Persiapan contoh analisis gulaTujuan persiapan contoh analisis gula yaitu untuk memisahkan gula dari matrik bahan

pangan. hasil dari persiapan contoh ini digunakann untuk analisis total gula, analisis gula pereduksi, dan analisis gula non pereduksi. Contoh dipisahkan dari komponen yang dapat mengganggu analisis seperti senyawa nitrogen, lipida, fenolik, dan pigmen-pigmen yang larut. Pigmen (klorofil,karotenoid) dan lipida dipisahkan dengan mengekstrak dengan petroleum ether (gula tidak larut). Pigmen, senyawa berwarna, dan koloid juga dapat dihilangkan dengan arang aktif atau timbal asetat basa (Pb-asetat).protein dihilangkan dengan cara mengendapkan senyawa yang mengganggu penetapan gula metode reduksi dan kolorinetri dengan menambahkan etanol sehingga protein menggumpal kemudian dipisahkan dengan penyaringan atau pengendapan dengan logam-logam berat seperti Zn(OH)2.Contoh cair

Contoh dibuat basa dengan menambahkan CaCO3 sehingga asam-asam yang terdapat dalam contoh tidak menghidrolisis gula selama pemanasan contoh bertujuan untuk inaktivasi enzim-enzim penghidrolisis gula. Penambahan Pb-asetat basa untuk menghilangkan pigmen, senyawa berwarna, dan koloid.Contoh padat

Contoh diekstraksi dengan alkohol 80% untuk memisahkan gula dalam contoh dengan komponen lain. Kebanyakan gula sensitif terhadap alkohol konsentrasi tinggi, sehingga alkohol perlu dihilangkan dengan pemanasan rendah.Prosedur kerja pada persiapan contoh cair

1.    Contoh dimasukkan dalam gelas piala, tambahkan air destilata dan CaCO3.

2.    Didihkan contoh selama 30 menit, kemudian dinginkan.3.    Pindahkan contoh ke dalam labu takar 250 ml.

4.    Tambahkan contoh dengan 1,5-2,5 ml larutan Pb-asetat jenuh, sampai larutan menjadi jernih.5.    Tepatkan volume larutan contoh sampai tanda tera dengan air destilata.6.    Kocok dan saring dengan kertas saring.

7.    Ambil filtrate contoh ke dalam gelas piala yang lain. Tambahkan Na-oksalat kering ke dalam filtrate contoh untuk mengendapakan Pb.

8.    Saring kembali filtrate contoh.9.    Filtrate siap digunakan untuk analisis karbohidrat.

Persiapan contoh padat1.      20 g contoh padat dalam gelas piala, tambahkan 20 ml alkohol 80%.2.      Hancurkan contoh dengan waring blender sampai semua gula terekstrak.3.      Pindahkan hancuran contoh ke dalam gelas piala lain secara kuantitatif.4.      Saring contodan pindahkan filtrate yang diperoleh ke dalam gelas piala lain.5.      Cuci sisa padatan pada kertas saring dengan alkohol 80% sampai seluruh gula terlarut masuk kedalam fasofiltrat.6.      Ukur nilai pH dari filtrat contoh. Bila asam, tambahkan CaCO3 sampai basa dan panaskan pada penangas air 100oC selama 30 menit.7.      Saring contoh dengan kertas saring whatman nomer 2.8.      Uapkan alkohol dari contoh dengan memanaskan filtrat pada penangas air 85oC.9.      Jika masih ada endapan,saring kembali contoh.10.  Pindahkan filtrate kedalam labu takar 250 ml. tepatkan volume sampai tanda tera dengan air destilata.11.  Kocok labu takar, saring, dan ambil filtratnya.

