prodrogues

exemple : absence d’effet analgésique de la codéine

codéine morphine

CYP 2D6

- Métaboliseurs ultra rapides : absence de réponse thérapeutique

LE POLYMORPHISME GENETIQUE DU METABOLISME D’OXYDATION

Support génétiqueméchanismes moléculaires du polymorphisme génétique

A - simple nucléotide

dans une région codante : substitution d’acides aminés

dans une région non codante :

séquence de régulation : sous ou sur production de protéines actives

intron : ARNm inapproprié, erreurs post traductionnelles, modification d ’activité

enzymatiques

B - délétion, duplication génique

exemple de l’allèle *4B du CYP 2D65’ 3’

exon 3 exon 4

G = > A

enzyme normale : 497 aa enzyme mutée *4B : 181 aa, inactive

Mutations les plus communes du CYP2D6

Figure 4. Pharmacogenetics of Nortriptyline.

Mean plasma concentrations of nortriptyline after a single 25-mg oral dose are shown in subjects with 0, 1, 2, 3, or 13 functional CYP2D6 genes. Modified from Dalén et al.23 with the permission of the publisher.

UGT 1A1 Polymorphismes.Uridine Diphosphate glucuronyl transférase.

US : 3 notices avec recommandations pour testing pharmacogénétique : Irinotecan (campto), 6-mercaptopurine (imuran), warfarin.

UGT : superfamille enzymes (17) de glucuroconjugaison.

Très polymorphique : 60 isoformes.

Irinotecan (inhibiteur de topoisomérases) : prodrug SN-38, mét. Actif conjugué par UGT 1A1. Si allèle UGT 1A1*28 (TA)7 au lieu de (TA)6 pour le WT : UGT 1A1*1 activité – 70% neutropénie,diarrhées sévère, bilirubine ++.

Allèle UGT 1A1*16 (GlyArg) : activité – 40%

Irinotecan aussi substrat pour P-gp att. polymorphisme ABCB1.

Les inhibiteurs des protéases inhibent le UGT 1A1 bilirubine ++ et att. ictère.

UGT 1A1 testing : 255 usd

UGT 1A1 : Substrats, Inducteurs et Inhibiteurs.

DEFICIT EN CARNITINE :

-Inhibition du transport des fragments acyls issus de la Bêta-oxydation avec accumulation et blocage du métabolisme mitochondrial.

-Manifestations cliniques : atteintes:

Musculaires (muscles striés, cardio-myopathie).

Neurologiques (œdème cérébral, coma).

Hépatiques : (hypoglycémie, hyperammoniémie, acidose métabolique, syndrome de Reye).

Les déficits peuvent être primaires (défaut génétique en acyl-CoA déshydrogénase, CPT 1, CPT 2, cycle de l ’urée) ou secondaires ou acquis par déplétion des stocks : hémodialyse, insuffisance d ’apport :TPN, médicaments : acide valproique, pivampicilline.

NRG1 : neuregulin 1; DTNBP1 : dysbindin; RGS4 : regulator G-protein signaling 4;

COMT : catechol-o-methyltransferase; PRODH : prolin deshydrogenase;

DISC1 : disrupted-in-schizophrenia.

+++ = at least three positive studies.

Proline eseentielle pour synthèse glutamate et GABA.

Cependant, passer au crible les 10 millions de SNP courants qui se trouvent dans les chromosomes d’un patient serait un processus extrêmement coûteux.

Pour la schizophrénie, des dizaines voire des centaines de variables génétiques sont quelque peu prédictives du risque de schizohrénie mais aucune n’est cliniquement utile par elle-même.Il s’agit d’examiner ces gènes qui ont tous un petit effet et de créer un algorithme pour prédire les risques éventuels. Le développement de HapMap permettra aux généticiens de tirer profit de l’organisation des SNP et des autres variations génétiques dans les chromosomes.

Maladie d’Alzheimer : dépistage plus tôt.

Autisme : prédispositions : chaque point correspond à un locus lié positivement à l’autisme.

Ethanol : Pharmacogénétique

Grande variabilité de l’ADME de l’alcool due aux facteurs génétiques et environnementaux.

CYP2E1 augmenté dans l’alcoolisme chronique et des polymorphismes du CYP2E1 seraient impliqués dans certains cancers (estomac) et pancréatites chez l’éthyl.

7 gènes encodent pour l’ADH dont 2 polymorphes : L’ADH2*1 2x moins vite que le ADH1 (wt) et l’ADH2*2 métabolise 15x plus vite que le wt avec risque d’accumulation toxique d’acétaldéhyde.

2 gènes encodent pour l’ALDH avec 2 allèles dont un est inactif; rare chez les caucasiens, il est présent chez 40% des orientaux avec risque d’accumulation d’acétaldéhyde.

5HTTLPR : transporteur de la sérotonine.

HLA : Human Leukocytes Antigens systems

Le chromosome 6 contient une région connue comme : MHC = major histocompatibility complex. 60% des gènes de cette région codent pour des protéines impliquées dans les réponses immunologiques dont le système HLA, vital pour nos défenses antiinfectieuses.

