Periodico della Società Italiana di Citometria ...gic.casaccia.enea.it/lett-gic/LG 013-1/letter GIC 1-13 3.pdf · Incontro di Aggiornamento per l’idoneità all’esame per l

Identificazione del CD66c/CEACAM6 come antigenetumore associato con capacità funzionali nel carcinomadel colon-retto

Valutazione in Citometria a Flusso della malattia minimaresidua nelle Leucemie dell’adulto

News in Bibliografia ......

P e r i o d i c o d e l l a S o c i e t à I t a l i a n a d i C i t o m e t r i a

Aprile 2013Vol. 22, Num. 1PosteItalianeS.p.A.-Sped.inAbb.Postale-D.L.353/2003(Conv.inL.27/02/2004n.46)art.1com.1-DCB-RomaISSN2280-8663

Programma preliminareXXXI CONFERENZA NAZIONALE DI CITOMETRIA

LA CITOMETRIA DALLA RICERCAALLA CLINICAPalazzo Ducale - Lucca 8-11 ottobre 2013

DIRETTORE RESPONSABILERaffaele De Vita

COMITATO EDITORIALEMarco DanovaDipartimento di MedicinaA.O. di PaviaS.C. di Medicina Interna e Oncologia MedicaOspedale Civile di VigevanoRaffaele De VitaUnità Biologia delle Radiazioni e Salute dell’UomoENEA - Centro Ricerche CasacciaRomaEugenio ErbaIstituto Ricerche Farmacologiche “Mario Negri”MilanoGiuseppe StaraceIstituto Medicina Sperimentale CNRRoma

Volume 22, numero 1 - Aprile 2013

Lettere GICPeriodico della Società Italiana di CitometriaAutorizz. del trib. di Roma n° 512/92 del 17/9/92Edizione quadrimestraleSpedizione in abbonamento postale

Peer Review JournalISSN 2280-8663

Grafica: Renato Cafieri

Stampa:

Redazione:

c/o Unità Biologia delle Radiazioni eSalute dell’UomoENEA Centro Ricerche Casaccia, s.p. 016Via Anguillarese, 301 - 00123 ROMA� 06/30484671 Fax 06/30484891e-mail: [email protected]://biotec.casaccia.enea.it/GIC/

SocietàItaliana diCitometria

In copertina: dal lavoro “Identificazione del CD66c/CEACAM6 come antigene tumore associato con capacità funzio-nali nel carcinoma del colon-retto” Marica Gemei, Peppino Mirabelli, Rosa Di Noto, Luigi Del Vecchio.Espressione del CD66c nelle cellule staminali del colon normale e dei tumori al colon-retto. Nel tessuto nor-male le espressioni del CD66c e del marcatore di staminalità CD133 sono mutualmente esclusive (3a), mentre neicampioni tumorali i due marcatori correlano positivamente (3b).

Aprile 2013

Periodico della Società Italiana di Citometria

Vol. 22, Num. 1

Associato allaUnione StampaPeriodica Italiana

SOMMARIO

Programma preliminareXXXI Conferenza Nazionale di Citometria 6Palazzo Ducale - Lucca 8-11 ottobre 2013

Qualifica di Citometrista 12Percorso di formazione e certificazione

Scheda abstract 13XXXI Conferenza Nazionale di Citometria

Corso di Formazione FAD accreditato ECM 14Metodologie Citometriche nella Biologia e nella Clinica

In memoria di Guido Pagnucco 15Matteo Della Porta

Identificazione del CD66c/CEACAM6 come antigenetumore associato con capacità funzionali nelcarcinoma del colon-retto 19Marica Gemei, Peppino Mirabelli, Rosa Di Noto, Luigi Del Vecchio

Valutazione in Citometria a Flusso della malattiaminima residua nelle Leucemie dell’adulto 25Annamaria Tenore, Cristina Picone, Erica Consensi, Laura Vanelli,Matteo G Della Porta

News in Bibliografia 30a cura di “Marty DV.”

Viaggiango per Convegni 31a cura del “Viaggiatore”

Lettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013 SOMMARIO 5

Zona Industriale Settevene - Nepi (VT)Tel. 0761527323 - Fax 0761527323

6 PROGRAMMA PRELIMINARE Lettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013

XXXI CONFERENZA NAZIONALEDI CITOMETRIA

La Citometria dalla Ricerca alla ClinicaPalazzo Ducale - Lucca, 8 -11 ottobre 2013


Martedì 8 ottobre

Incontro di AggiornamentoIdoneità all’esame per l’iscrizione all’Albo dei Citometristi

8.30-13.00 Gli obiettivi scientifico-professionali e i programmi di formazione ed aggiornamento GICGiuseppe Gaipa (Monza), Giuliano Mazzini (Pavia)

Qualifica di Citometrista: percorso di formazione e certificazioneRaffaele De Vita (Roma)

La figura professionale in attività di ricercaIgea D’Agnano (Roma)

La figura professionale nelle applicazioni clinicheGiuseppe Pirozzi (Napoli)

Come rendere la Citometria una disciplina compiutaLuigi Del Vecchio (Napoli)

Discussione

Colloqui con caffè

Conferenza

14.00 Registrazione e allestimento poster

SESSIONE PLENARIA

15.00-17.30 Seminari introduttiviImmunoematologia e Metodologie Analitiche

17.30 Apertura dei lavori e saluto Autorità

Lettura MagistraleLa Citofluorimetria per guidare il trattamento delle leucemie acuteDario Campana (Singapore)

Brindisi di Benvenuto

Programma Preliminare

7PROGRAMMA PRELIMINARELettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013

Mercoledì 9 ottobre

8.30-13.00 SESSIONE PLENARIA

Finestra con vista: struttura, funzione e trasporto di farmaci nel cervello osservati intempo reale ed in TechnicolorGian Michele Ratto (Pisa)

L’approccio cromosomico in genomica: la separazione di cromosomi tramite flow sortingconsente un grande passo in avanti nell’analisi di genomi complessiJaroslav Doležel (Olomouc)

Ruolo della citometria nella diagnostica delle biopsie linfonodaliFrancesco Lanza (Cremona)

Discussione

11.00-13.00 PROGETTI GIC

Progetto GIC 1: Immunofenotipizzazione delle Leucemie Acute in citometria a flusso:indirizzi metodologici e valore clinicoGiuseppe Gaipa (Monza)

Progetto GIC 2: Standardizzazione delle metodiche di valutazione delle cellule endotelialicircolanti e dei progenitori endoteliali circolanti tramite analisicitofluorimetrica. Studio della Società Italiana di CitometriaMatteo Della Porta (Pavia)

Progetto GIC 3: Qualifica di citometrista: percorso di formazione e certificazioneRaffaele De Vita (Roma)

14.00-17.00 SESSIONI PARALLELE

Parallela 1 SIMPOSIO INTERSOCIETARIO ONCOLOGIA (GIC/AIOM/ASMO/GOIRC):Le Cellule Tumorali Circolanti: dalle innovazioni in campo analitico allericadute nell’ambito degli studi clinici in oncologia medicaCoordinatore: Marco Danova (Vigevano) (GIC)

L’analisi delle Cellule Tumorali Circolanti: l’impatto clinico in oncologiaEditta Baldini (Lucca) (AIOM)

Le Cellule Tumorali Circolanti: nuovi biomarkers negli studi clinici in oncologiaSergio Palmeri (Palermo) (ASMO)

Le cellule tumorali circolanti nel carcinoma polmonare non a piccole cellule:l'esperienza di ParmaCecilia Bozzetti (Parma) (GOIRC)

Comunicazioni orali

Sessione poster con caffè

Parallela 2 IMMUNOLOGIA

Caratterizzazione delle cellule dendritiche circolanti in gravidanza fisiologicae patologicaSilvia Della Bella (Milano)

Regolazione recettore mediata dell’homing delle cellule NK umaneEmanuela Marcenaro (Genova)

Comunicazioni orali



Giovedì 10 ottobre


Standardizzazione dell’analisi citofluorimetrica nelle leucemie acuteLuigi Del Vecchio (Napoli)

Le microtecnologie del silicio per nuove prospettive analitiche in biologia cellulareGiuliano Mazzini (Pavia)

La citometria nel laboratorio di ricerca oncologica di baseIgea D’Agnano (Roma)

Discussione


Parallela 3 METODOLOGIE

Analisi della migrazione cellulare mediante sorting citometricoGiuseppe Pirozzi (Napoli)

Una nuova metodica citofluorimetrica per la misura dell’aggregazione piastrinicaSergio Rutella (Roma)

Comunicazioni orali

Parallela 4 IMMUNOLOGIA

CD39 ed immunoregolazione: non solo Treg CD4+Daniela Fenoglio (Genova)

Nuovi aspetti della comunicazione linfocitaria nel pathway apoptoticoFrancesca Luchetti (Urbino)

Comunicazioni orali


Parallela 5 SIMPOSIO INTERSOCIETARIO EMATO-ONCOLOGIA (GIC/ SIE/ SIES/ AIEOP)La misura della malattia residua minima in Oncoematologia: avanzamenti neimetodi ed evidenze in clinicaCoordinatore: Giuseppe Gaipa (Monza) (GIC)

Determinazione della malattia minima residua nelle leucemie mieloidi acutecome potenziale end-point surrogatoAdriano Venditti (Roma) (SIE)

La leucemia mieloide cronica: il paradigma di come il monitoraggio della MRDsia critico per il successo della terapiaSimona Soverini (Bologna) (SIES)

