Pharmacocinétique et optimisation galénique de

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Pharmacocinétique et optimisation galénique dedithiarsolanes à visée antileucémique : exemple des

nanosuspensions d’arsthinolImane Ajana

To cite this version:Imane Ajana. Pharmacocinétique et optimisation galénique de dithiarsolanes à visée antileucémique :exemple des nanosuspensions d’arsthinol. Sciences pharmaceutiques. Université Henri Poincaré -Nancy 1, 2010. Français. �NNT : 2010NAN10018�. �tel-01775835�

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UNIVERSITE HENRI POINCARE – NANCY I

UFR de Pharmacie

ECOLE DOCTORALE "BIOLOGIE SANTE ENVIRONNEMENT"

THESE

Présentée et soutenue publiquement Le 30 mars 2010

Pour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE HENRI POINCARE – NANCY I

Mention : Sciences de la Vie et de la Santé

Par

Imane AJANA

Titre de la thèse :

Pharmacocinétique et optimisation galénique de dithiarsolanes à visée antileucémique : exemple des nanosuspensions d’arsthinol

MEMBRES DU JURY Rapporteurs : Professeur Pierre JEANNESSON (Faculté de Pharmacie, Reims) Docteur Fabrice PIROT (Faculté de Pharmacie, Lyon) Examinateurs : Docteur Fariba NEMATI (Institut Curie, Paris) Professeur Alain ASTIER (Faculté de Pharmacie, Nancy) Professeur Philippe MAINCENT (Faculté de Pharmacie, Nancy) Docteur Stéphane GIBAUD, directeur de thèse (Faculté de Pharmacie, Nancy) Laboratoire de Pharmacie Clinique EA 3452 "Cibles thérapeutiques, formulation et expertise préclinique du médicament" Faculté de Pharmacie 5, rue Albert Lebrun 54001 Nancy Cedex, France

UNIVERSITE HENRI POINCARE – NANCY I

UFR de Pharmacie

ECOLE DOCTORALE "BIOLOGIE SANTE ENVIRONNEMENT"

THESE

Présentée et soutenue publiquement

Le 30 mars 2010

Pour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE HENRI POINCARE – NANCY I

Mention : Sciences de la Vie et de la Santé Par

Imane AJANA

Titre de la thèse :

Pharmacocinétique et optimisation galénique de dithiarsolanes à visée antileucémique : exemple des nanosuspensions d’arsthinol

MEMBRES DU JURY Rapporteurs : Professeur Pierre JEANNESSON (Faculté de Pharmacie, Reims) Docteur Fabrice PIROT (Faculté de Pharmacie, Lyon) Examinateurs : Docteur Fariba NEMATI (Institut Curie, Paris) Professeur Alain ASTIER (Faculté de Pharmacie, Nancy) Professeur Philippe MAINCENT (Faculté de Pharmacie, Nancy) Docteur Stéphane GIBAUD, directeur de thèse (Faculté de Pharmacie, Nancy) Laboratoire de Pharmacie Clinique EA 3452 "Cibles thérapeutiques, formulation et expertise préclinique du médicament" Faculté de Pharmacie 5, rue Albert Lebrun 54001 Nancy Cedex, France

A mes chers parents A ma famille A mes amies

Remerciements Je tiens tout d’abord à remercier Monsieur le Docteur Stéphane GIBAUD de m’avoir proposé ce sujet de thèse, et de m’avoir aiguillé et conseillé dans la réalisation de mes travaux pour mener à bien ce projet.

Je remercie vivement : Monsieur le Professeur Pierre JEANNESSON et Monsieur le Docteur Fabrice PIROT qui me font l’honneur d’avoir accepté de juger ce travail de thèse et d’en être les rapporteurs. Madame le Docteur Fariba NEMATI qui me fait l’honneur d’avoir accepté de participer au jury de cette thèse. Monsieur le Professeur Alain ASTIER de m’avoir initié dans la réalisation de ce projet. Il me fait l’honneur d’avoir accepté de participer au jury de cette thèse. Monsieur le Professeur Philippe MAINCENT ; le Directeur de l’équipe EA 3452 qui m’a accueillie dans son unité de recherche pendant toute la période de ma thèse et pour l’honneur qu’il me fait d’avoir accepté de participer au jury de cette thèse. Je remercie Monsieur François DUPIRE pour son aide précieuse dans la réalisation de l’analyse des échantillons par CLHP-SM. Je remercie Monsieur le Docteur Raphael DUVAL pour sa disponibilité et pour les connaissances qu’il m’a su apporter en biologie cellulaire. Enfin, je remercie Mme Pascale CARNET pour sa bienveillance, son efficacité ainsi que tout le personnel du laboratoire de Pharmacie Clinique pour leur encouragement.

Table des matières

Introduction générale ............................................................................ 1

Etude bibliographique .......................................................................... 6 I. Dérivés arsenicaux dans le traitement des leucémies ......................................... 7

1. Trioxyde d’arsenic .......................................................................................................... 7

1.1. Historique ............................................................................................................................ 7

1.2. Propriétés physico-chimiques .............................................................................................. 8

1.3. Propriétés pharmacocinétiques ............................................................................................ 8

1.4. Intérêt thérapeutique du trioxyde d’arsenic sur les leucémies ............................................. 9

1.4.1. Leucémie de type LAM3 .............................................................................................. 9

1.4.2. Etudes cliniques ......................................................................................................... 10

1.5. Mécanisme d’action .......................................................................................................... 10

1.5.1. Induction de l’apoptose .............................................................................................. 11

1.5.2. Effet sur le système enzymatique ............................................................................... 12

1.6. Métabolisme ...................................................................................................................... 13

2. Mélarsoprol................................................................................................................... 15

2.1. Historique .......................................................................................................................... 15

2.2. Propriétés physico-chimiques ............................................................................................ 16

2.3. Propriétés pharmacocinétiques .......................................................................................... 16

2.4. Mécanisme d’action sur les cellules leucémiques ............................................................. 17

2.5. Etudes cliniques ................................................................................................................. 18

2.6. Voie d’élimination ............................................................................................................. 18

3. Arsthinol ....................................................................................................................... 20

3.1. Historique .......................................................................................................................... 20

3.2. Synthèse et préparation ..................................................................................................... 20

3.3. Propriétés physico-chimiques ............................................................................................ 21

3.4. Intérêt thérapeutique .......................................................................................................... 22

3.5. Voie d’élimination ............................................................................................................. 23

II. Neurotoxicité des dérivés arsenicaux ............................................................... 25

1. Arsenic inorganique...................................................................................................... 25

2. Arsenic organique ......................................................................................................... 25

Table des matières

III. Particules colloïdales et passage des barrières biologiques .......................... 27

1. Nanosuspensions de principes actifs peu solubles ....................................................... 27

1.1. Introduction ....................................................................................................................... 27

1.2. Nanosuspensions ............................................................................................................... 29

1.2.1. Production à l’échelle d’un laboratoire ...................................................................... 29

1.2.2. Propriétés des nanosuspensions ................................................................................. 30

1.2.2.1. Caractéristiques .................................................................................................. 30

1.2.3. Modification des propriétés de surface ...................................................................... 31

1.2.4. Influence de la taille des particules ............................................................................ 32

1.2.5. Applications thérapeutiques et propriétés biologiques .............................................. 33

1.2.5.1. Administration par voie orale ............................................................................. 33

1.2.5.2. Voie d’administration intraveineuse ................................................................... 34

2. Rappel de la physiologie médullaire et passage des particules colloïdales .................. 35

2.1. Moelle osseuse et barrière hémato-médullaire (BHM) ..................................................... 35

2.1.1. Rappel de la physiologie ............................................................................................ 35

2.1.2. Fonction réticulo-endothéliale ................................................................................... 37

2.2. Passage des particules colloïdales à travers la BHM ......................................................... 37

2.2.1. Aspect physiologique de la BHM .............................................................................. 37

2.2.2. Modulation galénique et passage de la BHM ............................................................ 38

3. Rappel de la physiologie de la BHE et passage des particules colloïdales .................. 40

3.1. Physiologie de la Barrière hémato-encéphalique (BHE) ................................................... 40

3.2. Passage des particules colloïdales à travers la BHE .......................................................... 41

IV. Conclusion ......................................................................................................... 45

Travail expérimental ........................................................................... 46

Chapitre I : Nanosuspensions d’arsthinol : pharmacocinétique et activité

antileucémique .............................................................................................................. 47

1. Résumé de la publication n°1 : ..................................................................................... 48

1.1. Mise au point des nanosuspensions d’arsthinol ................................................................. 48

1.2. Etude de la pharmacocinétique des nanosuspensions d’arsthinol et évaluation de leur

activité sur les cellules NB4 de LAM3 ..................................................................................... 49

Publication n°1: Arsthinol nanosuspensions: pharmacokinetics and anti-leukaemic activity on

NB4 promyelocytic leukaemia cells ........................................................................................ 51

2. Evaluation de l’activité apoptotique de l’arsthinol ....................................................... 59

2.1. Introduction ....................................................................................................................... 59

Table des matières

2.2. Matériels et méthodes ........................................................................................................ 61

2.2.1. Lignées cellulaires et réactifs ..................................................................................... 61

2.2.2. Mesure de l’activité des caspases-3/7 ........................................................................ 61

2.3. Résultats et discussion ....................................................................................................... 63

3. Conclusion .................................................................................................................... 65

Chapitre II : Métabolisme de l’arsthinol ....................................................................... 66

Résumé de la publication n°2 : ................................................................................................. 68

Publication n°2: Speciation of arsenic in urine following intravenous administration of

arsthinol in mice ....................................................................................................................... 69

Discussion générale ............................................................................ 89

1. Activité antileucémique de l’arsthinol .......................................................................... 90

2. Propriétés des nanosuspensions d’arsthinol ................................................................. 91

3. Pharmacocinétique de l’arsthinol et de ses nanosuspensions ....................................... 93

3.1. Pharmacocinétique plasmatique ........................................................................................ 93

3.2. Distribution tissulaire de l’arsthinol en solution ............................................................... 93

3.3. Distribution tissulaire des nanosuspensions d’arsthinol .................................................... 95

4. Etude du métabolisme de l’arsthinol ............................................................................ 97

4.1. Identification des métabolites ............................................................................................ 97

4.2. Mécanisme de transformation de l’arsthinol ..................................................................... 97

Conclusion .......................................................................................... 99

Liste des figures .............................................................................. 102

Liste des tables ................................................................................ 105

Références bibliographiques ............................................................ 106

Liste des abréviations

• Apo : Apolipoprotéine

• ACTH : Adreno cortico tropic hormone

• ADN: Acide désoxyribonucléique

• ARNm: Acide ribonucléique messager

• As2O3 : trioxyde d’arsenic

• ATP : Adénosine triphosphate

• ATRA : Acide tout-trans rétinoïque

• BAL : British anti-lewisite

• BHE : Barrière hémato-encéphalique

• BHM : Barrière hémato-médullaire

• CLHP : Chromatographie liquide à haute performance

• CLHP-SM : Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie

de masse

• DMAIII : Dimethylarsinous acid

• DMAAV : Dimethylarsinic acid

• 2-D PAGE : Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis

• EAR : Encéphalopathie arsenicale réactive

• GPx : Glutathion peroxydase

• GSH : Glutathion

• GSTπ : Glutathion S-transférase

• Ig G : Immunoglobuline G

• LAM3 : Leucémie aiguë promyélocytaire

• LCR : Liquide céphalo-rachidien

• LDL : Low density lipoproteins

• LMC : Leucémie myéloïde chronique

• LLC : Leucémie lymphoïde chronique

• MAAV : Monomethylarsonic acid

• MMAIII : Monomethylarsonous acid

• NADP : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

• PBCA : Polybutylcyanoacrylate

• PML : Promyelocytic leukemia

• RARα : retinoic acid receptor-α

• SAM : S-adénosyle-méthionine

• SCP : Spectroscopie de corrélation de photon

• SNC : Système nerveux central

• SPM : Système de phagocytes mononuclées

• SRE : Système réticulo-endothélial

1

Introduction générale


2

Depuis plus de 2000 ans, les propriétés médicinales de l’arsenic ont été utilisées dans

le traitement de nombreuses pathologies : dermatite herpétiforme, asthme, syphilis, épilepsie,

psoriasis, trypanosomiase et amibiase (Jackson et Grainge, 1975). L’activité trypanocide du

trioxyde d’arsenic (As2O3) a été mise en évidence lors des expéditions de Sir David

Livingstone, (1858), tandis que son activité sur les leucocytes a été décrite pour la première

fois en 1878 chez les patients atteints de leucémies myéloïdes chroniques (Cutler et Bradford,

1878). Le premier dérivé organoarsénié utilisé en thérapeutique (atoxyl) a été synthétisé par

Antoine Béchamp (1816-1908) (Béchamp, 1863). Son utilisation a toutefois été limitée par

une toxicité oculaire importante (Anonyme, 1910). D’autres composés [arsphénamine,

néoarsphénamine (Ehrlich et Bertheim, 1911)] ont progressivement enrichi cette classe

thérapeutique qui constituait une classe majeure au début du XXème siècle.

Dans les années 1950, après de nombreuses recherches sur les composés arsenicaux, le

mélarsoprol, un organoarsénié trivalent est devenu le principal principe actif utilisé dans le

traitement de la phase tardive de la trypanosomiase africaine humaine (Pépin et Milord, 1994).

L’efficacité du mélarsoprol reste incontestable mais son utilisation est limitée par des effets

indésirables sévères qui se manifestent notamment par une encéphalopathie. Un autre

organoarsénié trivalent ; commercialisé sous le nom de Balarsen® (arsthinol) en 1953 était

relativement mieux toléré en clinique (Goldman et coll., 1956). L’arsthinol était produit de la

réaction de 3-acétamido-4-hydroxy-acide phénylarsonique et du dimercaptopropanol (BAL).

Il a été utilisé dans le traitement du pian et de l’amibiase (Friedheim, 1949 a ; Loughlin et

coll., 1954). De plus, de nombreuses formulations d’organoarséniés (comprimés, collutoires,

poudres, etc.) sont restées commercialisées en occident jusqu’à leur éviction dans les années

1990. C’est à cette époque qu’un rapport bénéfice/risque négatif a été mis en évidence pour

les composés arsenicaux utilisés dans le traitement des pathologies sans une vraie

connaissance de leur mécanisme d’action.

Après quelques décennies d’oubli, le trioxyde d’arsenic a été réintroduit dans les

années 1970 en médecine chinoise dans le traitement de la leucémie aiguë promyélocytaire

(LAM3) car il permet dans certains cas une rémission complète (Sun et coll., 1992). Les essais

in vitro réalisés récemment ont montré que le mélarsoprol a des effets similaires au trioxyde

d’arsenic sur les lignées cellulaires leucémiques lymphoïdes et myéloïdes (Konig et coll.,

1997; Wang et coll., 1998 a). Malgré cette activité antileucémique intéressante du mélarsoprol,


3

les essais cliniques menés chez l’homme ont été arrêtés à cause des effets neurotoxiques

sévères (Soignet et coll., 1999).

Dans notre laboratoire, des tests de cytotoxicité des dithiarsolanes (arsthinol et

mélarsoprol) et du trioxyde d’arsenic inorganique ont été réalisés sur les lignées cellulaires

leucémiques (U937 myélomonocytaire et K562 érythroleucémique). Cette étude a montré que

l’arsthinol était beaucoup plus actif que l’As2O3 et le mélarsoprol (Gibaud et coll., 2006). De

plus, l’index thérapeutique de l’arsthinol [DL50 chez la souris (µmol/kg) / CI50 sur cellules

K562 (µmol/l)] obtenu était de 279 vs 40 pour le mélarsoprol et 2,3 pour l’As2O3. Ceci

suggère que l’arsthinol est le composé le plus intéressant dans le traitement des leucémies.

L’administration de composés arsenicaux peut être associée à des effets indésirables

importants. Ainsi, au cours du traitement de l’amibiase par de l’arsthinol, il y a eu apparition

des fièvres et des leucopénies (Most et coll., 1954). Toutefois, la toxicité cérébrale reste la

plus redoutable. De nombreux travaux ont montré que la réalisation de vecteurs colloïdaux

(nanoparticules, nanocapsules, liposomes, nanosuspensions) permettrait de modifier

considérablement la répartition tissulaire de principes actifs "encapsulés". Dans de nombreux

cas, ce type de formulation a permis de diminuer la toxicité de principes actifs toxiques ou

d’améliorer le passage de certaines barrières biologiques (barrière hémato-encéphalique,

barrière hémato-médullaire, etc.). Le premier objectif de notre travail sera de réaliser des

nanosuspensions d’arsthinol qui auraient la propriété de limiter les concentrations cérébrales

et d’augmenter les concentrations médullaires, favorisant ainsi l’activité antileucémique.

L’arsthinol est caractérisé par une faible solubilité en milieu aqueux et comme tout

composé hydrophobe son élimination nécessite une biotransformation en composé

hydrosoluble. Les travaux de Cristau et coll., (1973) ont montré que l’arsthinol est

essentiellement éliminé par voie biliaire chez le rat en raison de son caractère hydrophobe. Par

ailleurs, la toxicité et la biodisponibilité des composés arsenicaux sont dépendantes de leur

structure chimique ce qui peut avoir une influence sur leur activité. Au sein de cette classe, les

dithiarsolanes ont la particularité de posséder un cycle "soufré" qui protège le site actif

constitué essentiellement par l’atome d’arsenic sous sa forme trivalente. Ce cycle peut être

facilement hydrolysé en milieu aqueux pour donner un arsènoxyde très actif.


4

A ce jour, l’ensemble des métabolites des dithiarsolanes n’est pas encore connu. Il a

été montré que des quantités significatives en arsenic sont éliminées dans les urines (Cristau

et coll., 1973 ; 1975) sans aucune identification n’ait été réalisée. Dans ce contexte,

l’identification des métabolites urinaires de l’arsthinol, permettrait d’obtenir un schéma

complet de son métabolisme et des indications supplémentaires sur sa toxicité. Cette étude des

métabolites est l’un des objectifs de notre travail.

En résumé, le travail expérimental de ce travail a d’abord consisté à développer des

nanosuspensions d’arsthinol adaptées à l’administration intraveineuse. Cette formulation était

susceptible de réunir plusieurs avantages : améliorer la solubilité de l’arsthinol en milieu

aqueux, éviter l’utilisation de solvants organiques et permettre de modifier favorablement la

distribution tissulaire du principe actif après injection (concentrations médullaires importantes

et faibles concentrations cérébrales). Ensuite, nous avons évalué les potentialités

antileucémiques de l’arsthinol et de sa forme galénique sur la lignée cellulaire NB4 de LAM3

in vitro. Enfin, nous avons étudié le métabolisme de l’arsthinol administré par voie

intraveineuse chez un modèle murin.

La partie bibliographique de ce mémoire a pour objectif de montrer l’intérêt des

dérivés de l’arsenic en clinique et en particulier dans le traitement des leucémies. Cette partie

rassemble les travaux réalisés jusqu’à présent sur l’arsenic organique et inorganique en

hématologie (activité antileucémique in vitro, mécanisme d’action et essais cliniques). Par la

suite, nous rappelons les avantages de l’utilisation des nanosuspensions pour l’administration

de principes actifs peu solubles, ainsi que les applications possibles de cette formulation en

thérapeutique. Nous avons également fait le point sur les modulations galéniques possibles

pour modifier le passage de principes actifs à travers les barrières biologiques [barrière

hémato-médullaire (BHM) et barrière hémato-encéphalique (BHE)]. Enfin, nous détaillons les

différents travaux qui ont été réalisés sur le métabolisme et les voies d’élimination de

l’arsenic organique et inorganique.


