- 1 -

Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet Institutt for bioteknologi

KURSHEFTE I MIKROBIOLOGI

Emne: TBT4110

Per Bruheim, Olav Vadstein, Marte Dragset

Revidert 2010

- 2 -

Noen ord/begreper vi kommer til å bruke, slå opp i læreboka hvis du ikke kan disse! Anaerob Aseptisk teknikk Autoklavere Cellemorfologi (staver/kokker) Homogenisat Inkubere Inokulere Inokulum Koloni Kultur Pode Preparat (mikroskopi) Resistens Resuspendere Stamme Steril Supernatant Turbiditet

- 3 -

GENERELL ORDEN

En del utstyr til forsøkene er samlet i en skuff i benken. Denne skuffen skal inneholde:

Fast utstyr (Skal ikke kastes) En podenål En smukk til pasteur-pipetter

Forbruksvarer (be om mer når det er tomt) En eske objektglass En eske dekkglass Når kurset er over ryddes eskene på plass i skuffen.

Kasting av brukt engangsutstyr. Glass kastes i pappboks med svart plastpose, merket glassavfall. KUN glass og ikke noe annet kastes i denne! (NB! Knust glass skal kostes opp tvert (særlig ubehagelig er dekkglass som mistes, de er svært vanskelig å oppdage av andre enn de som mister dem, før man skjærer seg på dem).

Brannfarlig avfall skal kastes i røde dunker (lite aktuelt på dette kurset).

Alt annet (papir, engangshansker, plastpipetter, petriskåler osv.) kastes i svarte sekker eller i papirkurver.

Rydding Før dere forlater kursalen, skal dere sørge for følgende:

Væsker/gamle bakteriekulturer skal helles ut i vasken, utstyret skylles, tusj fjernes med stålull. Skylt utstyr settes på rullebord.

Kulturer som skal til inkubering settes på anvist plass, vanligvis rullebord ved tavlen.

Alt som skal til inkubering må MERKES godt, med benknummer, initialer, forsøksnummer og dato.

Hilsen laboratoriepersonalet

- 4 -

TIMEPLAN Dag Tidspunkt Gruppe Normalt Store oppgaver Tirsdag I 1015-11 1015-12 II 1415-15 1415-16 Fredag I 1015-11 II 1415-15 OVERSIKT OVER ØVELSENE. 1. Mikroskopering. 2. Utstrykning av E. coli på agarskål. 3. Mikroorganismer i luft og på kroppen. 4. Gram-farging. 5. Lysozym i tårer. 6. Isolering av ekstremt halofile arkebakterier. 7. Karakterisering av pseudomonader. 8. Mikroskopering av utvalgte mikroorganismer. 9. Aerobe nitrogenfikserende bakterier - Azotobacter. 10. Isolering av streptomyceter. 11. Isolering av endosporedannende bakterier -Bacillus. 12. Isolering av melkesyrebakterier - Lactococcus-type. 13. Virkning av antibiotika vist på agarskål. 14. Kimtall i næringsmidler. 15. Totaltall og spektrofotometrisk måling av bakterietetthet. 16. Vekstkurve. 17. Bakteriofag. 18. Mikrobiologisk vannanalyse. 19. Winogradsky-søyle (demonstrasjonsoppgave). LABORATORIEKURSET. KURSDAG 1. Fredag 22/1. Øvelse 1. Mikroskopering. Øvelse 2. Utstrykning av E. coli på agarskål, 1. dag. Utstyr og medier: Plate med kolonier av E. coli. 1 kolbe med steril 0,9 % NaCl Pasteurpipetter, sterile 1 plate med LA medium KURSDAG 2. Tirsdag 26/1. Øvelse 2. Utstrykning av E. coli på agarskål, 2. dag. Øvelse 2B. Overføring av E. coli fra agarskål til flytende medium, 1. dag. Øvelse 3. Mikroorganismer i luft og på kroppen, 1. dag. Utstyr og medier: 4 plater med LA-medium 1 EM kolbe med minimalmedium

- 5 -

KURSDAG 3. Fredag 29/1. Øvelse 2B. Overføring av E. coli fra agarskål til flytende medium, 2. dag. Øvelse 3. Mikroorganismer i luft og på kroppen, 2. dag. Øvelse 4A. Gram-farging. Utstyr, reagenser og bakterier: Agarplater med E. coli og Micrococcus sp. (en av hver pr . benk) Krystallfiolett (løsning 1) Grams jodløsning (løsning 2) Safranin (løsning 3) Etanol Pasteur- eller dråpepipetter (usterile) 1 begerglass og 1 petriskål Filterpapir KURSDAG 4. Tirsdag 2/2. Øvelse 4B. Gram-test etter KOH-metoden. Øvelse 5. Lysozym i tårer, 1. dag

Øvelse 6. Isolering av ekstremt halofile arkebakterier. Utstyr, medier og bakterier: Plater med E. coli og Micrococcus luteus (en av hver pr . benk) Dråpeflasker med Micrococcus- og E. coli-kultur (en av hver pr. benk). 1 stykke løk Sterilt Eppendorf-rør 1 dråpepipette (plast, engangs) Pasteurpipetter 2 plater med LA-medium 3% KOH 1 plate med YES-agar Grovt sjøsalt Skål med etanol + glasstav KURSDAG 5. Fredag 5/2. Øvelse 5. Lysozym i tårer, 2. dag (Avsluttes).

Øvelse 7A. Pseudomonader, mikroskopering og oppbevaring. Øvelse 8. Mikroskopering av utvalgte mikroorganismer.

Utstyr, medier og bakterier: Pasteurpipetter 1 plate med succinat-medium 1 skråagar med succinatmedium Pseudomonas på agarskåler (1 per benk, ordnes av kursansvarlig)

Utvalgte mikroorganismer KURSDAG 6. Tirsdag 9/2.

Øvelse 7B. Pseudomonader, anaerob respirasjon, dag 1. Øvelse 7C. Pseudomonader, karakterisering, dag 1.