Afin de couvrir le large spectre antiinfectieux, c’est le système le plus polymorphe du génome humain.

Malheureusement, cette large variabilité augmente aussi le risque de développements aberrants chez certains individus pouvant mener à des maladies auto-immunes et dans le cas de médicaments, à des réactions allergiques sévères.

Allele or haplotype Drug ADR associated with HLA

HLA-B*1502 Carbamazepine Stevens-johnson syndrome

HLA-DRB1 *1501, HLA-DQB1 *0602, HLA-DRB5*0101

Amoxicillin-clavulanic acid Hepatitis

HLA-DQ7 Pyrazolones Pyrazolone hypersensitivity

HLA-A29, HLA-B12,

HLA-DR7

Sulfonamides Toxic epidermal necrolysis

HLA-B38, HLA-DR4,

HLA-DQ3, HLA-Cw*7, HLA-DQB *0502, HLA-DRB*0101,

HLA-DRB3 *0202

Clozapine Agranulocytosis

HLA-B *5701,

HLA-DR7, HLA-DQ3

Abacavir Abacavir hypersensitivity reactionj

HLA-DR4

Hydralazine Systemic lupus erythematosus

Examples of HLA alleles and halotypes associated with ADRs

HLA : human leukocytes antigens systems.

Gene Name Allele of AA change Effect on phenotype

B2AR β2-adrenergic receptor Arg16/Gly Reduced response to β2 agonists

Gln27/Glu Increased response to β2 agonists

B1AR β1-adrenergic receptor R389G Reduced response to β-agonists

ALOX5 5-lipoxygenase GGGCGG† Reduced response to leukotrienes

LTC4S Leukotiene C4 synthase A2444C Increased response to zafirlukast in C/A;CC

GNB3 G-protein B3 C825T Increased response to sibutramine in T/C;TT subjects

LIPC Hepatic lipase C514T Reduced response to statins in T/C;T/T subjects

UGTA1 UDP-glucoronosyl transferase1A1 UGRA1*28 Increased toxicity to irinotecan

TYMS Thymidylate synthase TSER*2/*3 Reduced response to 5-fluorouracil

MTHFR Methylene tetrahydrofolate reductase C677T Increased toxicity to methotrexate

ABCB1 P-glycoprotein-1 (MDR1) C343T Decreased response to antiepileptic drugs

AGT Angiotensinogen M235T Increased response to antihypertensive drugs

DRD3 Dopamine D3 receptor S9G Reduced response to clozapine

HTR2A Serotonin receptor 2A H452Y Reduced response to clozapine

†Variable number tandem repeat in promoter. AA: Amino acid

Table 1. Examples of Genetic Polymorphisms Affecting Drug Response

Central Orexigenic

NPY, Melanin,

AgoutiRP

Orexins, galanin

Central Anorectic :

CART, glucagon,

Melanocortins,

CRF, 5HT,

Neurotensin.

Periph Orexigenic

Ghrelin.

Periph Anorexic.

PYY, Leptin,

Insulin,

Cholecystokinin.

CART = cocaine amphetamine regulated transcript.

APPROCHES INDUSTRIELLES

• OUTILS BIOINFORMATIQUES : pour analyser la carte du génome humain.• OUTILS DE SEQUENCAGES : pour générer les bio-marqueurs.• OUTILS DE GENOTYPAGE : pour comparer les polymorphismes entre les populations.• OUTILS BIOSTATISTIQUES : pour étudier l’association des biomarqueurs et des gènes aux caractéristiques cliniques.

BIOMARQUEUR GENOMIQUE.

= caractéristique mesurable de l’ADN ou ARN qui est un indicateur :

-de diagnostic : le biomarqueur permet d’identifier une maladie.

-de pronostic : détermine l’évolution prévisible de la maladie.

-de dynamique : rend compte de l’effet du médicament.

-de toxicité : analyse les effets indésirables.

-de pathologie : mesure de la maladie, de ses conséquences.

On parle de puce à ADN, puce à gènes, biopuce, biochips, microchips, DNA-microarrays, microarrays

TESTS GENETIQUES : UTILES OU ARNAQUE ?

Dans la grande majorité des cas (plus de 1000 tests recensés aux USA) = ARNAQUE ! Il faudrait analyser 1500 protéines !!!!

Rares sont les tests validés par la FDA : UGTA1, Chips CYP450…Les autres n’ont aucune valeur prédictive individuelle : difficulté

d’interpréter les données : un SNP identique peut être sérieux chez une personne et bénin chez une autre en fonction de la race, de l’environnement, de la pathologie…. Si nous pouvions tout prédire, nous irions vers une Société sans espoir…..

Par contre, utilité pour les maladies monogéniques (environ 50 dont 20 sont génétiquement identifiée (huntington, dystrophie, mucoviscidose, hémophilie, phénylacétonurie, anémie falciforme etc..).