Percorso di alternanza scuola-lavoro

Biotechlab

Classi IV DSA-

Classi IV BSA – IV CSA – IV B

Referente: prof T. MacolinoTutor scolastici: proff. Macolino-Caranfa- Iozzi- AntonucciDocenti e tutor aziendali: dott. R. Scrima –dott A. Tonti – dott. V. De Simone – M . Russo

Liceo Scientifico “A. Volta” – FoggiaDirigente scolastico Prof Gabriella Grilli

a.s. 2014-2015

FINALITA’ ed OBIETTIVI DEL CORSO

Il principale obiettivo di questo corso è quello di fornire un

in modo tale da indirizzarvi per i vostri studi futuri

Attività laboratoriali tecnico-pratiche (esercitazioni)

Quali saranno gli argomenti delle esercitazioni?

– Tecniche di biologia molecolare– Procedure e le tecniche delle analisi chimiche,

microbiologiche e biotecnologiche– Regole per la sicurezza e la qualità alimentare– Biologia molecolare– Analisi genetiche– Chimica analitica– Tecniche di sterilizzazione– Tecniche di miglioramento genetico– Sicurezza e prevenzione in laboratorio– Caratteristiche dei principali microrganismi patogeni

per l’uomo– Principali norme ISO nelle analisi microbiologiche– Procedure di analisi chimico-biologiche - biochimiche

attraverso l'uso di strumentazioni tecniche

Le aziende/ gli Enti

Principali interessi di RICERCA del laboratorio di Chimica Medica e Biochimica

del Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale Università di Foggia

(Responsabili: Prof. Nazzareno Capitanio, Prof. Domenico Boffoli, Prof.ssa Claudia Piccoli, Dott.ssa Rossella Scrima, Dott.ssa Olga Cela)

Metabolismo ossidativo mitocondriale ed extramitocondriale

ROS signaling e differenziamento in cellule staminali ematopoietiche

Disfunzioni mitocondriali in malattie neurodegenerative

Valutazione della «biosafety» di cellule mesenchimali ingegnerizzate derivate da midollo osseo

Analisi delle disfunzioni bioenergetiche mitocondriali indotte dal virus C dell’epatite (HCV)

Analisi delle disfunzioni bioenergetiche mitocondriali indotte dalla trisomia del cromosoma 21

Il Lachimer è una Azienda speciale della Camera diCommercio di Foggia, dal 1996 svolge attività dianalisi, attraverso l'effettuazione di prove chimiche,fisiche e microbiologiche.Scopo dell'Azienda è quello di svolgere un servizio diprova, consulenza e certificazione di merci e prodottiin settori di analisi rispondenti alle esigenzedell'economia locale.

Centro di Ricerca

per la Cerealicoltura

La missione

Il Centro di Ricerca per la Cerealicoltura di

Foggia si occupa di genetica, miglioramentogenetico, selezione varietale e dell’agrotecnicadei cereali per il consumo umano e animalecon particolare attenzione agli aspetti diresistenza agli stress biotici e abiotici, allasostenibilità della coltivazione e alla qualitàdelle produzioni in un’ottica di filiera.

Il Centro di Ricerca per la Cerealicoltura di Foggia dispone di un’azienda agricola sperimentale di 145 ettari, e di attrezzature per la sperimentazione cerealicola ed agronomica.

Azienda sperimentale

Centro di Collegamento Ricerca-Divulgazione

Sala congressi (100 posti), Foresteria, e Sala mensa.

Miglioramento genetico e

Sperimentazione agronomica

Chimica analitica

(metabolomica)

Tecnologia alimentare

(pasta e pane)

Genetica,

Biologia molecolare

e Biochimica

(Genomica)

Centro di Ricerca per

la Cerealicoltura:aree di ricerca

Laboratorio dedicato alla qualità della semola/pasta

Estrusione

Essicazione

Impianto pilota di pastificazione

Laboratorio di tecnologia della

trasformazione (pane e pasta)

Parametri qualitativi del frumento duro

• PESO ETTOLITRICO >80kg/hl

• PESO 1000 SEMI

• RESA ALLA MACINAZIONE

• CONTENUTO IN CENERI <0,9%

• QUANTITA’ E QUALITA’ DELLE PROTEINE > 13%

• INDICE ALVEOGRAFICO (W >200 e P/L<1,8)

• INDICE DI GLUTINE >60

• INDICE DI GIALLO >25

Laboratorio di metabolomicaHPLC

Ditta: AGILENT

Modello: 1100 anno: 2004

CONFIGURAZIONE

DAD (diode array detector)

FLD (fluorimetric detector)

Thermostatic autosampler

GC MS

Ditta: AGILENT

Modello: GC 6890 anno: 2004

MS 5973

CONFIGURAZIONE

PURGE and TRAP

Autosampler

LC MS MS

Ditta: APPLIED BIOSYSTEM

Modello: API 2000 anno: 2004

CONFIGURAZIONE

HPLC 1100 AGILENT

Thermostatic autosampler

Interface: ESI APCI

ICP

Ditta: VARIAN

Modello: VISTA MPX anno: 2004

CONFIGURAZIONE

autosampler

hydride generator

IC

Ditta: DIONEX

Modello: GP50 ED50 anno: 2004

Fibre, Fibre solubili, Carotenoidi, Tocoli,

Steroli, Minerali, Acidi fenolici, Lignani

Metabolomica:

ricerca di composti con valenza nutrizionale

Utilizzando le tecniche metabolomiche sono in corso ricerche

per migliorare il contenuto di sostanze antiossidanti, di

vitamine, di microelementi negli alimenti a base di cereali

Laboratorio di genomica

Luminex

ABI 3130

• Identificazione di geni utili e loro localizzazione cromosomica

• Analisi funzionale

Gene: regione di DNA che contiene le informazioni per la codifica di una proteina. Contiene pertanto le informazioni che determinano il fenotipo dell’organismo.

Uno dei modi per comprendere il ruolo biologico di un gene è quello di confrontare ilfenotipo di individui normali con quello di mutanti nei quali l’espressione del gene in esame èannullata o fortemente ridotta.

• Identificazione di geni utili e loro localizzazione cromosomica

• Analisi funzionale

• Incrocio tra due varietà che siano distinteper il carattere in esame e sviluppo di unapopolazione segregante

Prerequisiti per la realizzazione di mappegenetiche:

• Il carattere in studio deve essere ereditabile

• Marcatori che risultino polimorfici tra le diverse varietà

F8

xParental

P1 P2

Hybrid

F1

Recombinant inbred line (RIL) population

F2 population

F2

F3

F4

F5

F6

F7

• sono pezzi di DNA che contraddistinguono grazie alla loropresenza un determinato tratto cromosomico

• consentono di rilevare i polimorfismi del DNA

• non sono influenzati dall’ambiente

• potendo co-segregare con i geni, sono ereditati secondo i modellimendeliani.

Gene1

M1

Gene2

M2

Gene4

M4

Gene3

M3

• permettono di “guardare” direttamente nel DNA e di verificare la presenza di determinate caratteristiche (es. resistenza a malattie)

• accelerano e rendono più efficace il lavoro di costituzione varietale

Cosa sono i marcatori molecolari?

Le biotecnologie innovative: alcuni esempi

Le IMPRONTE DIGITALI molecolari

Il DNA rappresenta una caratteristica UNICA per ogni organismo. Dal DNA si può quindi risalire all’IDENTITA’ di una persona e risolvere, per esempio, un

caso giudiziario…

Scena del

crimineSospetto

A

Sospetto B Sospetto

C

Nel DNA si cerca quel frammento che rivela se la pianta sarà resistente o meno ad una determinata malattia

Pianta resistente Pianta ammalata

Centinaia di marcatori molecolari vengono analizzati tra i parentali di mappa e nella progenie.

I dati ottenuti vengono raccolti in un file Excel ed analizzati attraverso un software (Joinmap), il quale a sua volta li elabora statisticamente e li raggruppa in cromosomi, generando una mappa genetica.

• PCR (Reazione a catena della Polimerasi)

• Gel d’agarosio o elettroforesi capillare

500 marcatori totali

1820 cM

ANALISI QTL

DATI GENOTIPICI DATI FENOTIPICI

RICERCA DELLE REGIONI SUL GENOMA CHE INFLUENZANO LA

MANIFESTAZIONE DEL CARATTERE E DI MARCATORI MOLECOLARI

STRETTAMENTE ASSOCIATI

MAS (Marker Assisted Selection)Selezione Assistita da Marcatori Molecolari

PR22D89

Alta resaOttimo glutineRidotta attività

LOX

UC1113

Proteine, Fe, ZnResistenza alla Ruggine

gialla

5BIL-42

Gene Pm36Resistenza all’Oidio

CRESO

Gene Lr14cResistenza alla Ruggine

bruna

NEODUR

SBCMV - Virosi

SUMAI 3

FBH – Fusariosi della spiga

PRIMADURPEDROSO

Indice di giallo

CIRILLO

Ug99 – Ruggine nera

PYRAMIDING GENI IN UNA CV DI ELITE

Galileo Galilei(1564-1642)

OSSERVAZIONE

IPOTESI

ESPERIMENTO

La fase sperimentale ha lo scopo di CONVALIDARE o CONFUTARE l’ipotesi che lo scienziato ha formulato

Se l’ipotesi è esattaRipetere n volte l’esperimento

ANALISI STATISTICA(in genere l’esperimento va

ripetuto almeno 3 volte)

Se l’ipotesi è SBAGLIATA

Formulare una nuova ipotesi

una teoria non è mai definitiva ma è suscettibile di modifiche o di sostituzioni, qualora vengano

alla luce nuovi aspetti non ancora considerati.