Øvelse 9. Azotobacter, 1. dag. Øvelse 10. Streptomyceter, 1. dag. Øvelse 11. Anrikning av aerobe endosporedannende bakterier: Bacillus 1.dag Medier og utstyr: Matjord for inokulum

- 6 -

Sterilt vann 1 anaeroberør med hette og propp 1 150 ml EM kolbe med succinat/nitrat medium 1 150 ml EM-kolbe med 20 ml mannitol-”N-fritt”-medium 1 plate med GA 1 plate med GA5Urea 1 plate Kusteragar 4 rør med Hugh og Leifsons stikkagar (Sjekk pH, skal være svakt grønn) Steril parafin Treklype Glasstav + skål med etanol Pasteurpipetter, sterile Sterilt reagensrør med plast-propp/hette Vannbad på 80 ºC E.coli utlevert på agarskål (1 per benk) KURSDAG 7. Fredag 12/2. Øvelse 7B. Pseudomonader, anaerob respirasjon, dag 2 (avsluttes). Øvelse 7C Karakterisering av pseudomonader, dag 2 (avsluttes). Øvelse 9. Azotobacter, 2. dag. Øvelse 10. Streptomyceter, 2. dag. Øvelse 11. Bacillus, 2. dag. Medier og utstyr: 1 anaerobrør med hette og propp 2 plater med GA 2 plater med Kusteragar 1 150 ml EM-kolbe med 20 ml mannitol-”N-fritt”-medium Kovaks oksidase reagens (ferskt)

Filterpapir E. coli utlevert på agarskål (1 per benk, helst ferske) 3 % KOH

KURSDAG 8. Tirsdag 16/2. Øvelse 9. Azotobacter, 3. dag (avsluttes). Øvelse 10. Streptomyceter, 3. dag. Øvelse 11. Bacillus, 3. dag. Øvelse 12. Melkesyrebakterier, 1. dag. Utstyr og medier: 2 skråagar med GA-medium 1 plate med næringsagar-LA Upasteurisert melk 1 anaerobrør med hette og propp KURSDAG 9. Fredag 19/2. Øvelse 6. Isolering av ekstremt halofile arkebakterier, dag 2 (avsluttes) Øvelse 12. Melkesyrebakterier, 2. dag. Øvelse 19. Winogradsky-søyle (Start på demonstrasjonsoppgave)

- 7 -

Utstyr og medier: 20 % sterilt saltvann 2 stk. 13 ml plastrør Automatpipetter (100-1000 μl) og spisser 1 plate med KPGA5L-CaCO3 E-M kolbe med dest. vann. Til Winogradski søylen: Marint mudder for inokulum, skjeer og spatler (felles) 1 kolbe med sterilt 2 % NaCl. 250 ml målekolbe Cellulosepulver Sjøvann CaSO4 Gjærekstrakt 2 store og 1 liten spatel 1 begerglass à 500 ml og 1 begerglass à 250 ml Al-folie KURSDAG 10. Tirsdag 23/2. Øvelse 10. Streptomyceter, 4. dag Øvelse 11. Bacillus, 4. dag (Avsluttes). Øvelse 12. Melkesyrebakterier, 3.dag (Katalase- og gram-test; avsluttes) Øvelse 13. Virkning av antibiotika vist på agarskål. Medier og utstyr: Antibiotika Pinsetter

3% KOH 30 % hydrogenperoksid Flytende kultur av en gram positiv bakterie Flytende kultur av en gram negativ bakterie Pipetter

Sterile pipettespisser Glasstav + skål med etanol E.coli på agarskål (1 per benk) Skråagar med Pseudomonas og Bacillus laget tidligere

2 GA el. LA-plater KURSDAG 11. Fredag 26/2 Del 1 av labjournal leveres! Øvelse 10. Streptomyceter, 5. dag (avsluttes). Øvelse 13. Virkning av antibiotika vist på agarskål, dag 2, avsluttes. Øvelse 14. Kvantitativ mikrobiologi, 1. dag. A. Kimtall i næringsmiddel. Medier, utstyr og bakterier. 1 pakke kjøttdeig el lignende fra ferskvare (ikke vakuumpakket, saltet, røykt etc.) Fortynningsløsning, 0.9% NaCl LA-medium til fortynning Steril homogenisator + en steril pinsett 6 sterile 13 ml plastrør for fortynningsserie Sterile pipetter (10 ml) Pelleusballonger Whirlmixere

6 skåler med LA-medium Automatpipetter (1,0 ml)

Sterile pipettespisser Glasstav + skål med etanol

- 8 -

KURSDAG 12. Tirsdag 2/3. Øvelse 14. Kvantitativ mikrobiologi, 2. dag. A. Kimtall (Avsluttes) Øvelse 15. Totaltall og måling av optisk tetthet Medier, utstyr og bakterier: Kultur av Vibrio natriegens Formalin Tellekammer BHI-medium til fortynning Kyvetter Automatpipetter + spisser 13 ml rør til fortynning KURSDAG 13. Fredag 5/3. Øvelse 16. Vekstkurve for bakterie, 1. dag. NB; FORSØKET TAR 2 TIMER. Medier, utstyr og bakterier: Det samme som kursdag 12 i tilpasset antall og mengde

5 plater BHI-medium Semilogaritmisk millimeterpapir

Vannbad 37oC Whirlmixere KURSDAG 14. Tirsdag 9/3. Øvelse 16. Vekstkurve, 2. dag (Avsluttes) Øvelse 17. Bakteriofag (”pfu”), 1. dag. Medier, utstyr , fag og bakterier: Dråpeflaske med kultur av E. coli B Suspensjon av T2-fag 9 plater med Hersheys agar 2 x 9,9 ml 0,9% NaCl til fortynning 5 x 9,0 ml 0,9% NaCl til fortynning 9 x 3,5 ml Hershey´s “sloppy” agar (toppagar) Automatpipetter Sterile pipetter og spisser til automatpipetter Varmeblokk Whirlmixere

- 9 -

KURSDAG 15. Fredag 12/3. Øvelse 17. Bakteriofag, 2. dag. Ettrinns vekst ("burst size") for bakteriofag. NB; FORSØKET TAR 2 TIMER. Medier, utstyr , fag og bakterier: Aktivt voksende kultur av E. coli B i Hershey´s broth 0,1 ml 0,02 M KCN 2 x 9,9 ml Hershey´s broth Suspensjon av T2-fag 15 rør med Herseys broth til fortynning (9 ml i hvert) 21 plater med Hershey´s agar 21 x 3, 5 ml Hershey´s “sloppy” agar (toppagar) Automatpipetter og sterile spisser Varmeblokk, vannbad, stoppeklokke Whirlmixere KURSDAG 16. Tirsdag 16/3. Øvelse 17. Bakteriofag, 3. dag. Ettrinns vekstkurve for bakteriofag (avsluttes). Øvelse 18. Mikrobiologisk vannanalyse, 1. dag. Medier og prøver: Vannprøver 5 durhamrør med 5 ml laktose-pepton medium (3 x styrke) 10 durhamrør med 10 ml laktose-pepton medium (enkel styrke) 1 stk. 10 ml pipette 3 stk. 1 ml pipette KURSDAG 17. Onsdag 17/3. Øvelse 18. Mikrobiologisk vannanalyse, 2. dag. Medier og prøver: 1 stk. 10 ml pipette 3 stk. 1 ml pipette 1 durhamrør med laktose-briljantgrønt-gallesalter for hver positive (2. dag) 1 durhamrør med laktose-gallesalter for hver positive (2. dag.) 1 rør med indol-medium for hver positive (2. dag). KURSDAG 18. Fredag 19/3. Øvelse 18. Mikrobiologisk vannanalyse, 3. dag. Øvelse 19. Winogradski-søyle (avsluttes). Oppsummering. Reagenser: Kovacs indolreagens Fredag 26/3. Siste frist for innlevering av journal 2!