5

La partie expérimentale de ce travail de recherche est divisée en trois parties :

Préparation et contrôle des nanosuspensions. Pharmacocinétique et distribution

tissulaire des nanosuspensions chez la souris après administration par voie

intraveineuse.

Evaluation de l’activité de l’arsthinol sur la lignée cellulaire NB4 de LAM3 in vitro

(test de cytotoxicité et mesure de l’activité apoptotique).

Spéciation et identification des métabolites de l’arsthinol dans l’urine de souris

après administration intraveineuse, et étude du mécanisme de transformation in

vitro de cet organoarsénié.

6

Etude bibliographique


7

I. Dérivés arsenicaux dans le traitement des leucémies

L’arsenic a été utilisé pendant de nombreuses années dans diverses indications

thérapeutiques. Les dérivés arsenicaux inorganiques et organiques ont notamment montré une

activité intéressante en particulier sur les leucémies. Dans ce chapitre, nous détaillerons les

dérivés arsenicaux les plus étudiés en hématologie, ainsi que l’arsthinol qui a fait l’objet de

notre travail.

1. Trioxyde d’arsenic

1.1. Historique

Le mot "arsenic" vient d’un mot grec “arsenikon” signifiant “puissant”. Les composés

arsenicaux ont été utilisés depuis 2000 ans avant Jésus-Christ comme principes actifs et

poisons (Belcastro, 2001). Les dérivés inorganiques sont généralement plus toxiques et moins

stables que les composés organiques. Ils peuvent exister notamment sous forme de sulfites,

d’oxydes, de sels de sodium, de potassium ou de calcium.

Dans les années 1700, Thomas Fowler a mis au point une solution composée de

trioxyde d’arsenic (As2O3) dissous dans du bicarbonate de potassium (1 % w/v). Cette

solution a été utilisée empiriquement dans le traitement de diverses maladies comme l’asthme,

le choléra, le pemphigus, l’eczéma et le psoriasis (Kwong et Todd, 1997 ; Aronson, 1994). En

1865, des médecins allemands ont commencé à administrer la solution de Fowler à des

patients atteints de leucémie myéloïde chronique (LMC) (Sears, 1988). Par la suite, elle a été

officiellement reconnue dans la Pharmacopée française et à travers le monde (Langenhan,

1918). Son efficacité a été publiée pour la 1ère fois en 1878 (Culter et Bradfort, 1878). De

plus, Forkner et Scott, (1931) de l’hôpital de Boston, ont réalisé des études précises dans la

même indication mais des cas d’empoisonnements chroniques à l’arsenic ont été constatés

chez ces patients (Kandel et LeRoy, 1937). Après cela, l’utilisation de la solution de Fowler

déclina progressivement devant l’apparition de nouveaux anticancéreux.

En médecine traditionnelle chinoise, l’arsenic a été réintroduit dans le traitement de la

leucémie aiguë promyélocytaire (LAM3) dans les années 1970 et fut associée à des extraits de

plantes (Ailing-1) (Sun et coll., 1992). Plus récemment, des équipes de chercheurs ont décrit

des réponses cliniques intéressantes avec des taux de rémission significatifs chez les patients

atteints de LAM3 et en rechute, traités au trioxyde d’arsenic (Soignet et coll., 1998 ; Niu et


8

coll., 1999). En conséquence en l’an 2000, l’U.S. Food and Drug Administration (FDA) a

approuvé le trioxyde d’arsenic (Trisenox®) dans le traitement de la leucémie aiguë

promyélocytaire (LAM3) réfractaire (Soignet et coll., 2001).

1.2. Propriétés physico-chimiques

La formule chimique du trioxyde d’arsenic est As2O3 ; sa masse molaire est de 197,83

g/mol. Il existe sous l’aspect d’une poudre blanche inodore ou de cristaux transparents dont le

point de fusion est de 312,3 °C. Sa solubilité dans l’eau est de 37 g/l à 20°C.

1.3. Propriétés pharmacocinétiques

Les études pharmacocinétiques réalisées sur les patients atteints de la leucémie aiguë

promyélocytaire et en rechute à l’ATRA (acide tout-trans rétinoïque) et à la chimiothérapie,

ont montré que l’arsenic était rapidement éliminé du plasma même après administration

répétée pendant 30 jours. Pour une dose de 10 mg/jour administrée pendant 3 heures par voie

intraveineuse, la concentration plasmatique maximale est de 6,85 µmol/l, la demi-vie de

distribution (t1/2 α) est de 0,89 ± 0,29 heures et celle d’élimination (t1/2 β) est de 12,13 ± 3,31

heures (Shen et coll., 1997). Les concentrations plasmatiques mesurées après 30 jours de

traitement sont quasiment identiques à celles obtenues après 1 jour de traitement, signifiant

que l’arsenic ne s’accumule pas dans le plasma.

Toutefois, il a été constaté que 95 % à 97 % de l’arsenic se fixe à l’hémoglobine du

sang ce qui permet une distribution rapide dans certains organes. Chez l’homme,

l’accumulation de l’arsenic minéral a eu lieu principalement dans les tissus riches en protéines

qui ont le groupement sulfhydrile. Ces protéines se retrouvent par exemple dans les cheveux,

les ongles et la moelle osseuse (Nielsen et Uthus, 1981). En revanche, après l’arrêt du

traitement, la quantité d’arsenic dans les cheveux et les ongles a tendance de diminuer alors

que l’excrétion urinaire de l’arsenic continue. Cette excrétion urinaire journalière reste

relativement faible (1 % à 8 %) et la quantité excrétée dans l’urine est nettement inférieure à

celle dans les fèces. Ceci confirme l’hypothèse de Nielsen et coll., (1981) selon laquelle

l’appareil gastro-intestinal est l’un des principales voies d’excrétion de l’arsenic minéral.

Une étude comparative entre les voies d’administration orale et intraveineuse de

trioxyde d’arsenic a été réalisée sur des patients atteints de la leucémie myéloïde aiguë. Ces


9

patients ont reçu une dose de 10 mg d’As2O3 par voie intraveineuse au 1er jour de traitement

(Kumana et coll., 2002). Le traitement a été poursuivi par voie orale à la même dose (10 mg/j).

Cette étude a permis de montrer que la biodisponibilité de l’As2O3 était similaire pour les

deux voies d’administration. En conséquence, la voie orale semble préférable et moins

couteuse pour le patient.

1.4. Intérêt thérapeutique du trioxyde d’arsenic sur les leucémies

1.4.1. Leucémie de type LAM3

Le terme leucémie a été proposé pour désigner des maladies caractérisées par une

production exagérée des précurseurs des leucocytes (du grec. leukos, blanc et haima, sang)

(Virchow, 1845). Aujourd'hui, les leucémies rassemblent divers "cancers de globules

sanguins" présents à la fois dans le sang et dans la moelle osseuse qui les produit. Elles

présentent des aspects différents selon deux caractères principaux : le type de cellules

concernées et l'évolution aiguë ou chronique.

La leucémie aiguë promyélocytaire (LAM3 dans la classification internationale FAB

France, Amérique, Grande-Bretagne) est caractérisée par la présence de cellules malignes qui

ressemblent à des promyélocytes, cellules intermédiaires de la lignée granulocytaire. Les

cellules sont bloquées à ce stade de maturation et ont un aspect anormal avec de nombreux

bâtonnets appelés corps d’Auer. Elles vont progressivement envahir la moelle osseuse et

asphyxier les lignées cellulaires normales. Par ailleurs, les leucémies sont souvent associées à

des translocations chromosomiques impliquant les gènes clés de la différenciation cellulaire.

La translocation à l’origine de la leucémie aiguë promyélocytaire a été caractérisée il y a dix

ans. Elle correspond à la translocation réciproque t (15 ; 17) (q22 ; q21) conduisant à la

formation de deux gènes de fusion PML1-RARα (retrouvé chez tous les patients) et RARα-

PML (présent chez la plupart d’entre eux). En effet, la protéine PML contribue au contrôle de

la prolifération et de la survie cellulaire (Mu et coll., 1994 ; Koken et coll., 1995 ; Wang et

coll., 1998 b). Alors que la protéine RARα2 est un des récepteurs de l’acide rétinoïque (AR) et

appartient à la classe des récepteurs nucléaires.

1 PML : Promyelocytic leukemia 2 RARα : retinoic acid receptor-α


10

1.4.2. Etudes cliniques

Les effets thérapeutiques du trioxyde d’arsenic ont été évalués sur les patients atteints

de LAM3. Chez ces patients en rechute, le taux de rémissions complètes était de 90 % après

traitement par l’As2O3 (10 mg/j) (Shen et coll., 1997). Il a même été constaté que de faibles

doses en trioxyde d’arsenic (0,06 à 0,2 mg/kg/j) suffisent pour induire 92 % de rémissions

complètes (Soignet et coll., 1998). Par ailleurs, les travaux de Niu et coll., (1999) ont montré

que le taux de rémissions complètes était de 72,7 % chez les patients atteints de LAM3

nouvellement diagnostiqués, alors que ce taux était de 85,1 % chez les patients en rechute. En

conséquence, il a été suggéré que le trioxyde d’arsenic peut aussi être inclus dans un

programme de traitement de maintenance ou de consolidation avec d’autres principes actifs

(ATRA et autres chimiothérapies). Soignet et coll., (2001) ont également publié que le

trioxyde d’arsenic permet d’obtenir une rémission complète (85 %) chez les patients atteints

de la LAM3 et en rechute. Enfin, malgré ces effets bénéfiques du trioxyde d’arsenic, ce

composé possède un profil de toxicité important même lorsqu’il est utilisé à des doses

thérapeutiques (neutropénies, thrombocytopénies, hyperglycémies, fièvre, dyspnées, douleurs

osseuses, arthralgies, etc.).

1.5. Mécanisme d’action

Dans les années 1990, il a donc été constaté que les patients atteints de LAM3

résistants à l’ATRA (acide tout-trans rétinoïque) et à la chimiothérapie manifestaient une

rémission complète après traitement par l’As2O3. Il en a été déduit que l’As2O3 agissait par un

mécanisme d’action différent de celui de l’ATRA. Plusieurs travaux ont tenté de mettre en

évidence ce mécanisme d’action original. Les travaux de Chen et coll., (1996) ont montré que

le trioxyde d’arsenic pouvait induire l’apoptose ou favoriser la différenciation des cellules de

la lignée cellulaire NB4 de LAM3 (figure 1). Ces deux effets sont dépendants de la dose et de

la durée de traitement. Les concentrations en As2O3 comprises entre 0,5 et 2 µmol/l

engendrent des changements morphologiques et la fragmentation de l’ADN caractéristiques

de l’apoptose. Alors que de faibles concentrations (0,1 - 0,25 µmol/l) entrainent une

différenciation partielle des cellules NB4 au bout de 10 jours. En clinique, il est également

connu que de faibles concentrations en arsenic peuvent stimuler l’hématopoïèse. Ceci était

autrefois considéré comme un effet bénéfique pour l’homme (Soignet et coll., 1998).


11

Figure 1 — : Mécanismes d’action possibles du trioxyde d’arsenic sur la leucémie aiguë

promyélocytaire (LAM3), d’après Waxman et Anderson, (2001).

1.5.1. Induction de l’apoptose

De point de vue moléculaire, le mécanisme d’induction de l’apoptose par le trioxyde

d’arsenic (As2O3) sur la lignée cellulaire NB4 de LAM3 a été décrit par Chen et coll., (1996).

Il semblait être associé à la régulation de l’expression du gène bcl-2 et à la modulation des

protéines PML-RARα/PML.

La protéine bcl-23 contrôle le mécanisme d’apoptose en jouant le rôle d’antioxydant.

Des auteurs ont montré que les cellules surexprimant le gène bcl-2 sont plus résistantes à

l’apoptose induite par un stress oxydatif, par exemple l’exposition au peroxyde d’hydrogène

ou à la ménadione4 (Hockenbery et coll., 1993). Par ailleurs, cette protéine peut former un

hétérodimère (bcl-2/bax) avec la protéine bax5 ce qui a un effet antagoniste sur bcl-2 et

consécutivement l’induction de l’apoptose (Oltvai et coll., 1993 ; Krajewski et coll., 1994). Il

a également été montré que l’As2O3 module les taux d’ARNm et des protéines bcl-2, ainsi un

faible ratio bcl-2 / bax peut contribuer à l’induction de l’apoptose des cellules NB4 (Chen et

coll., 1996).

3 Bcl-2 : B-cell lymphoma 2, protéine anti-apoptotique 4 Ménadione : cétone aromatique polycyclique 5 Bax : protéine pro-apoptotique


12

D’autre part, l’As2O3 peut stimuler l’apoptose des cellules NB4 en induisant la

dégradation de la protéine de fusion PML-RARα et ceci en ciblant la protéine PML (Gianni et

coll., 1998). Ce mécanisme ne parait pas fondamental. En effet, d’autres auteurs ont observé

que l’As2O3 inhibe la croissance et induit l’apoptose des lignées cellulaires de leucémies

myéloïdes indépendamment de l’expression de PML et de PML-RARα. L’apoptose a été

observée sur les cellules NB4 (expriment la protéine de fusion PML-RARα), mais aussi sur

les cellules leucémiques U937 (myélomonocytique) et HL60 (myéloblastique) (n’expriment

pas la protéine de fusion PML-RARα) (Wang et coll., 1998 a), ainsi que sur les cellules

leucémiques lymphoïdes (lymphocytes T) (Ishitsuka et coll., 1997). L’activité cytotoxique du

trioxyde d’arsenic n’est donc pas spécifique aux cellules NB4 de leucémie aiguë

promyélocytaire.

1.5.2. Effet sur le système enzymatique

Depuis les années 1980, on sait que l’As2O3 a une affinité avec le groupement thiol (-

SH) de certaines protéines (Tappel, 1984). Parmi ces protéines, les enzymes qui régulent les

concentrations cellulaires en peroxyde d’hydrogène (H2O2) ont un rôle particulièrement

important. Dans les cellules NB4, les taux cellulaires de ces enzymes [glutathion peroxydase

(GPx), catalase, glutathion-S-transférase π (GSTπ)] sont relativement faibles par rapport à la

lignée cellulaire U937. Ceci signifie que les cellules NB4 seront donc plus sensibles au

trioxyde d’arsenic du fait de leur faible capacité à métaboliser l’H2O2 produit sous stimulation

de l’As2O3 (Jing et coll., 1999).

Par ailleurs, dans les cellules NB4, le faible taux d’expression de l’enzyme GSTπ

réduit la détoxification cellulaire de l’As2O3 et l’augmentation consécutive du taux cellulaire

en arsenic contribue à inactiver la GPx. Ceci a pour effet d’augmenter très significativement

la concentration en peroxyde d’hydrogène cellulaire et d’entrainer une série d’événements

délétères [chute du potentiel de membrane mitochondrial, libération du cytochrome C6 dans le

cytoplasme, activation de la caspase-3, fragmentation de l’ADN et enfin changements

morphologiques caractéristiques de l’apoptose] (figure 2) (Jing et coll., 1999). Bien que de

nombreux effets moléculaires du trioxyde d’arsenic aient été identifiés, son mécanisme

d’action précis n’est que partiellement connu.

6 Cytochrome C : protéine associée à la membrane interne de la mitochondrie


13

Figure 2 — : Diagramme représentant la voie apoptotique possible induite par le trioxyde d’arsenic (As2O3) sur les cellules NB4, d’après Jing et coll., (1999). SOD : superoxyde dismutase, GPx : glutathion peroxydase, GST : gluthation-S-transférase

1.6. Métabolisme

Récemment, il a été montré que le trioxyde d’arsenic administré par voie intraveineuse

à des patients atteints de LAM3, se métabolise en composés méthylés (MAAV et DMAAV) qui

ont été identifiés dans le plasma (Fujisawa et coll., 2007). Des composés arsenicaux

inorganiques (AsIII et AsV) ont été également détectés dans le plasma. A noter que la

méthylation de l’arsenic inorganique est une réaction importante qui permet d’augmenter sa

solubilité et de diminuer sa toxicité. L’arsenite (AsIII) est méthylé par l’enzyme arsenite

méthyle transférase (Zakharyan et coll., 1995). Dans cette réaction, le groupement thiol est

nécessaire pour l’activité enzymatique et c’est la S-adénosyle méthionine (SAM) qui est le

donneur du groupement méthyle.

Par ailleurs, le degré de l’oxydation de l’arsenic influence la toxicité et le processus de

détoxification. L’arsenate (AsV) peut remplacer le phosphate dans certaines réactions in vivo,

ainsi il diminue l’énergie stockée dans la cellule en inhibant la formation d’ATP pendant la

glycolyse (Bhuvaneswaran, 1979). D’autre part, l’arsenite (AsIII) est nettement plus toxique


14

du fait de sa forte affinité pour le groupement thiol et spécialement aux thiols vicinaux des

protéines. Ainsi, il peut inhiber certaines enzymes qui possèdent ce groupement dans leur site

actif, par exemple : la thiolase et la glutathion réductase (Zakharyan et coll., 1995). De ce fait,

le mécanisme de détoxification de l’arsenic trivalent inorganique a été étudié in vitro par

Aposhian et coll., (2003). En effet, il a été montré que le peroxyde d’hydrogène peut jouer un

rôle dans l’oxydation des composés arsenicaux trivalents (AsIII, MMAIII, DMAIII) en

composés pentavalents moins toxiques (figure 3). In vivo, le peroxyde d’hydrogène est généré

et détruit d’une manière continue. La réaction de la xanthine oxydase n’est pas la seule

productrice de H2O2. La dismutation du radical superoxyde par l’enzyme superoxyde

dismutase peut aussi générer l’H2O2. Les autres sources de H2O2 sont la NADH-NADPH

oxydase (Thannickal et Fanburg, 1995), les peroxysomes (Tamura et coll., 1990), l’aldéhyde

oxydase (Hille, 1996). Toutes les réactions d’oxydation réalisées jusqu’à présent avec le

peroxyde d’hydrogène sont effectuées in vitro. Néanmoins, d’autres essais devraient être

effectués in vivo pour déterminer la signifiance de ces résultats.

Figure 3 — : Structure chimique des composés arsenicaux inorganiques et méthylés. D’après Aposhian et coll., (2004).


15

2. Mélarsoprol

2.1. Historique

Dans les années 1930, la tryparsamide était utilisée dans le traitement de la

trypanosomiase africaine (Pearce, 1925), mais de nombreux cas de résistance sont apparus.

Ceci a nécessité la commercialisation de nouveaux composés. L’oxyde de mélarsène est un

dérivé trivalent du mélarsène qui a été synthétisé par Friedheim en 1939. Il s’est montré actif

sur la maladie du sommeil (trypanosomiase) au niveau des deux stades de la maladie (hémato-

lymphatique et méningo-encéphalique) (Friedheim, 1948). Les nombreuses recherches sur les

composés arsenicaux à groupement mélamine ont aboutit à la synthèse d’un nouveau

composé désigné “Mel B” ou mélarsoprol (figure 4), obtenu de la complexation de l’oxyde de

mélarsène et du dimercaptopropanol. Il était toléré à des doses significativement plus élevées

que l’oxyde de mélarsène. Ceci a permis d’administrer des doses assez importantes chez les

patients atteints de la trypanosomiase et ainsi de réduire la durée du traitement (Friedheim,

1949 b).