La malattia minima residua nelle leucemie linfoblastiche acute pediatricheGiuseppe Gaipa (Monza) (AIEOP)

Comunicazioni orali


Parallela 6 SCIENZE AMBIENTALI

Detection di batteri patogeni del cavo orale mediante anticorpi in citometria a flussoAnita Manti (Urbino)

9PROGRAMMA PRELIMINARELettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013

FISHIS: come la citometria a flusso può usare la FISH per sviluppare nuovecapacità di analisi e flow sortingSergio Lucretti (Roma)

Comunicazioni orali


Assemblea dei Soci GICPremi di Studio GIC 2013Premi Poster GIC 2013Rinnovo cariche sociali

Evento sociale

Venerdì 11 ottobre


Parallela 7 EMATOLOGIA

Valutazione qualitativa e funzionale delle cellule staminali ematopoietichecriopreservateRiccardo Saccardi (Firenze)

Patologia molecolare della leucemia linfatica cronicaGianluca Gaidano (Novara)

Comunicazioni orali

Parallela 8 ONCOLOGIA

L’infiltrato immunitario tumorale come marcatore prognosticoPaolo Ascierto (Napoli)

Immunità innata e progressione tumorale: un punto di vista citofluorimetrico!Achille Anselmo (Rozzano)

Comunicazioni orali


LA CITOMETRIA IN IMMUNOTERAPIA E NELLA DIAGNOSTICA

Anticorpi immunomodulanti per il trattamento delle neoplasie solideMichele Maio (Siena)

La citometria nel Laboratorio di diagnosticaGiuseppe Basso (Padova)

Discussione

12.30-13.00 Conclusioni e Sorteggio - Premiazione delle Schede di valutazione della Conferenza

I contributi scientifici saranno presentati sotto forma di relazioni su invito, comunicazio-ni orali e poster. Gli abstract devono essere redatti in inglese, secondo le indicazioni innota dell’apposita scheda disponibile nel sito Internet del GIC, ed inviati per fax edanche via e-mail come file allegato, elaborati in Word.Gli abstract per le presentazioni orali dovranno pervenire alla Segreteria GIC entro il 31maggio, mentre quelli per i poster dovranno essere inviati entro e non oltre il 26 luglio2013. L’accettazione degli abstract verrà comunicata, agli Autori via e-mail.


Gli abstract accettati saranno pubblicati in un fascicolo della rivista CYTOMETRY.Saranno assegnati 4 “Premi Poster GIC” in diverse discipline.Nell’ambito della Conferenza è prevista l’annuale Assemblea Sociale GIC e la presenta-zione di materiale e di apparacchiature da parte delle principali Aziende del settore.

I Soci GIC, partecipanti alla Conferenza, potranno iscriversi (con una quota ridotta) alCCoorrssoo EECCMM FFAADD 22001133 “Metodologie Citometriche nella Biologia e nella Clinica”.

QQuuaalliiffiiccaa ddii CCiittoommeettrriissttaa:: ppeerrccoorrssoo ddii ffoorrmmaazziioonnee ee cceerrttiiffiiccaazziioonneeIInnccoonnttrroo ddii AAggggiioorrnnaammeennttoo ppeerr ll’’iiddoonneeiittàà aallll’’eessaammee ppeerr ll’’ iissccrriizziioonnee

aallll’’AAllbboo ddeeii CCiittoommeettrriissttiiIl GIC intende istituire un Albo per la figura professionale di Citometrista, suddiviso perspecifici settori disciplinari. Si svolgerà un Incontro di Aggiornamento, riservato ai Socicon una specifica e documentata esperienza professionale, che dovranno evidenziarenell’apposita scheda, insieme al CV e alla domanda d’iscrizione. L’Incontro sarà seguitoda un colloquio individuale, nel cui ambito sarà valutato il profilo professionale delCandidato. L’Incontro si svolgerà solo se perverranno almeno 5 iscrizioni.Sarà rilasciato un attestato di partecipazione all’Incontro e agli idonei un certificato diammissione all’esame per l’iscrizione all’Albo.

RRiieeppiillooggoo ssccaaddeennzzee3311 mmaaggggiioo scheda iscrizione per quota ridotta e abstract per comunicazioni

orali e poster3300 ggiiuuggnnoo scheda e CV per Incontro Albo Citometristi2266 lluugglliioo abstract per poster e prenotazione alberghiera1100 sseetttteemmbbrree prenotazione per le visite culturali

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La Conferenza è organizzata sotto l’Alto Patronato del Presidente della Repubblica

con il Patrocinio di

ENEA Agenzia nazionale per le nuove tecnologie,l’energia e lo sviluppo economico sostenibile

CNR Consiglio Nazionale delle Ricerche

Istituto Superiore di Sanità

Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri”

Istituto Nazionale Tumori “Fondazione G. Pascale”

Stazione Zoologica “Anton Dohrn”

Società Italiana di Immunologia Clinica e Sperimentale

Comune di Lucca

Con il Patrocinio ed il supporto della Provincia di Lucca

Segreteria OrganizzativaItalymeeting s.r.l.Via Parsano, 6/b - 80067 Sorrento NAtel. 081 8073525 – 081 8784606fax 081 8071930e-mail: [email protected]://www.italymeeting.it

Segreteria ScientificaSocietà Italiana di Citometria c/o Unità Biologia delle Radiazioni e Salute dell’UomoENEA Centro Ricerche Casaccia s.p. 016Via Anguillarese, 301 - 00123 Romatel. 06 30484671 - fax 06 30484891e-mail: [email protected] http://biotec.casaccia.enea.it/GIC/

Qualifica di Citometrista percorso di formazione e certificazione

Incontro di Aggiornamento per l’idoneità all’esame per l’iscrizione all’Albo dei CitometristiLucca 8 ottobre 2013


11QUALIFICA DI CITOMETRISTALettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013

Il GIC, quale Società scientifica multidisciplinare di riferimento della citometria in Italia, intende riconosce-re, a beneficio esclusivo dei propri iscritti, la figura professionale di Citometrista istituendo uno specificoelenco con le peculiarità di Albo. In tal modo il GIC associazione scientifico-professionale, senza fini di lucro,che da più di 30 anni svolge la propria attività di formazione e aggiornamento nel campo della citometria,vuole garantire ai professionisti di questa disciplina la possibilità di operare, nel rispetto delle proprie aree dicompetenza, la corretta gestione degli specifici processi analitici in tutti i loro aspetti dalla gestione del cam-pione, alla interpretazione dei risultati e alla loro refertazione. La società GIC possiede tutte le competenzenecessarie per riconoscere la “Qualifica Professionale” di “Citometrista” in diverse aree tematiche, che spa-ziano da quello clinico/applicativo (ematologia, onco-ematologia, medicina trasfusionale, immunologia,oncologia) a quello della ricerca (oncologia sperimentale, neuroscienze, nuove tecnologie e metodologie), ealle scienze ambientali (microbiologia). Il GIC si farà anche carico di mettere in atto le procedure di forma-zione-aggiornamento e verifica atte a mantenere tale “Qualifica” nel tempo.

La citometria, definita “scienza delle misure cellulari”, grazie al rapido e continuo progresso tecnologico negliultimi anni sta sempre più evolvendo verso una complessità elevata sia dal punto di vista della conoscenzadelle tecniche che dal punto di vista dell’ interpretazione dei dati e dovrà quindi sempre più essere conside-rata una vera e propria disciplina. D’altra parte già altre discipline in ambiti quali quello della biochimica cli-nica e quello ambientale hanno istituito degli elenchi dei professionisti del settore ai quali si può avere acces-so solo dopo il superamento di un intero percorso formativo e di un esame. La nuova legge, (LEGGE 14 gen-naio 2013, n. 4), sulle disposizioni in materia di professioni non organizzate, disciplina quelle professioniappunto non “strutturate” in ordini o collegi, consentendo la costituzione di associazioni privatistiche per lavalorizzazione delle competenze degli associati e per garantire il rispetto delle regole deontologiche.

Gli obiettivi di questa iniziativa GIC sono pertanto di riconoscere le qualità professionali di un Citometristae di garantire, nel tempo, il livello professionale individuato; per il riconoscimento di questa figura professio-nale il GIC promuove l’istituzione di una stuttura organizzativa nel quale siano riconosciute figure con profi-li professionali differenti in specifiche aree applicative. L’Albo sarà articolato in due livelli professionali: 1°livello, Esperto in tecniche di analisi citometriche e 2° livello, Citometrista esperto, ciascuno nelle speci-fiche aree di competenza. Il percorso di accesso prevederà un primo evento formativo (evento satelliteConferenza GIC, Lucca 8 ottobre 2013), per iscriversi al quale i soci GIC interessati potranno presentaredomanda necessariamente corredata dal loro curriculum vitae (per i non-Soci è ovviamente necessarial’iscrizione alla Società). Sulla base dei curricula saranno selezionati coloro che sosterranno un colloquio altermine di questo primo evento formativo ed avranno così la possibilità di conseguire l’idoneità per accedereall’esame finale per l’iscrizione all’Albo; in alternativa, a coloro che non avranno conseguito l’idoneità saran-no assegnati 5 “Crediti formativi GIC” per iniziare un percorso formativo delineato per completare le cono-scenze e l’esperienza pratica necessarie per l’accesso all’esame finale.