- 10 -

Øvelse 1. Mikroskopering Mikroorganismer er for små til å kunne ses med det blotte øye og må derfor observeres i et mikroskop (mikro betyr liten, skopein betyr å se). Et moderne lysmikroskop består av følgende hovedkomponenter; lyskilden som sitter nede på foten og sender lys gjennom kondensoren som fokuserer lyset i et lite område i objektet planet. Objektet som skal undersøkes er plassert på objektbordet og over det sitter objektiv-linsene som forstørrer objektet. Nærmest øyet er okularlinsene som gir en ytterligere forstørrelse av bildet i objektivet.

Fig 1.1. Skisse av mikroskop med fasekontrast kondensor

- 11 -

- 12 -

Dybdeskarpheten i bildet avtar eksponensielt med økende numerisk appretur. Den vanlige lysmikroskopi metoden kalles lysfeltmikroskopiering. Preparatet er da mørkt på lys bakgrunn, fordi en del av lyset som treffer preparatet blir absorbert eller reflektert. Ved mørkefeltsmikroskopi benyttes en kondensator som bryter lyset slik at bare det lyset som spres fra preparatet kommer inn i objektet. Preparatet blir lyst på mørk bakgrunn. Mørkefelttsmikroskopi gir bedre kontrast og oppløsningsevne enn vanlig lysfeltsmikroskopi, men gir bare omrisset av cellens som skal studeres. De fleste mikroorganismer er store nok til å kunne bli sett i et lysfeltsmikroskop, men det er ofte vanskelig å se i ufargede preparater fordi cellene absorberer lite lys, og det blir dermed liten kontrast mellom dem og omgivelsene. Det samme problemet gjelder også for organeller og andre tette komponenter inne i en enkelt (eukaryot) celle. Fasekontrastmikroskop benyttes for å øke kontrasten mellom cellene, bakgrunnen og strukturere inne i cellen og cytoplasma. Fasekontrastmikroskopet nyttegjør seg av at objekter med forskjellig tetthet (og dermed forskjellig refraksjonsindeks) sprer lys forskjellig. Fase-endrede elementer i objektivlinsen endrer lyset slik at det blir en faseforskjell mellom det spredte (diffrakterte) og ikke spredte lystet. Når det spredte og ikke spredte lyset bringes sammen, gir det en lavere lysintensitet p.g.a. faseforskjellen (destruktiv interferens). Jo mindre gjennomskinnelige objekter er, jo større er diffraksjonen (spredningen) og jo mørkere vil objektet fremstå.

Anmerkninger om mikroskopene Forstørrelsen er inngravert på objektiver og okularer. Avstanden mellom okularene må tilpasses avstanden mellom øynene. Når bildet fra begge øynene faller sammen til et sirkelrundt bilde, er avstanden riktig (som en kontroll kan du spørre din optiker neste gang du tar en synstest). Den vanligste objektivforstørrelsen vi bruker er 40x. Alle mikroskopene har også et 100x objektiv, merk at dette kun kan brukes sammen med immersjonsolje.

- 13 -

Ringblenderne i kondensorene er tilpasset objektivene. Følgende innstillinger brukes: Objektiv Lysfelt Mørkefelt Fasekontrast 2,5x H (0) - - 10x H (0) 5 (D) 1 40x H (0) 5 (D) 2 100x H (0) (NB olje!) - 3 (NB olje!) Vi bruker oftest fasekontrast, lysfelt bukes til fargede prepareter (Øvelse 4, Gram-farging) Et sett mikroskoper (benk nr 1 til 8) har felles fasering for alle forstørrelsene. Behandling av mikroskopet. Mikroskopet er et kostbart presisjonsinstrument, og følgende punkter må overholdes nøye: 1) Støvhetten skal alltid være på mikroskopet når det ikke er i bruk. 2) Søl av kjemikalier må fjernes straks. 3) Rengjøring av optikken foretaes enklest ved å puste dugg på linsene, og tørke med linsepapir. Bruk aldri tørt papir på optikk. 4) Immersjonsolje og fett på linsene fjernes omhyggelig med linsepapir fuktet med xylen eller ”Lens Cleaner” (Kodak e. l.). Bruk hansker. 5) Bruk begge hender når du flytter mikroskopet, unngå støt. ØVELSE 1. Mikroskopering Det er utlevert en petriskål med kultur av Escherichia coli, 0,9% NaCl og pasteurpipetter. I skuffen finnes objektglass, dekkglass og en podenål. 1) Koble til strøm for å få lys . Still alltid lysjusteringen lavt til å begynne med, og skru opp til behagelig lys.

Høye spenninger forkorter lampens levetid betydelig. 2) Juster avstanden mellom okularene slik at de passer til øynene. Blikket skal brukes som om du ser på noe

som er langt borte, okularbredden er riktig når du ser bildet som en enkelt sirkel. 3) Sjekk at alle blendere (lampe og kondensor er åpne) 4) Plasser objektglass med preparatet på kryssbordet med den fjærbelastede armen. 5) Skru opp kryssbordet til avstand mellom objektiv og preparatet er ca 1 mm. 6) Se i mikroskopet samtidig som du a) beveger kryssbordet horisontalt b) hever kryssbordet inntil preparatet

kommer i fokus. Hensikten med å bevege kryssbordet er at en da kan skille mellom preparatet (som da beveger seg), og artefakter som kan oppstå fra støv og lignende i selve optikken. Sjekk fra tid til annen om linsen berører preparatet, da har du skrudd for langt, gå i så fall tilbake til punkt 5. Preparater: Lag en suspensjon av bakterien på objektglasset (ved å løse opp litt av én koloni i en liten dråpe saltvann) med en steril podenål. Suspensjonen skal være lett turbid, ikke helt grå, da er den for tett. Sett på dekkglass og prøv så å finne bakteriene i mikroskopet ved å bruke objektivet med 10x. Bruk deretter 40x og tilslutt 100x. Ved 100x må det brukes olje mellom objektivet og dekkglasset for at man skal kunne se noe. Drypp derfor en dråpe olje oppå dekkglasset. Obs. Det skal ikke være olje mellom objektglass og dekkglass. Fyll inn info om mikroskopet i tabellen i laboratoriejournalen og tegn en liten figur av hva du ser i mikroskopet.