Precisione ed accuratezza nelle misurazioni

PRECISIONE: questo termine indica quanto sono in accordo fra diloro diverse determinazione della stessa quantità

ACCURATEZZA: questo termine indica quanto sono in accordo fra diloro una determinata misura e il valore accettato perquella quantità

Errore Sperimentale: differenza tra il risultato ottenuto e il valore accettato

Deviazione Standard: radice quadrata della somma dei quadrati delledifferenze fra ogni misura e il valore medio, diviso per ilnumero delle misure meno uno

(errore sistematico o errore casuale)

Espressione dei dati analitici

Retta di taratura per pipettata

COLTURE CELLULARIScongelamento e congelamento di linee cellulari

Colture Cellulari: introduzione

• Colture cellulari in vitro: cellule isolate dal loroambiente e messe in condizioni di vivere all'internodi un sistema definito

– strumento fondamentale per studi biochimici,microbiologici, farmacologici…

– utili nella produzione di fattori di crescita, anticorpimonoclonali, vaccini, proteine ricombinanti in generale…

Introduzione

• 1951 messa in coltura della prima linea cellulare(derivante da cellule epiteliali della cervice uterina)stabilizzata umana, di origine tumorale: la lineaHeLa (dal nome della prima paziente, HenriettaLacks).

• Conoscendo le caratteristiche delle colture èpossibile apprezzarne i vantaggi (ad esempio studidi tossicità sulla nostra specie, per la quale in vivoesistono evidenti problemi).

Colture cellulari

• Batteri

• Lieviti (eucarioti inferiori)

• Colture di cellule vegetali

• Colture primarie di cellule animali

• Linee cellulari

Tipologia di crescita cellulare

• In sospensione

• Adese

COLTURA PRIMARIA

La coltura primaria di un determinato tipo cellulare corrispondealla fase in cui le cellule sono state appena isolate dal tessuto ehanno proliferato in appropriate condizioni, occupando in talmodo tutto la superficie a disposizione (situazione di confluenza).In questa fase le cellule possono essere «sottocoltivate»trasferendole in nuovi contenitori (piastre o fiasche) con terrenofresco in modo tale da espaderle.

Colture primarie

• Prelievo delle cellule da un campione(organo, embrioni o uova).

• dissezione meccanica.

• Trattamento con tripsina (o altro enzima)per eliminare i contatti tra cellule.

• Inibitore per bloccare la digestioneenzimatica

• Controllo della vitalità cellulare (ad esempiotrypan blue)

• Le colture cellulari possono essere seminatesu terreno solido in piastra Petri oppure insospensione.

Allestimento di una coltura primaria

LINEA CELLULARE

Dopo la prima sottocoltura, la coltura primaria diventa notacome LINEA CELLULARE o SOTTOCLONE.

Le linee cellulari derivanti dalle colture primarie hanno unavita limitata (sono cioè delle colture cellulari «finite»)

Differenza tra linea cellulare FINITA vs linea cellulare CONTINUA:

Le cellule normali si dividono solo un numero limitato di volte,dopodichè esse perdono la loro capacità proliferativa; questoevento è geneticamente determinato ed è noto come SENESCENZAe la linea cellulare in questo caso è finita.Altre linee cellulari invece diventano «immortali» tramite unprocesso detto «TRASFORMAZIONE», che può avvenirespontaneamente oppure può essere indotto chimicamente o conagenti virali.Quindi quando una linea cellulare finita va incontro atrasformazione acquisendo la capacità di dividersi infinite volte,essa diventa una linea cellulare continua.

Cellule primarie animali: esempi

• Linfociti/timociti

• Macrofagi

• Cellule di embrione di pollo/ratto

• Cellule di fegato /cuore (di embrione)

• Fibroblasti (cellule del tessuto connettivo)

Morfologia delle colture cellulari

• Fibroblastoidi: le cellule sono bipolari omultipolari, presentano forma allungata ecrescono attaccate alla superficie.

• Epithelial-like: le cellule sono poligonali conuna forma di regolari dimensioni, e cresconoattaccate alla superficie a gruppetti (patches).

• Lymphoblast-like: le cellule presentano unaforma sferica e solitamente crescono insospensione senza attaccarsi alla superficie.

Vantaggi nelle colture cellulari

• Larga disponibilità di tipi di cellule

• Disponibilità commerciale di media , fattori, ecc.

• Documentazione su isolamento/conservazione

• Controllo delle variabili ambientali (T, pH...)

• Semplicità nel replicare esperimenti

• Possibilità di dimensionare gli esperimenti con finalità biotecnologiche

• Riduzione nel numero di animali uccisi

Svantaggi nelle colture cellulari

• Metodi molto specializzati e laboriosi

• Costo dei materiali richiesti (ad esempio, siero, fattori di crescita...)

• Sistemi semplificati rispetto ad un organismo integrato

• Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo

Tipi di colture cellulari

• Colture a breve/lungo termine: nel primo caso il numero di cicli cuivanno incontro le cellule è ridotto: in colture a lungo termine le cellule sidividono molte volte, o addirittura illimitatamente (linee cellularistabilizzate)

• Colture in monostrato/ in sospensione: le cellule tendono ad aderirealla superficie del recipiente di coltura: moltiplicandosi formano unmonostrato, in quanto risentono dell’inibizione da contatto. Celluletrasformate possono formare pluristrati.

• Colture clonali: le cellule vengono diluite prima della “semina” in mododa avere ogni cellula separata, che prolifera formando una singolacolonia (clone).

Evoluzione di una linea cellulare in coltura

Tra la “semina” e la ripresa della crescitac’è un intervallo (“lag”). Nel grafico,l’evoluzione del logaritmo del numero dicellule nel tempo.

La coltura primaria è caratterizzata da untempo di duplicazione lento, cheaumenta notevolmente nei successivipassaggi in coltura, quando si parla dilinea cellulare primaria.

Nella terza fase si nota la senescenza,con tempi di dupli-cazioneprogressivamente più lunghi (sino allamorte), a meno che (porzionearancione) non intervenga unatrasformazione, che produce una lineacellulare immortalizzata in grado direplicarsi indefinitamente.

Il laboratorio per le colture cellulari

incubatorecappa

centrifuga

Contaminazioni delle colture

• L’ingresso indesiderato nel terreno di coltura di microrganismi èdannoso: questi competono con le cellule in coltura (chegeneralmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possonosecernere sostanze tossiche. Tipici contaminanti sono batteri,micoplasmi, lieviti, muffe.

• In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta (acidifica) eintorbidisce. Le infezioni da micoplasmi sono più subdole, inquanto il microrganismo è meno visibile e richiede un paio disettimane per formare colonie visibili.

• Questo pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici alterreno (ad esempio: streptomicina-penicillina); va ricordato chesono stabili per pochi giorni a 37°C.

Contaminazioni di una coltura cellulare da E.Coli

Contaminazioni di una coltura cellulare da lieviti

Contaminazioni di una coltura cellulare da micoplasma (o mollicutes)

A CB

Sterilità

• Al fine di mantenere la sterilità per la colturacellulare, il laboratorio di biologia cellulare deveessere esclusivo: occorre lavorare sotto cappe aflusso laminare, in cui vanno sostituitiperiodicamente i filtri.

• Per la sterilizzazione dei materiali:

– Stufa a secco, 150°C per 3 ore per la vetreria

– Autoclave (calore umido), 1 atm, 121°C per filtri,soluzioni saline…

– Filtrazione con filtri da 0.22 μm terreni di coltura,soluzioni organiche…

– Raggi materiali di plastica

– Raggi UV sterilità della cappa

Piastre di coltura

Fiasca con tappo ventilatoSuperficie: 25-235 cm2

Piastre multi-pozzetto (multiwell) (6-384 pozzetti)

Piastre Petri

Il mezzo extracellulare

• Fase gassosa, Temperatura, Substrato di adesione eterreno di coltura

• Le cellule di mammifero crescono a 37°C, sature diumidità, in un mezzo tamponato a pH 7,3. Il sistematampone più comunemente utilizzato èbicarbonato/acido carbonico

• Il pH viene controllato aggiungendo un indicatore come ilrosso fenolo (giallo a pH acido, rosso-viola a pH alcalino).