En 2001, Sanofi-Aventis a signé avec l’OMS un accord de partenariat et s’est engagé à

fournir de l’Arsobal® (mélarsoprol) dans les pays affectés. En pratique, il est administré par

voie intraveineuse en solution à 3,6 % dans du propylène glycol. L’efficacité du mélarsoprol

est importante mais son utilisation est limitée par des effets indésirables qui peuvent être

dramatiques. La complication majeure causée par ce composé est l’encéphalopathie réactive

qui survient dans 2 % à 10 % des cas et devient parfois fatale (mortalité : 50 % des cas).

L’origine de ce syndrome reste un sujet de controverse, mais l’hypothèse d’une réponse

immunitaire a été suggérée (Haller et coll., 1986 ; Hunter et coll., 1992).

Figure 4 — : Structure chimique du mélarsoprol


16

2.2. Propriétés physico-chimiques

La formule chimique du mélarsoprol est C12H15AsN6OS2 ; sa masse molaire est 398,34

g/mol. Le mélarsoprol est insoluble dans l’eau, l’éthanol et le méthanol, mais soluble dans du

propylène glycol. Son pka est de 4,8 (Keiser et Burri, 2000). Le coefficient de partage

octanol/tampon à pH 7 du mélarsoprol mesuré par spectrométrie UV (λ = 279 nm) est égal à

40. Ceci indique sa forte lipophilie.

2.3. Propriétés pharmacocinétiques

La pharmacocinétique du mélarsoprol a été étudiée chez l’homme. A pH

physiologique (pH 7,4) seulement 0,2 % du mélarsoprol est non-ionisée. Cette partie peut

ainsi traverser la barrière hémato-encéphalique (Keiser et Burri, 2000). Les concentrations

plasmatiques du mélarsoprol mesurées chez les patients traités avec des doses croissantes (1,2

mg/kg à 3,6 mg/kg en I.V.) sur 4 jours, varient entre 2 à 4 µg/ml (concentrations mesurées 24

h après administration). Tandis qu’après 120 h, ces concentrations restent supérieures à 0,1

µg/ml. Les concentrations retrouvées dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) sont 50 fois

inférieures aux concentrations plasmatiques (Burri et coll., 1993). Cette faible concentration

mesurée dans le LCR semble être liée à la fixation importante du mélarsoprol aux protéines et

à son état d’ionisation.

Les paramètres pharmacocinétiques du mélarsoprol ont été déterminés chez des

patients qui ont reçu 10 doses de 2,2 mg/kg en mélarsoprol délivrées avec un intervalle de 24

h. Le temps de demi-vie déterminé par CLHP était inférieur à 1 heure alors qu’il était de 35

heures par les techniques de bioanalyse et de la spectroscopie d’absorption atomique

(mesurant la quantité en arsenic "élément"), ce qui indique l’existence de métabolites (figure

5). Un seul métabolite du mélarsoprol a été identifié par CLHP, il s’agit de l’oxyde de

mélarsène. La concentration plasmatique maximale de ce métabolite était atteinte à 15 min

après administration du mélarsoprol. Sa clairance et sa demi-vie sont respectivement 21,5

ml/min/kg et 3,9 heures (Keiser et coll., 2000).


17

Figure 5 — : Concentrations sériques de l’oxyde de mélarsène et du mélarsoprol en fonction du temps, déterminées par chromatographie liquide à haute performance et comparées à celles de l’arsenic déterminées par bioanalyse et par spectroscopie d’absorption atomique (SAA). D’après Keiser et coll., (2000).

2.4. Mécanisme d’action sur les cellules leucémiques

Parallèlement aux tests de l’activité du trioxyde d’arsenic inorganique sur les cellules

leucémiques, ceux réalisés avec le mélarsoprol ont montré que cet organoarsénié était plus

actif sur les lymphocytes B de la leucémie lymphoïde chronique. Ainsi, le mélarsoprol

induisait l’apoptose de ces cellules. Cet effet était associé à une importante diminution ou à

une perte de l’expression de bcl-2 observée au niveau de taux d’ARNm et de protéines (Konig

et coll., 1997). Wang et coll., (1998 a) ont également montré que le mélarsoprol induisait

l’apoptose sans altérer les protéines PML et PML-RARα et qu’il agissait indifféremment sur

les cellules NB4 de LAM3 (expriment la protéine PML-RARα) et les lignées cellulaires

myéloïdes HL60 et U937 (n’expriment pas la protéine PML-RARα). L’activité

antileucémique du mélarsoprol n’est donc pas limitée aux lignées cellulaires myéloïdes.


18

2.5. Etudes cliniques

De nombreux travaux réalisés in vitro ont révélé que le trioxyde d’arsenic et le

mélarsoprol avaient une importante activité antileucémique sur les lignées cellulaires

lymphoïdes et myéloïdes. A regard de ces résultats, Soignet et coll., (1999) ont réalisé une

étude clinique sur le mélarsoprol afin d’évaluer sa pharmacocinétique et son efficacité sur les

leucémies (LAM3, LMC, LLC) réfractaires ou résistantes. Les patients ont reçu des doses

croissantes (1 mg/kg à 3,6 mg/kg) par voie intraveineuse 3 jours par semaine, pendant 3

semaines. Les concentrations plasmatiques obtenues après l’injection ont varié de 1,2 µg/ml

au 1er jour à 2,4 µg/ml au 3ème jour et le temps de demi-vie d’élimination était de 15 min. A

l’issue de ce traitement 3 patients sur 8 ont montré des signes de toxicité neurologique à la

2ème semaine. Cette neurotoxicité a suspendu l’utilisation du mélarsoprol en clinique.

Actuellement, le mélarsoprol ne peut pas remplacer le trioxyde d’arsenic qui reste le

traitement de choix de la leucémie aiguë promyélocytaire réfractaire (Soignet et coll., 1998).

2.6. Voie d’élimination

Les caractéristiques d’élimination de certains composés organoarséniés ont été

étudiées chez le rat. Dans le cas du mélarsoprol et de l’oxyde de mélarsène, l’élimination est

fortement lente. L’élimination globale en 24 h [(As urinaire + As biliaire) x 100/ As injecté]

est de 40 %, l’excrétion est essentiellement biliaire. La lenteur de leur élimination jointe à leur

caractère peu polaire plaident en faveur d’une biotransformation préalable (Cristau et coll.,

1973). Chez le Cobaye, l’excrétion du mélarsoprol (20,33 %) est significativement inférieure

à celle chez le rat (Cristau et coll., 1975).

Les essais cliniques menés chez l’homme ont également montré que l’élimination du

mélarsoprol était relativement lente (t1/2 vie = 35 h) (Burri et coll., 1993) et que son excrétion

urinaire est mineure (Nodenot et coll., 1960 ; Harrison et coll., 1997). L’oxyde de mélarsène

est le seul métabolite du mélarsoprol qui a été identifié (Keiser et coll., 2000). Ce métabolite

peut être formé à partir d’une simple hydrolyse du mélarsoprol (Bronner et coll., 1998).

Néanmoins, l’incubation du mélarsoprol dans du sérum in vitro à température ambiante a

montré une hydrolyse assez lente avec une demi-vie de 3 jours (Ericsson et coll., 1997). Par

conséquent, il est possible que le mélarsoprol puisse aussi être hydrolysé par une réaction

enzymatique.


19

Plus récemment, les travaux de Gregus et coll., (2000) ont montré que le glutathion

(GSH) joue un rôle important dans le transport hépatobiliaire du mélarsoprol chez le rat. En

effet, ce dithiarsolane est essentiellement éliminé dans la bile sous forme de mélarsène-

diglutathion, ainsi son excrétion est partiellement dépendante du taux du glutathion hépatique

(figure 6). Ce complexe mélarsène-diglutathion est réabsorbé et suit un cycle entérohépatique.

Enfin, le mélarsoprol peut également être excrété dans la bile sous forme de glucuronide de

mélarsoprol (Gregus et Gyurasics, 2000).

Figure 6 — : Métabolites du mélarsoprol retrouvés dans la bile de rat, d’après Gregus et coll., (2000).


20

3. Arsthinol

3.1. Historique

Depuis l’introduction des antibiotiques dans le traitement de dysenterie amibienne7, la

thérapie de l’amibiase s’est redirigée vers les composés dont l’activité est dépendante de leur

contenu en arsenic, en bismuth, en iode ou en émétine. Dans les années 1950, l’activité de

l’arsthinol, un nouveau organoarsénié trivalent a été testée sur des patients atteints du pian8 et

également d’une amibiase. Chez ces patients, il y a eu disparition du parasite après

administration de l’arsthinol par voie orale. De plus, aucun signe de toxicité ou d’intolérance

n’a été observé au cours du traitement (Loughlin et coll., 1954). Cette absence de toxicité

confirme les observations de Friedheim, (1949 a) qui avait synthétisé l’arsthinol en 1949 et

qu’il l’avait testé sur des patients atteints de pian (framboesia tropica). Ce dithiarsolane avait

auparavant été parfaitement bien toléré par les animaux de laboratoire dans le cadre de l’étude

de sa toxicité aiguë et chronique (Loughlin et coll., 1954).

L’arsthinol a été désigné par le nom de "STB" et ensuite a été commercialisé sous le

nom de Balarsen® par Endo Products, Inc., Richmond Hill, New York (Anonyme, 1953). Cet

organoarsénié est formé à partir de la réaction de l’acide 3-acétamido-4-hydroxy-acide

phénylarsonique avec le 2,3-dimercaptopropanol (BAL; British Anti Lewisite). L’arsthinol

était le composé le plus efficace en dermatologie et dans le traitement des infections

intestinales.

3.2. Synthèse et préparation

La méthode de synthèse des dithiarsolanes a été mise au point par E.A.H. Friedheim

en 1949. Cette synthèse consiste à mélanger le composé organométallique avec du

thioglycolate d’ammonium en milieu liquide à la température de 50 °C. Ensuite, la réaction de

condensation de l’arsènoxyde avec le dimercaptopropanol (BAL) a lieu spontanément à

température ambiante (figure 7) (Gibaud et coll., 2006).

7 Dysenterie amibienne : infection de l’intestin causée par l’amibe Entamoeba histolytica 8 Pian : tréponématose endémique causée par Troponema pallidum pertenue, entrainant des lésions cutanées


21

Figure 7 — : Schéma de synthèse des phényldithiarsolanes d’après Friedheim, (1953) (Gibaud et coll., 2006).

3.3. Propriétés physico-chimiques La formule chimique de l’arsthinol est C11H14AsNO3S2 et sa masse molaire est 347,27

g/mol. Il contient 21,6 % d’arsenic. Il s’agit d’une molécule cyclique : 2-(3-acetamido-4-

hydroxy-phényl)-1,3-dithia-2-arsacyclopentane-4-méthanol (figure 8). L’arsthinol est une

poudre microcristalline blanche, incolore dont le point de fusion est de 166 °C (Anonyme,

1953). Il est très peu soluble dans l’éther et l’eau (0,32 g/l à 25°C) et moins de 1 % d’arsthinol

dissous est ionisé (Hiskey et Cantwell, 1968). Cependant, l’arsthinol est soluble dans certains

solvants organiques comme le propylène glycol. Le pKa est de 9,5 ± 0,1 et la lipophilie de

l’arsthinol exprimée par le coefficient de partage (log P) est de 2,34 (Gibaud et coll., 2006).

Figure 8 — : Structure chimique de l’arsthinol


22

3.4. Intérêt thérapeutique

L’arsthinol a été utilisé dans un premier temps dans le traitement du pian (Friedheim,

1949 a). Ensuite, dans les années 1954, il a été prescrit dans le traitement de l’amibiase. Ce

dithiarsolane était considéré comme non toxique quand il était administré par voie orale aux

patients à une dose journalière de 15 mg/kg ou 20 mg/kg (pendant 10 ou 5 jours

respectivement). Ce traitement s’est avéré efficace en 6 semaines sur la disparition des kystes

du parasite des fèces (Loughlin et coll., 1954). De plus, aucun signe d’intolérance n’a été

constaté durant le traitement.

En dermatologie, l’arsthinol s’est montré plus actif que l’arsenite de potassium dans le

traitement du lichen plan9. Cette différence de réponse était en partie due à la biodisponibilité

(Goldman et coll., 1956). De plus, il a été constaté qu’une dose de 10 mg/kg en arsthinol était

bien tolérée et efficace.

Par ailleurs, les méthodes conventionnelles comme les rayons-X, les vaccins et

l’ACTH (adreno cortico tropic hormone) qui ont été utilisées dans le traitement de pustules

d’origine bactérienne étaient inefficaces, alors que la prescription du Balarsen® (arsthinol)

s’est révélé bénéfique et même curatif (Kuhn, 1956).

Récemment, l’activité cytotoxique de l’arsthinol a été mise en évidence sur des lignées

cellulaires leucémiques U937 (myélomonocytique) et K562 (érythroleucémique) en

comparaison avec le mélarsoprol et le trioxyde d’arsenic. En effet, son activité antileucémique

était nettement supérieure à cellule du mélarsoprol et du trioxyde d’arsenic (Gibaud et coll.,

2006). De plus, son index thérapeutique [DL50 chez la souris (µmol/kg)/CI50 sur cellules K562

ou U937 (µmol/l)] était plus élevé que celui du mélarsoprol et du trioxyde d’arsenic (tableau

1).

Enfin, ces résultats expérimentaux laissent supposer que le médicament

dithiarsolanique, l’arsthinol pourrait avoir un intérêt dans le traitement de leucémie. En effet,

les essais cliniques réalisés avec le mélarsoprol n’ont pas pu aboutir à cause des effets

neurotoxiques. Ces effets semblent beaucoup moins importants dans le cas de l’arsthinol.

9 Lichen plan : maladie auto-immune touchant en général la peau, la bouche ou parfois les deux


23

Tableau 1 : activité cytotoxique in vitro et dose létale 50 des différents dérivés de l’arsenic organique et inorganique, d’après Gibaud et coll., (2006).

Traitement CI50 K562 (µM)a CI50 U937 (µM)a DL50 (µmol/kg)b ITd

K562 U937

Arsthinol 1,44 ± 0,17 2,86 ± 0,23 402 ± 12 279,2 140,6

Mélarsoprol 2,81 ± 0,12 2,77 ± 0,11 112 ± 1 39,9 40,4

As2O3 24,95 ± 1,76 16,73 ± 1,54 57c 2,3 3,4

a : CI50 (concentration inhibant 50 % de la croissance cellulaire) obtenu après 48 h d’incubation b : DL50 (dose létal causant la mort de 50 % de population animale) obtenu chez la souris (n = 5 / dose) c : obtenu par Kreppel et coll., (1990) d : index thérapeutique DL50/CI50 K562 et U937 : lignées cellulaires leucémiques humaines

3.5. Voie d’élimination

Chez le rat, l’arsthinol est essentiellement éliminé par voie biliaire, cette excrétion en

24 heures est de 47,3 %. Ce résultat suggère que l’arsthinol devrait subir une

biotransformation en composés hydrosolubles avant son élimination.

En vue d’étudier l’influence de l’espèce animale sur l’excrétion de médicament

organoarsénié, l’arsthinol a été administré par voie intraveineuse au Cobaye. L’excrétion de

cet organoarsénié se fait aussi par voie biliaire comme chez le rat. Toutefois, il a été remarqué

que cette élimination est d’environ 1,5 fois plus importante chez le rat que chez le cobaye

(tableau 2). Ainsi, l’excrétion biliaire n’est que de 32 % chez le Cobaye à 8 heures après

injection (Cristau et coll., 1975).


24

Tableau 2 : Excrétion urinaire et biliaire de l’arsenic chez le Rat et le Cobaye après administration intraveineuse de l’arsthinol (dose d’arsenic injectée = 0,8 mg/kg), d’après Cristau et coll., (1975).

% excrété en 24 h (Rat) et 8 h (Cobaye) As biliaire/ As total x 100 (%) Bile Urine Total

Rats 47,3 5,07 52,2 89,4

Cobayes 32 20,21 52,21 61,3


25

II. Neurotoxicité des dérivés arsenicaux L’effet indésirable le plus redouté des dérivés arsenicaux est leur toxicité cérébrale.

Comme nous l’avons écrit en introduction, l’atténuation des concentrations d’arsenic dans le

SNC constitue l’un des objectifs principaux de ce travail. Ce chapitre a pour but de décrire en

détail les différents effets de l’arsenic sur le système nerveux central, ainsi que les

mécanismes supposés de cette toxicité.

1. Arsenic inorganique

Les effets de l’exposition à l’arsenic peuvent se manifester dès les premières semaines

sur le SNC. Des encéphalopathies ont été décrites et se caractérisent par un handicap des

fonctions neurologiques comme l’apprentissage, la mémoire et la concentration (Bolia-Wilson

et coll., 1987). D’autre part, des neuropathies périphériques surviennent très fréquemment et

sont causées par une exposition chronique à l’arsenic (Mazumder et coll., 1992). Elles se

caractérisent par une faiblesse ascendante sévère similaire au syndrome de Guillain-Barré

(SGB10) nécessitant de la ventilation mécanique.

Des effets neurotoxiques sévères ont été également constatés chez les patients atteints

de LAM3 et traités au trioxyde d’arsenic (Soignet et coll., 2001). D’autres effets indésirables

peuvent aussi apparaitre comme un allongement de l’intervalle QT à l’électrocardiogramme

(Barbey et Soignet, 2001), des réactions cutanées et des désordres gastro-intestinaux (Cuzick

et coll., 1982).

2. Arsenic organique

La complication majeure lié à l’administration du mélarsoprol est l’encéphalopathie

arsenicale réactive (EAR) qui survient dans 2 % à 10 % des cas et devient fatale dans 50 % à

75 % des cas (Robertson, 1963 ; Sina et coll., 1977 ; Haller et coll., 1986). Chez les patients

atteints d’une trypanosomiase à la phase cérébrale, il est parfois difficile de distinguer cet

effet indésirable de l’effet du parasite. De plus, l’administration du produit peut entrainer une

réaction de type Jarisch-Herx-heimer et peut donc aggraver la symptomatologie (Haller et

coll., 1986). D’autres effets indésirables peuvent apparaitre comme les symptômes digestifs,

10 SGB : polyneuropathie aiguë inflammatoire démyélinisante déclenchée par un processus infectieux aigu


26

de la fièvre, la réaction cutanée, l’arthralgie, la granulocytose et la défaillance rénale et

hépatique (Rive et coll., 1973 ; Robertson, 1963). D’autre part, les analyses toxicologiques

ont montré que l’arsenic s’accumule d’une manière importante dans la moelle épinière par

rapport au nerf périphérique. Ce résultat a permis ainsi de confirmer l’hypothèse selon

laquelle la neuropathie causée par l’arsenic se manifeste par une démyélinisation proximale

initiale et par l’apparition retardé de dommage axonal distal (Gherardi et coll., 1990).

Dans le cas de l’arsthinol, l’administration d’une dose supérieure à 10 mg/kg/j peut

entrainer des effets toxiques. Ainsi, les doses élevées (> 15 mg/kg) ont eu de l’effet sur le

système nerveux central avec l’apparition de la fièvre et de la leucopénie. Alors que, de

faibles doses peuvent avoir dans 6 % des cas une toxicité cutanée et gastro-intestinale (Most

et coll., 1954).


27

III. Particules colloïdales et passage des barrières biologiques

Rappelons que l’objectif de notre travail est d’améliorer la solubilité de l’arsthinol en

milieu aqueux, d’éviter l’utilisation de solvants organiques et d’améliorer la distribution

tissulaire (augmentation de la concentration médullaire et diminution de la concentration

cérébrale).