- 14 -

ØVELSE 2. Dyrkning av E. coli på agarskål og i flytende vekstmedium Som dere vil erfare i dette laboratoriekurset, vokser bakterier (og andre mikroorganismer) nær sagt overalt i naturen. Når bakteriene finner de rette vekstbetingelsene vil de vokse og formere seg. Mikrobiologer ønsker vanligvis å studere renkulturer av bakterier. Det vil si at mikrobiologer må kunne isolere de ønskede bakteriene og holde dem i kultur i laboratoriet uten at kulturene blir forurenset (kontaminert) av andre mikroorganismer. Mikrobiologer må med andre ord beherske det vi kaller sterilteknikker. Hensikten med denne oppgaven er derfor å innøve noen vanlige teknikker for isolering og dyrkning av bakterier. Escherichia coli benyttes som eksempel. Agar er et polysakkarid fremstilt fra rødalger, og det benyttes til å omdanne vekstmedier til en fast gel. Vanligvis inneholder vekstmedier 1,5 til 2,0% agar. Dersom agarmedier inneholder de nødvendige næringsemnene, og de fysikalske betingelsene (temperatur, pH, aerobt/anaerobt etc.) ved inkuberingen er de rette, kan bakterier, gjær og sopp vokse på agaroverflaten. For rasktvoksende bakterier (f. eks. E. coli) kan en celle formere seg og gi en synlig koloni på agarmediets overflate i løpet av et halvt døgn. Dyrkning av bakterier på agarmedier skjer vanligvis i petriskåler, og petriskåler med agarmedium betegnes agarskåler eller -plater. Agarskåler er hensiktsmessige å benytte for å oppnå renkulturer av bakterier, kontrollere renheten av kulturer og oppbevare kulturer over kortere tidsrom. Kolonienes utseende (morfologi) varier hos ulike typer bakterier, sopp og gjær. Selv om koloni-morfologi ikke i seg selv er et tilstrekkelig grunnlag til å klassifisere bakterier eller andre mikroorganismer, vil utseendet av koloniene på agarskålen gi oss en indikasjon på om vi har en renkultur eller om kulturen inneholder flere typer bakterier/mikroorganismer. En annen vanlig dyrkingsmåte for å oppformere eller studere bakterier er å benytte flytende næringsmedier. For aerob dyrkning (med tilgang på luft) has vekstmediet i en kolbe med plasthette eller bomullspropp som virker som luftfilter. Bakterier som på forhånd er isolert i renkultur på agarmedium, overføres til mediet og kolben settes vanligvis på en rystemaskin for å bedre lufttilførslen under inkubasjonen. I denne oppgaven skal vi øve oss på å stryke ut bakterien E. coli på agarskål. Hensikten med utstrykningen er å lage en gradient av bakterier på agaroverflaten, slik at man oppnår at de enkelte bakteriecellene blir skilt fra hverandre og kan gi opphav til adskilte kolonier. For denne dyrkningen brukes et rikt LA-medium (inneholdende gjærekstrakt og pepton). Koloniene som vokser opp på LA-mediet skal den neste kursdag brukes som inokulum for en flytende kultur. Her benyttes et minimal-medium som inneholder glukose som eneste karbon- og energikilde samt fosfat, NH4

+, SO4-,Mg2+, K+ og spormineraler for å tilfredsstille E. coli bakteriens øvrige

vekstkrav. Utførelse Øvelsens 1. dag (Kursdag 1). Det er utlevert en agarskål med LA-medium pr. kursdeltaker og en agarskål med bakterien E. coli pr. benk. Podenålen (gjerne med en liten løkke på enden) flamberes først i en gassflamme (dvs. glødes) og avkjøles ved å stikke den ned i agaren. Når nålen er avkjølt, tas det opp litt materiale fra en koloni, og nålen strykes 3 - 4 ganger nær kanten av den sterile agarskålen (se 1 i Fig. 2 s. 16). Nålen flamberes på nytt og avkjøles. Den strykes så 3 - 4 ganger på agaroverflaten, slik at den berører strekene fra første utstrykning en gang (se 2 i Fig. 2). Nålen flamberes igjen, og utstrykningen gjentas for tredje og eventuelt fjerde gang som vist på figur 2 side 16. Merk bunnen (ikke lokket) av skålene med GRUPPE-NR., BENK-NR. og øvelse nr. Skålene inkuberes opp/ned (for å hindre rask uttørking) ved 37oC. Øvelsens 2. dag (Kursdag 2). Overføring av E. coli fra agarskål til flytende medium Agarskålen inspiseres. Vurder om utstrykningen har gitt områder med godt adskilte kolonier og om koloniene ser ensartet ut. Fra en godt adskilt koloni overføres cellemateriale med podenålen til det flytende vekstmediet i vekstkolben. Det er utlevert en kolbe til hver student. Agarskålen kastes etter bruk.

- 15 -

Merk kolben med GRUPPE-NR., BENK-NR. og øvelse nr. Kolben inkuberes med rysting ved 37oC. Øvelsens 3. dag (Kursdag 3). Se om det er vekst i kolben og kontroller ved mikroskopering at cellene ser ensartet ut. (Øvelsen avsluttes). * * * ØVELSE 3. Mikroorganismer i luft og på kroppen. Mikroorganismer finnes praktisk talt overalt. Dette kan påvises ved å berøre overflaten av et generelt agarmedium med f. eks. fingrene eller leppene eller la agarskålen stå udekket mot luft i ca. 10 til 30 min. Etter inkubering ved 30oC, vil celler av bakterier, gjær eller muggsopp som har havnet på skålen, vokse fram til kolonier. Utførelse Det er utlevert 4 agarskåler med LA pr. gruppe. Øvelsens 1. dag. (Kursdag 2). Bakterier i luft. Agaroverflaten eksponeres en viss tid mot luft ved å ta av lokket. 2 grupper går sammen om ansvaret for å måle bakterietetthet i hver sin lokalitet. Laboratoriets labbenk, vinduskarm, gang etc. Bruk 4 skåler med forskjellig eksponeringstid (f. eks. 5-10 – 30min- 1 time; noter tiden på skålene). Bakterier på fingre. Sett to streker i kryss på bunnen av en skål slik at den deles i fire deler. Hver deltaker setter et fingeravtrykk på agaroverflaten i ett av feltene. Merk disse to feltene med uvasket og med initialer. Vask så hendene med såpe, skyll og tørk. Sett deretter av fingeravtrykk på de to gjenværende feltene og merk disse. Bakterier på lepper. En i gruppen presser leppene mot agaroverflaten på den fjerde skålen. Agarskålene merkes og inkuberes ved 30oC til neste kursdag. Øvelsens 2. dag. (Kursdag 3 eller 4). Inspiser skålene og tell antall kolonier. Resultatet fra luftskålene noteres på tavlen så raskt som mulig slik at hele klassen kan få alle resultatene. Husk å notere ned resultatene i labjournalen. Mikroskoper noen av koloniene fra luft platene, og noen fra leppe platen, ved å overføre en liten del av koloniene vha. podenåla til en dråpe vann på et objektglass. Undersøk spesielt om “luft-platene” er kontaminert med kolonier av Micrococcus luteus som er vanlig forekommende i luft. Dette er den bakterietypen som vi benytter i lysozym-øvelsen (Øvelse 5) og til gramfarging (Øvelse 4). De danner gule kolonier og forekommer gjerne i kuber med åtte celler (sarcina-type cellemorfologi). (Skålene kastes etter bruk). Noter alle resultater i labjournalen. * * * ØVELSE 4. Gramfarging. Ved gramfarging kan vi skille mellom to typer cellevegg hos bakterier. Hos grampositive (G+) bakterier består celleveggen nesten bare av peptidoglykan. Hos gramnegative (G-) bakterier utgjør peptidoglykanet bare 5-10% av celleveggen, mens resten utgjøres av en yttermembran bestående av lipopolysakkarid (LPS), fosfolipid og protein. Hos begge typer bakterier er det peptidoglykanet som gir celleveggen mekanisk styrke. Gramfarging utføres ved at bakterier som er fiksert til et objektglass, tilsettes løsninger med henholdsvis krystallfiolett og KI-jod. Ved blanding av jod og krystallfiolett dannes det et fargekompleks. Ved rask skylling med etanol avfarges G- bakterier, mens G+ bakterier beholder dette fargekomplekset inne i cella (slå opp i