Si può accedere ad entrambi i percorsi se in possesso di Laurea Specialistica oppure Magistrale con cicli diformazione riconosciuti dal GIC e specifica esperienza professionale. I candidati in possesso di laurea di Ilivello (triennale) o di diploma di tecnico sanitario biomedico, integrati da esperienza professionale specificae cicli di formazione riconosciuti dal GIC, possono accedere solo alla qualifica di 1° livello Esperto in tecni-che di analisi citometriche. Dottorandi, Assegnisti e Borsisti, possono presentare domanda di partecipazioneall'Incontro e saranno indirizzati a seguire uno specifico programma di aggiornamento e formazione.

L’incontro di aggiornamento per l’idoneità all’esame per l’iscrizione all’Albo dei Citometristi che si terrà aLucca la mattina dell’8 ottobre p.v. è la prima tappa formativa propedeutica per chi desidera acquisire la qua-lifica professionale di Citometrista; le schede per l’iscrizione ed il modulo per il curriculum sono scaricabilidalla home page sito GIC: http://biotec.casaccia.enea.it/gic/ e dovranno pervenire alla Segreteria GIC entro il30 giugno p.v.

12 SCHEDA ABSTRACT Lettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013

13CORSO DI FORMAZIONE FADLettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013

• offrirà agli iscritti un nuovo modo di fare formazione, efficace e certamente più economico (in termini dicosto/credito ECM).

• consentirà a ciascun discente una formazione allineata con le proprie disponibilità di tempo e riconosceràagli autori il ruolo di docenti e formatori.

Al corso sono stati concessi 25 crediti ECM.Il corso è riservato ai soci GIC in regola con le quote associative ed agli iscritti alla Conferenza 2013 e avràvalidità 12 mesi dalla data di attivazione; i crediti saranno assegnati per l’anno solare in cui il Partecipantesvolge il test di apprendimento.

Per informazioni e per ricevere la scheda per la domanda di iscrizione rivolgersi alla Segreteria GIC e allaSegreteria Italymeeting.

CORSO DI FORMAZIONE FAD ACCREDITATO ECMMetodologie Citometriche nella Biologia e nella Clinica

in collaborazione conFORM@S - GIC

Il corso di Formazione a Distanza ECM FAD“Metodologie Citometriche nella Biologia e nellaClinica” che proponiamo sarà composto da 4 modulididattici, ciascuno ottenuto dalla rielaborazione di alcu-ni articoli già pubblicati sulla nostra Rivista, e correda-ti con le immagini che vi sono pubblicate ad alta defini-zione che trattano argomenti di Biologia Cellulare,Ematologia, Immunologia e Oncologia, in cui le meto-dologie citometriche svolgono un ruolo significativo.

La “rielaborazione”, curata dal PROVIDER, consistenella creazione di un “libro sfogliabile” consultabile inrete, o scaricabile sul proprio PC, con tutti i riferimentibibliografici interrogabili.

Ai fini dei crediti ECM il TEST di VERIFICAdell’APPRENDIMENTO sarà composto da 4 domandeper ogni credito attribuito a scelta quadrupla con unasola risposta esatta. Ogni iscritto sarà tenuto a svolgerecompletamente il TEST online, entro la data di scaden-za del Corso, attraverso la piattaforma del Providerdalla quale sarà possibile poi stampare autonomamentel’attestato.La formazione a distanza nella formulazione qui proposta:

Segreteria Organizzativa Italymeeting s.r.l. Via Parsano, 6/b - 80067 Sorrento NAtel. 081 8073525 – 081 878460 - fax 081 807193e-mail: [email protected]://www.italymeeting.it

Segreteria Scientifica Società Italiana di Citometria c/o Unità Biologia delle Radiazioni e Salute dell'UomoENEA Centro Ricerche Casaccia s.p. 016Via Anguillarese, 301 - 00123 Romae-mail: [email protected] http://biotec.casaccia.enea.it/GIC/

Carissimi,recentemente è scomparso l’amico Guido Pagnucco, direttore dell’ematologia del l'Ospedale Civico diPalermo, e soprattutto - per come lo ha conosciuto la maggior parte di noi - esperto e brillante cito-fluorimetrista. L’ho incontrato per la prima volta da studente, durante il mio internato di tesi a Pavia,pochi anni prima che Guido la lasciasse per iniziare una nuova sfida affascinante a Palermo. Ho cono-sciuto da subito il suo carattere deciso, accompagnato però dalla capacità di trasmettere apprezza-mento e affetto alle persone che stimava profondamente, alle quali si è legato in maniera indissolubi-le. Credo che molti di quelli che l’hanno conosciuto, lo ricordino così. Per chi ha fatto (o ancora oggifa) citofluorimetria a Pavia, non è possibile dimenticare che Guido ha creato e sviluppato il laborato-rio di citometria clinica oncoematologica del Policlinico San Matteo. Ricordo che fin da studente miaveva colpito molto che una stessa persona coniugasse profonda conoscenza clinica delle malattieematologiche e padronanza completa delle tecniche di laboratorio. Guido negli anni mi ha fatto capi-re che non si trattava semplicemente di una dote, ma piuttosto di una ricerca professionale continuae faticosa, quanto necessaria per fare bene il nostro lavoro. Oggi, mi rendo conto che il ricordo dellepersone che ci hanno insegnato qualcosa è più vivo, e ho voluto condividerlo con voi

Matteo Della Porta

In memoria di

Guido Pagnucco

15

Premio di StudioLa Citometria nelle tesi sperimentali

ed in lavori originali inediti27a Edizione 2013

La Società Italiana di Citometria, allo scopo di promuovere la ricerca nel campo della Citometria, indice un concorsoper l'assegnazione di n. 3 premi a:- 2 Tesi sperimentali su argomenti di rilevanza applicativa e di base della Citometria;- 1 Articolo originale inedito su argomenti di rilevanza applicativa e di base della Citometria.

I premi saranno assegnati, con giudizio insindacabile, da una Commissione nominata dal GIC e consistono in unaBorsa di Partecipazione completa alla XXXI Conferenza Nazionale di Citometria, 8 - 11 ottobre 2013, Palazzo Ducaledi Lucca, in cui i vincitori saranno ospiti e presenteranno una sintesi del loro Lavoro e potranno essere invitati a pre-sentare un articolo per la Rivista Lettere GIC.

Modalità di partecipazioneLa domanda dovrà pervenire entro il 31 luglio 2013 alla Segreteria della Società Italiana di Citometria specificando:nome, cognome, indirizzo, recapiti telefonici personali e del laboratorio, fax, e-mail e l’impegno a citare il Premio,nell’Articolo che sarà pubblicato.

Il Segretario Il PresidenteRaffaele De Vita Giuseppe Gaipa

Per informazioni:Società Italiana di Citometria

c/o Unità Biologia delle Radiazioni e Salute dell’Uomo ENEA Centro Ricerche Casaccia, s.p. 016 Via Anguillarese, 301 - 00123 Roma - tel.: 06 30484671 - fax: 06 30484891e-mail: [email protected]; [email protected] - http://biotec.casaccia.enea.it/GIC/

Con il patrocinio di Agenzia nazionale per le nuove tecnologie, l’energia e lo sviluppo economico sostenibile


19ATTIVITÀ SCIENTIFICALettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013

Identificazione del CD66c/CEACAM6 come antigene tumore associato con capacità funzionali nel carcinoma del colon-retto

Marica Gemei1, Peppino Mirabelli2, Rosa Di Noto1,3, Luigi Del Vecchio1,31CEINGE-Biotecnologie Avanzate s.c.a.r.l., Napoli, Italy

2IRCCS Fondazione SDN, Napoli, Italy3Dipartimento di Medicina molecolare e Biotecnologie mediche, Università “Federico II”, Napoli, Italy

e-mail: [email protected]

IntroduzioneLa caratterizzazione delle cellule tumorali e l’iden ti -ficazione di antigeni tumore-associati affidabili è allabase dello sviluppo di nuove metodiche diagnostiche eterapeutiche (1). In particolare, negli ultimi anni, si èposta l’attenzione degli studiosi sulla caratterizzazionefenotipica e funzionale di una popolazione ristretta dicellule tumorali con caratteristiche staminali (2,3). Lecellule staminali tumorali sono state indicate come leresponsabili dello sviluppo e della crescita dei tumoriprimari, così come dei processi di metastatizzazione adistanza o recidive locali. I marcatori fino ad oggi propo-sti per l’identificazione delle cellule staminali tumoralinel colon comprendono il CD133, CD44, CD24 e ilCD166 (3-5). Tuttavia nessuno di questi marcatori èespresso esclusivamente dalle cellule staminali tumoralie le popolazioni isolate mediante la loro espressionesono contaminate da cellule tumorali più differenziate(6-11). Inoltre nessuno di questi marcatori si è dimostra-to un buon target per un nuovo approccio terapeuticodiretto contro le staminali del carcinoma del colon-retto(6-9). Da un’estesa caratterizzazione dei profili fenotipi-ci di membrana delle cellule tumorali abbiamo identifi-cato il CD66c/CEACAM6 come nuovo marcatore dellecellule staminali tumorali nel carcinoma del colon. IlCD66c è una proteina appartenente alle molecole di ade-sione della famiglia dell’antigene carcinoembrionario edè sempre più studiata per il suo ruolo funzionale in diver-si tipi di neoplasie (12-14). La sua espressione, misuratamediante immunoistochimica, è stata riportata essereaumentata nelle neoplasie del colon-retto in cui è ancheun fattore prognostico (15-17). Il CD66c è un target tera-peutico molto promettente nel tumore del pancreas in cuisia il suo silenziamento mediante siRNA, sia l’uso dianticorpi farmaco-coniugati contro il CD66c si sonodimostrati approcci utili al contrasto della crescita tumo-rale (18,19). In questo studio abbiamo caratterizzatol’espressione del CD66c nei tumori del colon-retto enelle cellule staminali tumorali. Inoltre abbiamo dimo-strato come il silenziamento di questa proteina inibisca lecapacità tumorigeniche delle cellule di tumore al colonin vitro ed in vivo.