12.  Tambahkan Na-oksalat kering sebanyak 1,5 g untuk mengendapkan Pb dan saring kembali contoh.

Analisi total gula metode AnthroneGula dapat beraksi dengan sejumlah pereaksi menghasilakn warna spesifik dimana

intensitas warna dipengaruhi oleh konsentrasi gula. Pereaksi anthrone bereaksi dengan karbohidrat dalam asal sulfat pekat mengahsilkan warna biru kehijauan. Intensitas absorbansnya diukur pada 630 nm pereaksi anthrone (9,10-dihidro-9-oksoantrasena) 0,1% dalam asam sulfat pekat.

Prosedur kerjaPembuatan kurva standar.1.    Kedalam tabung reaksi bertutup, pipet larutan glukosa standar sebanyak 0,2;0,4;0,6;0,8; dan 1,0

ml (glukosa standar 0,2 mg/ml), lalu encerkan sehingga total volume masing-masing tabung 1,0 ml.

2.    Buat larutan blanko dengan cara memipet 1 ml air destilata ke dalam tabung reaksi lain.3.    Tambahkan pereaksi 5 ml Anthrone dengan cepat ke dalam larutan glukosa standard an blanko

kemudian tutup. Voertex dan kocok hingga merata.4.    Panaskan tabung reaksi di atas penangas air 100oC selama 12 menit. Dinginkan 5.    Pindahkan larutan ke dalam kuvet dan baca absorbans dengan UV-Vis spektrofotometer pada

630 nm.6.    Buat plot kurva yaitu konsentrasi (g) glukosa standar pada sumbu x dan nilai absorbans pada

sumbu y.

Analisis total gula (metode anthrone)Analisis contoh

1.    Lakukan pengenceran contoh2.    Masukkan sebanyak 1ml contoh kedalam tabung reaksi tertutup3.    Lakukan tahap seperti pada pembuatan kurva standar

PerhitunganTentukan konsentrasi gula dengan kurva standar dan hitung pengenceran yang dilakukan

Total gula (%) = DimanaG = konsentrasi gula dari kurva standar (gram)FP = faktor pengenceranW = berat contoh (gram)

Analisis total gula (metode fenol)Metode ini digunakan untuk menetapkan total gula semua bahan pangan. Langkah yang

harus dilakukan adalah menyiapkan contoh untuk analisis. Pada metode ini gula sederhana, oligosakarida, plisakarida dan turunannya dapat bereaksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna orany kekuninggan yang stabil.

Prosedur:

Pembuatan kurva standar1.    Ambil sebanyak 2ml larutan pada beberapa konsentrasi2.    Tambahkan 1ml larutan fenol (5%), lakukan vorteks3.    Tambahakan 5 ml larutan asam sulfat pekat dengan cepat secara tegak lurus kepermukaan cairan4.    Diamkan selama 10 menit, vorteks, dan tempatkan dalam penangas air selama 15 menit5.    Ukur absorbansnya pada 490nm untuk hekstosa sedangkan untuk pentosa dan asam uronat 480

nm.6.    Buat plot kurva standar. Lalu tentukan persamaan regresi linier.

Analisis contoh1.    Lakukan pengenceran contoh2.    Masukkan 2ml contoh ke dalam tabung reaksi dan lakukan tahap seperti pada pembuatan kurva

standar.Perhitungan:Konsentrasi gula ditentukan dengan menggunakan kurva standar.Perhitungan pengenceran

Total gula (%) = Dimana:G = konsentrasi gula dari kurva standart (gram)FP = faktor pengenceranW + berat contoh (gram)

Analisis gula reduksimetode lane-eynonKonsentrasi gula pereduksi dalam bahan pangan dapat ditentukan berdasarkan

kemampuannya untuk mereduksi pereaksi lain. Analisis metode ini dilakukan secara volumetri dengan titrasi/tetrimetri. Kegunaan metode ini untuk menentukan gula reduksi dalam bahan padat dan cair. Metode ini didasarkan pada reaksi reduksi pereaksi fehling oleh gula-gula perduksi. Penetapan gula pereduksi adalah pengukuran volume larutan pereduksi standar yang dibutuhkan untuk mereduksi pereaksi tembaga (III) oksida (Cu2O). Udara yang mempengaruhi reaksi dikeluarkan dari campuran reaktan dengan cara mendidihkan selama titrasi.Titik akhir titrasi ditunjukkan dengam metilen blue yang warnanya akan hilang karena adanya kelebihan gula.Reaksi kimia yang terjadi selama analisisR-COH (gula pereduksi) +CU2+ → RCOOH (gula teroksidasi) +CU+