Après avoir montré précédemment l’intérêt de l’arsthinol en thérapeutique, nous allons

décrire dans ce chapitre la formulation galénique que nous avons utilisé : les nanosuspensions.

Nous allons ensuite détailler les mécanismes de passage des particules colloïdales à travers les

barrières biologiques qui nous intéressent (BHM et BHE) après administration intraveineuse.

1. Nanosuspensions de principes actifs peu solubles

1.1. Introduction

La solubilité est un facteur essentiel pour l’efficacité de principes actifs

indépendamment de la voie d’administration. Les approches conventionnelles utilisées pour

améliorer la solubilité ont une applicabilité limitée, en particulier lorsque les principes actifs

sont peu solubles à la fois en milieux aqueux et non-aqueux.

La micronisation de la poudre de principes actifs est une technique utilisée depuis

plusieurs années pour réduire la taille des particules, elle se réalise à l’aide d’un microniseur

ou broyeur à jet. La taille des particules obtenue varie largement de 0,1 µm à 25 µm. Une

faible proportion de ces particules pourrait atteindre une taille inférieure à 1 µm (Müller et

coll., 1995). La micronisation permet d’augmenter la vitesse de dissolution de principe actif

grâce à l’augmentation de la surface. Néanmoins, cette approche n’était pas suffisante pour

surmonter le problème de la biodisponibilité de nombreux principes actifs peu solubles.

Une étape conséquente était de passer de la micronisation à la nanonisation. La

formulation galénique des nanoparticules polymériques chargées en principe actif a été

développée par Speiser et collaborateurs (Speiser, 1973 ; Couvreur et coll., 1979). Il s’agit de

nanoparticules polymériques solides et biodégradables dont la taille peut varier de 10 à 1000

nm (en général 50 - 300 nm) et sont généralement administrées par voie intraveineuse (Olivier,

2005). Grâce à cette formulation, il est devenu possible de cibler les principes actifs vers les

sites d’action désirés tout en évitant leur dégradation in vivo (ex : enzymatique) et également

d’obtenir une libération contrôlée de principe actif. L’obstacle majeur dans le développement

des nanoparticules était leur clairance rapide de la circulation sanguine.


28

Dans les années 1990, les nanocristaux (NanoCrystals®) ont été mis au point par

Liversidge et coll., (1991). Cette formulation qualifiée de 1ère génération est produite selon la

technique de désintégration. La suspension aqueuse [composée de la poudre de principe actif,

un stabilisateur et un milieu de dispersion (généralement de l’eau)] est introduite dans un

appareil de "Pearl milling". Les forces de cisaillement provoquent un haut degré de réduction

de la taille des particules. La production peut se dérouler pendant des heures sous une

température contrôlée (Patravale et coll., 2004). L’une des caractéristiques des nanocristaux

est leur composition de 100 % de principes actifs, il n’y a pas de matériel transporteur entant

que dans les nanoparticules polymériques. Ainsi, cette formulation est adaptée aux principes

actifs très peu solubles à la fois en milieux aqueux et organiques. Alors que, l’inconvénient

majeur est le risque de contamination de la production par des impuretés sous l’effet de

l’érosion des boulets (Junghanns et Müller, 2008). Récemment, certains principes actifs

développés selon la technologie NanoCrystals® ont été commercialisés (Rabinow, 2004)

(Müller et Keck, 2004) :

- Rapamune® est un médicament utilisé par voie orale pour prévenir le rejet aigu de

greffe rénale, commercialisé par Wyeth Pharmaceuticals.

- Emend® est un médicament antiémétique administré par voie orale, commercialisé par

Merck.

Par ailleurs, la production de particules colloïdales à l’aide d’un homogénéisateur à

haute pression conduit à l’obtention des nanosuspensions (DissoCubes®) qualifiée de 2ème

génération. Il s’agit d’une dispersion de nanocristaux de principes actifs dans des milieux

liquides, en général stabilisées par des agents tensioactifs ou de polymères (Junghanns et

Müller, 2008). Ces nanosuspensions ont été mises au point par Müller et coll., en 1994

(Müller et coll., 1998). Elles peuvent être produites soit à l’échelle du laboratoire ou dans le

cadre d’une production industrielle. Cette formulation est convenable pour résoudre le

problème de solubilité de principes actifs peu solubles. Elle est simple à préparer et

avantageuse par rapport à d’autres approches. Les nanosuspensions peuvent être délivrées par

divers voies y compris la voie orale, la voie parentérale, pulmonaire et oculaire.


29

1.2. Nanosuspensions

1.2.1. Production à l’échelle d’un laboratoire

Les nanosuspensions sont produites par homogénéisation grâce à des forces de

cavitation crées par l’homogénéisateur à haute pression (figure 9 a). La poudre de principe

actif est d’abord dispersée dans une solution aqueuse contenant un tensioactif à l’aide d’un

disperseur tournant à grande vitesse. Cette "macro-suspension" est ensuite forcée par un

piston dans l’interstice de l’homogénéisateur à haute pression réglé à la pression de 1500 bar.

En général, 20 cycles d’homogénéisation suffisent pour obtenir des nanosuspensions. La taille

des nanosuspensions obtenue par ce processus est inférieure à 1 µm, est dépend de la pression

de l’appareillage et du nombre de cycles. Elle est également affectée par la dureté de la

poudre. Par exemple, la taille moyenne des nanosuspensions de clofazimine11 est de 600 nm

(Peters et coll., 2000) et celle des nanosuspensions de RMKP2212 est de 540 nm (Müller et

coll., 1998).

(a) (b)

Figure 9 — : (a) schéma représentant le processus d’homogénéisation à haute pression (Patravale et coll., 2004), (b) image de l’homogénéisateur à haute pression Avestin EmulsiFlex®-B3 (Avestin, Inc., Ottawa, Canada).

11 Clofazimine : médicament antimicrobien, anti-inflammatoire 12 RMKP22 : 4-[N-(2-hydroxy-2-methyl-propyl)-ethanolamino]-2,7-bis (cis-2,6-dimethylmorpholin-4-yl)-6- phenyl-pteridine


30

Les homogénéisateurs généralement utilisés en laboratoire pour des petites

productions des nanosuspensions sont par exemple l’APV Micron LAB 40 (APV Deutschland

GmbH, Lübeck, Germany) et l’Avestin EmulsiFlex-B3 (volume de l’échantillon : 3,5 ml)

(Avestin Inc., Ottawa, Canada) (figure 9 b). La taille optimale des nanosuspensions produites

dépendra de la nature du principe actif et aura un impact sur les propriétés

biopharmaceutiques obtenues. Pour une dissolution rapide des nanosuspensions, une taille

inférieure à 200 nm est recherchée, alors que pour une dissolution prolongée la taille des

particules pourra être placée entre 800-1000 nm. En conséquence, la taille des

nanosuspensions doit être fonction du but recherché.

1.2.2. Propriétés des nanosuspensions

1.2.2.1. Caractéristiques

Les paramètres principaux qui caractérisent les nanosuspensions sont :

a. La taille

b. La charge de surface (potentiel zêta)

c. L’état de cristallisation

d. La vitesse de dissolution, la solubilité

La taille des nanosuspensions et leur distribution (indice de polydispersité) sont

généralement déterminées par la spectroscopie de corrélation de photons (SCP) (Müller et

Müller, 1984). Cependant, la charge de surface est une indication de la stabilité des

nanosuspensions en solution aqueuse. Cette charge est exprimée par le potentiel zêta (mV).

Pour une suspension stable, stabilisée par la répulsion électrostatique un potentiel zêta

minimum de ± 30 mV est nécessaire. En cas de stabilisation combinée électrostatique et

stérique des nanosuspensions, un potentiel zêta de ± 20 mV serait suffisant (Müller et coll.,

2001). La vitesse de dissolution est également un paramètre souvent pris en compte pour

évaluer l’intérêt des nanosuspensions en comparaison avec la formulation traditionnelle.

En cas d’administration par voie intraveineuse, l’hydrophobicité de la surface des

nanosuspensions peut avoir un impact important. En effet, ce paramètre affecte la distribution

des nanosuspensions vers les organes et détermine les interactions possibles avec les cellules

(Müller, 1991). L’hydrophobicité peut être déterminé par la technique de chromatographie


31

d’interaction hydrophobique (Müller et coll., 2001). Ainsi, elle peut être évaluée par

l’adsorption du colorant hydrophobe la Rose Bengale (test de Rose Bengale) à la surface des

nanoparticules en suspension (Müller et coll., 1997).

1.2.3. Modification des propriétés de surface

La biodistribution des nanosuspensions peut être améliorée en modifiant leur propriété

de surface. Il est possible de créer certaines propriétés de surface en produisant des

nanosuspensions avec des tensioactifs ou des polymères spécifiques [polysorbate,

poloxamer13, poloxamine (figure 10),…]. Le contrôle de la modification peut être effectué par

des mesures physiques comme la mesure de la charge de surface (potentiel zêta) ou l’analyse

des interactions hydrophobes par chromatographie (HIC) (Müller et coll., 2001). L’analyse de

l’adsorption des protéines plasmatiques sur les nanosuspensions peut également être effectuée

par la technique d’électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide (2-D PAGE)

(Gessner et coll., 2000).

Figure 10 — : Structure chimique du poloxamine, d’après Pitard et coll., (2004).

Par ailleurs, les propriétés de surface des nanosuspensions peuvent influencer

considérablement l’adsorption des protéines plasmatiques à leur surface. En effet, la clairance

de ces nanoparticules par les cellules du système de phagocytes mononuclées (SPM) peut

augmenter significativement avec l’augmentation de l’hydrophobicité de la surface (Edebo et

13 Poloxamer : polymère en bloc non-ionique composé d’une chaîne centrale hydrophobe de poly (oxyde de propylène), flanquée de deux chaînes hydrophiles de poly (oxyde d’éthylène)


32

Richardson, 1985). Par exemple, l’adsorption des opsonines : les immunoglobulines

(spécialement Ig G et Ig M), les facteurs du complément (spécialement C3b et C5) entrainent

la reconnaissance par les macrophages du SPM (Luck et coll., 1999). Alors que l’adsorption

des protéines : l’albumine ; les apolipoprotéines A-I, A-IV, C-III et H, permet de diminuer la

capture par les macrophages (Moghimi et coll., 1993).

1.2.4. Influence de la taille des particules

La distribution des particules colloïdales administrées par voie intraveineuse est

fonction de leur taille. Les nanoparticules de petites tailles sont capturées par les cellules du

système de phagocytes mononuclées du foie, de la rate et de la moelle osseuse (Illum et Davis,

1982). Dans le cas de particules de taille supérieure à 150 nm, la clairance hépatique par les

cellules de Kupffer est prédominante (60 - 90 % dans les 5 à 10 min). Deux à 20 %

s’accumulent dans la rate, des proportions variables dans les poumons et jusqu’à 1 % dans la

moelle osseuse (Kreuter, 1994).

Une étude réalisée chez le lapin a montré l’influence de la taille des nanosuspensions

d’oridonin 14 formulées avec le Pluronic® F-68 (poloxamer 188) tensioactif sur la

pharmacocinétique. Après administration intraveineuse, les nanosuspensions de 103 nm ont

des propriétés pharmacocinétiques et une biodistribution similaires à celles obtenues avec

l’oridonin en solution. De plus, ces nanosuspensions montrent une cinétique de dissolution

rapide in vitro (99,9 % de dissolution en 10 min). En revanche, les nanosuspensions de 897

nm ont une biodistribution différente de celle des nanosuspensions de 103 nm, ainsi qu’une

dissolution lente in vitro (85 % de dissolution en 2 h) (Gao et coll., 2008). Donc, la taille des

particules est un paramètre qui peut affecter significativement la distribution tissulaire des

nanosuspensions.

14 Oridonin : un diterpénoïde isolé de rubescens Rabdosia, a des effets pharmacologiques tels que anti- inflammatoire, anti-bactéries, anti-tumorales.


33

1.2.5. Applications thérapeutiques et propriétés biologiques

1.2.5.1. Administration par voie orale

Lorsqu’un principe actif est administré par voie orale, la biodisponibilité et finalement

l’efficacité dépendent de sa solubilité et de son absorption par l’appareil gastro-intestinal.

Ainsi, la faible solubilité in vitro de certains principes actifs représente une étape limitant leur

utilisation en thérapeutique. Cependant, l’administration des nanosuspensions par voie orale

permet de résoudre le problème de la solubilité à cause de leur adhésion sur les surfaces

biologiques à savoir l’épithélium de la paroi intestinale (Müller et coll., 2001). La "bio-

adhérence" des nanosuspensions peut être améliorée par l’utilisation de polymère muco-

adhésif dans la formulation (Kayser, 2001). Cette adhérence contribue non seulement à

améliorer la biodisponibilité mais également au ciblage des parasites qui subsistent dans le

tractus gastro-intestinal.

L’exemple d’atovaquone15 (Wellvone®) démontre l’intérêt de ce type de formulation.

Ce principe actif est utilisé dans le traitement de la pneumonie à Pneumocystis carinii chez les

patients atteints du VIH 16 . Ce médicament est aussi efficace dans le traitement de la

leishmaniose, mais qu’à des doses élevées. Il est administré par voie orale à une dose de 750

mg/j. La raison de l’administration d’une dose élevée d’atovaquone est sa faible absorption.

Lorsque des nanosuspensions d’atovaquone (figure 11) sont administrées par voie orale chez

des souris infectées par des Leishmania, une diminution importante du nombre de parasites

dans le foie a été observée (de 40 % à 15 %) avec une dose réduite à 7,5 mg/kg. Ce résultat

démontre clairement l’efficacité de cette formulation (augmentation de l’activité de 2,5 fois)

même après réduction de la dose administrée (de 22,5 mg/kg à 7,5 mg/kg) (Müller et coll.,

2001).

15 Atovaquone : substance chimique qui appartient à la classe des naphtalènes, médicament antiparasitaire 16 VIH : virus de l’immunodéficience humaine


34

Figure 11 — : Nanosuspension d’atovaquone observée par microscopie électronique à transmission (taille moyenne : 468 nm), d’après Müller et coll., (2001).

1.2.5.2. Voie d’administration intraveineuse

Les infections comme la tuberculose, la listériose, la leishmaniose et la toxoplasmose

sont causées par des parasites qui résident dans les macrophages du système de phagocytes

mononuclées. Les particules colloïdales (nanosuspensions, nanoparticules,…) sont

rapidement capturées par ces cellules, ce qui permet de concentrer le principe actif à

proximité des parasites. En effet, Peters et coll., (2000) ont constaté que les nanosuspensions

de clofazimine (préparées avec le Pluronic® F-68) s’accumulent plus dans le foie, la rate et les

poumons que les liposomes 17 après administration I.V. chez les souris infectées par

Mycobacterium avium. Cependant, certains parasites (par exemple : la trypanosomiase et la

toxoplasmose) peuvent se localiser dans le cerveau qui n’est pas un organe du SPM. Dans ce

cas, la formulation des nanosuspensions permet de cibler cet organe. En effet, les travaux de

Schöler et coll., (2001) ont montré qu’une amélioration du ciblage d’atovaquone vers le

cerveau dans le traitement de la toxoplasmose cérébrale a été obtenu dans un modèle murin

infecté par Toxoplasma gondii et ceci en utilisant la formulation des nanosuspensions

d’atovaquone.

17 Liposome : vésicule constituée d’un volume interne aqueux entouré d’une membrane lipidique


35

2. Rappel de la physiologie médullaire et passage des particules colloïdales

2.1. Moelle osseuse et barrière hémato-médullaire (BHM)

2.1.1. Rappel de la physiologie

La moelle osseuse est un tissu localisé dans la cavité intérieure des os et responsable

de la production des érythrocytes, des leucocytes et des plaquettes. Ces cellules sont

nécessaires pour le transport de l’oxygène, les réponses immunitaires et l’hémostase. Elle est

également riche en vaisseaux sanguins.

De point de vue structural, la moelle osseuse est divisée en trois compartiments (Porter et coll.,

1994) (figure 12) :

Un compartiment vasculaire médullaire constitué de capillaires et de sinus.

Un compartiment extravasculaire constitué d’une matrice extracellulaire, de cellules

du stroma et du parenchyme hématopoïétique. Ce compartiment est le site de

l’hématopoïèse.

La partie entre ces deux compartiments essentiellement formée par la paroi des sinus

constitue la barrière hémato-médullaire (BHM).

Os

Capillaires périostéaux

Moelle osseuse

Veine centrale

Artère nourricière

Sinus primaires

Os

Figure 12 — : Anatomie de la circulation sanguine dans la moelle osseuse. D’après Porter et coll.,(1994). Coupe longitudinale.

: sens du flux sanguin


36

La BHM forme une barrière entre le sang et la moelle qui contrôle le passage des

cellules formées dans le compartiment hématopoïétique vers le compartiment sanguin

périphérique (figure 13). Cette barrière règle également le passage inverse (du sang vers la

moelle osseuse) de certaines particules présentent dans la circulation (Moghimi et coll., 1990).

Généralement, il est considéré que la BHM est constituée de trois composants : l’endothélium,

une couche externe discontinue de cellules réticulaires adventices et une lame basale

discontinue. Les macrophages périsinusaux sont parfois considérés comme une quatrième

composante de la BHM (Tavassoli, 1977).

Figure 13 — : Schéma des différentes associations cellulaires constituant la moelle osseuse. Le sinus vasculaire est constitué d’un endothélium, d’une membrane basale et de cellules réticulaires adventices. Des cellules hématopoïétiques passent vers le compartiment vasculaire et un macrophage périsinusal émet des prolongements dans la lumière sinusale. L’îlot érythroblastique est constitué d’un macrophage entouré d’érythroblastes profondément insérés dans le cytoplasme. D’après Moghimi et coll., (1990).


37

2.1.2. Fonction réticulo-endothéliale

Même si la fonction principale de la moelle osseuse est l’hématopoïèse, cet organe

joue également une fonction réticulo-endothéliale qui permet la suppression des cellules

mortes, anormales et de toute autre particule exogène de la circulation sanguine. Les cellules

impliquées se situent au niveau de la paroi sinusale (macrophages périsinusaux) et au niveau

du parenchyme médullaire (macrophages).

Des macrophages qui émettent des extensions cytoplasmiques dans la lumière sinusale

ont été mis en évidence chez le lapin (Hussain et coll., 1989 ; Tavassoli, 1977). Ces

phagocytes, se trouvent directement au contact du sang et captent facilement les particules

circulantes. Ce système réticulo-endothélial (SRE) est synonyme du système de phagocytes

mononuclées (SPM).

2.2. Passage des particules colloïdales à travers la BHM

2.2.1. Aspect physiologique de la BHM

Le passage des particules colloïdales du sang vers la moelle osseuse a suscité un grand

intérêt pour la vectorisation d’agents thérapeutiques. Le premier obstacle physiologique

rencontré lors de l’administration de ces particules est celui de leur capture par d’autres

cellules du système de phagocytes mononuclées (SPM). Ce système est représenté par les

cellules de Kupffer dans le foie et par les macrophages dans la rate. Ainsi, ces phagocytes

sont facilement accessibles aux particules colloïdales par rapport à ceux de la moelle osseuse

(Porter et coll., 1994).

Les solutions qui ont été proposées pour contourner ce problème sont :

Le ciblage passif, qui consiste à réduire la capture des particules colloïdales par le

foie et la rate grâce à la modification des propriétés de surface des particules, ce

qui favorise leur clairance par la moelle osseuse (3ème organe majeur du SPM).