Materiali e MetodiDigestione e marcatura dei campioni biopticiQuarantasei biopsie da tumore al colon-retto accompa-gnate dalla corrispettiva biopsia di mucosa colonica nor-male sono state ottenute dal Dipartimento di MedicinaClinica e Sperimentale della Seconda Università diNapoli. I campioni bioptici sono stati digeriti comedescritto in precedenza (3) e incubati per 30’ a 4°C conla quantità appropriata di una miscela di anticorpi mono-clonali composta da: anti-CD326-PerCP-Cy5.5, anti-CD45-APC-Cy7, anti-CD66c-PE, anti-CD133-APC.Successivamente sono stati lavati e risospesi in 500 µl diPBS/2%FBS, sono stati aggiunti 0,5µl di Sytox Bluecome colorante vitale e sono stati acquisiti al citometroBD FacsARIAIII. Prima di valutare l’espressione deimarcatori CD133 e CD66c, la popolazione di cellule epi-teliali tumorali è stata selezionata mediante la seguentestrategia di gating: 1) esclusione dei detriti sul dot-plotFSC versus SSC, 2) esclusione degli aggregati sul dot-plot FSC-A versus FSC-H, 3) selezione delle cellule epi-teliali tumorali vitali come CD45-/CD326+/Sytox Blue-.Il livello di background di ogni fluoro cromo è statovalutato con la tecnica della “fluorescenza meno 1” (20).

Silenziamento del CD66c nelle cellule Caco2Come modello cellulare abbiamo scelto la linea continuada tumore al colon umano Caco2. Abbiamo silenziato ilCD66c mediante “si-RNA interference” utilizzando unostealth-RNA interference (sequenza: GGAAGGAG-GUUCUUCUACUCGCCCA) acquistato presso l’Invi -trogen Life Technologies. Come controllo negativoabbiamo impiegato un oligo ad alto contenuto di GCsimile al CD66c-siRNA usato per il silenziamento. Per latransfezione con Lipofectamina 2000 abbiamo seguito leistruzioni del produttore quando le Caco2 hanno rag-giunto una confluenza del 40-50%. L’avvenuto silenzia-mento è stato accertato mediante analisi al citometro del-l’espressione del CD66c.

Analisi degli effetti del silenziamento del CD66cPer valutare gli effetti del silenziamento del CD66cabbiamo utilizzato le cellule Caco2 transfettate con il

20 ATTIVITÀ SCIENTIFICA Lettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013

CD66c-siRNA e con l’oligo aspecifico ad alto contenutodi GC per effettuare diversi saggi in vitro ed in vivo.Abbiamo analizzato la proliferazione cellulare quotidia-namente per una settimana mediante l’uso del coloranteWST1 seguendo le istruzioni del produttore. Abbiamovalutato l’induzione dell’apoptosi mediante colorazionedelle cellule con YO-PRO1/PI. Abbiamo, infine, valuta-to le capacità clonogeniche e tumorigeniche delle cellu-le silenziate. La clonogenicità è stata analizzata median-te semina a bassa concentrazione in piastra e successivaconta delle colonie formate (21). La tumorigenicità èstata valutata in vivo iniettando le cellule silenziate e lecellule di controllo nei fianchi destro e sinistro rispettiva-mente di topi NOD/SCID femmine di 4-6 settimane. Itumori sottocutanei ottenuti sono stati in parte digeriti eanalizzati mediante citometria (valutando l’espressionedel CD326 e HLA-A-B-C umani) e in parte fissati inparaformaldeide per la successiva inclusione in paraffinae analisi immunoistologica.

Analisi statisticaLe differenze tra i gruppi di campioni sono state valuta-te utilizzando il t-test per dati appaiati, il test di Mann-Whitney o il test di Wilcoxon a seconda della necessità,usando il software Graphpad Prism. Soltanto le differen-ze significative (p<.05) sono state considerate.

RisultatiEspressione del CD66c nel colon normale e nei tumo-ri colorettali.Abbiamo analizzato 41 biopsie da tumori primari al colon-retto, 5 metastasi epatiche e i corrispondenti tessuti sani da44 pazienti differenti, valutando l’espressione del CD66c.

Il CD66c si è rivelato significativamente più espresso neicampioni tumorali che nel tessuto sano con un’intensità diespressione che seguiva la gravità della lesione osservata(figura 1) (risultava infatti più intenso sui campioni deipazienti classificati come T1-2 rispetto a quelli T3-T4 enei pazienti metastatici alla diagnosi rispetto ai non meta-statici). Inoltre i tumori primari esprimono mediamentemeno CD66c delle metastasi epatiche. (Figura 1)Mediante immunoistochimica abbiamo valutato l’espres -sione del CD66c anche in campioni pre-neoplastici os -ser vando un’intensità di espressione intermedia negliadenomi rispetto ai tessuti normali risultati tutti negativie i tessuti tumorali classificati come altamente positivi.(Figura 2)

Espressione del CD66c nelle cellule putative stamina-li nei tumori del colon-retto e nel colon normale.Mediante citometria multidimensionale abbiamo analiz-zato l’espressione del CD66c nelle cellule putative sta-minali CD133+ in campioni tumorali e nei corrispettivicampioni di mucosa normale. La nostra analisi ha rivela-to come nel tessuto tumorale le espressioni dei due mar-catori (CD133 e CD66c) siano direttamente correlate, alcontrario del tessuto normale dove sono mutualmenteesclusive. (Figura 3)Mediante immunoistochimica abbiamo valutato l’espres -sione del CD66c all’interno delle cripte coloniche neltessuto sano e tumorale, confermando che nella mucosanormale il CD66c è completamente assente alla basedelle cripte dove risiedono le cellule staminali (23,24),mentre le cripte dismorfiche tumorali sono risultate inte-ramente positive per il CD66c. Nel tessuto sano, unalieve espressione del CD66c è stata osservata soltanto

Figura 1: Espressione del CD66c nelcolon normale e nei campioni tumo-rali. Il CD66c è significativamente(p<.0001) più espresso nei tumori pri-mari rispetto al tessuto sano, sia comepercentuale di cellule positive (1A,a)sia come intensità di espressione(1A,b). Inoltre il CD66c è significativa-mente (p=.0073) più espresso nei tumo-ri dei pazienti classificati T1-T2 rispet-to ai T3-T4 (1B), e nei pazienti metasta-tici rispetto ai non metastatici(p=.0290) (1C). Infine i tumori primarihanno una espressione ridotta(p=.0102) del CD66c se comparati conle metastasi epatiche (1D) in cui siosserva una naturale selezione dellecellule CD66c positive (1E a,b)

Figura 2: Espressione delCD66c in campioni normali,pre-neoplastici e cancerosi.L’immagine 2A mostra unesempio rappresentativo di 34tessuti normali (2A,a), 12 ade-nomi (2A,b) e 22 tumori alcolon-retto (2A,c) analizzatimediante immunoistochimica.

L’intensità di espressione del CD66csi è dimostrata parallela alla gravitàdelle lesioni osservate (2B), infattitutti i tessuti normali sono stati giudi-cati negativi eccetto che per una lieveespressione nella parte apicale dellecripte, gli adenomi sono risultati nega-tivi o mediamente esprimenti ilCD66c mentre i carcinomi erano alta-mente positivi.


Figura 3: Espressione del CD66cnelle cellule staminali del colonnormale e dei tumori al colon-retto.Nel tessuto normale le espressioni delCD66c e del marcatore di staminalitàCD133 sono mutualmente esclusive(3a), mentre nei campioni tumorali idue marcatori correlano positivamen-te (3b).

Figura 4: Espressione del CD66call’interno della cripta. Nel colonnormale il CD66c è completamentenegativo alla base della cripta in cui lecellule staminali risiedono (4a eriquadro), una lieve espressione èosservabile soltanto nella parte apica-le più differenziata della cripta (indi-cata dalle frecce). Di contro le criptedismorfiche tumorali sono interamen-te positive per il CD66c con un eleva-to grado di espressione (4b). Unacripta esemplificativa per ciascuncampione è stata evidenziata median-te la linea tratteggiata. Le immaginisono a 10x, mentre il particolare nelriquadro è a 63x.

nella parte apicale e più differenziata delle cripte.(Figura 4)Silenziamento del CD66c nella linea di tumore alcolon umana Caco2Poiché le Caco2 esprimono ad alti livelli il CD66c e sonointeramente positive per questo marcatore, abbiamo uti-lizzato questo modello cellulare per effettuare degliesperimenti di silenziamento del C66c e per valutarne gli

effetti sulle proprietà clonogeniche e tumorigeniche delleCaco2 stesse. A questo scopo abbiamo transfettato leCaco2 con un siRNA specifico per il CD66c e con unsiRNA aspecifico utilizzato come controllo. Mediante


Figura 5: Espressione del CD66c nelle Caco2 e silenziamento mediante siRNA. Le cellule Caco2 esprimono alti livelli di CD66c(5A). In seguito al silenziamento del CD66c mediante l’uso di siRNA l’espressione della proteina scende in maniera significativa(p=.0013) rispetto alle cellule di controllo (5B).