Pereaksi :Fehling A berisi tembaga (III) yaitu CuSO4 . 5H2O dan H2SO4

Fehling B berisi garam Rochelle atau potasium sodium tartat tetrahidrat

Prosedur kerjastandarisasi larutan fehling

1.    Masukkan 10 ml laruta campuran Fehling A dan B kedalam erlenmeyer dan tambah 2-4 tetes metilen blue 0,2%.

2.    Kemudian lakukan tahapan seperti pada analisis contoh.

Analisis contoh

1.    Campurkan larutan fehling A dan B dengan volume yang sama2.    Pipet 10 ml larutan dari hasil persiapan contoh kedalam erlemeyer3.    Tambahkan kedalam erlenmeyer 10 ml larutan campuran fehling A dan B serta 2-4 tetes metilen

blu 0,2 %.4.    Panaskan campura larutan di atas hot plate magnetic stirrer5.    Setelah mendidih, lakukan titrasi sengan larutan gula standart sampai warna biru hilang6.    Titrasi dilakukan dengan cepat, maka perlu ditambahkan larutan glukosa standar dengan volume

tertentu.

Perhitungan

Gula pereduksi (%) = DimanaVo = volume larutan glukosa standar untuk titrasi larutan Fehling (ml)Vs = volume larutan glukosa standar untuk titrasi contoh (ml)G = konsentrasi larutan glukosa satandar (g/ml)Ts = volume contoh total dari persiapan contoh (ml)T = volume contoh yang diperlukan untuk titrasi (ml)W = berat contohF = faktor pengenceran

Analisis gula reduksi (metode nelson-somogyl)Metode ini digunakan untuk menentukan gula pereduksi dalam bahan padat atau cair.

Tetapi perlu dilakukan persiapan contoh gula terlebih dahulu. Metode ini didasarkan pada reaksi reduksi pereaksi tembaga sulfat oleh gula-gula pereduksi. Gula perdeuksi mereduksi pereaksi tembaga (II) basa menjadi tembaga (I) oksida (Cu2O) dengan arsenomolibdat membentuk senyawa kompleks berwarna. Pereaksi tembaga sulfat mengandung Na2HPO 4, sodim potasium tartarat, NaOH, CuSO4, NaSO4. Sedangkan pereaksi arsenomolibdat mengandung amonium molibdat H2SO4, Na2H2SO4.7H2O.

Analisis Gula Reduksi (Metode Nelson - Somogyi)Prosedur kerja :

1.    Pipet sebanyak 2 ml larutan dari hasil persiapan contoh ke dalam tabung reaksi, tambahkan 2 ml pereaksi tembaga sulfat dan tutup tabung reaksi

2.    Tempatkan tabung reaksi dalam penangas air 100oC selama 10 menit, kemudian dinginkan selama 5 menit dalam air mengalir

3.    Tambahkan 1 ml pereaksi arsenomolibdot, vortex.4.    Encerkan samapi volume tertentu antara 10 – 25 ml, tergantung kepekatan warna larutan5.    Ukur absorbans pada 250 nm6.    Blanko dibuat dengan cara yang sama seperti tahapan diatas, kecuali contoh diganti dengan cair7.    Buat kurva standar dari larutan glukos standar dengan cara yang sama seperti analisis contoh.

PerhitunganKandungan gula pereduksi dalam contoh ditentukan dengan menggunakan kurva standar

(hubungan antara konsentrasi gula standar dengan absorbans) dan memperhitungkan pengenceran yang dilakukan. Apabila kandungan gula pereduksi diketahui, maka kandungan

gula non – pereduksi dapat ditentukan sebagai selisih antara kadar total gula dengan kadar gula pereduksi.