Terreni di coltura

• La composizione dei mezzi di coltura prevede:

– Sali inorganici (Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl -,..)

– Glucosio, glutammina

– Amminoacidi essenziali

– Vitamine del gruppo B

– Tracce di Fe, Zn, Cu, Se, Mn, Mo (tracce significa che non occorreaggiungerli in quanto le minime contaminazioni presenti in altricomponenti sono sufficienti).

– Siero fetale bovino, 5-20% o un sostituto

• MEM Minimal Essential Medium (Eagle)

• DMEM Dulbecco’s modified MEM

• RPMI Roswell Park Memorial Institute

Composizione di un terreno per cellule animali: un esempio

• Amminoacidi

• Vitamine

• Sali

• Glucosio

• Indicatore di pH

• Antibiotici

• Siero

• Soluzione tampone (HEPES, acido 4-2-idrossietil-1-piperazinil-etansolfonico)

Il siero (FBS, Foetal Bovine Serum)

Svantaggi

• Possibile tossicità di anticorpi;

• Variabilità da lotto a lotto;

• Inibitori metabolici;

• Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari

Vantaggi

• Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità;

• Introduce fattori di crescita ed ormoni;

• Veicola lipidi, ferro e molecole organiche;

• Favorisce interazioni cellule-substrato;

• Contiene inibitori della tripsina

L’uso del siero è controverso. Generalmente si preferisce il siero fetale in quanto contiene meno anticorpi.

Terreni definitiL’uso di terreni privi di siero nasce dal desiderio di avere condizioni controllate,riproducibili e specifiche per il tipo cellulare in esame.Devono contenere: un inibitore della tripsina, fattori di adesione, ormoni, fattoridi crescita, nutrienti e proteine.

Svantaggi

Cellule più sensibili alle condizioni ambientali;

Crescita più lenta;

Alcuni additivi sono costosi e/o labili;

I terreni sono specifici per un tipo cellulare.

Vantaggi

Maggiore riproducibilità;

Standardizzazione anche fra laboratori diversi;

Può favorire subpopolazionispecifiche (non solo fibroblasti);

Agevola la purificazione di un prodotto.

Congelamento di cellule• Per il congelamento delle cellule si utilizza un criopreservante, ad esempio il

DMSO (dimetilsolfossido).

La cappa

I filtri HEPA e la tecnologia del flusso laminare hanno resopossibile la realizzazione di "clean rooms", di laboratorimicrobiologici di massima sicurezza, di cappe sterili e di cabine"Biohazard'.

Filtrazione a flusso laminare

• Il flusso laminare è ottenuto dalla combinazione di un filtro assoluto (HEPA)con una massa d'aria che lo attraversa alla velocità costante di di 0,45m/sec. (+/- 20%).

• Il flusso laminare è un flusso d'aria unidirezionale formato da filetti d'ariasterili paralleli che si muovono alla medesima velocità in tutti i punti, cosìda creare una corrente d'aria omogenea senza turbolenze.

• In un ambiente sterile così ottenuto ogni contaminante libero nella zona dilavoro viene trascinato lontano da un fronte di aria sterile.

Campi d’applicazione

Esempi d’indagine Ambito

Controllo della crescita e del metabolismo, analisi deldifferenziamento. Ingegneria tissutale (coltura eproduzione in vitro di porzioni di tessuto).

Biologia cellulare

Studio di promotori e enhancers, di espressione genica edi interi genomi.

Biologia molecolare

Analisi di mutanti. Mappaggio, trasfezione con DNAesogeno.

Genetica

Diagnosi cliniche (anche prenatali) Citogenetica

Caratterizzazione di tumori. Oncologia

Test di citotossicità. Farmacologia

Produzione di proteine ricombinanti (ormoni…) e dianticorpi monoclonali.

Immunologia

Camera di Bürker

Reticolo della camera di Bürker

Legge di Lambert-Beer

A= εlc

ε coefficiente di estinzione molare

l cammino ottico

c concentrazione

ElettroforesiSeparazione delle proteine mediante

elettroforesi su gel di poliacrilammide: SDS-PAGE

Elettroforesi

Separazione differenziata di molecole cariche

(aminoacidi, peptidi, proteine,

acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elettrico

Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico

Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA

Forza elettrica : Fel = q · EForza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r )

Quando le forze si bilanciano:

q ·E = f ·v q

v = — · E f

v qmobilità elettroforetica : = — =

—E f

ELETTROFORESI – principi generali

Una molecola con una carica netta non nulla posta tra due elettrodi di

segno opposto migra verso

l’elettrodo con segno opposto alla sua carica netta

La molecola si muove verso l’elettrodo di segno opposto con una

velocità(v) che è proporzionale

all’entità del campo elettrico (E) e della sua carica (q) e inversamente

proporzionale all’attrito che

incontra nel muoversi (f – coefficiente d’attrito) v = Eq/f

FASI DELLA PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

CROMATOGRAFIA PER FILTRAZIONE SU GEL

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’

ELETTROFORESI

Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale

Visualizzazione del DNA: etidio bromuro

luce UV

Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso molecolare del campione ignoto

pozzetti

distanza in cm dai pozzetti

-20-10-7.0

x

1

2

3

4

5

6

7

8

ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMIDE

ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMIDE

SDS-PAGE

(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)

Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare

Colorazione con Coomassie

Colorazione con nitrato di Ag

Si possono effettuare valutazioni

quantitative delle bande proteiche

col densitometro: misurazione della

luce trasmessa quando un raggio luminoso

è fatto passare attraverso il gel colorato.

Si hanno picchi di assorbimento di cui si può

calcolare l’area che è proporzionale

alla quantità di proteina

Applicazioni della SDS-PAGE

• Purezza del campione

• Determinazione del PM

• Western blot

• Purificazione della proteina

MAPPE GENETICHE AD ELEVATA DENSITA’ DIMARCATORI

Dott.ssa Russo Maria Anna

Il Frumento duro in Italia

Il frumento duro rappresenta la materiaprima dell’industria delle paste alimentaririvestendo, pertanto, un ruolo strategico perl’intero settore agro-industriale del nostroPaese.

Attualmente per coprire le esigenze deipastificatori, l’Italia importa oltre 1 M ditonnellate di frumento duro per anno.

Oggi gli strumenti della genetica, della genomica e della bioinformatica, offrono concrete opportunità per accelerare e rendere più efficiente la costituzione di varietà di frumento più produttive e con spiccate caratteristiche qualitative.

I marcatori molecolari

• RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorfism)

• RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA)

• AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorfism)

• SSR (Simple Sequence Repeat)

• STS (Sequence Tagged Site)

• SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)

• CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)

• TRAP (Target region amplification polymorphism)

• SNP (Single Nucleotide Polymorfism)

• DArT (Diversity Array Technology)

I microsatelliti (SSR) sono polimorfismi di lunghezza del DNAGli SNPs sono polimorfismi di sequenza del DNA

Sequenze di DNA che consistono di corte unità (da una a sei basi) ripetute in tandem

CCG ATG CTG TTA AGT CTG ATG CAT GTT GCT GAA GTA CCG CCG CCG CCG CCG CCG

CCG TGT CAT AGA TCT AGT CGA TCT GAT GCA ACG TAC GAT

Vantaggi:

• Abbondanza e alto livello di polimorfismo,

• codominanti,

• Facili da utilizzare.

SSR (Simple Sequence Repeat) o Microsatelliti

• Gli SNPs,scoperti negli anni 80, sono variazioni di sequenza del DNA che si verificano quando è alterato un singolo nucleotide della sequenza genomica

• SNP (Single Nucleotide Polymorfism)

Attualmente sono i marcatori molecolari più utilizzati, il grande vantaggio nell’utilizzarli è dato dall’elevato numero di polimorfismi e dalla loro elevata densità lungo tutto il genoma

• E’ il polimorfismo più semplice• Altamente abbondante• Largamente usati come marcatori

SNP markers

INDIVIDUAZIONE DEGLI SNP

• Il più semplice approccio consiste nell’eseguire il sequenziamentodiretto dei prodotti di PCR di regioni genomiche contenenti il gene di interesse in individui diversi

• Tale approccio è però molto costoso in quanto richiede lo studio di primers specifici ed inoltre è limitato a regioni di cui è nota la sequenza.

• Genotipizzazione degli SNP mediante microarray…

• Incrocio tra due varietà chesiano distinte per il carattere inesame e sviluppo di unapopolazione segregante

• Il carattere in studio deve essere ereditabile

• Marcatori che risultino polimorfici tra le diverse varietà

F8

xParental

P1 P2

HybridF1

Recombinant inbred line (RIL) population

F2 population

F2

F3

F4

F5

F6

F7

Prerequisiti per la realizzazione di mappe genetiche:

Centinaia di marcatori molecolari vengono analizzati tra i parentali di mappa e nella progenie.

I dati ottenuti vengono raccolti in un file Excel ed analizzati attraverso un software (Joinmap), il quale a sua volta li elabora statisticamente e li raggruppa in cromosomi, generando una mappa genetica.