Figura 6: Analisi della proliferazione cellulare, apoptosi e necrosi a seguito del silenziamento del CD66c. Le cellule silenziatemostrano un tasso di proliferazione significativamente (p<.001) ridotto rispetto alle cellule trattate con il siRNA aspecifico di control-lo (6A). Inoltre l’apoptosi e la necrosi risultano aumentate in modo significativo (p=.0013 e p=.0214 rispettivamente) (6B a,b).

Figura 7: Analisi delle capacità clonogeniche delle cellule silenziate. Il silenziamento del CD66c ha ridotto le capacità clonogeni-che in piastra delle cellule Caco2 (7A a,b e 7B), infatti le cellule silenziate erano in grado di produrre un numero significativamente(p=.0009) inferiore rispetto alle cellule di controllo (7B).


citometria abbiamo valutato l’efficacia del silenziamen-to dopo 72h dalla transfezione e abbiamo proceduto coni saggi funzionali una volta accertato l’avvenuto silenzia-mento. (Figura 5)La proliferazione cellulare è risultata significativamenteridotta nelle cellule silenziate fino a 144h dalla transfe-zione. Inoltre l’apoptosi e la necrosi sono incrementate inmodo significativo a seguito del silenziamento delCD66c. (Figura 6)Le cellule silenziate sono state piastrate a bassissimadensità per valutare la capacità delle singole cellule diformare colonie in piastra e abbiamo osservato una ridu-zione delle capacità clonogeniche nelle cellule silenzia-te. (Figura 7)Infine abbiamo testato in vivo le proprietà delle cellulesilenziate comparate con quelle delle cellule di controllo.A questo scopo abbiamo iniettato un ugual numero dicellule sottocute nei fianchi destro e sinistro di topi SCIDe abbiamo osservato la crescita tumorale. Le cellulesilenziate si sono dimostrate incapaci di formare tumorimacroscopicamente apprezzabili. Abbiamo successiva-mente valutato mediante istologia e citometria la compo-sizione delle formazioni ottenute e abbiamo osservatoche le cellule silenziate, quando davano origine a picco-le formazioni, portavano alla formazione di poche ghian-dole tumorali di piccole dimensioni. La citometria haconfermato che i tumori generati dalle cellule silenziatecontenevano in realtà pochissime cellule tumorali ederano per lo più frutto di una reazione infiammatoria

all’iniezione di un grosso quantitativo di cellule sottocu-te. (Figura 8)

DiscussioneNegli ultimi anni diversi gruppi hanno evidenziato comeil CD66c sia iper-espresso nel carcinoma del colon-rettolasciando tuttavia inesplorato il suo ruolo funzionale (15-19). Dai dati pubblicati sappiamo che il CD66c è identi-ficato come un marcatore di differenziamento nellamucosa del colon normale, in cui ha un ruolo importanteper il mantenimento dell’architettura tissutale e per il dif-ferenziamento dei colonociti. Nel colon sano il CD66c èup-regolato di pari passo col procedere del differenzia-mento come dimostrato dalla sua espressione localizzataall’apice delle cripte che anche noi abbiamo descritto(12-25). In questo lavoro abbiamo invece identificato ilCD66c come un marcatore di staminalità nel cancrocolorettale. In particolare abbiamo consideratol’espressione brillante del CD66c come marcatore di cel-lule staminali in quanto le cellule CD66c brillanti corri-spondono alle cellule putative staminali CD133+, inoltrele cellule CD66c brillanti si sono dimostrate tumorigeni-che in vivo mentre la controparte negativa no (dati nonmostrati). Infine le cellule CD66c brillanti da biopsietumorali fresche iniettate in topo si sono dimostratecapaci di formare tumori istologicamente comparabilicon quelli primari dei pazienti dando origine a celluleCD66c positive e negative. In precedenza altri autorihanno dimostrato come l’iper-espressione del CD66c in

Figura 8: Analisi delle capacità tumorigeniche in vivo delle cellule Caco2 silenziate. I tumori generati dalle cellule di controllo sisono dimostrati più ricchi di ghiandole tumorali rispetto alle formazioni originate dall’iniezione di cellule silenziate per il CD66c(8a,c). La citometria ha confermato l’esiguo numero di cellule Caco2 nelle suddette formazioni rispetto ai tumori ottenuti dalle cellu-le di controllo (8b,d).


linee cellulari di carcinoma del colon fosse in grado dibloccarne il differenziamento distruggendo l’architetturadelle cripte in vivo (25,26). L’aumentata espressione delCD66c è stata associata anche con un aumento della resi-stenza all’anoikis (26). Tutti questi effetti possono con-tribuire ai processi tumori genetici, infatti l’espressioneectopica del CD66c in mio fibroblasti di ratto è in gradodi modificarli fino a renderli capaci di formare strutturetumorali in vivo (27). Inoltre l’iper-espressione nelle cel-lule Caco2 si è dimostrata responsabile della riduzionedel tempo di latenza nello sviluppo di tumori in topo(12). Poco si sa della funzione del CD66c, nonostante lecrescenti evidenza della sua importanza nella tumorige-nesi colorettale. Il CD66c è stato identificato all’internodi specifiche zattere lipidiche nella membrana citopla-smatica in cui il legame incrociato del suo dominioextracellulare è in grado di reclutare ed attivare altremolecole, come le integrine, influenzando processi comeil differenziamento, la proliferazione e la sopravvivenzacellulare (26). I nostri dati completano le informazioni adisposizione riguardo il CD66c sottolineando la possibi-lità di utilizzare il suo silenziamento nella terapia delcancro colorettale. Il silenziamento del CD66c è già statoproposto e testato in modelli preclinici di tumore al pan-creas con risultati molto incoraggianti (18). Inoltre èstato prodotto un anticorpo farmaco-coniugato contro ilCD66c per il trattamento del carcinoma del pancreas. Inquesto studio preclinico è stato dimostrato comel’esposizione a tale anticorpo fosse poco tossica, deter-minando solo una lieve granulo citopenia, in primati nonumani, che regrediva in breve tempo dopo l’interruzionedel trattamento (19). Il CD66c è quindi un ottimo candi-dato per lo sviluppo di nuove terapie contro il carcinomadel colon in quanto è funzionalmente importante nellecellule tumorali in cui è altamente espresso, è specifica-mente espresso nelle cellule tumorali staminali e presso-ché assente nei tessuti normali eccetto che per una lieveespressione nei colonociti differenziati e nei granulociti.

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Scopo di questo lavoro di revisione della letteratura èquello di fornire informazioni aggiornate sul significatoclinico e il livello di implementazione dello studio incitometria a flusso della malattia minima residua (MRD)nelle leucemie acute dell’adulto. L’analisi MRD rappre-senta attualmente uno standard clinico per la valutazio-ne del rischio individuale di malattia nei pazienti affettida leucemia acuta linfoblastica (LAL). Verrà analizzatobrevemente il razionale scientifico e il livello di eviden-za a supporto dell’utilizzo della citometria a flusso per lavalutazione MRD in questo setting clinico. Nella seconda parte del lavoro verrà dato ampio spazioalla discussione del razionale dell’impiego della citome-tria a flusso nella valutazione MRD delle leucemie acutemieloidi, e il suo possibile utilizzo clinico come fattoreprognostico in aggiunta all’analisi citogenetica e mole-colare che costituiscono attualmente l’impianto standardper la stratificazione prognostica dei pazienti e per ladeterminazione del loro percorso terapeutico.

Valutazione in citometria a flusso della malattia minimaresidua (MRD) nella leucemia linfoblastica dell’adulto.La valutazione della malattia minima residua (MRD) haacquisito un ruolo di primo piano nella gestione clinicadei pazienti pediatrici e adulti affetti da leucemia acutalinfoblastica (LAL), in ragione del suo importante valo-re prognostico. (1,2) Diversi studi hanno dimostrato unaforte associazione tra MRD e rischio di recidiva, per cuila valutazione della MRD è stata inserita in protocolliclinici con lo scopo di ottimizzare la valutazione delrischio individuale di malattia e di guidare le decisionicliniche. (1,2) I pazienti MRD negativi dopo la fase diinduzione della remissione possono essere candidati aduna riduzione di intensità del trattamento, mentre altilivelli di MRD identificano soggetti a prognosi sfavore-vole meritevoli di strategie terapeutiche alternative. Lapredittività della valutazione delle MRD come misuradella risposta farmacologia in vivo ha aperto nuove pro-spettive per il suo utilizzo nel processo clinico decisiona-le, favorendo lo sviluppo di strategie terapeutiche basatesulla valutazione del rischio individuale e fornendo unostrumento di valutazione precoce dell’efficacia di tratta-menti sperimentali con farmaci innovativi.