Total gula = gula pereduksi + gula non – pereduksiAnalisis Total Pati, Amilosa, Amilopektin

Kandungan pati dalam bahan pangan dapat ditentukan secara volumetric / titrimetri atau kalorimetri. Penentuan pati dengan cara menghidrolisis pati secara sempurna menjadi glukosa. Hidrolisis pati menjadi gula :1.      Perlakuan asam : memecah ikatan glikosidik yang mehubungkan antar glukosa

2.      Secara enzimatis (enzim -amilase dan glukoamilase) : enzim memecah molekul – molekul amilosa dan amilopektin menjadi gula sederhana.

Kandungan glukos dapat ditentukan dengan menggunakan metode penetapan gula seperti metode Anthrone, metode ferol, dll. Kandungan pati ditentukan menggunakan factor pengali (0,9), dimana kandungan pati adalah kandungan glukosa x 0,9.

Kandungan amilosa ditentukan berdasarkan kemampuan amilosa untuk bereaksi dengan senyawa iod untuk menghasilkan kompleks berwarna biru. Intensitas warna biru tergantung pada kadar amilosa dan dapat ditentukan secara spektrofotometri. Kandungan amilopektin ditentukan sebagai selisih antara kandungan pati dengan amilosa.

Pati = amilosa + amilopektinProsedur Kerja Analisis Total PatiPersiapan Contoh

1.        Masukkan sebanyak 2 – 5 g contoh padat atau cair ke dalam gelas (untuk contoh padat perlu dihaluskan dahulu)

2.        Tambahkan ke dalam gelas piala sebanyak 50 ml alkohol 80%. Aduk selama 1 jam3.        Saring suspensi yang terbentuk dengan kertas saring dan cuci dengan air sampai volume filtrat

250 ml (filtrat ini mengandung karbohidrat yang larut dan dibuang)4.        Untuk menghilangakn lemak, cuci pati yang terdapat sebagai residu dengan 10 ml eter

(sebanyak 5 kali). Saring setiap pencucian dengan kertas saring. Biarkan menguap eter yang tersisa dalam residu.

5.        Cuci lagi residu dengan 150 ml alkohol 10% untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat yang terlarut.

6.        Pindahkan residu secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam gelas piala dengan cara pencucian dengan 200 ml air. Tambahkan 20 ml HCl 25%.

7.        Tutup suspensi residu di dalam gelas piala dengan pendinginan balik (kondensor). 8.        Setelah didinginkan, netralkan larutan yang terbentuk dengan larutan NaOH 45% dan masukkan

ke dalam labu takar 500 ml secara kuantitatif.9.        Tepatkan larutan sampai tanda tera dengan menggunakan air destilat.10.    Saring kembali larutan dengan menggunakan kertas saring.

Analisis contoh Filtrate diperoleh dari persiapan contoh dianalisis kadar glukosa dengan menggunakan

analisis gula pereduksi (metode Lane – Eynon atau Nelson - Somogyi).Perhitungan

Berat pati dalam contoh diperoleh dengan mengalikan berat glukosa dengan 0,9. Angka 0,9 adalah factor konversi untuk pembentukan glukosa dari hidrolisis pati.

Prosedur Kerja Analisis AmilosaPembuatan kurva standar

1.    Timbang sebanyak 40 mg amilosa murni dan masukkan ke dalam tabung reaksi.2.    Tambahkan ke dalam tabung reaksi 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1N. 3.    Panaskan tabung reaksi di dalam air mendidih sekitar 10 menit sampai semua amilosa

membentuk gel.4.    Setelah didinginkan, pindahkan campuran secara kuantitatif ke dalam labu takar 100ml dan

tepatkan dengan air sampai tanda tera5.    Pipet gel amilosa (beberapa seri konsentrasi) ke dalam labu takar 100ml6.    Tambahkan ke dalam masing – masing labu takar asam asetat 1N, kemudian tambahkan masing