Le ciblage actif, en produisant des particules avec des ligands spécifiques à leur

surface et qui auront une affinité directe et spécifique avec la moelle osseuse par

rapport aux cellules du SPM des autres organes.


38

En 1968, Hudson et Yoffey ont étudié la capture des particules de charbon de 25 nm

par la moelle osseuse après administration intraveineuse chez le Cochon d’Inde (Hudson et

Yoffey, 1968).

Les particules ont été retrouvées 5 min après injection dans la lumière des vaisseaux sanguins

et seule une faible accumulation a été observée dans l’endothélium sinusal. Après 15 min, les

particules ont atteint le parenchyme médullaire. Après 3 h, les particules se localisaient à la

fois dans l’endothélium et dans les macrophages du parenchyme. Après 2 jours, les particules

sont significativement concentrées dans les macrophages. Enfin, après 14 jours, la plupart des

particules se retrouvaient dans les macrophages du parenchyme.

Ces observations permettent de confirmer que les particules sont captées par les cellules

endothéliales sinusales 5 min après injection (Hudson et Yoffey, 1968). Cependant, le passage

des particules vers le parenchyme n’est pas instantané, puisque seulement quelques particules

ont atteint le parenchyme après 15 min. Ceci signifie que ces particules sont transportées

directement à travers l’endothélium. D’après certains auteurs le transport des particules peut

être effectué par l’intermédiaire des cavéoles intracellulaires et des vésicules de pinocytoses

présentent dans l’endothélium sinusal (Florey, 1964 ; Moore et Ruska, 1957).

2.2.2. Modulation galénique et passage de la BHM

Les particules colloïdales administrées par voie intraveineuse sont naturellement

capturées par les cellules du SPM. Les cellules de Kupffer du foie et les macrophages de la

rate constituent 80 % - 95 % de cellules phagocytaires de ce système et captent la plus grande

partie des nanoparticules (Illum et Davis, 1987). D’autres cellules du SPM situées dans la

moelle osseuse jouent également un rôle important dans la capture des particules colloïdales

(Gibaud et coll., 1994 ; 1996). La faible capture des particules par la moelle osseuse est en

partie due au fait que cet organe ne représente qu’une petite fraction du système réticulo-

endothélial. De plus, le flux sanguin n’est que de 250 ml/min dans la moelle osseuse alors

qu’il atteint 1350 ml/min dans le foie (Rowland et Tozer, 1980).

Les travaux d’Illum et Davis, (1987) réalisés chez le lapin, ont montré qu’il est

possible d’obtenir une accumulation prépondérante de particules colloïdales de 60 nm dans la

moelle osseuse en utilisant des polymères tensioactifs : les poloxamers 338 et 407 comme

agent de surface (figure 14). En effet, le poloxamer 407 s’est révélé particulièrement efficace

en terme de spécificité médullaire que le poloxamer 338 tout en réduisant la capture hépatique

et splénique.


39

Figure 14 — : Structure chimique des poloxamers 338 et 407. D’après Moghimi et coll., (1990) a : poly (oxyde d’éthylène) ; b : poly (oxyde de propylène), MW : masse moléculaire

Le mécanisme de cette reconnaissance médullaire a été éclairci par la suite grâce aux

travaux de Porter et coll., (1992 b). Ces auteurs ont observé que les particules de taille

inférieure ou égale à 150 nm recouvertes de poloxamer 407 sont captées par les cellules

endothéliales sinusales de la moelle osseuse chez le lapin. Ainsi, il a été suggéré qu’à

l’encombrement stérique répulsive généré par le poloxamer 407 peut s’apposer une face

attractive spécifique. Cette attraction spécifique peut avoir lieu grâce à l’interaction directe du

poloxamer 407 avec certains récepteurs au sein de la paroi des cellules endothéliales sinusales

(Porter et coll., 1992 a).


40

3. Rappel de la physiologie de la BHE et passage des particules colloïdales

3.1. Physiologie de la Barrière hémato-encéphalique (BHE)

La BHE représente une barrière infranchissable pour la majorité de principes actifs.

Cette limitation d’accès au cerveau est due aux jonctions serrées qui sont localisées entre les

cellules endothéliales de l’endothélium capillaires du cerveau. Ainsi, à la présence de

systèmes de transport actif des molécules appelés "transporteurs-ABC"18 (ex : la P-gp19)

localisés dans la membrane luminale des cellules endothéliales (Kreuter, 2005). Les astrocytes

sont associées aux cellules endothéliales et participent à la formation de la BHE (figure 15).

Les jonctions serrées permettent de prévenir le transport paracellulaire de principes actifs,

tandis que les transporteurs-ABC sont responsables de l’efflux de substrats des cellules

endothéliales vers le compartiment sanguin (Begley, 1996). L’intégrité de la BHE est

maintenue grâce aux jonctions serrées. Ces jonctions peuvent être transitoirement ouvertes

sous l’action de la pression osmotique qu’on augmente parfois expérimentalement pour

favoriser la délivrance de principes actifs au cerveau (Rapoport et coll., 1978). A l’inverse,

l’ouverture de la barrière pose un risque lié à l’entrée des toxines qui peuvent entrainer des

dommages au cerveau (Greig, 1989).

18 Transporteurs-ABC : transporteurs-ATP Binding Cassette 19 P-gp : glycoprotéine-P, est un récepteur transmembranaire de la membrane plasmique qui appartient à la superfamille des transporteurs-ABC


41

Figure 15 — : Représentation schématique de la barrière hémato-encéphalique (BHE). La barrière hémato-encéphalique est formée par les cellules endothéliales des capillaires sanguins et est caractérisée par l'existence de jonctions serrées. Les prolongements astrocytaires associés aux cellules endothéliales participent à la formation de la barrière hémato-encéphalique (www.virologie.free.fr/documents/virologie).

3.2. Passage des particules colloïdales à travers la BHE

De nombreux travaux ont déjà porté sur le développement de stratégies de ciblage du

cerveau avec les agents thérapeutiques hydrophiles comme les antibiotiques, les anticancéreux

et les neuropeptides, qui traversent très difficilement la barrière hémato-encéphalique (BHE)

(Tamai et Tsuji, 1996). Par exemple, des nanoparticules de polybutylcyanocrylate (PBCA)

recouvertes de tensioactif non-ionique polysorbate 80 (Tween 80®) (figure 16), ont été

utilisées avec succès par Alyautdin et coll., (1998) et par Kreuter et coll., (1995 ; 1997) pour

le transport de différentes molécules vers le système nerveux central.


42

Figure 16 — : Structure chimique du polysorbate 80 (www.polysorbate.jp).

Récemment, il a été montré que la dalargine, un peptide analogue à la leu-enképhaline,

a un effet analgésique puissant après administration intra-cérébro-ventriculaire, alors que son

effet est très faible par voie intraveineuse (Kreuter et coll., 1997). Lorsque ce peptide est

adsorbé sur les nanoparticules de PBCA (230 nm) recouvertes de polysorbate 80, il induisait

un effet analgésique important 15 min après injection intraveineuse chez des souris (Kreuter

et coll., 1997). Un effet analgésique significatif est également observé avec les nanoparticules

de dalargine recouvertes de polysorbates 20, 40 et 60 par rapport à d’autres tensioactifs

(poloxamers 184, 188, 388, 407 et poloxamine 908). Par contre, aucun effet n’a été obtenu

après injection de dalargine adsorbée sur des nanoparticules de PBCA. Cette étude confirme

les résultats obtenus par Tröster et coll., (1990) chez le rat. En effet, il a été constaté une

accumulation importante dans le cerveau des nanoparticules de poly (méthyle méthacrylate)

(131 nm) recouvertes de polysorbates 80 20 et 60 par rapport à d’autres tensioactifs

(poloxamers, poloxamines).

L’explication de cette spécificité des polysorbates à améliorer le transport des

nanoparticules à travers la BHE a été étudiée et serait liée à l’apolipoprotéine E (apo E). Cette

protéine joue un rôle important dans le transport des lipoprotéines LDL21 vers le cerveau.

Ainsi, après injection I.V. des nanoparticules recouvertes de polysorbate, l’adsorption de l’apo

E plasmatique à leur surface favorise l’interaction avec le récepteur au LDL et ensuite

l’endocytose des nanoparticules (Kreuter, 2001 ; Kreuter et coll., 2002). Elles miment ainsi le

mécanisme naturel de capture des lipoprotéines par le récepteur présent sur les cellules

endothéliales des capillaires cérébraux.

20 Polysorbate 80 : surfactant non-ionique et émulsifiant dérivé de sorbitane polyéthoxylés et de l’acide oléique, sa formule moléculaire est C64H124O26 21 LDL : lipoprotéines de basse densité


43

A l’issue ces résultats, il a été suggéré que les mécanismes de transport possibles des

nanoparticules à travers la BHE peuvent être :

- L’endocytose des nanoparticules par les cellules endothéliales des capillaires

cérébraux par l’intermédiaire du récepteur au LDL localisé au niveau de ces

cellules. Ensuite, une libération du principe actif dans ces cellules et une diffusion

dans le cerveau.

- La transcytose22 par passage des nanoparticules à travers les cellules endothéliales.

Par ailleurs, des nanoparticules de PBCA chargées de doxorubicine et recouvertes de

polysorbate 80 ont été également utilisées comme stratégie pour cibler cet agent

anticancéreux vers le cerveau. En effet, cette formulation a permis d’augmenter

significativement les concentrations cérébrales de l’anthracycline après administration

intraveineuse chez le rat (figure 17) (Gulyaev et coll., 1999). De ce fait, il a été suggéré un

autre mécanisme de passage des nanoparticules à travers la BHE et qui est en relation avec la

glycoprotéine-P. Cette protéine (P-gp) présente au niveau des cellules de l’endothélium

cérébral est impliquée dans le phénomène de multi-résistance aux médicaments (ex :

anticancéreux) (Woodcock et coll., 1992). Il a été constaté récemment que le polysorbate 80

tensioactif inhibait le système d’efflux de la P-gp (Nerurkar et coll., 1996).

22 Transcytose : mouvement de matériel d’un espace extracellulaire à l’espace extracellulaire opposé par l’intermédiaire de cavéoles qui se referment pour former des vésicules


44

Figure 17 — : Concentrations de doxorubicine (µg/g) dans le cerveau de rat après administration intraveineuse. Nanoparticules de doxorubicine (5 mg/kg) recouvertes de polysorbate 80 (1%), Doxorubicine (5 mg/kg) en solution saline. D’après Gulyaev et coll., (1999).

En conclusion, ces études montrent clairement que la BHE est une barrière dynamique.

Ainsi, le passage des nanoparticules peut être modulé ou amélioré via l’utilisation de

tensioactifs favorisant leur endocytose par les cellules endothéliales des capillaires cérébraux.


45

IV. Conclusion

D’après les données bibliographiques, l’arsthinol qui a été utilisé dans les années 1950

dans le traitement de l’amibiase et en dermatologie, présente aussi une activité antileucémique

in vitro. Ainsi, cette activité est plus importante que celle de l’As2O3 (Trisenox®) qui est

actuellement utilisé comme traitement de leucémies aiguës promyélocytaires réfractaires.

Pour l’As2O3, les mécanismes d’action moléculaire impliqués dans son activité anticancéreuse

sur les cellules NB4 de LAM3 ont été clairement élucidés. Mais l’identification du mécanisme

par lequel l’arsthinol exerce son activité reste à étudier.

Lorsqu’il était utilisé par voie orale, l’arsthinol était très bien toléré chez l’homme. Sa

tolérance a également été démontrée chez les animaux de laboratoire. Cependant, il est connu

que l’administration de dérivés arsenicaux (organique et inorganique) est souvent associée à

une toxicité cérébrale.

Même si de nombreux travaux ont tenté d’améliorer le passage de particules

colloïdales à travers la BHE par l’utilisation d’agents tensioactifs, les particules "non-

modifiées" (sans polysorbate 80) passent très peu la BHE. Par conséquent, dans notre cas,

l’utilisation de vecteurs nanoparticulaires représente une approche prometteuse qui permettra

de diminuer la toxicité de l’arsenic. Parmi ces vecteurs, les nanosuspensions offrent

l’avantage d’augmenter la solubilité de principes actifs peu solubles et d’améliorer leur

pharmacocinétique.

Par ailleurs, comme nous l’avons vu précédemment le métabolisme des dérivés de

l’arsenic (organique et inorganique) marque quelques points de différence. En effet, le

trioxyde d’arsenic se transforme en composés méthylés éliminés par voie urinaire, alors que

l’organoarsénié le mélarsoprol se transforme en composés hydrosolubles (par l’intermédiaire

du glutathion et /ou de l’acide glucuronique) éliminés par voie biliaire. L’étude du mécanisme

de transformation de l’arsthinol sera l’un des objectifs de notre travail.

46

Travail expérimental


47

Chapitre I :

Nanosuspensions d’arsthinol : pharmacocinétique et activité antileucémique


48

1. Résumé de la publication n°1 :

Lors d’une étude précédente réalisée au sein de notre laboratoire, il a été montré que

les dithiarsolanes (mélarsoprol et arsthinol) étaient actifs sur les lignées cellulaire

leucémique myélomonocytique (U937) et erythroleucémique (K562). Ces travaux avaient

également montré que l’arsthinol était le composé le plus actif sur ces cellules (CI50 de

l’arsthinol < CI50 Mél < CI50 de l’As2O3) (Gibaud et coll., 2006). Ce composé qui avait déjà

commercialisé et utilisé chez l’homme dans le traitement du pian et des amibiases nous a

semblé particulièrement intéressant dans le domaine de la cancérologie. Récemment, il a été

montré que l’arsthinol présente un index thérapeutique élevé par rapport au mélarsoprol et

au trioxyde d’arsenic. Toutefois, il ne peut pas être utilisé facilement par voie injectable

comme de nombreux organométalliques et tout particulièrement les dithiarsolanes.

L’arsthinol est quasiment insoluble dans l’eau et nécessite une solubilisation dans du

propylène glycol. Compte tenu des données cliniques actuellement disponibles au sujet du

mélarsoprol, ce type de préparation est très mal toléré et conduit fréquemment à des veinites

au point d’injection.

Le premier objectif de notre travail était de préparer des nanosuspensions d’arsthinol

pour une optimisation thérapeutique. Cette formulation galénique a déjà était étudiée pour le

mélarsoprol et en théorie a plusieurs avantages. Elle devrait permettre de limiter les

concentrations cérébrales en organoarséniés et conduire ainsi à une limitation très

significative de la toxicité cérébrale. En effet, comme nous l’avons démontré dans la partie

bibliographique, les sphères colloïdaux nanoparticulaires ne passent pas facilement la BHE.

A l’inverse, le passage de la barrière hémato-médullaire est généralement important (capture

par les macrophages médullaire). Enfin, la formulation des nanosuspensions permet d’éviter

l’utilisation de solvants organiques.

1.1. Mise au point des nanosuspensions d’arsthinol

Les nanosuspensions ont été préparées selon la technique développée par Müller et

coll., (1998). Cette formulation convenable aux principes actifs peu solubles à la fois en

milieux aqueux et organiques, est relativement simple à préparer. De plus, certains travaux

ont montré que l’utilisation de poloxamer 407 tensioactif comme agent de surface des

nanoparticules a permis de cibler significativement la moelle osseuse (Illum et Davis, 1987 ;

Porter et coll., 1992 a, b). En conséquence, nous avons effectué une mise au point de la


49

technique pour la préparation des nanosuspensions d’arsthinol avec le poloxamer 407

tensioactif, dont le protocole est décrit dans la publication n°1.

1.2. Etude de la pharmacocinétique des nanosuspensions d’arsthinol et évaluation de leur activité sur les cellules NB4 de LAM3

Les études de la pharmacocinétique de l’arsthinol en solution et des nanosuspensions

d’arsthinol sont réalisées chez la souris après administration intraveineuse. Les paramètres

pharmacocinétiques obtenus de ces deux formulations indiquent que les nanosuspensions

sont rapidement éliminées de la circulation sanguine. De plus, ces nanosuspensions

formulées avec le poloxamer 407 tensioactif ont une taille de 391 nm, cette caractéristique

favorise leur capture par les cellules du système de phagocytes mononuclées des organes.

Cette observation a été confirmée par les concentrations significatives en arsenic retrouvées

dans la moelle osseuse à 30 min post-injection I.V. (vs Cmax (arsthinol) atteinte à 1 h). Donc,

les nanosuspensions d’arsthinol sont rapidement capturées par les macrophages de la moelle

osseuse.

En revanche, les nanosuspensions s’accumulent moins dans le cerveau qui s’explique

d’une part par le fait que le cerveau n’est pas un organe du système réticulo-endothélial.

D’autre part, par l’incapacité des nanosuspensions de traverser la barrière hémato-

encéphalique en raison de leur propriété de surface et de leur taille. En conséquence, les

nanosuspensions représentent un avantage considérable en faveur de limiter la toxicité de

l’arsenic. Au niveau du foie et du rein, les concentrations en arsenic mesurées après

injection des nanosuspensions d’arsthinol sont légèrement supérieures à celles obtenues

après injection de l’arsthinol en solution. Ceci indique que les nanosuspensions sont

efficacement capturées par le SPM du foie et éliminées par le rein.

Dans ce travail, nous avons également évalué l’activité cytotoxique de l’arsthinol et

des nanosuspensions d’arsthinol sur la lignée cellulaire NB4 de LAM3 en comparaison avec

le mélarsoprol et le trioxyde d’arsenic. Nos résultats montrent que de faibles concentrations

en arsthinol (CI50 = 0,78 µmol/l) inhibent la croissance des cellules NB4 après 24 h

d’incubation par rapport au mélarsoprol (CI50 = 1,44 µmol/l) et au trioxyde d’arsenic (CI50 =

1,60 µmol/l). L’arsthinol sous forme des nanosuspensions reste toujours actif sur les cellules

NB4. Ces premières constatations (cf. tableau 2, publication n°1) confirment que l’arsthinol

présente des potentialités antileucémiques équivalentes au trioxyde d’arsenic mais son

mécanisme d’action précis demeure inconnu.


50

Enfin, ce travail nous a permis de montrer l’intérêt attendu des nanosuspensions qui

est celui d’améliorer la solubilité de l’arsthinol grâce à la diminution de la taille des

particules et à l’utilisation de polymère tensioactif hydrophile. De plus, la distribution

tissulaire de l’arsthinol s’est significativement améliorée. Les concentrations importantes en

arsenic mesurées dans la moelle osseuse sont plutôt avantageuses en cas de traitement de

leucémie. Alors que de faibles concentrations cérébrales en arsenic permettent de limiter

d’éventuel effet neurotoxique.


51

Publication n°1:

Arsthinol nanosuspensions: pharmacokinetics and anti-leukaemic activity on NB4 promyelocytic leukaemia cells

Journal of pharmacy and pharmacology

(Mise en ligne octobre 2009)


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2. Evaluation de l’activité apoptotique de l’arsthinol

2.1. Introduction

Nous avons vu dans le paragraphe précédent que l’arsthinol et ses nanosuspensions

ont une activité cytotoxique importante sur les cellules NB4 de LAM3 par rapport au

mélarsoprol et au trioxyde d’arsenic (As2O3). En effet, la croissance de ces cellules a été

activement inhibée par l’arsthinol après 24 h et 48 h d’incubation (cf. tableau 2, publication

n°1). Nous avons constaté également que de faible concentration (CI50 < 1 µM) en arsthinol

suffit pour inhiber la croissance cellulaire. Alors qu’avec l’As2O3 et le mélarsoprol, se sont

les concentrations de CI50 supérieures à 1 µM qui ont un effet inhibiteur de la croissance

après 24 h d’incubation. Ces résultats intéressants nous ont incité à obtenir quelques

explications sur le mécanisme par lequel l’arsthinol induit la mort cellulaire des cellules

leucémiques et ceci en comparaison avec l’As2O3.