• PCR (Reazione a catena della Polimerasi)

• Gel d’agarosio o elettroforesi capillare

500 marcatori totali

1820 cM

Caratteri fisiologici e agronomici• Precoce• Resitente all’allettamento e alle alte temperature• Resistente alla Septoria e all’odio• Suscettibile alla Ruggine bruna• Elevato contenuto proteico• Indice di glutine buono• Elevato indice di giallo

Caratteri fisiologici e agronomici•Accentuata rusticità (adattamento a terreni poveri, resistenza al freddo, alla siccità e alle malattie, competitività con le infestanti) che ne fanno una coltura particolarmente adatta alla valorizzazione di zone agricole marginali, al recupero delle aree collinari, più in generale, alla coltivazione con ridotto impiego di input energetici. •Il farro è caratterizzato da bassa produttività, taglia elevata, rachide molto debole e scarsa attitudine alla panificazione e pastificazione.

Molise sel. Colli (Farro)

X

IAAV11200,0BS00071658_51 RAC875_c29075_225 RAC875_c215_3840,4BS00011038_51 Tdurum_contig47429_149 Tdurum_contig47429_248 IAAV3405RAC875_c65707_171

1,3

Tdurum_contig5427_314 tplb0025f09_973 tplb0025f09_1052 Tdurum_contig42083_757Tdurum_contig42083_890

5,6

CAP11_rep_c4893_84 RAC875_rep_c106667_302 Tdurum_contig94184_313 wsnp_Ex_c13357_210548027,7Kukri_c8386_767 wsnp_BF483640B_Ta_2_28,1GENE-2384_84 wsnp_Ex_c18318_27140346 wsnp_Ra_c9755_16199734 wsnp_Ra_c9755_1620094412,8Kukri_c66885_230 Tdurum_contig97386_20713,5BobWhite_c162_145 Tdurum_contig67399_676 Tdurum_contig31139_79 Tdurum_contig31139_143RFL_Contig2277_1446

13,9

Excalibur_rep_c79414_306 GENE-4933_1095 GENE-4933_489 BS00010115_51Tdurum_contig50625_2342

15,1

Kukri_c80544_61 Kukri_c49506_396 Tdurum_contig68677_611 Kukri_c8594_203tplb0035d20_506

17,6

wsnp_Ex_c30695_3957940818,0BS00022534_51 Kukri_rep_c69273_148 Excalibur_c3077_383 wsnp_Ex_c7362_1262273618,3RAC875_c61273_277 Tdurum_contig41902_1524 BS00022431_5122,2Tdurum_contig64772_41723,8Tdurum_contig51688_68128,0Tdurum_contig81905_50228,4Tdurum_contig63153_343 Tdurum_contig77081_121 Tdurum_contig82633_313 IAAV585Tdurum_contig82633_417

38,1

Kukri_c7202_135038,9Tdurum_contig61509_172 Tdurum_contig61509_349 Tdurum_contig61509_53839,7BS00102182_5140,2RFL_Contig4212_924 IACX773 RFL_Contig4212_597 Tdurum_contig48778_328Tdurum_contig13165_443

41,9

BA004656-0593 Tdurum_contig51555_568 Tdurum_contig65570_31742,7Tdurum_contig4974_486 Tdurum_contig4974_1105 Kukri_c9578_2045 Tdurum_contig4974_1725Tdurum_contig4974_3193

43,0

Tdurum_contig31451_173 Tdurum_contig4842_650 BS00034255_51 Tdurum_contig12801_136Tdurum_contig25698_123

43,4

BS00049907_51 GENE-2913_148 BS00075631_5146,5BS00022090_51 BS00067428_51 BS00105308_51 Excalibur_c8845_1531Tdurum_contig28351_239

46,9

BS00089409_51 IACX600647,7Excalibur_c52718_1059 BobWhite_c10574_19350,6Excalibur_c26054_428 Excalibur_c23547_118 Kukri_c27822_55 Kukri_c17377_1826Tdurum_contig15827_321

51,4

TA006298-050051,8Excalibur_c26244_178 RAC875_rep_c91551_80 Kukri_c47660_356 Excalibur_c17514_270Excalibur_rep_c66744_2113

53,8

IACX5989 IACX802354,9GENE-0037_298 Excalibur_c37391_669 BS00066282_51 TA003708-0300BS00040159_51

55,3

BS00094771_5156,2BS00064884_5157,4Tdurum_contig98255_148 Excalibur_c8131_385 IAAV2880 BobWhite_c4810_190Tdurum_contig98255_84

61,5

IAAV459562,7wsnp_Ex_c3119_576376267,7BS00022194_51 Tdurum_contig51818_14571,9Tdurum_contig57254_254 Excalibur_c7964_129074,1Tdurum_contig54548_1282 Tdurum_contig11735_1294 Tdurum_contig57212_71 Tdurum_contig11735_222Tdurum_contig54548_2035

74,5

Tdurum_contig64848_104 Tdurum_contig64848_75 Kukri_c322_139481,5Tdurum_contig54559_21182,7Excalibur_c5769_798 Tdurum_contig11593_170 tplb0034b12_591 Tdurum_contig86933_317Kukri_c26900_996

83,5

Excalibur_c32467_676 wsnp_Ra_c18498_2757174083,9RAC875_c23144_1560 wsnp_Ku_c5502_976594284,2BobWhite_c665_296 Tdurum_contig55374_309 Tdurum_contig45550_570 IACX9352RAC875_c42019_60

84,6

BS00107247_51 IACX5891 BS00010940_51 Kukri_c34453_332wsnp_JD_c2488_3379427

85,0

wsnp_Ex_c30581_3948278890,8RFL_Contig3023_2098 Tdurum_contig69157_375 Excalibur_c17420_213 RAC875_c15143_227Tdurum_contig28121_180

91,3

Tdurum_contig29060_176 wsnp_CAP7_c1405_706142 RAC875_rep_c108328_299 Excalibur_c20863_45592,1Tdurum_contig28920_29694,3RAC875_c62816_54 Tdurum_contig48088_463 wsnp_BE446161B_Td_2_2 IAAV6327wsnp_Ex_c35910_43971560

95,1

Tdurum_contig4795_404 RAC875_c89195_138 wsnp_Ex_c37437_45183236 wsnp_Ex_c37437_45184851wsnp_Ex_c72198_70679871

96,0

Xgwm1084-4B98,2BS00037020_51 Ra_c86142_34999,4IAAV5572 Kukri_c36207_91101,9Excalibur_c22632_576 Tdurum_contig43431_583 BS00106144_51 BS00022582_51BS00104364_51

102,3

wsnp_CAP12_c1101_569783102,7BobWhite_c2646_141 Excalibur_c106884_135 Tdurum_contig43246_1855 IACX2314BobWhite_c17899_1160

103,8

Tdurum_contig10137_89 Tdurum_contig29112_483 Ra_c106922_266 Ra_c106922_334GENE-2372_204

104,4

RAC875_c14455_1148106,8Excalibur_c27349_166 Kukri_c9162_223 Tdurum_contig97308_88107,3RAC875_c67417_275107,7Tdurum_contig45927_1211 tplb0036a20_1295 Tdurum_contig920_126 RFL_Contig5869_863Tdurum_contig95381_152

114,5

GENE-2566_317116,3Excalibur_c49297_159 RAC875_rep_c109509_148 RAC875_c36213_352 GENE-2889_80Excalibur_rep_c102761_90

117,7

tplb0056i06_856 BS00022466_51119,1Tdurum_contig56458_594 BobWhite_c12593_361121,3Tdurum_contig51356_290 wsnp_Ex_c14138_22066009123,2tplb0024i19_322 Tdurum_contig51521_90 RAC875_c45353_450 IAAV5564wsnp_Ex_c15490_23776560

125,6

Excalibur_rep_c114140_567 BS00094252_51 BS00022808_51 BobWhite_c27801_429IAAV8622

127,2

Excalibur_c57603_523 GENE-2278_444131,3JG_c3271_440 Tdurum_contig56887_256 Tdurum_contig56887_322 wsnp_Ra_c22777_32275954RAC875_c31708_337

138,1

GENE-2982_310 Tdurum_contig9168_2214140,1RAC875_c17026_714 Tdurum_contig58200_210 BobWhite_c15529_288 GENE-4505_30wsnp_Ex_c4125_7456528

143,9

BS00063310_51148,6HuHri_rep_c86966_239 IACX2226 tplb0055m09_246 BS00000054_51IAAV1091

159,1

BobWhite_c42663_70159,9Tdurum_contig42695_410162,4Tdurum_contig9118_1078 Ku_c2885_1286165,3Ku_c2885_1189 Ku_c2885_1277 RAC875_c6026_963 Ku_c9134_782RFL_ConBiA3368_209

165,7

4B

4B

Chromosome Likage groups number Total markers Map length (cM)Marker density

(cM/markers)