– masing 2 ml larutan iod.7.    Tepatkan larutan iod dengan air hingga tanda tera.8.    Setelah didiamkan selama 20 menit, ukur absorbans dari intensitas warna biru dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm.9.    Buat kurva standar sebagai hubungan antara kadar amilosa (sumbu x) dengan absorbans (sumbu

y)

Analisis contoh1.    Gunakan contoh tepung yang mengandung pati (apabila contoh mengandung komponen lain

maka pati perlu diekstrak dahulu)2.    Timbang sebanyak 100mg contoh dan masukkan ke dalam tabung reaksi3.    Tambahkan ke dalam tabung reaksi 1ml etanol 95% dan 9ml NaOH 1 N.4.    Panaskan tabung reaksi selama 10 menit untuk menggelatinisasi pati5.    Setelah didinginkan, masukkan pasta pati ke dalam labu takar 100ml dan tepatkan hingga tanda

tera dengan menggunakan air6.    Pipet larutan pati tersebut dan dimasukkan ke dalam labu takar 100ml, lalu ditambahkan asam

asetat 1N, 2 ml larutan iod, dan air hingga tanda tera7.    Setelah didiamkan selama 20 menit, ukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada 625 nm.

PerhitunganKadar amilosa ditentukan dengan menggunakan kurva standar, dengan menggunakan rumus :

Kadar amilosa (%) = Keterangan:C = konsentrasi amilosa contoh dari kurva standar (mg / ml)V = volume akhir contoh (ml)FP = factor pengaliW = berat contoh (mg)*Kadar amilopektin (%) = kadar pati (%) – kadar amilosa (%)

Analisis Karbohidrat Yang Tidak Dapat DicernaAnalisis Karbohidrat Yang Tidak Dapat Dicerna yaitu meliputi Analisis serat kasar

(crude fiber) dan analisis serat makanan (dietary fiber).Serat kasar ditentukan dari residu setelah contoh diperlakukan dengan asam dan basa kuat. Serat makanan ditentukan berdasarkan kadar acid detergent fiber (ADF) dan neutral detergen fiber (NDF). ADF itu sendiri terdiri dari sebagian besar selulosa dan lignin, dan sebagian kecil

hemiselulosa dan substansi pektat sehingga umumnya dianggap sebagai selulosa dan lignin. NDF terdiri dari selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Penetapan lignin yaitu dengan metode klason. Sedangkan penetapan substansi pekat dengan metode spektrifotometer. Kadar hemiselulosa diperoleh dengan menghitung selisih kadar NDF dengan kadar ADF. Kadar selulosa diperoleh dengan menghitung selisih kadar ADF dan kadar Lignin. Total serat makanan dihitung dengan menjumlahkan kadar NDF dengan kadar substansi pektat. Serat kasar yaitu residu dari bahan makanan yang telah diperlakukan dengan asam dan alkali mendidih. Terdiri dari selulosa, sedikit lignin dan pentosa.Prosedur Kerja1.      Giling contoh sampai halus sehingga dapat melewati saringan berdiameter 1 mm. Bila contoh tidak dapat dihaluskan, maka digiling hingga homogen.2.      Timbang sebanyak 2 gram contoh dan ekstrak lemaknya dengan menggunakan soxhlet dengan pelarut petrolium eter.3.      Pindahkan contoh yang sudah bebas lemak secara kuantitatif ke dalam erlenmeyer. Tambahkan 0,5 g asbes yang telah dipijarkan dan 2 tetes zat anti buih.4.      Tambahkan ke dalam erlenmeyer sebanyak 200 mL larutan H2SO4 mendidih.5.      Letakkan erlenmeyer di dalam pendingin balik.6.      Didihkan contoh di dalam erlenmeyer selama 30 menit dengan sesekali digoyang-goyangkan.7.      Setelah selese saring suspensi dengan kertas saring.8.      Cuci residu yang tertinggal dengan air mendidih. Pencucian dilakukan hingga air cucian tidak bersifat asam lagi (diuji dengan kertas lakmus).9.      Pindahkan residu secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam erlenmeyer kembali.10.  Cuci kembali sisa residu di kertas saring dengan 200 mL larutan NaOH mendidih sampai semua residu masuk ke dalam erlenmeyer.11.  Didihkan kembali contoh selama 30 menit dengan pendingin balik sambil sesekali digoyang-goyangkan.12.  Saring kembali contoh melalui kertas saring yang diketahui beratnya sambil dicuci dengan K2SO4 10%.13.  Cuci residu di kertas saring dengan air mendidih kemudian dengan alkohol 95%.14.  Keringkan kertas saring dalam oven 1100C sampai 1-2 jam.15.  Setelah didinginkan dalam desikator, timbang contoh.16.  Hitung berat residu serat kasar dengan menghitung selisih antara berat contoh dan kertas saring dengan berat kertas saring.Perhitungan