Quelques travaux ont montré que le trioxyde d’arsenic induisait l’apoptose des

cellules NB4. Ainsi, différents mécanismes d’action moléculaires impliqués dans ce

processus ont été proposés :

- Chen et coll., (1996) ont montré que l’As2O3 inhibe la prolifération cellulaire des

cellules NB4 de LAM3 précédant à l’induction de l’apoptose. Cette apoptose est

associée à la régulation de l’expression du gène bcl-2 et à la modulation des

protéines PML-RARα/ PML.

- Jing et coll., (1999) ont démontré que la production de peroxyde d’hydrogène

par les cellules NB4 de LAM3 sous stimulation de l’As2O3 provoque le processus

d’apoptose.

Dans ce travail, nous avons cherché à déterminer si l’arsthinol induit l’apoptose des

cellules leucémiques (NB4 et U937) de la même manière que le trioxyde d’arsenic. Pour

cela, nous avons évalué l’activité des caspases-3/7 qui sont un marqueur du processus

d’apoptose. Les caspases sont des protéases qui jouent un rôle essentiel dans l’exécution de

l’apoptose. Les substrats des caspases sont essentiellement des protéines impliquées dans le


60

maintient de l’intégrité cellulaire qu’elles vont cliver, ainsi que les endonucléases23 qu’elles

vont activer.

Dans le processus d’apoptose, il y a deux types de caspases qui interviennent : les

initiatrices et les effectrices. La caspase-9 initiatrice est activée dès le début de la cascade

apoptotique par le cytochrome C qui est libéré de la mitochondrie en réponse à des stimuli

apoptotique (Li et coll., 1997). Cette première activation induit l’activité protéolytique

d’autres caspases en aval y compris la caspase-3, la caspase-6 et la caspase-7 qui sont des

caspases effectrices.

23 Endonucléase : une nucléase qui coupe un acide nucléique en fragments plus courts


61

2.2. Matériels et méthodes

2.2.1. Lignées cellulaires et réactifs

La lignée cellulaire NB4 leucémique aiguë promyélocytaire humaine est obtenue

auprès du Dr. M. Lanotte (Centre Hayem, Hôpital Saint Louis, Paris, France). La lignée

cellulaire U937 myélomonocytique leucémique humaine a été obtenue à l’Hôpital Henri

Mondor (ATCC n° CRL-1593.2). Les cellules NB4 ou U937 sont mises en culture dans du

milieu RPMI 1640 + GlutaMaxTM-I contenant 10 % de sérum de veau fœtal et 1 %

d’antibiotique-antifongique, et incubées à 37°C dans une atmosphère à 95 % d’air et 5 % de

CO2.

Le milieu de culture RPMI 1640 + GlutaMaxTM-I, l’antibiotique-antifongique, le

sérum de veau foetal nous ont été fournis par Gibco (Gibco Invitrogen, France). Le Kit Apo-

One® Homogeneous Caspase-3/7 Assay a été fourni par Promega (Promega Corporation,

USA). Ce Kit est composé d’une solution tampon et du substrat (Z-DEVD-R110) des

enzymes caspases-3/7.

2.2.2. Mesure de l’activité des caspases-3/7

Les cellules NB4 ou U937 (1 x 105 cellules/ml) en phase exponentielle sont incubées

avec différentes concentrations (1 µM, 2 µM et 5 µM) en arsthinol ou en As2O3 pendant 24

h à 37 °C et sous atmosphère à 95 % d’air et 5 % de CO2. Ensuite, la mesure de l’activité des

enzymes caspases-3/7 (indicateur de l’apoptose) dans ces cellules est effectuée suite à

l’ajout à la suspension cellulaire (traitées et contrôles, NB4 ou U937) du substrat en solution

(Z-DEVD-R110) couplé à un fluorophore, la rhodamine 110. En effet, la caspase-3 est une

protéase qui effectue le clivage spécifique au niveau du C-terminal de l’aspartate qui est un

résidu de la séquence peptidique DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) (figure 18). Cette séquence est

aussi reconnue par l’enzyme caspase-7. Après que le substrat est clivé par les enzymes

caspases-3/7, le fluorophore libéré (rhodamine 110) émet une fluorescence à 530 nm suite à

une excitation à 485 nm. La mesure de la fluorescence est réalisée à l’aide d’un lecteur de

fluorescence (Fluoroskan Ascent, Thermo Scientific).


62

Figure 18 — : Schéma de la réaction de clivage du substrat (Z-DEVD-R110) non-fluorescent par les caspases-3/7 et libération de la rhodamine R-110 fluorescente (www.promega.com).


63

2.3. Résultats et discussion

Le traitement des cellules NB4 de LAM3 par l’arsthinol pendant 24 h a induit une

augmentation importante de l’activité des enzymes caspases-3/7 (figure 19). Cette activité

est à peu près équivalente à celle obtenue avec le trioxyde d’arsenic (As2O3) quelle que soit

la concentration et bien qu’une différence ait été observée aux concentrations de 1 µM et de

2 µM. Ces résultats indiquent que ces composés arsenicaux (arsthinol et As2O3) induisaient

le processus de l’apoptose des cellules NB4 via l’activation des enzymes (caspases- 3/7) clés

de ce processus.

Figure 19 — : Activité des caspases-3/7 mesurée après traitement des cellules NB4 par l’arsthinol ou le trioxyde d’arsenic. Les résultats sont exprimés en unité relative de fluorescence (URF). Chaque valeur d’URF représente la moyenne ± écart-type (n = 3). Test de Mann-Whitney (* p < 0,05 différence significative entre les deux traitements). T cellule : témoin cellule (NB4).

Cependant, le traitement des cellules U937 avec les mêmes concentrations (1 µM - 5

µM) en l’arsthinol ou en As2O3 n’induisait pas ou très peu (à 5 µM) l’activation des

caspases-3/7 (figure 20). Malgré que cette activité enzymatique ne soit pas détectée dans ces

cellules, leur croissance cellulaire a été inhibée par l’arsthinol et le trioxyde d’arsenic. En

effet, les valeurs de CI50 obtenues sont de 2,86 µM et de 16,73 µM après 48 h de traitement


64

respectivement (Gibaud et coll., 2006). Ces résultats sont en accord avec celles obtenus par

Chen et coll., (1996) qui ont constaté que les concentrations en As2O3 allant de 0,25 µM à 2

µM n’induisent pas l’apoptose des cellules U937. Donc, ces composés arsenicaux peuvent

avoir une apoptose préférentielle à des concentrations élevées (≥ 5 µM) sur les cellules

U937. A l’inverse, les concentrations ≤ 5 µM inhibent activement la croissance cellulaire

des cellules NB4 précédant à l’induction de l’apoptose. Ces résultats laissent suggérer que

les cellules NB4 sont plus sensibles à l’arsthinol que les cellules U937. D’après Jing et coll.,

(1999) la sensibilité des cellules NB4 à l’arsenic par rapport aux U937 est en relation directe

avec la faible activité des enzymes (GPx et catalase) impliquées dans le catabolisme du

peroxyde d’hydrogène. Ainsi, l’augmentation des concentrations de H2O2 sous la

stimulation de l’arsenic peut déclencher l’apoptose. Les cellules U937 détoxifient les

composés arsenicaux (arsthinol et As2O3) et catabolisent l’H2O2 plus efficacement que les

cellules NB4 de LAM3, elles sont donc peu sensibles à l’arsthinol.

Figure 20 — : Activité des caspases-3/7 mesurée après traitement des cellules U937 par l’arsthinol ou le trioxyde d’arsenic. Les résultats sont exprimés en unité relative de fluorescence (URF). Chaque valeur d’URF représente la moyenne ± écart-type (n = 3). Test de Mann-Whitney (p > 0,05 non significative). T cellule : témoin cellule (U937).


65

3. Conclusion

En conclusion, ce travail nous a permis de confirmer que l’activité antileucémique de

l’arsthinol se caractérise par l’inhibition de la croissance et l’induction de l’apoptose via

l’activation des caspases-3/7. Ainsi, comme l’As2O3, se sont les concentrations en arsthinol

inférieures ou égales à 5 µM qui induisent l’apoptose des cellules NB4 de LAM3. En

revanche, sur les cellules U937 il faut des concentrations élevées (≥ 5 µM) en arsthinol (ou

en As2O3) pour produire cet effet.


66

Chapitre II :

Métabolisme de l’arsthinol


67

Nous avons vu dans le chapitre I que l’arsthinol (en solution dans du propylène glycol

et sous forme des nanosuspensions) était actif sur les cellules NB4 de leucémie aiguë

promyélocytaire humaine. Bien que ce principe actif ait déjà été utilisé chez l’homme

(Balarsen®), aucune étude exclusive n’a été réalisée sur son métabolisme. Seuls les travaux de

Cristau et coll., (1973 ; 1975) ont démontré que 61,3 % d’une dose de 0,8 mg/kg solubilisée

dans du propylène glycol et injectée à des cobayes était retrouvé dans la bile. Ce pourcentage

atteint 89,4 % chez le rat et aucune étude n’a été réalisée chez l’homme.

Notre étude réalisée chez la souris avait pour objectif d’identifier par la technique de

CLHP-SM l’ensemble des métabolites de l’arsthinol qui ont été dosés dans les urines par la

méthode colorimétrique (dosage de l’arsenic total). De plus nous avons montré par les essais

in vitro les mécanismes chimiques et enzymatiques qui peuvent intervenir dans la

transformation de l’arsthinol. Ces travaux ont pu confirmé les résultats de Berger et Fairlamb,

(1994) qui avaient montré le rôle de peroxyde d’hydrogène dans le processus d’oxydation de

l’arsenic trivalent en arsenic pentavalent.


68

Résumé de la publication n°2 :

Après administration intraveineuse de l’arsthinol (une dose de 0,2 mmol/kg) à des

souris, les quantités d’arsenic dans les organes et fluides biologiques ont été mesurées par la

méthode colorimétrique. De faibles concentrations en arsenic ont été détectées dans les

échantillons d’organes à 24 h post-injection, indiquant que l’arsthinol et/ou ses métabolites

sont rapidement éliminés de l’organisme. Cependant, des quantités significatives en arsenic

ont été dosées dans les échantillons d’urines 24 h. L’analyse de ces échantillons d’urines par

la technique de chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de

masse (CLHP-SM) nous a permis d’identifier deux métabolites de l’arsthinol. Il s’agit de

l’acétarsol (pentavalent) et de l’oxyde d’acétarsol (trivalent). L’acétarsol était le principal

métabolite urinaire (51,7 % de l’arsenic excrété) identifié et quantifié par CLHP-SM. Alors

que de très faible quantité en arsthinol a été mesurée dans ces échantillons d’urines. Ceci

confirme les résultats de Cristau et coll., (1973 ; 1975) qui ont constaté que l’élimination de

l’arsthinol s’effectue essentiellement par voie biliaire chez le rat et le cobaye.

Par ailleurs, l’incubation de l’arsthinol en contact avec un oxydant le H2O2 a générée

l’acétarsol. Le même résultat a été obtenu lorsque l’arsthinol a été incubé en présence de

l’enzyme xanthine oxydase et du substrat de l’enzyme l’hypoxanthine comme source de H2O2.

En conséquence, ces essais in vitro démontrent que l’arsthinol trivalent pouvait être oxydé en

un métabolite pentavalent (c-à-d l’acétarsol) moins toxique. Cette hypothèse avait été étudiée

in vitro dans le cas du mélarsoprol (qui se transforme en mélarsène) et peut maintenant être

validée in vivo pour l’ensemble de dithiarsolanes.

Enfin, ce travail de spéciation nous a permis de déterminer les métabolites de

l’arsthinol en travaillant sur un modèle animal murin. Ainsi, d’en déduire le mécanisme de

transformation de cet organoarsénié in vivo par la réalisation de tests in vitro. De plus, nous

constatons que l’oxydation de l’arsenic trivalent par le peroxyde d’hydrogène représente une

voie de détoxification de l’arsthinol. Le glutathion (GSH) peut également jouer un rôle

important dans la voie d’élimination de l’arsthinol en raison de son caractère hydrophobe.


69

Publication n°2:

Speciation of arsenic in urine following intravenous administration of arsthinol in mice

(Soumise le 19 février 2010 dans European Journal of drug metabolism and

pharmacokinetics)

Imane AJANA, Alain ASTIER, Stéphane GIBAUD

Laboratoire de Pharmacie Clinique EA 3452 « Cibles thérapeutiques, formulation et expertise

préclinique du médicament »

Université Henri Poincaré - Nancy I -

5, rue Albert Lebrun - BP 80403 - 54001 Nancy Cedex, France


70

SUMMARY Recent investigations have shown that arsthinol, a trivalent organoarsenic compound

(dithiarsolane), has been active in vitro on leukemia cell lines and offers a better therapeutic

index than arsenic trioxide, as estimated by the ratio LD50/IC50.

To complete our understanding of its urinary excretion, a sensitive method using liquid

chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS) was used. Mice were injected

intravenously with a single dose of arsthinol at 0.2 mmol/kg of body weight. The amount of

total arsenic in tissues and body fluids was determined by a colorimetric method and urine

metabolites were analyzed on a C18 Acclaim PepMap 100 Å column by LC-MS. Our results

showed that only three arsenic species (acetarsol, acetarsol oxide and arsthinol) were detected

in the first 24 h - urine. Overall, this study confirms that the hydrolysis of dithiarsolanes to

arsenoxides (i.e. acetarsol oxide) can be followed by an oxidation in arsonic acids (i.e.

acetarsol). All these compounds are excreted in the urine.

KEYWORDS: arsenic, speciation, LC-MS, arsthinol, urine samples


71

1. Introduction

Arsenic has been used as medicinal agent for more than 2 400 years [1]. In the early

1900s, potassium arsenite (Fowler’s solution administered orally) was widely used in the west

for controlling leukocytosis in patients with chronic myelocytic leukemias [2]. In the early

twentieth century, organoarsenicals were used for trypanosomiasis, syphilis, blood diseases,

intestinal parasite infections and several other diseases. In the 1980’s and in the 1990’s, drug

regulation organizations considered that the benefits/risk balance was unfavorable and all the

pharmaceutical specialties were withdrawn in the United States, in Europe and elsewhere.

Nevertheless, a favorable benefits/risk balance has reappeared for leukemia. Actually

inorganic arsenic trioxide (As2O3) was reported to induce complete remissions in patients

with refractory acute promyelocytic leukemias (APL) [3] and it was re-introduced in 2000 in

the United States (Trisenox®).

Based on these results, studies have been carried out on trivalent organoarsenic dithiarsolanes

[4, 5]. These investigations have shown that arsthinol (Fig.1a) has been active in vitro on

leukemia cell lines, with a best therapeutic index (TI = LD50/IC50) than arsenic trioxide and

other organoarsenicals. Interestingly, arsthinol was used in the 1950s (Balarsen®) in the

treatment of amebiasis [6] and in dermatology [7] and could benefit from a renewal of interest

in hematology.

The pharmacokinetic properties of drugs are important determinants of their toxicity and are

critical for extrapolating more accurately experimental animal data to humans in the process

of risk assessment. The present paper completes the description of the metabolism pathways

of dithiarsolanes. In the 1970’s Cristau et al. had studied the excretion of a series of

dithiarsolanes (e.g. melarsoprol, arsthinol; Fig.1a and b); the authors had reported that

compounds are mainly excreted in the bile [8]. This point was confirmed by Gregus et al., [9]

who have demonstrated that melarsoprol reacted with glutathione (GSH) and glucuronic acid.


72

Nevertheless, arsthinol is less hydrophobic and is significantly excreted in urine [10] (5.07 %

of the dose for mice and 20.21 % for guinea pigs) but the identity of its metabolites remains

unexplored.

To improve our understanding of the urinary excretion of dithiarsolanes, we have used a

mouse model and developed an arsenic speciation method, using a high-performance liquid

chromatography coupled mass spectrometry (LC-MS). This experiment has been completed

by in vitro studies (hydrolysis and oxidation of arsthinol) to clarify the metabolic pathway.

AsS

SCH2OH

HO

H3COCHN

NH

As

S

SCH2OH

N N

N

NH2

NH2

a) arsthinol

b) melarsoprol

c) acetarsol

AsHO OH

HO

H3COCHNO

Fig.1. Chemical structure of arsthinol (a), melarsoprol (b) and acetarsol (c)


73

2. Experimental

2.1. Chemicals The synthesis of arsthinol was performed following the method previously described [4].

Acetarsol (Fig. 1c) and 1,2-propanediol were purchased from Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-

Fallavier, France). Acetonitrile was from Carlo Erba (Val-de-Rueil, France). Xanthine

oxidase (from bovine milk; EC 1.1.3.22), hypoxanthine, peroxidase type II (from horseradish;

HRP II; EC 1.11.1.7) and phenol red were purchased from Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-

Fallavier, France). Hydrogen peroxide (30 %) was purchased from Acros Organics (Noisy-le-

Grand, France).

2.2. LC-MS analytical procedure Arsenic speciation was achieved by using the LC-MS system. The chromatographic analysis

was carried on a C18 Acclaim PepMap 100 Å analytical column (150 mm x 1 mm i.d., 3 µm

particle size, Dionex) and eluted with a gradient of acetonitrile - acetic acid (0.6 %, v/v) at a

flow rate of 50 µl/min (0 to 100 %, v/v of acetonitrile in 30 min). An aliquot of 1 µl urine

sample was injected onto the HPLC column for speciation. Detection was performed at 254

nm and by using a simple quadrupole-TOF mass spectrometer (MicroOTOF, Bruker

Daltonics) fitted with an ESI source working in positive ion and selected reaction monitoring

mode. For quantification of the species of arsenic by LC-MS, four spiked control samples

were prepared at amounts ranging from 0 to 50 nmol, for each compound of arsenic species

and then determined in duplicate. Arsthinol was dissolved in acetonitrile and diluted to a

working concentration in de-ionized water (DI); acetarsol was dissolved in 10 mM NaOH and


74

diluted in DI. The limit of detection (LOD) was 2.87 nmol for arsthinol and 1.8 nmol for

acetarsol.

2.3. HPLC for determination of arsthinol

Concentrations of arsthinol and acetarsol were also determined by reversed-phase HPLC

using a Nucleosil C18 column (4.6 mm X 250 mm, 5 µm; Macherey-Nagel, Eckbolsheim,

France). The mobile phase was eluted with a gradient of acetonitrile - acetic acid (0.6 %, v/v)

at a flow rate of 1 ml/min (0 to 100 %, v/v of acetonitrile in 30 min). The injection volume

was 20 µl and the detection wavelength was 254 nm.

In these analytical conditions, the retention time was about 8.9 ± 0.2 min for acetarsol and

21.1 ± 0.4 min for arsthinol. The external standard curves had excellent linearity from 22

µmol/l to 363 µmol/l (correlation coefficient > 0.998).