1A 5 617 141.6 0.23

2A 4 732 202.5 0.28

3A 4 523 246.8 0.47

4A 5 492 181.5 0.37

5A 3 435 241.1 0.55

6A 2 491 176.8 0.36

7A 4 715 217.4 0.30

Genome A 27 4005 1407.7 0.35

1B 3 954 204.5 0.21

2B 1 978 295.1 0.30

3B 5 648 211.4 0.33

4B 1 418 165.7 0.40

5B 4 617 201 0.33

6B 2 721 194.5 0.27

7B 2 699 199.4 0.29

Genome B 18 5035 1471.6 0.29

Total 45 9040 2879.3 0.32

Table 3 Density of markers and distribution among chromosomes

ANALISI QTL

DATI GENOTIPICI DATI FENOTIPICI

RICERCA DELLE REGIONI SUL GENOMA CHE INFLUENZANO LA MANIFESTAZIONE DEL CARATTERE E DI MARCATORI MOLECOLARI

STRETTAMENTE ASSOCIATI

Size_lengthAxis_major Diameter_max

Size_widthAxis_minor Diameter_min

Aspect (Ax_maj / Ax_min) Perimeter Area

Roundness [= (perimeter ^ 2) / (4 x pi x area)]

IAAV11200,0BS00071658_51 RAC875_c29075_225 RAC875_c215_3840,4BS00011038_51 Tdurum_contig47429_149 Tdurum_contig47429_248 IAAV3405RAC875_c65707_171

1,3

Tdurum_contig5427_314 tplb0025f09_973 tplb0025f09_1052 Tdurum_contig42083_757Tdurum_contig42083_890

5,6

CAP11_rep_c4893_84 RAC875_rep_c106667_302 Tdurum_contig94184_313 wsnp_Ex_c13357_210548027,7Kukri_c8386_767 wsnp_BF483640B_Ta_2_28,1GENE-2384_84 wsnp_Ex_c18318_27140346 wsnp_Ra_c9755_16199734 wsnp_Ra_c9755_1620094412,8Kukri_c66885_230 Tdurum_contig97386_20713,5BobWhite_c162_145 Tdurum_contig67399_676 Tdurum_contig31139_79 Tdurum_contig31139_143RFL_Contig2277_1446

13,9

Excalibur_rep_c79414_306 GENE-4933_1095 GENE-4933_489 BS00010115_51Tdurum_contig50625_2342

15,1

Kukri_c80544_61 Kukri_c49506_396 Tdurum_contig68677_611 Kukri_c8594_203tplb0035d20_506

17,6

wsnp_Ex_c30695_3957940818,0BS00022534_51 Kukri_rep_c69273_148 Excalibur_c3077_383 wsnp_Ex_c7362_1262273618,3RAC875_c61273_277 Tdurum_contig41902_1524 BS00022431_5122,2Tdurum_contig64772_41723,8Tdurum_contig51688_68128,0Tdurum_contig81905_50228,4Tdurum_contig63153_343 Tdurum_contig77081_121 Tdurum_contig82633_313 IAAV585Tdurum_contig82633_417

38,1

Kukri_c7202_135038,9Tdurum_contig61509_172 Tdurum_contig61509_349 Tdurum_contig61509_53839,7BS00102182_5140,2RFL_Contig4212_924 IACX773 RFL_Contig4212_597 Tdurum_contig48778_328Tdurum_contig13165_443

41,9

BA004656-0593 Tdurum_contig51555_568 Tdurum_contig65570_31742,7Tdurum_contig4974_486 Tdurum_contig4974_1105 Kukri_c9578_2045 Tdurum_contig4974_1725Tdurum_contig4974_3193

43,0

Tdurum_contig31451_173 Tdurum_contig4842_650 BS00034255_51 Tdurum_contig12801_136Tdurum_contig25698_123

43,4

BS00049907_51 GENE-2913_148 BS00075631_5146,5BS00022090_51 BS00067428_51 BS00105308_51 Excalibur_c8845_1531Tdurum_contig28351_239

46,9

BS00089409_51 IACX600647,7Excalibur_c52718_1059 BobWhite_c10574_19350,6Excalibur_c26054_428 Excalibur_c23547_118 Kukri_c27822_55 Kukri_c17377_1826Tdurum_contig15827_321

51,4

TA006298-050051,8Excalibur_c26244_178 RAC875_rep_c91551_80 Kukri_c47660_356 Excalibur_c17514_270Excalibur_rep_c66744_2113

53,8

IACX5989 IACX802354,9GENE-0037_298 Excalibur_c37391_669 BS00066282_51 TA003708-0300BS00040159_51

55,3

BS00094771_5156,2BS00064884_5157,4Tdurum_contig98255_148 Excalibur_c8131_385 IAAV2880 BobWhite_c4810_190Tdurum_contig98255_84

61,5

IAAV459562,7wsnp_Ex_c3119_576376267,7BS00022194_51 Tdurum_contig51818_14571,9Tdurum_contig57254_254 Excalibur_c7964_129074,1Tdurum_contig54548_1282 Tdurum_contig11735_1294 Tdurum_contig57212_71 Tdurum_contig11735_222Tdurum_contig54548_2035

74,5

Tdurum_contig64848_104 Tdurum_contig64848_75 Kukri_c322_139481,5Tdurum_contig54559_21182,7Excalibur_c5769_798 Tdurum_contig11593_170 tplb0034b12_591 Tdurum_contig86933_317Kukri_c26900_996

83,5

Excalibur_c32467_676 wsnp_Ra_c18498_2757174083,9RAC875_c23144_1560 wsnp_Ku_c5502_976594284,2BobWhite_c665_296 Tdurum_contig55374_309 Tdurum_contig45550_570 IACX9352RAC875_c42019_60

84,6

BS00107247_51 IACX5891 BS00010940_51 Kukri_c34453_332wsnp_JD_c2488_3379427

85,0

wsnp_Ex_c30581_3948278890,8RFL_Contig3023_2098 Tdurum_contig69157_375 Excalibur_c17420_213 RAC875_c15143_227Tdurum_contig28121_180

91,3

Tdurum_contig29060_176 wsnp_CAP7_c1405_706142 RAC875_rep_c108328_299 Excalibur_c20863_45592,1Tdurum_contig28920_29694,3RAC875_c62816_54 Tdurum_contig48088_463 wsnp_BE446161B_Td_2_2 IAAV6327wsnp_Ex_c35910_43971560

95,1

Tdurum_contig4795_404 RAC875_c89195_138 wsnp_Ex_c37437_45183236 wsnp_Ex_c37437_45184851wsnp_Ex_c72198_70679871

96,0

Xgwm1084-4B98,2BS00037020_51 Ra_c86142_34999,4IAAV5572 Kukri_c36207_91101,9Excalibur_c22632_576 Tdurum_contig43431_583 BS00106144_51 BS00022582_51BS00104364_51

102,3

wsnp_CAP12_c1101_569783102,7BobWhite_c2646_141 Excalibur_c106884_135 Tdurum_contig43246_1855 IACX2314BobWhite_c17899_1160

103,8

Tdurum_contig10137_89 Tdurum_contig29112_483 Ra_c106922_266 Ra_c106922_334GENE-2372_204

104,4

RAC875_c14455_1148106,8Excalibur_c27349_166 Kukri_c9162_223 Tdurum_contig97308_88107,3RAC875_c67417_275107,7Tdurum_contig45927_1211 tplb0036a20_1295 Tdurum_contig920_126 RFL_Contig5869_863Tdurum_contig95381_152

114,5

GENE-2566_317116,3Excalibur_c49297_159 RAC875_rep_c109509_148 RAC875_c36213_352 GENE-2889_80Excalibur_rep_c102761_90

117,7

tplb0056i06_856 BS00022466_51119,1Tdurum_contig56458_594 BobWhite_c12593_361121,3Tdurum_contig51356_290 wsnp_Ex_c14138_22066009123,2tplb0024i19_322 Tdurum_contig51521_90 RAC875_c45353_450 IAAV5564wsnp_Ex_c15490_23776560

125,6

Excalibur_rep_c114140_567 BS00094252_51 BS00022808_51 BobWhite_c27801_429IAAV8622

127,2

Excalibur_c57603_523 GENE-2278_444131,3JG_c3271_440 Tdurum_contig56887_256 Tdurum_contig56887_322 wsnp_Ra_c22777_32275954RAC875_c31708_337

138,1

GENE-2982_310 Tdurum_contig9168_2214140,1RAC875_c17026_714 Tdurum_contig58200_210 BobWhite_c15529_288 GENE-4505_30wsnp_Ex_c4125_7456528

143,9

BS00063310_51148,6HuHri_rep_c86966_239 IACX2226 tplb0055m09_246 BS00000054_51IAAV1091

159,1

BobWhite_c42663_70159,9Tdurum_contig42695_410162,4Tdurum_contig9118_1078 Ku_c2885_1286165,3Ku_c2885_1189 Ku_c2885_1277 RAC875_c6026_963 Ku_c9134_782RFL_ConBiA3368_209

165,7

4B

4B

In pratica, l’uso di marcatori molecolari permette di individuare le piante con determinateproprietà sulla base delle loro caratteristiche genetiche (genotipo) e non solo sulla base dicome queste caratteristiche si manifestano nel corso del ciclo vitale della pianta a seguitodell’interazione con l’ambiente (fenotipo).