Dopo l’iniziale dimostrazione che campioni di midolloosseo in remissione morfologica contenevano in realtàlivelli misurabili di linfoblasti leucemici (definiti comemalattia minima residua, MRD) (3), l’uso di metodicheper la valutazione della MRD è diventato di fondamenta-le importanza nella gestione clinica e nelle decisioni tera-peutiche dei pazienti con LAL (1,2,4). Da un punto di vista puramente teorico, una tecnica affi-dabile per rilevare la MRD deve avere i seguenti prere-quisiti: (i) una sensibilità di almeno 10-4 (cioè la capaci-tà di rilevare una cellula maligna all’interno di 10 000cellule normali); (ii) una elevata specificità nella discri-minazione delle cellule maligne dalle cellule normali alfine di evitare risultati falsi positivi; (iii) la stabilitàover-time dei marcatori specifici di malattia al fine dievitare risultati falsi negativi, in particolare negli studi alungo termine; (v) la riproducibilità tra diversi laboratori(importante per gli studi multicentrici); la attenta stan-dardizzazione e verifica dei controlli di qualità; una rapi-da disponibilità dei risultati, in tempi utili per le decisio-ni cliniche (4,5)Nelle leucemie acute linfoblastiche, i metodi più affida-bili per la valutazione della malattia minima includono lacitometria a flusso e la PCR quantitativa. Questi dueapprocci sono ora ampiamente usati per il monitoraggiodella MRD in studi clinici (forniscono informazionistrettamente correlate), e sono tecniche che soddisfanotutti i requisiti necessari elencati precedentemente (6).La citometria a flusso consente di studiare gli immunofe-notipi associati alla leucemia e di quantificare i linfobla-sti leucemici in quanto è in grado di distinguerli dallaloro controparte normale (7, 8 e Figura 1). La fattibilità di una standardizzazione multicentrica perla valutazione della MRD mediante citometria a flussonella leucemia acuta linfoblastica, è stata dimostrata dalgruppo AIEOP-BFM (7). La standardizzazione compor-ta un allineamento tecnico (preparazione del campione,selezione dei reagenti, settaggio dello strumento), istru-zione del personale (analisi e interpretazione dei dati),controlli di qualità costanti. Il range di quantificazionedella MRD in citometria può essere definito come lacapacità di rilevare 30 eventi in 3x105 eventi cellularitotali . Tuttavia un cluster di almeno 10 eventi con immu-

Valutazione in Citometria a Flussodella malattia minima residua nelle Leucemie dell’adulto

Annamaria Tenore, Cristina Picone, Erica Consensi, Laura Vanelli, Matteo G Della PortaDipartimento di Ematologia Oncologia

Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia & Università degli Studi di Pavia

e-mail: [email protected]


nofenotipo associato alla malattia e back-gating lightscatter può essere sufficiente a definire un campionecome MRD-positivo (7).Diversi studi condotti sia in età pediatrica che nell’adul-to hanno identificato lo studio della MRD come il fatto-re prognostico più rilevante ai fini della durata dellaremissione completa (2,8,9).Nel paziente adulto, l’ottimizzazione della stratificazio-ne del rischio di malattia basata sullo studio della MRDhanno consentito ai gruppi di studio GMALL e NILG diottenere risultati clinici importanti in termini di soprav-vivenza in pazienti affetti da LAL e negativi alla valuta-zione MRD, indipendentemente dalle caratteristiche cli-niche alla diagnosi (9,10). Risultati simili sono stati riportati dal trial UKALLXII/ECOG 2993 (11). Lo stato di MRD dopol’induzione di fase 2 è risultato altamente significativo intermini clinici: infatti a questo timepoint, il rischio rela-tivo di ricaduta è risultato 9 volte più alto in pazientiadulti MRD-positivi (≥ 10-4) rispetto ai pazienti MRD-negativi (< 10-4) e a 5 anni, la sopravvivenza libera damalattia è risultata pari al 15% e al 71% rispettivamentenei due gruppi di pazienti.Nello studio del gruppo Polacco ALL 4-2002, anche essocondotto in pazienti adulti, la valutazione della MRDmisurata mediante citometria a flusso al momento dellaterapia di induzione della remissione, è risultato essereun fattore prognostico indipendente (12). Questi dati for-niscono una solida base di evidenza scientifica a suppor-to dell’introduzione della stratificazione del rischio dimalattia basata sulla valutazione della MRD in tutti ipazienti in età adulta affetti da LAL. Una volta comple-

tata la terapia di induzione e di consolidamento, la MRDdiventa un importante fattore prognostico e le decisionirelative al trattamento dovrebbero tenerne in debitoconto (13).I risultati sul valore prognostico della MRD nei pazientiaffetti da LAL prima del trapianto allogenico sono anco-ra controversi. Il gruppo NILG ha riportato una associa-zione positiva tra tassi di recidiva a 36 mesi post-trapian-to e lo stato di MRD prima del trapianto (14). Nel trialUKALL XII/ECOG 2993 per contro, nei pazienti sotto-posti a trapianto allogenico di cellule staminali in primaremissione completa di malattia, la MRD-positività pre-trapianto non è risultata significativamente associata aduna maggiore probabilità di fallimento della procedura(11). In una coorte di leucemie acute linfoblastiche Ph-negative, il Gruppo di Studio Europeo per le LAL del-l’adulto, ha riportato una probabilità di sopravvivenzalibera da leucemia a 5 anni significativamente più altaper pazienti con MRD <0-1% prima del trapianto autolo-go, rispetto a pazienti con MRD ≥0-1% (15).In conclusione, allo stato attuale da un punto di vista teo-rico, la risposta alla terapia potrebbe essere controllatatramite PCR o citometria a flusso in ogni singolo indivi-duo affetto da LAL in modo da consentire un trattamen-to personalizzato in base alla dinamica della MRD. Ilvalore prognostico della MRD è stato ampiamente dimo-strato ed il suo uso come indicatore dell’attività di un far-maco ha basi solide. La MRD è generalmente utilizzataper guidare la terapia post-induzione o post-consolida-mento nei pazienti con LAL. Le valutazioni nelle fasiiniziali di terapia possono essere più utili se l’obiettivo èdi diminuire il carico di trattamento in pazienti che

Figura 1. Analisi della malattia minima residua su sangue midollare da paziente affetto da leucemia linfoblastica acuta B. In A, regio-ne sulle cellule Syto-16 positive (ovvero tutte le cellule nucleate). In B, regione su tutte le cellule CD19+, comprese anche le poten-ziali cellule leucemiche. In C, potenziali cellule leucemiche in quanto esprimono intensamente il marcatore di immaturità CD10. InD, E, F studio del fenotipo delle cellule leucemiche per meglio definire la malattia minima residua. In G è possibile osservare la posi-zione del clone leucemico caratterizzato da un CD45 a bassa intensità, mentre le cellule in verde rappresentano gli elementi B maturied i precursori B.


hanno possibilità di essere curati con terapie ad intensitàridotte. Al contrario, alti livelli di MRD nelle fasi più tar-dive del percorso terapeutico possono definire sottogrup-pi che meritano trattamenti più intensivi. In generale varicordato tuttavia che il valore della MRD significativoper decisioni cliniche deve essere valutato con attenzio-ne nel contesto di studi controllati, prima di essere utiliz-zato nella pratica clinica. Valutazione in citometria a flusso della malattia minimaresidua (MRD) nella leucemia acuta mieloide dell’adulto.In pazienti adulti affetti da leucemia acuta mieloide (LAM)una chemioterapia intensiva consente il raggiungimentodella remissione completa (RC) nel 50-80% dei casi.Nonostante questi risultati incoraggianti, la maggiorparte dei pazienti che rispondono alla terapia possonoavere ricadute di malattia, e solo nel 30-40% dei pazien-ti giovani e in meno del 20% di quelli anziani si osser-vano sopravvivenze a lungo termine. (16)In questo contesto risulta di fondamentale importanzaconoscere i fattori di rischio individuali che possano pre-dire l’aggressività biologica della malattia e consentanodi scegliere trattamenti risk-adapted personalizzati. Adoggi, le anomalie citogenetiche rappresentano il più affi-dabile parametro prognostico nelle LAM dell’adulto.Tuttavia, è riconosciuto il fatto che la citogenetica nonsempre e` in grado di predire l’outcome del singolopaziente; infatti circa il 40-50% dei pazienti con carioti-po favorevole possono andare incontro a una ricaduta.(17,18) L’identificazione di mutazioni somatiche ricor-renti (FLT3, NPM1, CEBPA e DMNT3A) ha ulterior-mente migliorato la capacità di valutazione prognosticade pazienti con LAM, specialmente all’interno di omo-genei gruppi cariotipici (cariotipi intermedi o cariotipifavorevoli). (19) Una corretta valutazione del rischio dimalattia nel singolo paziente rappresenta un passaggiocritico nel processo clinico decisionale delle LAM. Ipazienti collocati nella categoria a basso rischio nonbeneficiano di routine di procedure trapiantologiche inprima remissione. D’altra parte una mancata identifica-zione precoce dei pazienti ad alto rischio di malattia puòimpedire o ritardare il tempestivo utilizzo di trattamentiintensivi, come il trapianto. (20)La determinazione della MRD in citometria a flusso èstata testata negli ultimi anni all’interno di trials clinicicome metodica per valutare in maniera dinamica e pre-coce la sensibilità individuale al trattamento dei pazienticon LAM, allo scopo di poter sviluppare terapie rischio-correlate. (21,22)Alterazioni cromosomiche clonali sono presenti in piùdel 50% dei pazienti adulti affetti da LAM e sono univer-salmente considerate i più robusti parametri predittividella durata della risposta e della sopravvivenza globale.Sulla base della citogenetica, i pazienti sono generalmen-te stratificati in 3 gruppi di rischio: favorevole, interme-dio e sfavorevole. I pazienti che cadono nella categoriadel cariotipo a rischio favorevole hanno approssimativa-