2.4. Quantification of total arsenic by colorimetric method The amounts of total arsenic in the samples were determined using a colorimetric method [11]

after digestion with nitric acid (HNO3; 65 %) and hydrogen peroxide (H2O2; 30 %). In brief,

each sample (urine, tissues or blood) was placed in a digestion tube with 5 ml of HNO3

(65 %) and 5 ml H2O2 (30 %). The tubes were heated with a digester apparatus DK-20 (Velp

Scientifica, Milan,Italy). The samples of urine were heated sequentially at 80, 100-115, 280°C

as previously described [12]. Other samples (tissues and blood) were digested by slowly

increasing the temperature from 100°C to 200°C. The clear solution was evaporated to

dryness, the residue was taken up with 10 ml of HCl (2 N) and 5 ml was introduced into an

arsine generator apparatus. The reaction was initiated by zinc powder after reduction to AsIII

with tin chloride (SnCl2; 40 %) and potassium iodide (KI; 15 %). After 30 min, the

pentavalent arsenic (AsV) was completely reduced to arsine (AsH3) and the gas bubbled


75

through a solution of the silver salt of diethyldithiocarbamate in pyridine. The absorbance of

the brown complex was measured at 525 nm. A calibration curve was obtained with

increasing amounts of arsenic (As2O3; 0 - 0.09 µmol).

2.5. Animal experiments Female CD1 mice were from Charles River Laboratories (Saint-Germain sur l'Arbresle,

France). The animals were housed in cages under controlled conditions of 22 ± 1°C

temperature, 50 ± 10 % relative humidity and normal photoperiod (12 h light and dark).

2.5.1. Urine speciation For speciation studies, mice were housed individually in Techniplast metabolism cages

(Charles Rivers, L’Arbresle, France) during four days before administration of arsthinol [13].

The weight of the treated mice ranged from 24 g to 28 g. Three mice were injected in the

caudal vein with a single dose of arsthinol (0.2 mmol/kg of body weight). Immediately before

injection, arsthinol was dissolved in the mixture of propylene glycol/ NaCl 0.9 % (60/40, v/v);

control mice were injected with the same volume of solvent. Urine samples were collected at

24 h and stored at - 20°C until analysis by LC-MS and quantification of total arsenic by the

colorimetric method.

2.5.2. Tissue distribution

Groups of three mice were injected (0.2 mmol/kg) and after 24 h blood samples were

collected into heparinized tubes by cardiac puncture under anesthesia (halothane) and frozen

at - 20°C until analysis. Then, organs (liver, kidney, spleen, lung and brain) were removed,


76

weighted and stored at - 20°C until analysis. Arsenic was assessed by the colorimetric method.

2.6. In vitro hydrolysis assays Arsthinol was dissolved in propylene glycol. Three samples (5 ml) were added to 95 ml of

phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4) at various temperatures (4°C; 25°C; 37°C). The

concentration of arsthinol in each solution was 43.2 µmol/l (15 µg/ml). Each vial was placed

in a shaking water bath (WB14, Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Germany). At

predetermined time intervals, aliquots (1 ml) were withdrawn for HPLC analysis.

2.7. In vitro oxidation assays In a first time, the effects of H2O2 on arsthinol was studied in a reaction mixture containing

0.1 M of Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 mM of arsthinol, 40%, v/v of propylene glycol and

various concentrations of H2O2 (25 to 600 µM). This solution was incubated for 30 min at

25°C and aliquots (1 ml) were withdrawn for HPLC analysis.

Since xanthine oxidase is widely distributed in tissues, especially liver and intestine and can

act as a source of superoxide and H2O2 [14] , oxidation of arsthinol was also studied in a

mixture containing 1 mM arsthinol, 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0.4 mM hypoxanthine

and xanthine oxidase (30 to 120 µg). This mixture was incubated in the same conditions

(25°C, 30 min.) and aliquots (1 ml) were withdrawn for HPLC analysis.

The hydrogen peroxide generated from the xanthine oxidase assay was measured upon

presence of horseradish peroxidase (HRP II) and phenol red as described by Pick et al. 1980

[15].


77

3. Results and discussion

3.1. In vivo experiments

The quantification of total arsenic was performed in urine samples with the colorimetric

method and results are presented on Fig. 2. The cumulative excretion of arsenic amounted to

approximately 1.64 % of dose at 24 h after injection and rise progressively during 4 days.

0%

1%

2%

3%

4%

5%

0 1 2 3 4 5 6

Elim

inat

ed A

s (%

dos

e)

Days after injection

Fig. 2. Cumulative excretion of arsenic in urine after intravenous injection of arsthinol (0.2 mmol/kg)

in mice (Mean ± SD; n = 5).

Subsequently, the first 24 h-urine samples were analyzed by LC-MS and 3 arsenic species,

corresponding to acetarsol (AsV), acetarsol oxide (AsIII) and arsthinol (AsIII), were detected.

The retention time was 8 min for acetarsol, 10.1 min for acetarsol oxide and 21 min for

arsthinol which was very lipophilic and was eluted much more slowly. Fig. 3, 4 and 5 show

the spectrum for the speciation of these compounds.


78

Fig. 3. MS Spectrum of acetarsol. (tR = 8 min, m/z = 275.9868)

Fig. 4. MS Spectrum of acetarsol oxide. (tR = 10.1 min, m/z = 241.9809)


79

Fig. 5. MS Spectrum of arsthinol. (tR = 21 min, m/z = 347.9809)

Since standards of arsthinol and acetarsol were available, the quantification of these

compounds was achieved and presented in Table 1. Thus, our results have shown that after 24

h, 45.0 ± 0.01 nmol of acetarsol, 36.1 ± 0.01 nmol of acetarsol oxide and only 10.4 ± 0.02

nmol of unchanged arsthinol were excreted.

Table 1. Urinary excretion of the arsenical species (nmol) in the first 24 h - urine after injection of

arsthinol (0.2 mmol/kg). (Mean ± S.D., n = 3)

Time

after injection

LC-MS (nmol) Colorimetry

Acetarsol (AsV) Acetarsol oxide (AsIII) Arsthinol (AsIII) Total As

24 hours 45.0 ± 0.01 31.6* ± 0.01 10.4 ± 0.02 87.0 ± 0.01

* Acetarsol oxide value is estimated by application of the formula: [acetarsol oxide] = [total As] -

[acetarsol + arsthinol].


80

Our findings are in agreement with the results described on the rat using a polarographic

method [10]: a high proportion of arsenic was eliminated in the bile (46.6 %) and a low

concentrations (5.07 %) was recovered in the urine 24 h after injection [10, 16]. Nevertheless,

important discrepancies related to species have previously been reported especially between

rats and guinea pigs; the latter excreted up to 20.21 % of the injected dose in the urine after

only 8 h. Our model is closer to the rat model because only 1.64 % is excreted in 24 h and

3.2 % in 4 days.

After 24 hours (Table 2), the concentrations in all the organs are higher than 8.2 nmol/g

confirming the ability of dithiarsolanes to spread in the tissues. The quantification has been

realized on the same mice that were used for the speciation. Nevertheless, maximal

concentrations are usually achieved in the first 10 h and after 24 h the concentrations are

almost residual values [17].

Table 2. Arsenic concentrations determined by the colorimetric method. Organs were collected 24 h

after a single intravenous injection of arsthinol (0.2 mmol/kg) or solvent alone (control). Data

represents mean ± S.D., n = 3.

Time

after injection

Total arsenic (nmol/g of tissue or µmol/l of blood)

Liver Spleen Kidney Lung Brain Blood

24 h 8.2 ± 0.1 10.6 ± 0.2 9.1 ± 0.02 16.5 ± 0.2 18.3 ± 0.3 6.3 ± 0.2


81

3.2. In vitro experiments

In vitro studies have been realized to clarify the process that leads to acetarsol oxide and

acetarsol. The Fig. 6 shows a decrease of arsthinol concentrations at various temperatures

(phosphate buffer 0.1 M, pH 7.4; 4°C; 25°C and 37°C). This dithiarsolane ring-opening has

been described for other compounds [18] and leads to the related arsenoxide (i.e. acetarsol

oxide, Fig. 7). This latter compound was not oxidized in the presence of oxygen (data not

shown). In contrast, exogenous H2O2 can readily convert it to acetarsol (Fig. 7 and 8).

15

20

25

30

35

40

45

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Ars

thin

ol (µ

mol

/l)

Time (h)

Fig. 6. Stability of arsthinol in phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4) at 4°C (-○-), 25 °C (-□-) and 37°C

(-◊-). (Mean ± SD; n = 3).


82

AsS

S CH2OHHO

H3COCHN

AsHO

H3COCHN

O SH

SH CH2OH+

H2O

H2O2

AsHO

H3COCHN

OOH

OH

(a)

(b)

Arsthinol

Acetarsol

Acetarsol oxide Dimercaprol (BAL)

Fig. 7. Hydrolysis of arsthinol into acetarsol oxide, following by oxidation into acetarsol.

0

50

100

150

200

0 100 200 300 400 500 600 700

Ace

tars

ol fo

rmed

(µm

ol/l)

Hydrogen peroxide (µmol/l)

Fig. 8. Acetarsol formed from oxidation reaction in presence of H2O2 at room temperature (Mean ±

SD; n = 4).


83

In the second experiment, xanthine oxidase that can produced H2O2 (this production was

checked and corresponds to 212.63 ± 3.01 µmol/l for 90 µg of xanthine oxidase) converts

arsthinol to acetarsol (Fig. 9).

A complete scheme of metabolic pathways is presented in Fig. 10. The first step [Fig.10: (a)]

is a simple chemical hydrolysis of arsthinol to acetarsol oxide. This arsenoxide is chemically

more reactive than arsthinol and can bind to thiols such as glutathione [GSH, Fig.10: (b)] and

thiol-containing proteins [Fig.10: (c)]. Thus, conjugation with GSH was found to be important

in the elimination of dithiarsolanes; however glucuronidation is also involved [Fig.6 (d)] [9].

0

50

100

150

0 50 100 150

Acet

arso

l pro

duce

d (µ

mol

/l)

Xanthine Oxidase (µg)

Fig. 9. Acetarsol formed from oxidation reaction in presence of xanthine oxidase and hypoxanthine at

room temperature (Mean ± SD; n = 4).


84

Fig. 10. Schematic pathways proposed for the metabolism of arsthinol.


85

4. Conclusion

Our results showed that three organic arsenic species (acetarsol, acetarsol oxide and arsthinol)

were identified in the 24-h urine after injection of arsthinol. Among these compounds, the

AsV acetarsol was the major metabolite excreted into urine of mice. This minor pathway of

elimination of arsthinol is now clarified and should easily be extended to other dithiarsolanes.

Moreover, this work has confirmed the in vivo conversion of arsenoxides to pentavalent

arsonic acids.

Acknowledgments The authors tank the « Service commun de spectrométrie de masse » de l’Université Henri

Poincaré - Faculté des Sciences et Techniques - 54 506 Vandœuvre lès Nancy.


86

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88

[18] B.J. Berger, A.H. Fairlamb, Antimicrob. Agents Chemother. 38 (1994) 1298-1302.

89

Discussion générale


90

Dans ce travail, nous nous sommes fixé l’objectif de montrer l’intérêt des

nanosuspensions d’arsthinol dans le traitement de la leucémie aiguë promyélocytaire par rapport

au trioxyde d’arsenic, utilisé actuellement dans cette indication. Dans ce chapitre nous avons

dans un premier temps interprété l’activité cytotoxique des deux composés sur la lignée

cellulaire NB4 de LAM3 ainsi que le test d’apoptose. Ensuite, nous avons discuté les études

pharmacocinétiques que nous avons réalisées et les implications de ce travail sur le plan

thérapeutique. Enfin, nous avons décrit le mécanisme de transformation de l’arsthinol et le rôle

des différents facteurs qui interviennent pour faciliter son élimination.

1. Activité antileucémique de l’arsthinol

Nos résultats nous ont révélé que l’arsthinol inhibe activement la croissance des cellules

NB4 de LAM3 et qui est à peu près similaire à celle obtenue avec l’As2O3. Nous avons constaté

par ailleurs que l’arsthinol induisait l’activité des caspases-3/7 (marqueur de l’apoptose) comme

l’As2O3. Dans les cellules U937, seulement une très faible activité a été détectée à la

concentration de 5 µM après traitement par l’arsthinol ou l’As2O3. La sensibilité particulière des

cellules NB4 à l’arsenic inorganique (As2O3) serait en partie due à la faible activité des

enzymes : la peroxydase (GPx), la catalase et la glutathion-S-transférase π (GSTπ) ; dans ces

cellules par rapport aux U937 (Jing et coll., 1999). En effet, Jing et coll., (1999) avaient suspecté

que l’As2O3 pouvait contribuer à l’augmentation du taux de H2O2 dans les cellules NB4

principalement par l’inhibition de l’activité de la GPx. Cette inhibition peut être médiée par la

fixation de l’arsenic au groupement thiol de cette enzyme (Tappel, 1984).

De plus, le faible taux de l’enzyme GSTπ limite la détoxification cellulaire de l’As2O3 et

consécutivement contribue à l’inactivation de la GPx.

Au niveau moléculaire, l’activité cytotoxique de l’arsthinol sur les cellules NB4 est liée

essentiellement au groupement arsènoxyde trivalent (forme oxydée de l’arsthinol) qui est connu

d’avoir une affinité avec le groupement thiol (- SH). D’après Gordon et Quastel, (1947 ; 1948)

les arsènoxydes organiques trivalents (ex : phénylarsènoxyde) sont plus toxiques que leurs

équivalents pentavalents. Ainsi, les enzymes qui ont un groupement thiol au niveau de leur site

actif et que l’intégrité de ce groupement est importante pour leur activité, sont plus sensibles aux

arsènoxydes. Parmi ces enzymes, peuvent être citées l’uréase, la succinate déshydrogénase, la

cholinestérase et la pyruvate oxydase. D’autres enzymes (catalase, lactate déshydrogénase,


91

invertase et cytochrome oxydase) dont les groupements thiols atteints ne sont pas essentiels à

leur activité, sont relativement moins affectées par les arsènoxydes.

La différence d’activité constatée entre les dérivés arsenicaux (As2O3, arsthinol) pouvait

venir de l’encombrement stérique de la molécule et de la stabilité de la liaison arsenic-cystéine

(Schmidt et coll., 2007) (figure 21). Une des conséquences de ce processus d’inactivation est

l’induction du processus d’apoptose que nous avons évalué par la mesure de l’activité des

caspases-3/7.

Figure 21 — : Schéma représentant la liaison possible des dérivés arsenicaux (arsthinol et As2O3) au site actif d’enzyme.

2. Propriétés des nanosuspensions d’arsthinol

L’arsthinol est un dérivé organique de l’arsenic très peu soluble en milieu aqueux. Son

administration par voie intraveineuse nécessite une solubilisation dans du propylène glycol.

Cette formulation douloureuse à l’injection est peu adaptée à une utilisation en thérapeutique.

Pour ces raisons, nous avons choisi de préparer des nanosuspensions qui présentent deux

avantages majeurs : solubilisation de principes actifs peu solubles et simplicité de la préparation

(Müller et coll., 2001).

Dans ce travail, les nanosuspensions d’arsthinol ont été préparées selon la technologie

appelée "DissoCubes®" qui a été brevetée par R.H. Müller (Müller et coll., 1998) et mise en


92

œuvre à l’aide d’un Avestin EmulsiFlex®-B3. La taille optimale des nanosuspensions dépendait

de la nature du principe actif et des propriétés biopharmaceutiques recherchées. De plus, leur

distribution après administration intraveineuse est en partie fonction de leur taille. Généralement

les particules de petite taille s’accumulent significativement dans le foie, la rate et la moelle

osseuse. Les particules de taille > à 150 nm se concentrent essentiellement dans le foie et en

proportions variables dans la rate, les poumons et la moelle osseuse (Kreuter et coll., 1994).

Les nanosuspensions d’arsthinol que nous avons développé ont une taille (391 nm)

adaptée à l’administration intraveineuse. Néanmoins, cette taille est suffisante pour éviter leur

dissolution rapide avant qu’elles soient capturées par les cellules du SPM des organes. Ce

résultat rejoint celui de Peters et coll., (2000) qui ont constaté que les nanosuspensions de

clofazimine de taille (385 nm) proche de celle que nous avons obtenue s’accumulent d’une

manière importante dans les organes du SPM (foie, rate, poumons) après administration

intraveineuse chez les souris.

De plus, la formulation des nanosuspensions avec des tensioactifs spécifiques

(poloxamers, poloxamines,…) permet de modifier significativement la distribution tissulaire de

ces vecteurs nanoparticulaires. Dans notre travail, les nanosuspensions d’arsthinol ont été

formulées avec le poloxamer 407 tensioactif à caractère hydrophile. Ceci avait pour objectif de

limiter l’adsorption des protéines plasmatiques (opsonines) et par la suite les interactions avec les

cellules du SPM des organes. De nombreux travaux ont été réalisés dans ce sens ; ainsi le

poloxamer 407 s’est révélé efficace dans la redistribution des nanoparticules d’une taille de 150

nm vers la moelle osseuse chez le lapin (Porter et coll., 1992 b). De plus, Moghimi et coll.,

(1991) ont montré que malgré l’augmentation de la taille des microsphères à 250 nm, il était

toujours possible de diminuer leur phagocytose par les cellules de Kupffer du foie en utilisant le

poloxamer 407 comme agent de surface (Moghimi et coll., 1991).

Par ailleurs, l’étude de la dissolution des nanosuspensions en milieu aqueux nous a

permis de déterminer le comportement in vitro de cette formulation galénique en comparaison

avec la poudre d’arsthinol. Les profils de dissolution obtenus par ces deux formulations sont

significativement différents. En effet, l’arsthinol montre une dissolution lente (dissolution de

20 % en 10 min) en raison de sa faible solubilité dans l’eau (70 mg/l) et de sa granulométrie (5

µm) (Ajana et coll., 2009). En revanche, la dissolution des nanosuspensions d’arsthinol est plus

rapide (dissolution de 56 % en 10 min) du fait de la réduction de la taille des particules (391 nm).

En conclusion, notre étude a montré que les nanosuspensions ont permis d’améliorer

significativement la solubilisation de l’arsthinol à caractère hydrophobe.


93

3. Pharmacocinétique de l’arsthinol et de ses nanosuspensions

3.1. Pharmacocinétique plasmatique

L’arsthinol était utilisé par voie orale dans le traitement d’affections dermatologiques

avec une bonne tolérance (Goldman et coll., 1956). Par ailleurs, la voie intraveineuse a été

utilisée par Cristau et coll., (1973) dans une étude qui avait pour objectif de déterminer quelle

était la voie d’élimination de cet organoarsénié chez le rat.

Dans notre étude, les concentrations plasmatiques en arsenic mesurées après injection

intraveineuse sont à peu près similaires pour les deux formulations. Dans le cas des

nanosuspensions, on peut supposer qu’elles sont rapidement éliminées de la circulation sanguine

suite à leur capture par le SPM. En effet, Manjunath et Venkateswarlu, (2005) avaient décrits

que cette capture des nanoparticules par le SPM peut durer de quelques minutes à quelques

heures ; ce temps dépend généralement de leur taille et de leur composition.

Nous avons remarqué par ailleurs que les concentrations plasmatiques en arsenic

déterminées par la méthode colorimétrique deviennent faibles au-delà de 18 h.