R R S S R S S R R S S R RR R S S R S S R R S S R R

MAS - Selezione assistita da marcatori molecolari

IL MIGLIORAMENTO GENETICO DEL FRUMENTO DURO E L’IMPIEGO DI MARCATORI MOLECOLARI

Dott.ssa Maria Anna Russo

1900 1920 1940 1960 1980 20002

3

4

5

6

Res

a (

t h

a-1

)

Centro di Ricerca per la Cerealicoltura

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La MAS (Marker Assisted Selection)

Pyramiding dei geni

Il miglioramento geneticoDef.: processo di modifica del patrimonio genetico al fine di migliorarele caratteristiche utili all'uomo nelle specie coltivate o allevate

prima dai contadini cheinconsapevolmente sceglievano eselezionavano le varietà miglioridirettamente nei campi …

… poi dai genetisti nei laboratori e nei campi sperimentali.

Il miglioramento delle varietà è praticato con successo da migliaia di anni,

La nascita dell’agricoltura: un’evoluzione “contro natura”

NASCITA DELL’AGRICOLTURA - DOMESTICAZIONE DELLE PIANTE SELVATICHE

l’uomo inizia a scegliere tra le piante selvatiche e coltivare le piante utili per i suoi bisogni essenziali

Svantaggi: 1) le piante diventano dipendenti dall’uomo e incapaci di sopravvivere da sole 2) Perdita della biodiversità

Vantaggi: 1) Aumento parte edibile della pianta;2) Diminuzione dispersione dei semi;3) Omogeneità germinazione semi.

Domesticazione frumenti selvatici

Mezzaluna fertile

Domesticazione frumenti selvatici

Obiettivo: Ridurre dispersione semi

Seme vestito

Rachide fragile

Frumento coltivato

Frumento selvatico

Miglioramento genetico

2) l’ambiente cambia in continuazione ( clima; i parassiti si adattano e vincono le difese delle piante)

1) le popolazioni umane tendono ad aumentare più velocemente rispetto alla produzione agricola (malnutrizione, carestie)

A partire da quei primi passi decisivi nel Vicino Oriente, il processo di modificazionegenetica delle piante coltivate per migliorare le caratteristiche dei raccolti non si è maifermato. Per 2 importanti motivi:

Dai contadini agli scienziati

Seconda rivoluzione per l’agricoltura nel 1900: le leggi diMendel

Dai contadini agli scienziati

Nasce la GENETICA

Il miglioramento genetico non avviene più nei campi, ma nei centri di ricerca agronomica

Diventa più rapido e mirato

1900 1990

La rivoluzione verde

VANTAGGI: Aumento della produzione e diminuzione della fame nel mondo

SVANTAGGI: le varietà coltivate sono poche e c’è una diminuzione delle biodiversità e di geni utili

Miglioramento genetico tradizionale

SCELTA DEI GENITORI INCROCIO SELEZIONE FENOTIPO

F2

P2

F1

P1 x

SELEZIONE FENOTIPICA

Re-incrocio

Marcatori molecolari

Associazione carattere qualitativo-marcatore

MAS (Marker Assisted Selection)Selezione Assistita da Marcatori Molecolari

Nel DNA si cerca quel frammento che rivela se la pianta sarà resistente o meno ad una determinata

malattia

DNA Pianta

resistente

DNA Pianta

suscettibile

Pianta resistente Pianta ammalata

Classical breeding methodsClassical breeding methodsClassical breeding methods

4-6

Years

4-6

Years

Varietà commerciale Varietà commerciale

Vantaggi della Marker Assisted Selection

Scienza che studia le molecole di interesse biologico, le molecole della vita:

DNA e proteine

La Biologia Molecolare

D.ssa Russo Maria Anna

Il DNA !!!

Ciò che viene trasmesso da una generazione all’altra e

determina le caratteristiche di ogni essere vivente è il

DNA

Oswald Avery, McLeod e McCarthy

- 1944

Esiste un PRINCIPIO TRASFORMANTE che

trasmette le caratteristiche da una generazione all’altra

Frederick Griffith - 1928

Alfred Hershey e Martha Chase – 1952

La struttura del DNA !!!

Il DNA o ACIDO DESOSSIRIBONUCLEICO è

un POLIMERO di NUCLEOTIDI

I nucleotidi sono costituiti da un fosfato, uno zucchero e una base azotata.- ESISTONO 4 TIPI DI BASI AZOTATE: A, T, C, G

Le basi si accoppiano seguendo una regola precisa:

Adenina con TiminaCitosina con Guanina

Erwin Chargaff - 1950

L’ordine delle basi costituisce la SEQUENZA del DNA

FORMA A DOPPIA ELICA: DUE FILAMENTI UNITI TRAMITE LE BASI AZOTATE (COMPLEMENTARIETA’) AVVOLTI L’UNO INTORNO ALL’ALTRO

DETERMINATI SEGMENTI DI DNA FORMANO I GENI

I GENI CONTENGONO LE INFORMAZIONI PER

PRODURRE LE PROTEINE

“SERIE” DI GENI FORMANO I CROMOSOMI

I CROMOSOMI VENGONO EREDITATI

IL MATERIALE GENETICO DI UN INDIVIDUO VIENE DETTO GENOMA

Come funziona il DNA ???

Funzione

Informazione genetica

Trascrizione Traduzione

Come fa un GENE a “costruire” una PROTEINA???

Dal DNA viene TRASCRITTA una molecola di RNA

L’RNA viene TRADOTTO in una

PROTEINA

Cos’è una PROTEINA???

Una PROTEINA è un POLIMERO costituito da

MONOMERI: gli AMINOACIDI

Esistono 21 tipi diversi di AMINOACIDI

L’ordine degli aminoacidi costituisce la

SEQUENZA della proteina.

Diversa SEQUENZA = diversa FUNZIONE

argval

trp

trp

ile

phearg lys

ile

leu

trp

lysphe

ile

trp

ile

arg

lystrp

ile

phe

Come si studia il DNA??? Il DNA può essere

AMPLIFICATO…

..e si può SEQUENZIARE

Come si studia il DNA???

Si può VISUALIZZAREsu dei GEL con l’aiuto di

lampade particolari

Con l’aiuto di ENZIMI(speciali proteine) il DNA

si può “TAGLIARE” e “RICUCIRE”

Utilizzati come “forbici”, che permettono ai biologi di

tagliare/incollare le molecole di DNA

Tagliando una molecola di DNA e determinando l’ordine dei tagli (ottenuti con più enzimi) ed il numero di frammenti, si può comprendere la specifica organizzazione e sequenza della molecola mappe di restrizione

Con gli enzimi di restrizione si possono isolare e manipolare sperimentalmente i singoli geni

Estrazione del DNA

Soluzione salina per facilitare la rottura delle cellule(perdono molta acqua per il fenomeno dell’osmosi) Detergente, per disciogliere i lipidi delle membrane ecompletare la rottura delle cellule Calore (60-65°C): l’alta temperatura inattiva le DNAsi,gli enzimi che degradano il DNA, e facilita la rottura dellemembrane

L’estrazione di acidi nucleici è il primo passo nelle applicazioni di biologia molecolare

Il DNA può essere estratto da qualsiasi tessuto o cellula nucleata• con metodo classico (Fenolo/Cloroformio)• con diversi kit

FASI:• Rompere la parete o la membrana cellulare (LISI CELLULARE) per liberare il DNA• Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari (DEPROTENEIZZAZIONE)• Separare gli acidi nucleici tra loro, il DNA dall’RNA (PRECIPITAZIONE DELL’ACIDO NUCLEICO).

La tecnica della reazione a catena della polimerasi(Polymerase Chain Reaction, PCR, K. Mullis, 1985) offreuno strumento straordinariamente potentenell’amplificare in vitro e in poco tempo definitesequenze di DNA

Questa tecnica consente di ottenere centinaia dimigliaia di copie del DNA di interesse per successivecaratterizzazioni (determinazione della lunghezzadella sequenza nucleotidica, etc.)

Il maggior vantaggio della PCR, tuttavia, consiste nelpoter iniziare con quantità di materiale (come quelletipicamente associate a campioni provenienti da musei,o fossili o forensi) molto minori di quanto non sianosolitamente disponibili

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

Gli ingredienti della PCR sono:

• un templato

• due primer

• una miscela di deossinucleotidi trifosfati (dNTP)

• una DNA-polimerasi termostabile

Inizialmente, nella reazione venivautilizzata una polimerasi di Escherichiacoli. Tuttavia, questo enzima non è stabilealle alte temperature e viene inattivatodurante la fase di denaturazione di ciascunciclo PCR. Era pertanto necessarioaggiungerne una nuova aliquota prima dellafase di estensione. Tutto ciò rendeva latecnica laboriosa e costosa e aumentava laprobabilità di avere prodotti di reazioneaspecifici.