- 16 -

læreboka for å finne ut hvorfor! Hint: s 84 2009 edition). For lettere å skille mellom G+ og G- bakterier i mikroskop kontrastfarges vanligvis bakteriene med det røde fargestoffet safranin. Ved mikroskopering (uten bruk av fasekontrast) vil G+ bakterier være blåfiolette og G- bakterier være lyserøde (fargeløse eller lyseblå dersom kontrastfarging ikke brukes). (Se Fig. 3). Utførelse A. Prosedyre for gram-farging. (Kursdag 3). Det blir utlevert 1 skål med E.coli og en skål med M.luteus. 1). Et rent objektglass flamberes på begge sider for å fjerne fett. Obs. Dette gjøres med en treklype da glasset blir svært varmt. Sett glasset til avkjøling etterpå. 2) En liten dråpe vann settes på objektglasset når det er avkjølt til romtemperatur (bruk lite vann slik at det tørker fort igjen). Med podenålen overføres en liten mengde bakterier fra en bakteriekoloni til vanndråpen. (Dråpen skal bare bli svakt blakket så pass på at du ikke tar for mye av bakteriekolonien). Dråpen strykes utover i et tynt lag på objektglasset og tørkes i luft. 3) Fikser bakteriene til glasset ved å stryke objektglasset forsiktig gjennom flammen på gassbrenneren. Avkjøl til romtemperatur. 4) Legg et papirhåndkle på benken og legg en petriskål opp på dette. Objektglasset legges i skålen med preparatsiden opp og overhelles med krystallfiolett (reagens 1) slik at bakteriene er dekket. La stå i 1-2 min. 5) Skyll forsiktig med rennende vann ned i et begerglass, ryst av vannet og tilsett jodløsning (reagens 2). La stå i 1-2 min. 6) Objektglasset holdes på skrå og 96 % etanol dryppes på slik at det renner over preparatet til det ikke frigjøres mer fargestoff (10-30 sek. bør være nok). 7) Skyll raskt med rennende vann, rist av vannet og tilsett safranin (reagens 3). La stå 1/2 min. 8) Skyll raskt med vann og tørk ved å presse et filterpapir opp på preparatet. 9) Etter lufttørking kan preparatet mikroskoperes. Uten å dekke til med dekkglass lokaliseres de fargede cellene med 10X objektivet. Mikroskoper så med 40X objektivet eller tilsett immersjonsolje og mikroskoper med 100X objektivet (uten bruk av dekkglass). Noter resultatet i labjournalen. (Dersom du ønsker å studere de fargede preparatene ytterligere i mikroskop, så ta vare på disse til neste kursdag). B. Gram-test etter KOH-metoden. (Kursdag 4; avsluttes). En dråpe 3% KOH has på et objektglass. Materiale fra en bakteriekoloni slemmes opp i dråpen og blandes godt. Erfaring viser at dersom suspensjonen blir viskøs innen ca. ett min, er bakterien G-. Dersom suspensjonen ikke blir viskøs, er bakterien G+. En eventuell viskositetsøkning skyldes at DNA har lekket ut av cellen, og dette kan påvises ved å stikke løkken på podenåla ned i suspensjonen og observere om det kan trekkes ut seige “tråder” av DNA. Trådene er svært tynne og blir ikke så lange, så man må se nøye etter for å få øye på dem. Rør litt rundt i suspensjonen og prøv å dra opp tråder flere ganger hvis det ikke lykkes på første forsøk. Noter resultatet i labjournalen.

- 17 -

Fig4.1. Gram-farging

* * *

ØVELSE 5. Lysozym i tårer. Alexander Flemming, som oppdaget penicillin, oppdaget også et bakteriedrepende enzym som kalles lysozym. Lysozym forekommer i forskjellige kroppsvæsker og biologisk materiale som tårer og eggehvite og fungerer som et forsvar mot bakterier. Lysozym hydrolyserer peptidoglykan som finnes i cellevegg hos bakterier. Ved lysozymbehandling mister cellen sin form og cellemembranen sprekker på grunn av osmotisk påvirkning. Grampositive bakterier er spesielt følsomme for lysozym, mens peptidoglykanet hos gram negative bakterier er beskyttet mot lysozym av yttermembranen. Vi skal her undersøke innflytelsen av lysozym i tårer på vekst av en gram positiv bakterie (Micrococcus luteus) og en gram negativ bakterie (E. coli).

- 18 -

Utførelse Lysozym, 1. dag. (Kursdag 4). Hver gruppe får utlevert to agarskåler med LA-medium. Hver benk får utlevert en dråpeflaske med kulturer av henholdsvis E. coli og M. luteus. Drypp et par dråper av hver av kulturene på hver sin plate med næringsagar og fordel bakteriene jevnt utover vha. en bøyd glasstav. Glasstaven dyppes i etanol, brennes av vha. gassflammen og avkjøles i luft før bruk. (Glasstaven skal ikke holdes i flammen). La gjerne skålene tørke noen minutter etter utstrykning. Merk bunnen av skålene med hhv. Micrococcus og E. coli, samt gruppens nr., benk nr og øvelsens nr. Dere skal nå samle tårer. Hold derfor et lite stykke ferskt overskåret løk under øyet på din medarbeider. Vedkommende bør stå med hodet bøyd til samme side som det øyet det skal samles tårer fra. Fang opp tårene med en steril dråpepipette, og overfør dem til et sterilt Eppendorf-rør. Dere trenger 2 -3 dråper. Drypp en dråpe tåre på midten av hver agarskål. Skålene blir deretter inkubert ved 37oC. Lysozym, 2. dag. (Kursdag 5). Inspiser agarskålene. Noter og diskuter resultatene i laboratorie-journalen. (Skålene kastes etter bruk).