3.2. Distribution tissulaire de l’arsthinol en solution

Après administration intraveineuse de principes actifs, la fixation aux protéines

plasmatiques a un impact important sur la pharmacocinétique. Généralement, c’est la fraction de

principe actif non fixée aux protéines qui sera disponible pour la diffusion dans les tissus et qui

pourra exercer son activité pharmacologique (Wright et coll., 1996). Nous avons estimé in vitro

la fixation de l’arsthinol aux protéines plasmatiques à 85 %. Par ailleurs, la seule fonction acide

de l’arsthinol est la fraction phénolique (pKa 9,5) (Hiskey et coll., 1968) ; ce composé se trouve

donc essentiellement sous forme non-ionisée à pH physiologique.

Les concentrations d’arsenic mesurées dans le cerveau après injection I.V. de l’arsthinol

en solution sont relativement élevées par rapport à celles obtenues dans les autres organes (foie

et rein). Le pic de concentration en arsenic dans le cerveau est obtenu 1 h après injection, ce qui

peut être expliqué par le caractère lipophile de ce composé.

Bien que l’arsthinol soit essentiellement éliminé par voie hépatique, les concentrations en

arsenic dans cet organe restent modestes : la pharmacocinétique de l’arsenic montre deux pics, le

premier pic est observé immédiatement après injection (0,05 µmol/g). Le deuxième pic qui

apparait vers 5 h peut être expliqué par le cycle entéro-hépatique des conjugués ou des

métabolites (0,03 µmol/g). Dans le rein, les concentrations en arsenic sont moins élevées en


94

comparaison avec celles obtenues dans le foie et confirment les résultats obtenus par Cristau et

coll., (1975) sur la faible élimination urinaire des dithiarsolanes.

Enfin, dans la moelle osseuse les concentrations en arsenic sont nettement plus élevées

que celles mesurées dans le cerveau et également dans les autres organes (foie et rein). Cette

accumulation significative de l’arsenic dans la moelle osseuse est plutôt avantageuse pour un

traitement à visée antileucémique.

La différence d’accumulation de l’arsenic dans le cerveau et la moelle osseuse peut

paraitre surprenante. En effet, ces deux organes sont essentiellement constitués de lipides. On

peut donc supposer que cette différence d’accumulation vient essentiellement des

caractéristiques très différentes des deux barrières :

- La BHE est caractérisée par la présence de jonctions serrées qui la rendent très

imperméable.

- A l’inverse, la BHM est traversée en permanence par les cellules sanguines matures

qui rejoignent la circulation ; elle est donc généralement considérée comme très

perméable.


95

3.3. Distribution tissulaire des nanosuspensions d’arsthinol

Parallèlement à l’étude de la distribution tissulaire de l’arsthinol en solution, les dosages

réalisés avec les nanosuspensions ont montré que cette formulation permettait de réduire

significativement la toxicité de ce composé après administration I.V. En effet, les concentrations

cérébrales en arsenic mesurées après injection des nanosuspensions d’arsthinol sont très faibles

par rapport à celles obtenues avec la forme libre de l’arsthinol en solution. Ce résultat confirme

que le poloxamer 407 n’entraine pas une accumulation des nanoparticules dans le cerveau

comme le polysorbate 80 (Tröster et coll., 1990 ; Olivier, 2005). Dans notre cas, il a eu peu de

passage des nanosuspensions recouvertes de poloxamer 407 à travers la BHE. La différence de

comportement liée au polymère sera du à l’apolipoprotéine E (apo E) (Blunk et coll., 1993). En

effet, il a été montré récemment qu’après administration I.V. des nanoparticules recouvertes de

polysorbate 80, l’adsorption de l’apo E à leur surface favorise les interactions avec le récepteur

au LDL, ensuite l’endocytose (Kreuter et coll., 2002). Au contraire, le poloxamer 407 adsorbe

très peu l’apolipoprotéine E (Blunk et coll., 1993).

Par ailleurs, même si les concentrations en arsenic détectées dans la moelle osseuse sont

comparables après injection des nanosuspensions d’arsthinol ou d’arsthinol en solution, les

mécanismes de passages sont probablement très différents. L’arsthinol en solution peut diffuser

librement dans la moelle osseuse. Alors que, les nanosuspensions doivent être phagocytées par

les cellules du système de phagocytes mononuclées. On observe tout de même un décalage

significatif du Tmax (Tmax = 1 h dans le cas d’asrthinol en solution, Tmax = 30 min dans le cas

des nanosuspensions) qui démontre que l’accumulation dans la moelle osseuse ne se fait pas de

la même manière. De plus, cette différence de distribution peut aussi être corrélée au phénomène

d’adsorption des protéines plasmatiques à la surface des nanosuspensions. En effet, selon la

nature de polymère ou de tensioactif adsorbé à la surface des nanoparticules, il peut y avoir soit

augmentation de l’adsorption des protéines et ainsi leur capture par le SPM de l’organe

spécifique, soit diminution de cette adsorption et finalement diminution de leur capture par le

SPM (figure 22). Ces opsonines24 sont spécifiques à chaque organe du SPM et sont responsables

de l’initiation du processus de phagocytose des vecteurs nanoparticulaires par les macrophages

(Moghimi et Patel, 1989 ; 1990).

24 Opsonine : toute substance qui se lie à des antigènes et induit leur phagocytose par des macrophages ou des leucocytes neutrophiles.


96

Figure 22 — : Schéma de particule de nanosuspension recouverte par un surfactant ou un polymère. L’adsorption des protéines du sang est dépendante des propriétés de la couche de surfactant (ex : charge, hydrophobicité). En fonction de la nature des protéines adsorbées, la capture par SPM peut être augmentée ou réduite (Müller et coll., 2001).

Au niveau du foie, qui constitue la part la plus importante du SPM, les nanosuspensions

d’arsthinol s’accumulent d’une manière significative mais moins importante que dans la moelle

osseuse. L’accumulation des vecteurs colloïdaux dans le foie a été citée par de nombreux travaux.

Cette accumulation est d’autant plus importante que les particules sont hydrophobes (Edebo et

Richardson, 1985) et stables (Peters et coll., 2000 ; Gibaud et coll., 1994). L’adsorption de

poloxamer 407 comme nous l’avons réalisé est connue pour diminuer le ciblage hépatique

(Tröster et coll., 1990). A l’inverse, le rein n’est pas un organe du SPM et n’a pas les capacités

de concentrer les nanoparticules. Selon Illum et coll., (1987) les concentrations observées dans

cet organe pouvaient être la conséquence d’une adhésion des nanoparticules sur les cellules

endothéliales sans qu’il y ait de capture par les cellules.


97

4. Etude du métabolisme de l’arsthinol

4.1. Identification des métabolites

Dans l’optique d’un futur développement clinique, il a été nécessaire d’étudier le

métabolisme de l’arsthinol pour compléter son étude pharmacocinétique. On sait que les

métabolites méthylés du trioxyde d’arsenic minéral : acide monométhylarsonique (MAAV) et

acide diméthylarsinique (DMAAV) sont très toxiques et potentiellement cancérigène chez

l’homme. Ainsi, ils ont été classés dans le groupe 1 par l’IARC25.

Lorsque nous avons commencé le travail de spéciation des métabolites de l’arsthinol,

nous nous attendions à trouver des espèces d’arsenic organiques, inorganiques ou méthylées.

Hors, nous avons identifié deux métabolites organiques : l’acétarsol (pentavalent) et l’oxyde

d’acétarsol (trivalent) et aucun composé méthylé (par exemple : MAAV et DMAAV) n’a été

détecté. De plus, les quantités urinaires en acétarsol pentavalent sont importantes par rapport à

celles de l’oxyde d’acétarsol et de l’arsthinol. Ce résultat est plutôt favorable au profil

toxicologique de l’arsthinol. En effet, les arsenicaux organiques pentavalents sont moins

toxiques in vitro et affectent moins le système enzymatique (Gordon et Quastel, 1948).

Récemment, ce métabolite organique est officiellement classé avec d’autres composés

arsenicaux organiques dans le groupe 3 (cancérogénicité non classifiable, IARC). Toutefois, son

innocuité reste à démontrer.

4.2. Mécanisme de transformation de l’arsthinol

Le point innovant de notre travail, est que nous avons montré une nouvelle voie de

détoxification de l’arsenic organique trivalent en composé pentavalent plus soluble et moins

toxique. En effet, l’arsthinol peut être oxydé en composé pentavalent (acétarsol) sous l’action de

peroxyde d’hydrogène. Ce métabolite apparait dans les urines après administration intraveineuse

chez les souris.

In vivo, le peroxyde d’hydrogène est produit à partir de différentes réactions

enzymatiques (cf. Etude bibliographique, paragraphe 1.6., page 13). La xanthine oxydase qui est

largement distribué dans les tissus spécialement dans le foie et l’intestin, intervient dans la

production de H2O2 suite à la catalyse de la réaction d’oxydation de l’hypoxanthine en xanthine.

Nous avons constaté également qu’en présence de xanthine oxydase, l’arsthinol est transformé

25 IARC : International Agency for Research on Cancer


98

en acétarsol. En revanche, en absence de l’enzyme, l’acétarsol n’a pas été détecté. Ce résultat

laisse suggérer que la transformation de l’arsthinol en acétarsol in vivo pourrait être réalisée sous

l’action du peroxyde d’hydrogène généré par la réaction enzymatique.

99

Conclusion

Conclusion

100

Les dérivés organiques de l’arsenic ayant en commun une structure (2-phényl-[1,3,2]

dithiarsolane-4-yl)-méthanol ont tous montré des propriétés antileucémiques in vitro

supérieures à celles de l’anhydride arsénieux (As2O3) (Gibaud et coll., 2006). De plus, nous

avons pu identifier l’arsthinol utilisé dans les années 1950 notamment pour son activité

amoebicide comme le composé le plus intéressant.

Dans ce travail, nous avons pu montrer que l’arsthinol inhibe la croissance et induit le

processus d’apoptose des cellules NB4 de LAM3 et ceci à de faibles concentrations (≤ 5 µM).

Ce résultat prometteur peut conduire à d’éventuels essais précliniques sur des modèles

d’animaux leucémiques. Par exemple, le modèle de souris SCID (severe combined

immunodeficiency) sur lequel on greffe les cellules leucémiques ; pourrait être utilisé.

Récemment, ce modèle a été utilisé dans les essais précliniques pour évaluer les potentialités

antileucémiques du trioxyde d’arsenic et du mélarsoprol (Rousselot et coll., 2004). Ce modèle

a permis de confirmer in vivo les effets antileucémiques de ces composés.

Dans notre cas, l’utilisation éventuel de l’arsthinol dans les essais précliniques peut

être limitée du fait de sa solubilisation dans du propylène glycol. Cette formulation est peu

adaptée à des injections répétées par voie I.V. Pour ces raisons, nous avons préparé des

nanosuspensions d’arsthinol. Cette formulation galénique nous a offert deux

avantages majeurs : une diminution importante des concentrations en arsenic dans le système

nerveux central et ainsi qu’une accumulation de l’arsenic dans la moelle osseuse équivalente à

celle obtenue avec la forme libre de l’arsthinol. En outre, la vitesse de dissolution de

l’arsthinol en milieu aqueux s’est trouvée significativement améliorée. Ces nanosuspensions

sont facilement injectées et ne provoquent aucune douleur à l’animal contrairement à ce qui

peut être observé dans le cas de l’arsthinol en solution dans du propylène glycol.

Parallèlement à ces études, nous avons également étudié le métabolisme de l’arsthinol

qui nous a servi à comprendre le devenir de ce composé et l’effet que ses métabolites peuvent

avoir sur l’organisme après injection I.V. Deux métabolites de l’arsthinol ont été identifiés

dans l’urine de souris : l’acétarsol (pentavalent) et l’oxyde d’acétarsol (trivalent). D’après nos

essais chimique (en présence de H2O2) et biochimique (en présence de la xanthine oxydase),

nous avons constaté que le peroxyde d’hydrogène est fortement impliqué dans l’oxydation de

l’arsthinol en acétarsol. Il est donc maintenant évident que ce mécanisme de détoxification

joue un rôle important au même titre que la transformation hépatique de l’arsthinol en

Conclusion

101

glucurono-conjugués et par la complexation avec le glutathion qui avait été mise en évidence

par Gregus et coll., (2000).

102

Liste des figures

Figure 1 : Mécanismes d’action possibles du trioxyde d’arsenic sur la leucémie aiguë

promyélocytaire (LAM3).

Figure 2 : Diagramme représentant la voie apoptotique possible induite par le trioxyde

d’arsenic (As2O3) sur les cellules NB4.

Figure 3 : Structure chimique des composés arsenicaux inorganiques et méthylés.

Figure 4 : Structure chimique du mélarsoprol. Figure 5: Concentrations sériques de l’oxyde de mélarsène et du mélarsoprol en fonction du

temps, déterminées par chromatographie liquide à haute performance et comparées à celles de

l’arsenic déterminées par bioanalyse et par spectroscopie d’absorption atomique (SAA).

Figure 6 : Métabolites du mélarsoprol retrouvés dans la bile de rat.

Figure 7 : Schéma de synthèse des phényldithiarsolanes.

Figure 8 : Structure chimique de l’arsthinol. Figure 9 : (a) schéma représentant le processus d’homogénéisation à haute pression, (b) image

de l’homogénéisateur à haute pression Avestin EmulsiFlex®-B3 (Avestin, Inc., Ottawa,

Canada).

Figure 10 : Structure chimique du poloxamine.

Figure 11 : Nanosuspension d’atovaquone observée par microscopie électronique à

transmission (taille moyenne : 468 nm).

Figure 12 : Anatomie de la circulation sanguine dans la moelle osseuse.

Figure 13 : Schéma des différentes associations cellulaires constituant la moelle osseuse. Le

sinus vasculaire est constitué d’un endothélium, d’une membrane basale et de cellules

réticulaires adventices. Des cellules hématopoïétiques passent vers le compartiment vasculaire

103

et le macrophage périsinusal émet des prolongements dans la lumière sinusale. L’îlot

érythroblastique est constitué d’un macrophage entouré d’érythroblastes profondément insérés

dans le cytoplasme.

Figure 14 : Structure chimique des poloxamers 338 et 407. a : poly (oxyde d’éthylène); b :

poly (oxyde de propylène).

Figure 15 : Représentation schématique de la barrière hémato-encéphalique (BHE).

La barrière hémato-encéphalique est formée par les cellules endothéliales des capillaires

sanguins et est caractérisée par l'existence de jonctions serrées. Les prolongements

astrocytaires associés aux cellules endothéliales participent à la formation de la barrière

hémato-encéphalique.

Figure 16 : Structure chimique du polysorbate 80.

Figure 17 : Concentrations de doxorubicine (µg/g) dans le cerveau de rat après administration

intraveineuse. Nanoparticules de doxorubicine (5 mg/kg) recouvertes de polysorbate 80

(1%), Doxorubicine (5 mg/kg) en solution saline.

Figure 18 : Schéma de la réaction de clivage du substrat (Z-DEVD-R100) non-fluorescent par

les caspases-3/7 et libération de la rhodamine R-110 fluorescente.

Figure 19 : Activité des caspases-3/7 mesurée après traitement des cellules NB4 par

l’arsthinol ou le trioxyde d’arsenic. Les résultats sont exprimés en unité relative de

fluorescence (URF). Chaque valeur représente la moyenne ± écart-type (n = 3). Test de

Mann-Whitney (* p < 0,05 différence significative entre les deux traitements). T cellule :

témoin cellule (NB4).

Figure 20 : Activité des caspases-3/7 mesurée après traitement des cellules U937 par

l’arsthinol ou le trioxyde d’arsenic. Les résultats sont exprimés en unité relative de

fluorescence (URF). Chaque valeur représente la moyenne ± écart-type (n = 3). Test de

Mann-Whitney (p > 0,05 non significative). T cellules : témoin cellule (U937).

104

Figure 21 : Schéma représentant la liaison possible des dérivés arsenicaux (arsthinol et As2O3)

au site actif d’enzyme.

Figure 22 : Schéma de particule de nanosuspension recouverte par un surfactant ou un

polymère. L’adsorption des protéines du sang est dépendante des propriétés de la couche de

surfactant (ex : charge, hydrophobicité). En fonction de la nature des protéines adsorbées, la

capture par SPM peut être augmentée ou réduite.

105

Liste des tables

Tableau 1 : activité cytotoxique in vitro et dose létale 50 des différents dérivés de l’arsenic

organique et inorganique.

Tableau 2 : Excrétion urinaire et biliaire de l’arsenic chez le Rat et le Cobaye après

administration intraveineuse de l’arsthinol (dose d’arsenic injectée = 0,8 mg/kg).

106

Références bibliographiques


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Résumé :

L’arsthinol est un organoarsénié qui a été utilisé dans les années 1950 dans le traitement de l’amibiase et en dermatologie (pian). Ce composé commercialisé sous le nom de Balarsen® était relativement bien toléré en clinique. Récemment, des essais in vitro ont montré que l’arsthinol était plus actif sur les cellules leucémiques (U937 et K562) que le trioxyde d’arsenic inorganique et le mélarsoprol. Dans notre travail, l’activité antileucémique de l’arsthinol a été évaluée sur les cellules NB4 de leucémie aiguë promyélocytaire (LAM3). Nous avons constaté que ce composé inhibait la croissance et induisait l’apoptose de ces cellules à des concentrations ≤ 5µM. Cette activité sur les cellules NB4 est à peu près équivalente à celle obtenue avec le trioxyde d’arsenic. Nous avons par ailleurs mis au point des nanosuspensions d’arsthinol qui ont permis de diminuer considérablement les concentrations cérébrales en arsenic après injection I.V. chez la souris. A l’inverse, les concentrations d’arsenic dans la moelle osseuse sont restées importantes. De plus, l’arsthinol sous forme des nanosuspensions reste toujours actif sur les cellules NB4 de LAM3. En conséquence, cette distribution tissulaire des nanosuspensions d’arsthinol est plutôt avantageuse pour l’activité antileucémique de l’arsthinol. Enfin, nous avons identifié les métabolites de l’arsthinol dans l’urine de souris par CLHP-SM. Cette étude nous a permis de compléter la connaissance du métabolisme de l’arsthinol et de son élimination. Mots clés : Arsthinol, activité antileucémique, nanosuspensions, moelle osseuse, barrière hémato-encéphalique, métabolites, peroxyde d’hydrogène Abstract : The organoarsenical arsthinol (Balarsen®) was used in the 1950s in the treatment of amoebiasis and in dermatology and was considered as ‘highly tolerated’. Recent investigations have shown a very good efficiency of arsthinol on leukemic cells (U937 and K562) as compared with arsenic trioxide and melarsoprol. In the present work, we have assessed the anti-leukemic activity of arsthinol on acute promyelocytic leukemia NB4 cells as compared with As2O3. Our results have shown that arsthinol and As2O3 induced growth inhibition and apoptosis at low concentrations ≤ 5µM. Arsthinol is a promising drug for leukemia. However, this dithiarsolane is very poorly soluble in water. An alternative approach to overcoming problems such as solubility, local intolerability and risks of neurotoxicity is to develop nanosuspensions of the drug. The use of nanosuspensions of arsthinol after I.V. injection in mice has allowed us to reduce the cerebral concentration of the arsenical. In contrast, bone-marrow concentrations remained very high. Moreover, arsthinol nanosuspensions remained cytotoxic on NB4 cells. Finally, we have determined the metabolites of arsthinol in urine of mice. This study allowed us to complete the understanding on the mechanism of biotransformation and the elimination pathways of the drug. Keywords: Arsthinol, anti-leukemic activity, nanosuspensions, bone-marrow, blood-brain barrier, metabolites, hydrogen peroxyde

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Pharmacocinétique et optimisation galénique de