Nel 1988 fu isolata una DNA polimerasitermostabile prodotta dal batteriotermoresistente Thermus aquaticus (TaqDNA Polimerasi).L’uso di questa polimerasi ha consentito dieffettuare la fase di estensione a 72 °Caumentando la resa e la specificità deiprodotti di reazione e soprattutto ha resopossibile l’automazione del processo.

Le tre tappe della PCR:

• denaturazione per separare le due eliche del DNA

• appaiamento dei primer con le sequenze complementari sul DNA templato

• estensione dei primer con i nucleotidi complementari al templato ad opera della polimerasi

Denaturazione del DNAIl DNA deve essere portato ad una condizione di singola elica in modoche successivamente si verifichi l’appaiamento (annealing) allemolecole di primer (anch’esse a singolo filamento)La denaturazione viene favorita dalla presenza di concentrazionisaline relativamente alte (circa 150mM NaCl)

Appaiamento dei primer (annealing)

Questo secondo step consiste nella programmazione dellatemperatura e del tempo di appaiamento dei primer. La temperaturadi annealing (Ta) dei primer dipende dal loro contenuto in G+C e dallaloro lunghezza. Considerando primer di lunghezza media di 20 basiuna formula empirica spesso utilizzata per il calcolo della Tm è laseguente: TA = [4(G + C) + 2(A + T)] – 5Il tempo di annealing infine non deve essere troppo lungo (in modo dasfavorire appaiamenti aspecifici). Di solito si utilizzano tempidell’ordine di 30 sec o meno.

Estensione dei primer

L’estensione dei primer avviene ad una velocità di circa 100 basi/sec.Generalmente 1 min è sufficiente per amplificare stampi lunghi circa1000 bp.

Elettroforesi su gel

E’ il metodo standard utilizzato per:

• separare

• identificare

• purificare frammenti di DNA

Il tampone di elettroforesi è una soluzione salina che serve sia a condurre la corrente elettrica che a controllare il pH durante l’elettroforesi.

Elettroforesi su gel

I gel contengono pori attraverso i quali il DNA migra al polo positivo.

Più piccole sono le molecole, più velocemente migrano sul gel

Il gel può essere costituito da:

Poliacrilammide DNA 5-500 bpAlto potere risolutivo (1bp) – Gel verticali – Più complicati e pericolosi da utilizzare

Agarosio DNA 200-50000 bpVarie concentrazioni. Minore potere risolutivo - Gel orizzontali – Semplici da preparare e utilizzatiper separare frammenti di dimensioni variabili

L’agarosio è un polimero di carboidrati estratto dalle alghe. Esso, se fuso e gelificato, forma unamatrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione dell’ agarosio.Più elevate concentrazioni si usano per separare le molecole più piccole e, viceversa, concentrazionipiù basse sono più adatte a separare frammenti più grandi.

L’agarosio, in concentrazione opportuna, viene fuso insieme alla soluzione tampone.La soluzione fusa viene versata nella vaschetta e lasciata solidificare.Quando un campo elettrico viene applicato al gel il DNA, carico negativamente, si muove versol’anodo.

Preparazione di un gel di agarosio

Oggi l’intercalante utilizzato è il gel red, meno tossico e pericoloso dell’etidio bromuro

Il tampone di caricamento (colorante + addensante), LB, che si aggiunge ai campioni prima dell’elettroforesi, serve ad appesantire” icampioni, permettendo la loro permanenza nei pozzetti, e a fornire un marker visivo del progredire della corsa elettroforetica.

Per sciogliere l’agarosio, piuttosto che usare l’acqua distillata, si usano soluzioni tamponate che consentono al DNA di muoversi uniformementelungo il gel. Queste soluzioni hanno lo scopo, infatti, di determinare e mantenere stabili il pH e la concentrazione di ioni del gel.TAE e TBE sono i tamponi più comunemente usati per l’elettroforesi. T sta per Tris, che consente il mantenimento di un valore costante di pHdella soluzione; E sta per EDTA, che chela i cationi divalenti, come il magnesio. Questo è importante, perché la maggior parte delle nucleasirichiede cationi divalenti per funzionare. A o B sta per acido Borico o Acetico che forniscono l’appropriata forza ionica al tampone.

Dopo aver pesato l’agarosio e misurato il tampone, i due vengono mescolati. Dal momento che l’agarosio non è solubile a temperaturaambiente, esso deve essere portato ad ebollizione o in forno a microonde o in autoclave o su un agitatore magnetico.

Il sistema di costruzione di un gel di agarosio è costituito da tre parti, la piastra, il supporto e il pettine. Quest’ultimo serve a realizzare ipozzetti: si immerge nel gel “a denti in giù”, quando è caldo e liquido e poi, quando l’agarosio si sarà solidificato, si estrae, lasciando glispazi precedentemente occupati dai denti.Il gel viene quindi sistemato nella camera di elettroforesi e sommerso completamente con il tampone di elettroforesi, in modo che l’interogel sia soggetto ad uguale corrente elettrica.

Il campione di DNA, di qualsiasi tipo (estratto, restrizione enzimatica, etc.) è in soluzione acquosa. Questa , essendo di densità pari al quelladel tampone, non riuscirebbe ad impedire che il campione “scappi” dal pozzetto. Questo è il motivo per cui si aggiunge al campione unasostanza addensante: glicerolo, il blu di bromofenolo.

A questo punto si collega l’apparecchio ad un alimentatore e si applica il campo elettrico.

Dopo aver rimosso il gel dall’apparecchio di elettroforesi, si può visualizzare il DNA su un transilluminatore a luce UV

Il Clonaggio Molecolare

Dott.ssa De Simone VanessaConsiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria (CREA)24-28 settembre2015

Significa ottenere molte copie identiche di unframmento di DNA.

Cosa significa Clonaggio Molecolare?

Scopo del clonaggio molecolare

1. studiare un gene a livello molecolare (struttura, funzione,posizione nel genoma, regolazione fisiologica, ecc);

2. Identificare componenti cellulari che interagiscono con acidi nucleici;

3. facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica;

4. identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la sovraespressione;

5. studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine

Terapia genica: Trattamento causale delle malattie geneticheattraverso la correzione del difetto genetico presente in unpaziente, quindi, il ripristino del corretto funzionamentocellulare.

Ottenere microrganismi in grado di produrre molecole come l’insulina umana, l’interferone, ormoni della crescita…

Ricerca applicata

Applicazioni mediche

Ricerca di base

Procedura di Clonaggio

ISOLAMENTO del frammento di DNA

INTRODUZIONE del Vettore Ricombinante in cellule viventi per propagarlo (Trasformazione)

INSERZIONE del frammento in un VETTORE di clonaggio (Ligazione)

Procedura di Clonaggio

Cosa serve per un clonaggio ?

1) Gene (DNA di interesse)

4) DNA ligasi

2) Enzimi di restrizione

3) Vettore di clonaggio

5) Cellula ospite

2) Mediante l’uso di enzimi di restrizione

Isolamento del frammento del gene o DNA di interesse

1) Mediante l’uso della reazione a catena della polimerasi o PCR

PCR

Metodologia ideata nel 1980 da K. Mullis, utilizzata per ottenerecopie di segmenti specifici di DNA o di RNA, partendo da quantitàminime (anche una sola molecola)Le sue numerose applicazioni riguardano la genetica molecolare, ladiagnostica, le analisi alimentari e microbiologiche e gli studi difilogenesi molecolare.

PCR

PCR

Enzimi di restrizione

Sono enzimi in grado di tagliare i legami fosfodiesterei del DNA per dare frammenti specifici.