* * * ØVELSE 6. Isolering av ekstremt halofile arkebakterier. Det finnes tre hovedtyper arkebakterier (Archaebacteria) som kan dyrkes i laboratoriet: ekstremt halofile, metan-produserende og hyper-termofile S-avhengige. (Det finnes i tillegg andre typer arkebakterier som man hittil ikke har greid å dyrke i laboratoriet). Vi skal forsøke å isolere den ekstremt halofile typen. Disse arkebakteriene finnes i naturlig saltsjøer (f. eks. Dødehavet) og i laguner hvor det produseres havsalt ved sol-inndamping av sjøvann. Fra lagunene overføres de halofile arkebakteriene til havsaltet vi kjøper i butikken. Utførelse Øvelsens 1. dag. (Kursdag 4). Noen krystaller kommersielt havsalt strøs på overflaten av YES-agar, som inneholder gjærekstrakt og 20 % havsalt. Agarskålen pakkes i plastposer (for å hindre uttørking) og inkuberes ved 35oC. Obs: Ikke snu skålen for da faller saltkrystallene av. Det vil ta noen uker før det vokser opp kolonier som er store nok til å arbeide videre med. Øvelsens avslutning. (Kursdag 9 eller avtales senere) Lag en suspensjon av de halofile arkebakteriene i en dråpe 20% havsaltvann på et objektglass. Inspiser bakteriene i mikroskopet og beskriv cellene. Bakterieceller som er tilpasset sterk saltholdighet i mediet vil sprekke dersom saltholdigheten synker drastisk. Når bakteriecellene sprekker forsvinner turbiditeten i bakteriesuspensjonen, og dette skal vi vise ved et enkelt forsøk. Det er utlevert to reagensrør, lag en suspensjon av bakteriemasse i 1 ml saltvann i det ene røret, og pipetter halvparten over til det andre røret. Suspensjon bør være sterkt turbid, dvs. ganske grumsete (og rosa). Tilsett 1 ml 20 % saltvann til rør 1, deretter omtrent like mye destillert vann til det andre, vortex rørene og se om det skjer farge/gjennomsiktighets-endringer. Beskriv forskjellen i labjournalen. * * *

- 19 -

ØVELSE 7 A-C. Karakterisering av pseudomonader. Bakterier som tilhører gruppen Pseudomonas er stavformede og bevegelige (polart flagellerte) De får alltid energi (ATP) til vekst ved respirasjon. Oksygen er den foretrukne elektron-akseptoren, men de fleste kan utføre anaerob respirasjon med nitrat som elektron-akseptor (såkalt denitrifisering). Bakteriene inneholder cytokrom c-oksidase som kan påvises med Kovacs oksidasetest. De kan ikke gro fermentativt. Nyere taksonomi basert på 16S RNA-homologi har vist at Pseudomonas er en heterogen gruppe bakterier. Det finnes dessuten mange bakterier som likner på Pseudomonas, og man bruker derfor ofte ordet pseudomonader (engelsk: pseudomonads) som en løsere betegnelse på disse bakteriene. En typisk egenskap hos pseudomonader er at de kan bruke en mengde forskjellige lavmolekylære organiske forbindelser som eneste energi- og karbonkilde. I denne øvelsen får dere utlevert en ukjent stamme av Pseudomonas. Vi skal utføre noen enkle taksonomiske tester med denne stammen og deretter sammenlikne med skjema for identifisering av Gram-negative bakterier på side 7 i labjournalen. Øvelse 7, del A, mikroskopering. Utførelse Øvelsens 1. dag (Kursdag 5). En kultur av en ukjent Pseudomonas stamme utleveres på en agarskål (1 skål per benk). Mikroskoper og sjekk cellemorfologi og bevegelighet. Noter i tabell i labjournalen. Overfør bakterien til en skråagar med succinatmedium. Stryk også bakterien på en ny agarskål med succinatmedium slik at hver gruppe får sin egen skål. Skråagar er et reagensrør med agarmedium, hvor agaren lager en skrå overflate langs rørveggen. En skråagar tørker ikke så fort ut som agarplater og er derfor hensiktsmessig å bruke ved oppbevaring av bakterier. Øvelse 7, del B, anaerob respirasjon (denitrifisering). Utførelse 1. dag (Kursdag 6) Fra agarskålen med succinat-medium, ta en koloni av Pseudomonas og bruk denne som inokulum i et anaerobt rør med succinat-nitrat-medium. Fyll helt opp med medium og sett så på proppen (gjøres over vasken). Merk røret og inkuber kulturen. Vekst under disse betingelser vil bety at isolatet kan respirere med nitrat som elektron-akseptor. 2. dag (kursdag 7) Inspiser den anaerobe kulturen med succinat-nitrat-medium for bakterievekst og gassdannelse. Pseudomonas er denitrifiserende bakterier og forventes å produsere N2 og CO2 under anaerob vekst i dette mediet. (Kulturene kastes etter bruk). Noter resultatet i tabellen i labjournalen. Øvelse 7, del C, karakterisering av pseudomonader. Bakterien skal testes for dens evne til 1) å fermentere eller oksidere glukose til syrer, og 2) for tilstedeværelse av cytokrom c-oksidase i cellene. E. coli er fermentativ og mangler cytokrom c-oksidase, og brukes som kontroll. Utførelse 1. dag (kursdag 6) Fermenteringstest (OF-test eller Hugh-Leifson-test). Det lages to stikkagarer med Hugh-Leifson-medium for

- 20 -

hver bakterie som skal undersøkes. Mediet inneholder glukose, pepton, pH-indikatoren bromtymolblått og lav konsentrasjon av agar (ca. 0,5%). Agarmediet er fylt i reagensrør. Litt bakteriemasse tas ut med steril podenål, som stikkes rett ned i agaren. Det ene røret forsegles med steril smeltet parafinvoks. Voksen smeltes på benken over gassbrenner (dette blir det anaerobe røret; røret uten vokspropp er aerobt). Inokuler i tillegg et aerobt og et anaerobt rør med utlevert E. coli. Rørene inkuberes ved romtemperatur. 2. dag (kursdag 7) Inspiser stikkagarene med Hugh-Leifson-medium og noter resultatet. Syreproduksjon registreres ved fargeomslag av indikator fra grønt til gult. Gassproduksjon registreres ved dannelse av gasslommer i agaren som er forseglet med parafinvoks. Konsulter figur med skjema for identifisering av Gram-negative bakterier. Merk følgende: Pseudomonas er ikke-fermentative bakterier og skal derfor ikke produsere syre eller gass i de anaerobe rørene. Noen pseudomonader produserer imidlertid syre ved oksidasjon av glukose under aerob vekst. Det er også mulig med fargeomslag til blått (basisk reaksjon) i de aerobe rørene pga. ammoniakk-produksjon fra pepton i mediet. E. coli forventes å produsere syre og gass, særlig i det anaerobe røret. Tilleggsopplysninger til skjema OF-test Fermentative: Vekst og fargeomslag i det forseglede (anaerobe røret), eller begge. Vekst og fargeomslag i bare det aerobe: Pseudomonas gruppe I og II, samt Agrobacterium (da er de ikke fermentative, men produserer syre ved aerob respirasjon). Da pseudomonader er respiratoriske, vokser de ikke i det anaerobe røret (fordi her er ikke oksygen og ikke nitrat). Dersom avlesningen går greit vaskes rørene, hvis ikke inkuberes de videre til neste kursdag. Kovacs oksydasetest. Bakterier tilhørende gruppen Pseudononas inneholder alltid cytokrom c-oksidase, som kan påvises ved Kovacs oksydasetest. Drypp noen dråper oksydasereagens (1% N-tetrametyl-p-fenylendiamin i vann) på et filtrerpapir. Overfør materiale fra en koloni med pseudomonader til det våte området på papiret. Ved positiv reaksjon blir bakteriemassen dyp blå innen ett min. Bruk utlevert E. coli som en negativ kontroll. Utfør også Gram-test med KOH-metoden. (NB. Skråagaren av Pseudomonas skal brukes på nytt på kursdag 10 i Øvelse 10). Avslutning. Et skjema for klassifisering av noen gram-negative, heterotrofe bakterier er angitt på s. 9 i labjournalen. Undersøk om dine resultater samsvarer med det som gjelder for Pseudomonas-gruppene. 3. dag (kursdag 8) Eventuelt: Inspiser stikkagarene med Hugh-Leifson-medium og noter resultatene. * * * ØVELSE 8. Mikroskopering. Utføres kursdag 5. Vi skal i denne øvelsen ta oss tid til å mikroskopere forskjellige mikroorganismer som holdes i kultur ved instituttet. Arter eller typer bestemmes av hva som er tilgjengelig. Husk å notere hva dere så i mikroskopet i labjournalen. * * *