mente una probabilità di sopravvivenza libera di malattiaa lungo termine del 65%, quelli a rischio intermedio del40%, mentre pazienti appartenenti alla categoria delcariotipo a rischio sfavorevole hanno un pessimo outcome, con probabilità di sopravvivenza a lungo termineinferiore al 10%. All’interno di questo sistema prognosti-co bisogna considerare tuttavia che la categoria dipazienti a rischio intermedio ha un comportamento clini-co eterogeneo, e che in circa il 40% dei casi di LAM nonvengono identificate anomalie clonali tramite analisicitogenetiche convenzionali. (17,18)In anni recenti, sono stati identificati nuovi marcatorimolecolari che hanno permesso di definire meglio la pro-gnosi dei pazienti stratificati all’interno dei gruppi dirischio citogenetico convenzionali. Ad esempio neipazienti con cariotipo normale alterazioni del gene FLT3sono associate ad outcome sfavorevole, mentre mutazio-ni somatiche del gene NPM1 hanno significato progno-stico favorevole. (19)Parallelamente, diversi studi hannorivelato l’importanza prognostica di parametri post-trat-tamento nelle LAM. Whitley et al. hanno creato uno sco-ring system prognostico integrando i dati citogeneticipre-trattamento con i dati del raggiungimento dellaremissione dopo 1 o 2 cicli di terapia di induzione. (23)I pazienti con rischio citogenetico sfavorevole che rag-giungono la remissione dopo 2 cicli di induzione hannol’outcome peggiore. Tali evidenze suggeriscono lanecessità di integrare valutazioni della qualità dellarisposta individuale alla terapia nel processo clinicodecisionale assieme alla valutazione citogenetica e mole-colare pre-trattamento. Attualmente, tale ipotesi di lavo-ro può essere ulteriormente sviluppata, grazie allo studiodella malattia minima residua tramite PCR e citometria aflusso multiparametrica. (21,22)Il monitoraggio della MRD nelle LAM tramite citome-tria a flusso multiparametrica si basa sull’espressione di“immunofenotipi leucemia-associati” (LAIPs) definiticome la presenza di una combinazione di antigeni e/oanomalie citometriche dei parametri fisici che sonoassenti o molto rari nei midolli normali. (21,22) Il cre-scente interesse intorno a questa tecnica è dovuto alla suaampia applicabilità`(>85% delle AML), alla velocità diesecuzione, e alla elevata specificità. Inoltre, la diffusio-ne di strumentazioni dotate di laser multipli ha permessol’implementazione di saggi a più colori (combinazionicon più di 4 o 5 anticorpi monoclonali), favorendol’aumento della sensibilità`che,ora, si attesta ragionevol-mente tra 10-4 e 10-5. Dalla letteratura emerge chel’analisi della MRD tramite citometria a flusso è tecni-camente valida ed è in grado di stratificare i pazienti conLAM in categorie di rischio. (24,25) Molti studi hannocercato di stabilire un valore soglia di MRD sopra o sottoil quale l’outcome può essere significativamente diffe-rente. Nello studio di Al-Malawi et al., il cut-off ottima-le nella stratificazione dei pazienti con LAM in categoriedi rischio di recidiva è stato stabilito essere lo 0.15% di


cellule leucemiche residue post trattamento. (26)Buccisano et al. hanno individuato il valore di 0.035% dicellule leucemiche residue come cut-off ottimale perdiscriminare i casi MRD positivi dai casi MRD negativi,sia dopo induzione che dopo consolidamento. (27) Nellapratica clinica, nonostante sia raccomandato l’uso di unapproccio statistico dedicato per stabilire la soglia per lapositività/negatività della MRD, la riproducibilità di unaspecifica soglia in diversi laboratori rimane ancora diffi-coltosa. Un unico cut-off di riferimento sarebbe deside-rabile, ma esistono una serie di complicazioni di ordinetecnico e clinico. Tra questi ultimi, la differente intensitàdei regimi chemioterapici attuati in diverso contesti puògiocare un ruolo importante. Infatti, la soglia clinicamen-te rilevante della MRD può dipendere dalla terapia usatae può essere differente al cambiare degli schemi terapeu-tici. (21,22)Il sangue periferico potrebbe potenzialmente rappresen-tare una sorgente alternativa al midollo osseo per lo stu-dio della MRD. L’uso del sangue periferico in luogo delmidollo osseo (con il vantaggio dell’assenza di invasivi-tà del prelievo) o si basa sul presupposto che la presenzadi blasti circolanti al momento della remissione morfolo-gica possa riflettere la persistenza di cellule maligne alivello midollare. Maurilio et al hanno dimostrato la fat-tibilità dell’analisi della MRD su sangue periferico tra-mite citometria a flusso in una serie di 50 pazienti adulticon LAM. I livelli di MRD dopo induzione e consolida-mento su sangue periferico hanno significativamenteriprodotto quelli osservati a livello midollare. Un livellodi MRD maggiore di 0.015% su sangue periferico dopoconsolidamento è risultato essere associato and unasignificativa probabilità di ricaduta. (28)Un problema ancora in discussione è la scelta del migliortime point in cui eseguire la valutazione della MRD.(21,22) Il gruppo Cooperativo Tedesco ha dimostrato chela valutazione della velocità di clearance dei blasti al gior-no +16 dalla terapia di induzione (che dovrebbe rifletterela chemio-sensibilità del clone leucemico) rappresenta unfattore prognostico indipendente della probabilità di rag-giungere la remissione completa, nonché della sopravvi-venza libera da malattia e globale. (25) San Miguel et al.hanno dimostrato che la stratificazione basata su livelli diMRD minori di 0.01%, da 0.01% a 0.1%, da 0.1% a 1 %e maggiori di 1% dopo terapia di induzione, è risultata indifferenze significative in OS. (29)Al-Mawali et al. hanno osservato che una soglia di0.15% di cellule leucemiche residue al time point di postinduzione e post consolidamento discriminava casiMRD-negativi da casi MRD-positivi con ottima specifi-cità e sensibilità, permettendo di prevedere una immi-nente ricaduta. In questo studio l’analisi multivariata hamostrato che il livello di MRD post induzione influenzain modo indipendente la sopravvivenza. (26)Tuttaviasono state pubblicate anche opinioni divergenti che sup-portano l’ipotesi che time points ritardati possano essere

ancora più informativi rispetto a quelli precoci.Buccisano et al. hanno dimostrato che livelli di MRDuguali o superiori a 0.035%, misurati dopo terapia diconsolidamento, predicono una elevata frequenza di rica-duta e una ridotta sopravvivenza. (27,30) Selezionare un time point precoce piuttosto che ritardatopuò comportare la scelta di differenti opzioni terapeutiche:l’opzione del time point precoce può risultare utile peridentificare il più presto possibile i pazienti ad alto rischioper i quali è richiesta una rapida assegnazione a trattamen-ti molto intensivi. D’altra parte, sono da considerare pos-sibili situazioni di trattamento “ecces siva mente intensivo’’per pazienti che mostrano una lenta clearance dei blasti.Nell’esperienza di Buccisano et al., circa il 30% deipazienti che erano MRD positivi dopo induzione sonodiventati negativi alla fine del consolidamento e l’outcomeclinico di questi “slow responders” non era significativa-mente differente dai pazienti che risultavano MRD negati-vi subito dopo induzione. (27,30)Nella pratica clinica, i risultati della analisi citogeneticae molecolare alla diagnosi permettono la stratificazionedi circa il 40% dei pazienti con LAM rispettivamentenelle categorie di “ rischio favorevole” (basata sulla pre-senza di NPM1 mutato senza FLT3-ITD o cariotipo favo-revole) e “ rischio sfavorevole” (mutazioni FLT3-ITD ocariotipo complesso). (19) I pazienti a rischio favorevoleraggiungono alte percentuali di sopravvivenza libera damalattia a lungo termine con trattamenti chemioterapicistandard, mentre quelli a rischio sfavorevole necessitanodi terapie intensive (trapianto allogenico). Per contro,non ci sono criteri consolidati per indirizzare la sceltaterapeutica post-induzione/consolidamento per pazientiinclusi nella categoria a “rischio intermedio’’ (circa il60% dei casi). (19) Per questi pazienti, la valutazionedello stato di MRD risulta appropriato per definire quel-li ad alto(MRD-positivi) o basso (MRD-negativi) rischiodi ricaduta, per i quali potrebbero essere adottati tratta-menti differenziati. Sulla base di questa premessa,Buccisano et al hanno cercato di ottimizzare la definizio-ne del rischio di pazienti con LAM integrando la valuta-zione citogenetica/genetica pre-trattamento e lo statusdella MRD al time point post consolidamento. (31) Deipazienti collocati nella categoria di “rischio intermedio”,quelli MRD-negativi avevano una sopravvivenza liberada malattia 4 anni del 63%, mentre quelli MRD positiviavevano una sopravvivenza del 17% . (31)In conclusione, vi sono evidenze che suggeriscono lavalutazione della MRD può potenzialmente contribuire adefinire l’assessment del rischio nei pazienti adulti affet-ti da LAM. In quest’ottica, una stratificazione del rischiocomplessiva, generata integrando il valore prognostico diparametri pre e post trattamento (analisi citogeneti-ca/molecolare e MRD, rispettivamente), può aiutare acollocare la maggioranza dei pazienti in una categoria dirischio più realistica, favorendo così la scelta di piùappropriate strategie post remissione. Nel contesto di un


tale approccio integrato, il profilo citogenetico/geneticopretrattamento detterà l’intensità e il tipo della terapia diinduzione, mentre lo stato della MRD post trattamentoaiuterà a modulare l’intensità delle strategie post remis-sione, permettendo di somministrare un trattamento pro-porzionale al rischio individuale di ricaduta.