Kadar serat kasar (g/100 g contoh) = Dimana : W2 = berat residu dan kertas saring yang telah dikeringkan (g)

W1 = Berat kertas saring W = berat contoh yang dianalisis.

Analisis ADF (Acid Detergent Fiber)Dengan mengekstrak contoh dengan lrutan ADF (setiltrimetil amonium bromida dalam

H2SO4 1 N) sehingga seluruh komponen selain komponen ADF larut. Komponen yang tidak larut disaring, dikeringkan, ditimbang, dan dikoreksi dengan kandungan mineral yang ada dalam

komponen (dengan cara menyabunkannya sehingga yang tinggal hanya mineralnya). Kadar ADF dinyatakan sebagai selisih antara berat residu kering setelah perlakuan dengan larutan ADF dengan berat abu dibagi dengan berat awal contoh (dinyatakan dengan persen).

Analisis NDF (Neutral Detergent Fiber)Dengan mengekstrak contoh dengan larutan NDF (terdiri dari campuran EDTA, Na2B2O710H2O, laurit sulfat, Na2HPO, dan 2-etoksi-etanol) sehingga seluruh komponen selain komponen NDF larut. Komponen yang tidak larut disaring, dikeringkan, ditimbang, dan dikoreksi dengan kandungan mineral yang ada dalam komponen. Sampel yang mengandung pati maka pati akan dihidrolisis dahulu dengan enzim a-amilase (karena pati menyulitkan pada proses penyaringan). Kadar NDF dinyatakan sebagai selisih antara berat reidu kering setelah perlakuan dengan larutan NDF dengan berat abu dibagi dengan berat awal contoh (dinyatakan dalam persen).

Analisis Serat Makanan (Dietary Fiber)Analisis Lignin Dengan mengekstrak contoh dengan larutan ADF sehingga seluruh komponen selain

selulosa dan lignin larut. Selulosa yang ada dalam residu kemudian dihidrolisis dengan menggunakan H2SO4 72% sehingga yang tertinggal dalam residu hanya Lignin. Residu disaring, dikeringkan, ditimbang, dan dikoreksi dengan kandungan mineral yang ada dalam komponen. Kadar lignin dinyatakan sebagai elisih antara berat residu kering yang mengandung lignin dengan berat abu dibagi dengan berat awal contoh (dinyatakan dalam persen).

Analisis Substansi PEKTATMetode spektrofotometri didasarkan atas reaksi antara O-hidroksidifenil dengan

anhidrogalakturonat menghasilkan warna yang dapat diukur pada panjang gelombang 520 nm. Substansi pektat dihidrolisis dengan enzim pektinase sehingga asam galakturonat. Metode gravimetri yaitu dengan pektin yang telah diekstrak dari contoh disoponifikasi dengan alkali dan diendapkan sebagai kalsium pektat dengan menambahkan kalsium klorida dalam suasana asam. Endapan kalsium pektat dicuci sampai bebas klorida, kemudian dikeringkan dan ditimbang beratnya.