- 21 -

ØVELSE 9-11. Isolering av forskjellige typer bakterier fra jord. (Forord). Det er anslått at 100 g “god” matjord inneholder 10.000 forskjellige typer bakterier, men bare et fåtall av disse har hittil latt seg dyrke på laboratoriemedier. I dette eksperimentet skal vi isolere tre forskjellige typer av bakterier fra den samme jordprøven ved å variere behandlingen av jordprøven og anriknings- og vekstbetingelsene for bakteriene. Anrikningskulturer brukes når vi vil isolere bestemte typer bakterier (eller andre mikroorganismer) fra prøver som inneholder mange ulike mikroorganismer. Stryker vi ut fra en prøve direkte på en agarskål med et ikke-selektivt medium, vil vi bare få kolonier av de artene som det er mest av i prøven, og som kan vokse på det valgte vekstmediet. Når vi vil isolere bestemte typer bakterier, benytter vi vanligvis flytende anrikningskulturer med selektive medier hvor bestemte organismer favoriseres. Anrikningskulturene inokuleres med et inokulum som forventes å inneholde den eller de bakteriene som vi ønsker å isolere. Etter inkubering vil kulturene bli dominert av de bakteriene som vokser fortest og til høyest antall under de valgte betingelsene. Fra anrikningskulturene kan så de dominerende bakteriene eventuelt isoleres ved utstrykning på agarskåler. Vanlige parametere som kan varieres i anrikningskulturer er: - Karbonkilde (sukkerart, organisk syre, alkohol, alkaner etc.) - Nitrogenkilde (f. eks. NH4+, NO3-, N2) - Energikilde (organiske eller uorganiske forbindelser, lys) - Aerobe forhold - Anaerobe forhold med eller uten ekstern elektronakseptor ( f. eks.. NO3-, SO42-) - Temperatur Suspensjon av jord lages ved å riste ½ spiseskje jord med 20 ml sterilt vann, hvoretter suspensjon får stå i ca. 2 - 4 min. Én del av suspensjonen brukes som inokulum i en anrikningskultur for isolering av Azotobacter sp. (Øvelse 9), en annen strykes på skåler for vekst av streptomyceter (Øvelse 10). En tredje del pasteuriseres for bruk som inokulum ved isolering av Bacillus sp. (Øvelse 11). * * * ØVELSE 9. Aerobe nitrogenfikserende bakterier - Azotobacter. De fleste heterotrofe bakterier som fikserer N2, er obligat eller fakultativt anaerobe, og N2-fikseringen foregår dermed bare under anaerobe vekstbetingelser. Bakterier tilhørende slekten Azotobacter er eksempel på bakterier som kan fiksere N2 under aerob vekst, og denne egenskapen skal vi benytte til å anrike på denne typen bakterier. Erfaringsmessig gror disse bakteriene bra med mannitol som karbon og energikilde i medium uten bundet nitrogen (“N-fritt” medium). Mange bakterier kan ikke benytte mannitol, og bruk av mannitol som karbon- og energikilde er derfor med på å gjøre mediet enda mer selektivt. Utførelse Azotobacter, 1. dag. (Kursdag 6). Inokuler ca. 5 ml fra supernatanten av jordsuspensjonen til EM-kolbe med 20 ml mannitol-“N-fritt”-medium. Bruk pasteurpipette som tar ca. 1 ml. Kolben merkes og inkuberes stillestående og mørkt ved 30oC til neste kursdag. Azotobacter, 2. dag. (Kursdag. 7). Undersøk om det er dannet en tydelig hinne på overflaten av mediet. Obs: Ikke rist eller rør for mye på kolben for da vil hinna gå i stykker. Azotobacter er aerobe og har et stort oksygenforbruk, de kan leve i denne hinnen. Inspiser en prøve fra hinnen i mikroskop. Azotobacter er vanligvis bevegelige, cellene opptrer parvis, og de er