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30 NEWS IN BIBLIOGRAFIA Lettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013

Regulation of human NK-cell cytokine andchemokine production by target cell recognition

Cyril Fauriat, Eric O. Long, Hans-Gustaf Ljunggren andYenan T. Bryceson - Blood 115:2167-2176, 2010

E’ noto che le cellule natural killer (NK) sono distinguibilisulla base della intensità di espressione dell’antigene CD56 indue principali subset di cellule: CD56bright e CD56dim. Sebbeneentrambe le sottopopolazioni NK siano in grado sia di secer-nere citochine ad azione immunoregolatoria sia di svolgereattività citotossica cellulo-mediata, si ritiene che le celluleCD56bright presentino una maggior propensione a produrrecitochine, mentre le CD56dim siano caratterizzate da una spic-cata attività citotossica spontanea. Ulteriori differenze tra que-ste due sottopopolazioni riguardano la localizzazione, le primeabbondano nei linfonodi e le seconde nel sangue periferico,nonché la diversa risposta alle stimolazioni con citochine(come IL-2, IL-15, IL-21 e TGF-beta). Tali differenze sugge-riscono che si tratti di due sottopopolazioni funzionalmentedistinte (in maniera analoga ai CD4 e CD8), oppure, comeritiene la maggioranza dei ricercatori, stadi differenziatividiversi dello stesso lineage NK. In questo ambito di discussio-ne si inserisce il lavoro oggetto della recensione che, utilizzan-do una marcatura citofluorimetrica multicolore, aggiungenuove informazioni riguardanti le diversità tra le due sottopo-polazioni NK. Il lavoro infatti evidenzia come la propensionea produrre una gran quantità di citochine da parte delle cellu-le CD56bright rispetto alle CD56dim dipenda dalla stimolazionecon citochine esogene. Le cellule CD56dim, invece, produconouna maggior quantità di citochine e chemochine dopo stimo-lazione mediata dal contatto con cellule bersaglio. Questirisultati dimostrano che la funzione secretoria NK viene indot-ta nelle due sottopopolazioni attraverso due vie distinte di atti-vazione. Le CD56bright sarebbero maggiormente sensibili aglistimoli mediati da recettori di ligandi solubili come le citochi-ne, mentre le CD56dim più predisposte a rispondere a stimolilegati al contatto e al riconoscimento di cellule bersaglio, checoinvolgono i classici recettori attivatori NK (NCR, NKG2D).Sebbene la maggior parte della comunità scientifica sia con-vinta che le CD56dim derivino dal differenziamento delle cel-lule CD56bright, è difficile ipotizzare che le stesse funzioni NKpossano essere indotte da stimoli diversi a seconda dello sta-dio differenziativo. Pertanto, questi risultati potrebbero sugge-rire che i due subset NK rappresentino due popolazioni cellu-lari distinte con fenotipo e funzioni secretorie e citotossicheconvergenti.

Loris Zamai [email protected]

News in Bibliografiaa cura di “Marty DV.”

Distribution of several activating and inhibitoryreceptors on CD3- CD56+ NK cells

in regional lymph nodes of melanoma patientsVuletić A, Jurišić V, Jovanić I, Milovanović Z, Nikolić S,Konjević G.J Surg Res. 2013 Mar 13

Incremento di cellule NK CD3- CD56dim esprimentirecettori attivatori ed inibitori, nei linfonodi regionalimetastatici di pazienti con melanoma.

L’articolo descrive un interessante studio sulla distribu-zione di recettori attivatori ed inibitori, in cellule NK dilinfonodi regionali di pazienti con melanoma in diversistadi, in cui l’approccio citometrico ha un ruolo centrale.L’interesse è da porre in relazione alle informazioniancora insufficienti sulla presenza delle cellule NK neilinfonodi regionali di pazienti con tumore, che rappre-sentano la prima barriera immunologica alle metastasi edin cui le cellule NK svolgono un importante ruolo nellaprevenzione alla diffusione delle metastasi.Gli Autori hanno studiato l’espressione di alcuni recetto-ri attivatori ed inibitori della popolazione cellulare NKed i subset CD56dim e CD56bright sia in linfonodi metasta-tici che in linfonodi non metastatici.Lo studio sui recettori attivatori ed inibitori ha evidenzia-to sia un aumento dell’espressione del CD16 controbi-lanciato dall’aumentata espressione del recettore inibito-re CD158b, che un incremento percentuale del subsetdelle cellule NK CD56dim in linfonodi metastatici rispet-to ai linfonodi non metastatici.Gli Autori discutono questi risultati in riferimento ai pro-cessi infiammatori associati alle neoplasie che coinvol-gerebbero anche le sedi linfonodali regionali; concludo-no collocando i risultati ottenuti nell’ambito di unamigliore conoscenza del ruolo delle cellule NK nel con-trollo delle metastasi in linfonodi secondari. L’in -cremento delle conoscenze sul ruolo e sull’attività delleNK nei linfonodi metastatici può essere utile alla com-prensione dell’influenza del microambiente tumorale, sianel reclutamento delle NK CD56dim nei linfonodi interes-sati che nella modulazione dell’espressione degli specifi-ci recettori attivatori e inibitori.

Martina De Vita Valentina [email protected] [email protected]

Lettere GIC Vol. 22, Num. 1 - Aprile 2013 31VIAGGIANDO PER CONVEGNI

Viaggiando per convegnia cura del “Viaggiatore”

Ristorante e Pizzeria doc "Al Convento"sulla collina dei Camaldoli a Napoli

La quinta edizione del Corso SCAPE 2013 a Napoli, dellaScuola Nazionale di Citometria, ci ha dato l’occasione di gode-re, ancora una volta, della gastronomia e della squisita acco-glienza del Ristorante e Pizzeria doc “Al Convento” sulla colli-na dei Camaldoli di Napoli.Ritorniamo sempre con piacere per la cucina e l’accoglienza inquesto ristorante e pizzeria incastonato sulla collina e che si affac-cia sui Campi Flegrei e con una vista mozzafiato dall’ isolotto diNisida, propagine del Capo di Posillipo e che giunge fino a CapoMiseno, Procida, Ischia e nei giorni di tramontana fino all’Isola diPonza e Ventotene. Il ristorante, ha un ampio parcheggio, al cuicentro troneggia un maestoso albero di noci, che in queste setti-

mane è carico dei suoi frutti e pronto a fornire, seguendo un’antica tradizione, il 23 giugno, vigilia di San GiovanniBattista, le noci per la preparazione del “Nocino”, da lasciare in infusione per i canonici 40 giorni. Gli amici del GIC sono accolti dalla famiglia Garofalo. con calorosa e simpatica gentilezza in cui spiccanol’autorevole Sig. Mario, la maestria da chef della Signora Anna insieme ai figli Antonio e Simona; iCollaboratori sono sempre gentili ed affabili, sia quelli di sala chequelli in cucina, ed un apprezzamento particolare è dovuto al“Pizzaiuolo” per la “sapienza” nella preparazione della lievitazione enella cottura. “Al Convento” è un posto dove si può apprezzare un’atmosfera sere-na e rilassante e dove l’amore per la buona cucina è coltivato e fattofiorire con ricette della gastronomia tradizionale partenopea, chemani esperte trasformano in saporitissime e delicate prelibatezze,preparate con ingredienti genuini e freschi: dallo spettacolare assor-timento di antipasti, di mare e di terra, tra cui si esaltano quelli di ver-dura come le zucchine alla scapece, una buonissima insalata di polipo verace, mozzarelle di bufala “tipo aver-sana”, come pure la pasta, tra cui ricordiamo con piacere “le linguine alla puttanesca” con autentiche olive diGaeta-Itrane, oppure la specialità della casa: le “pennette al convento”; a nostro parere l’eccellenza viene rag-giunta con le pizze, che sono tra le migliori di Napoli, ed in cima alle quali collochiamo la pizza in bianco conprovola e friarielli.È sempre molto piacevole e rasserenante passare un paio d’ore “Al Convento”, sia in occasione di viaggi dilavoro che per una vacanza turistico-culturale, con la famiglia, godendo del terrazzo con vista mare spettaco-lare, e suggestivo se ci si sofferma a scrutare la costa di Capo Miseno in cui si riescono a distinguere i portinaturali della flotta romana, da cui partì in nave Plinio il Vecchio per andare ad osservare l’eruzione delVesuvio del 79 d.c.; la flotta al cui comando era Plinio il Giovaneche ci ha lasciato quello che si potrebbe definire una dettagliatadescrizione con carattere di osservazione scientifica dell'eruzionedel Vesuvio che si erge maestoso nel panorama che si osservadalla collina dei Camaldoli.

Al ConventoCupa Camaldoli 14, NapoliTel: 081 5874293

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Periodico della Società Italiana di Citometria ...gic.casaccia.enea.it/lett-gic/LG 013-1/letter GIC 1-13 3.pdf · Incontro di Aggiornamento per l’idoneità all’esame per l