Enzimi di restrizione

Sono enzimi di originebatterica necessari perdegradare il DNA virale deibatteriofagi e riconosconosequenze di 4,6, o 8 coppienucleotidiche (siti direstrizione)

Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA secondo diverse modalità e possono produrre: - estremità piatte (blunt ends) - estremità coesive (sticky ends)

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono usati per il clonaggio molecolare per formarenuove molecole, dette molecole ricombinanti

Vettori di Clonaggio

I vettori di clonaggio sono particolari molecole di DNA, naturale o anche artificiale

- sono molecole di DNA, generalmente di piccole dimensioni- sono facilmente estraibili dalle cellule e quindi purificabili - possiedono un cosiddetto marcatore selettivo, ossia una proprietà che può essere utilizzata per selezionare i batteri che hanno incorporato il vettore di clonaggio (sia esso ricombinante o no) - sono capaci di replicarsi autonomamente, ossia in modo indipendente dalla replicazione del cromosoma della cellula ospite - possiedono una zona in cui può essere inserito il DNA esogeno

• Plasmidi

• Fagi

• Cosmidi

• YAC (Yeast Artificial Chromosome)

• BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

• MAC (Mammalian Artificial Chromosome)

Esistono differenti tipi di vettori di clonaggio:

Vettori di Clonaggio

Vettore Base Dimensione limite

dell’inserto Applicazioni

principali

Plasmide Plasmidi multicopia

naturali < 10 kb

Clonaggio, clonaggio di

cDNA e saggi di

espressione

Fago Batteriofago 5 – 20 kb

Clonaggio di DNA

genomico e di cDNA,

librerie di espressione

CosmidePlasmide contenete un

sito cos del batteriofago

l

35 – 45 kb Costruzione di librerie

genomiche

BAC Plasmide del fattore F di

E. coli 75 – 300 kb Analisi di grandi genomi

YAC

Centromero, telomeri e

sequenza che si replica

autonomamente di S.

cervisiae

100 – 1000 kb Analisi di grandi genomi,

topi transgenici YAC

MAC Centromero, telomeri ed

origine di replicazione di

mammiferi

Da 100 a > 1 Mb Biotecnologie animali e

terapia genica umana

Vettori di Clonaggio

LigazioneE’ l’inserimento del DNA esogeno nel vettore

Ligazione

La reazione avviene a temperatura di 10°C o temperaturaambiente, per poche ore.La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendol’energia cinetica delle molecole, riduce la possibilità che leestremità appaiate si separino prima di venire stabilizzate dallaligazione.

La reazione necessita della presenza dell’enzima DNA ligasi.

Questo enzima è implicato nella riparazione e la replicazione delDNA.

L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi, perchéstabile e poco costosa.

DNA ligasi

E’ in grado di legare due frammenti di DNA che hanno subito una rottura ed è implicato nella riparazione e la replicazione del DNA . Questo enzima catalizza infatti la formazione di legami covalentifosfodiesterici tra nucleotidi di DNA adiacenti.

Al termine della reazione di ligazione, nella provetta sono presentidiversi tipi di molecole:

Ligazione

molecole ricombinanti vere e proprie(vettore + inserto)

molecole di vettore che si è richiuso su sestesso senza aver incorporato l’inserto

molecole ricombinanti contenenti più di uninserto

molecole di solo inserto

molecole di vettore che sono rimaste lineari

Il plasmide è il vettore di clonaggio più comunemente usato.

E’ una molecola circolare di DNA a doppio filamento,normalmente presente nella cellula batterica, in grado direplicarsi autonomamente dalla cellula ospite.

Il plasmide

Requisiti dei Plasmidi per il Clonaggio

1) piccole dimensioni

2) sito di origine della replicazione (ORI)

3) siti di restrizione unici (polylinker)

4) marcatori genetici specifici (in genere un gene di resistenza ad un antibiotico: es. ampR)

Il plasmide

I Plasmidi si dividono in:

• Plasmidi ad elevato numero di copie, la cui replicazione avviene più frequentemente rispetto a quella del DNA cromosomico (alta resa);

• Plasmidi a basso numero di copie, la cui replicazione avviene con la stessa frequenza del DNA cromosomico.

• Possono essere classificati anche in base alla Specificità d’ospite: Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie batteriche e si dicono a specificità d’ospite limitata (per es. PBR322 e PUC18 si replicano solo in E.Coli).

• Altri plasmidi sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si dicono a largo spettro d’ospite.

Il plasmide

TrasformazioneInserimento del vettore ricombinante nella cellula ospite

La riproduzione dei batteri è di tipoasessuale, cioè senza il contributodei due genitori ed il conseguenterimescolamento del patrimoniogenetico.

Trasformazione

In realtà, anche i batteriposseggono dei meccanismi discambio di geni, che sono:- la trasduzione- la coniugazione- la trasformazione

TrasformazioneNella trasduzione è un batteriofago,cioè un virus che infetta i batteri, atrasferire porzioni di DNA da unbatterio ad un altro.

Nella trasformazione la cellularicevente incorpora DNA libero concui viene in contatto.

Nella coniugazione il trasferimentodi DNA si realizza attraverso ilcontatto fisico tra una cellulabatterica donatrice ed una cellulabatterica ricevente.

Trasformazione

In una popolazione di batteri, solo una frazione di cellule ètrasformabile: tale proprietà prende il nome di competenza.

Trasformazione

Per poter utilizzare un batterio in esperimenti di clonaggiomolecolare, si deve indurre lo stato di competenza

METODI FISICI •Shock termico •Elettroporazione

METODI CHIMICI •Trasformazione con Cloruro di Calcio

METODI BIOLOGICI •Lipofezione

Trasformazione

Esistono svariati metodi per rendere competenti le cellulebatteriche. Essi si basano su principi chimici o fisici e variano anchein funzione del grado di efficienza di trasformazione che si vuolottenere.

Le cellule competenti trasformate sono cresciute in terreno dicoltura selettivo in modo da ottenere tante copie del DNA inserito

Coltura cellulare

Ogni batterio vitale si divideràsul terreno solido fino agenerare una colonia visibilea occhio nudo. In circa 12 oreogni cellula di E. coli generauna colonia che contiene circa107 cellule.

Quando si effettua un esperimento di clonaggio molecolaretramite trasformazione, non tutti i batteri vengono trasformatima è indispensabile poter distinguere le cellule batterichetrasformate da quelle non trasformate.

Trasformazione

E’ possibile ricorrendo all’uso dei cosiddetti “marcatori selettivi”del vettore di clonaggio.

Selezione del giusto clone

Selezione per inattivazione inserzionale

Il gene che conferisce resistenzaall’ampicillina codifica per l’enzimaβ-lattamasi.

Il gene LacZ codifica per l’enzima β-Galattosidasi, il quale è in grado didemolire il substrato cromogeno X-Gal con la produzione di unacolorazione blu

Selezione del giusto clone

Se un frammento di DNA èinserito nel gene lacZ, esso nonsarà più funzionale e laconversione di X-gal non saràpiù possibile. Le colonieresteranno dunque bianche.

In assenza dell’inserto, ilgene lacZ sarà funzionalee la colonia battericadiventerà blu.

Ogni cellula competente trasformata crea una colonia di celluleidentiche

Selezione bianco-blu

Coltura cellulare

INTERVALLO o Fase LagI batteri vengono diluiti nella colturainiziale; la divisione procedelentamente in quanto le cellule sistanno adattando al terreno fresco.

FASE LOGARITMICAI batteri crescono esponenzialmente

FASE STAZIONARIALa densità cellulare rimane costante.La coltura può anche entrare in unafase di declino in cui le cellule si lisanoed il DNA si degrada parzialmente.

Curva di crescita batterica

4 - 5 ore

10 - 11 ore

In ogni esperimento di clonaggio è necessario estrarre il DNAplasmidico dalle cellule trasformate ed analizzarlo medianteelettroforesi per verificare la presenza di DNA esogeno nelvettore plasmidico.

Esistono numerose procedure per isolare il DNA plasmidico esepararlo dal DNA del cromosoma di E. coli.

Purificazione del DNA plasmidico

In un tipico esperimento di clonaggiosi utilizzano delle procedure rapidedi estrazione di DNA plasmidico(miniprep) che permettono divalutare il risultato di unesperimento di clonaggio in tempimolto brevi (poche ore).

1. RISOSPENSIONE E. coli

3. NEUTRALIZZAZIONE

2. LISI

DNA cromosomico eDNA plasmidico

4. CENTRIFUGAZIONE erecupero del DNA plasmidico

Surnatante: DNA plasmidico

Pellet: DNA genomico, proteine,detriti cellulari

Purificazione del DNA plasmidico

Purificazione del DNA plasmidico

- Precipitazione DNA con etanolo assoluto

- Centrifugazione a velocità alta

- Evaporazione etanolo

- Risospensione del DNA precipitato in H2O o tampone

Purificazione del DNA plasmidico

Mediante digestione con enzimi di restrizione e succesivaseparazione per elettroforesi che separa le molecole di DNA inbase alla lunghezza facendole migrare in un campo elettrico.

Analisi del DNA ricombinante

Analisi del DNA ricombinante

Mediante amplificazione del frammento con primer specifici e sequenziamento.

Esempi di applicazione del clonaggioFermentazioni microbiche: per la produzione di antibiotici anchemodificati

Produzione di Vaccini: sintesi del gene virale che induce alla malattia al fine di ottenere vaccini più sicuri per il paziente

Sintesi di proteine : produzione di proteine di interesse su larga scala

Produzione di Animali e piante transgeniche: per migliorare la produttivitàdi alcune colture o migliorare la qualità nutrizionale di vegetali e carni.

Biotecnologie ambientali: produzione su larga scala di proteine batterichein grado di eliminare contaminanti ambientali (pesticidi, cancerogeni ecc.)

Regolazione dei geni e gene terapia: controllo dell’espressione di alcunigeni e trattamento di malattie genetiche