- 22 -

ofte fylt med “korn” av poly-β-hydroksybutyrat. Overfør noen dråper fra overflaten til nytt medium og inkuber med rysting til neste kursdag. De gamle kulturene kan også inkuberes på nytt (uten risting) dersom veksten av Azotobacter var utilfredsstillende. Azotobacter , 3. dag. (Kursdag 8; avsluttes). Inspiser og mikroskoper kulturene. Lag en tegning av bakteriene i labjournalen og sammenlign med bilder av Azotobacter i læreboka. (Kulturene kastes etter bruk). * * * ØVELSE 10. Isolering av streptomyceter. Streptomyces er den største gruppen av aktinomycetene. De ligner sopp ved at de danner et såkalt mycel som er et nettverk av lange, trådformede, ofte forgrenede hyfer. I motsetning til sopp som er eukaryote, er aktinomycetene prokaryote, grampositive bakterier. Det er stor forskjell på tykkelsen på mycelet som er 0.5 til 1.5 μm hos aktinomycetene og ca.10 μm hos sopp. På agarplater danner aktinomycetene et substratmycel ned i substratet og deretter et luftmycel. Hos mange aktinomyceter fragmenterer mycelet raskt til uregelmessige kokker og staver. Streptomycetene er karakterisert ved at de danner et mer stabilt mycel som ikke fragmenterer, og ved at de danner konidiesporer i lange kjeder på luftmycelet. Kolonier av streptomyceter er forholdsvis lett gjenkjennelige ved at de har sopplignende (”melaktig”) utseende. Dessuten kan vekst av streptomyceter ofte gjenkjennes ved at det dannes en karakteristisk jordlukt som forårsakes av produksjon av geosminer. Til isolering av streptomyceter benyttes Kusteragar. Mediet er til en viss grad selektivt fordi mange bakterier ikke kan bruke stivelse som karbonkilde og nitrat som nitrogenkilde. Mediet er dessuten tilsatt et soppdrepende middel, cycloheximid (50 μg/ml), for å hindre at agarskålene overgros med sopp. Mange (50% av alle isolerte til dags dato) streptomyceter produserer antibiotika, et av disse er Streptomycin. Antibiotika er lavmolekylære forbindelser som er giftige for andre mikroorganismer. Vi skal til slutt teste om våre isolater har påvisbar produksjon av antibiotika. Utførelse Streptomyceter, 1. dag. (Kursdag 6). Fra jordsuspensjonens supernatant overføres 1-2 dråper med pasteurpipette til en Kusterplate. Fordel dette ut over agarskålen med. en bøyd glasstav. (Glasstaven flamberes med etanol og avkjøles ved å berøre agarflaten ved siden av inokulumet). Platene inkuberes ved 25oC. Streptomyceter, 2. dag. (Kursdag 7). Undersøk om platene har en karakteristisk jordlukt. Se etter små melaktige kolonier. Undersøk disse koloniene i mikroskop ved å berøre dem med podenåla og overføre materiale direkte til en dråpe vann på et objektglass. Se etter konidiesporer. (Lever inn platene for videre inkubering dersom veksten er dårlig). Isoler to lovende streptomyceter fra plata ved å stryke ut på to nye skåler med Kusteragar. Lever inn de gamle skålene for videre inkubering dersom veksten var dårlig. Streptomyceter, 3. dag. (Kursdag 8). Inspiser skålene for steptomyceter. For testing av antibiotikaproduksjon strykes to kolonier (fortrinnsvis ren-isolerte fra hver sin plate) som parallelle striper på en næringsagar (se Fig. 13.1 på s. 25). Skålene inkuberes ved 25oC til kursdag 11. Streptomyceter, 4. dag (Kursdag 10). Dine isolater av streptomyceter skal nå ha vokst opp langs strekene på agarskålen. Eventuell

- 23 -

antibiotikaproduksjon testes ved at du stryker Pseudomonas (fra Øvelse 7) og Bacillus (fra Øvelse 11) sammen med en utlevert E. coli (som er en streptomycin-resistent stamme) på tvers mellom streptomycet-strekene slik at utstryket med testorganismene nesten berører de første strekene (se Fig. 13.1 på s. 25). Platene inkuberes til neste kursdag. Streptomyceter, 5. dag. (Kursdag 11; avsluttes). Inspiser platene og noter resultatet. Eventuell antibiotikaproduksjon vil gi hemming av en eller flere av testorganismene nær streptomycet-strekene. Lever inn skålene etter bruk, siden det er antibiotika-resistente bakterier på dem skal de i autoklaven for destruksjon. * * * ØVELSE 11. Isolering av endosporedannende bakterier - type Bacillus. Bakterier tilhørende slekten Bacillus danner sporer inne i cellen. I mikroskop ser endosporer ut som en intens lysende kule inne i bakterien, eller som kuler som svever fritt i medie hvis bakterien har gått i oppløsning rundt sporen. Sporene kan ha forskjellig plassering i bakteriecellen og ha større eller mindre diameter enn denne. Endosporer tåler ofte lengre tids koking, men de drepes ved autoklavering ved 121oC. Bacillus arter er vanlig forekommende i jord. For anrikning og isolering av disse bakteriene er det vanlig å utnytte endosporenes varmeresistens. Oppvarming av jordsuspensjon til 80oC i ca. 15 min, såkalt pasteurisering, dreper de fleste vegetative (dvs aktivt voksende) celler, men ikke endosporer. Ved anrikning tar vi også hensyn til disse bakterienes relasjon til oksygen. Bacillus-arter er obligat aerobe eller i noen tilfelle fakultativt anaerobe. I dette forsøket stryker vi pasteurisert jordsuspensjon direkte på agarskåler med gjærekstraktmedium (GA) som inkuberes aerobt. GA er et generelt medium som tillater vekst av mange typer bakterier, så seleksjonen skjer her hovedsakelig ved den måten vi har behandlet (pasteurisert) vårt inokulum. Vi skal dessuten benytte et mer selektivt agarmedium (GA5Urea) som inneholder 5% urea og indikatoren fenolrødt . Mange Bacillus-arter produserer enzymet urease som spalter urea til ammoniakk og CO2. (NH2)2C0 + H20 -> CO2 + 2NH3 Mens høye konsentrasjoner av ammoniakk er giftig for de fleste organismer, gror de ureaspaltende Bacillus-artene best i nærvær av ammoniakk og forholdsvis høy pH. Indikatoren fenolrødt skifter farge fra rød (sur) til gul (basisk) ved pH 7,8. Fargeskifte indikerer dermed dannelse av ammoniakk (basisk). Ammoniakk lukter dessuten ganske sterkt og kan påvises ved å lukte forsiktig på platen. Utførelse Bacillus, 1. dag (Kursdag 6). Pasteuriser en del av jordsuspensjonen ved å varme den i vannbad ved 80oC i 15 min. Omtrent like mengder pasteurisert jordsuspensjon (f. eks. 2-3 dråper) overføres til GA- og GA5Urea-skåler og fordeles jevnt utover med en steril glasstav. Skålene merkes og inkuberes ved 30oC. Bacillus, 2. dag (Kursdag 7). Inspiser agarskålene for vekst av bakteriekolonier. Er det noen forskjeller i kolonitall på agarskåler med GA og GA5Urea? Er det noen fargeforandring i urea-mediet? Lukt forsiktig på platene (vær spesielt forsiktig når du lukter på GA5Urea). Se på utvalgte kolonier i mikroskop. Typiske kolonier av Bacillus sp. er flate med ujevne kanter og ru overflate. De er hvite eller svakt grå - eller brunfarget. Påvisning av endosporer ved mikroskopering er et sikkert tegn på Bacillus. Husk å notere resultat i labjournalen. Beskriv og tegn bakteriene. Stryk en koloni fra hver skål på hver sin nye agarskål med GA-medium (Kast de gamle skålene).

- 24 -

Bacillus, 3. dag (Kursdag 8). Inspiser koloniene fra andre utstryk på GA-plate. Overfør to Bacillus-kolonier til skråagar med GA-medium. Disse Bacillus-stammene skal benyttes igjen på kursdag 10. Bacillus, 4. dag (Kursdag 10; avsluttes). Se Øvelse 10, Streptomyceter, 4. dag og Øvelse 12, Melkesyrebakterier, 3.dag. Bacillus-kulturene kastes etter bruk. * * * ØVELSE 12. Isolering av melkesyrebakterier Melkesyrebakterier forekommer i naturlig surnet melk. I dette forsøket skal vi forsøke å isolere bakterier av denne typen. Vi skal dessuten teste katalase-aktivitet og foreta en forenklet Gram-test etter KOH-metoden (se Øvelse 4B) på de isolerte organismene. Hydrogenperoksid dannes som et toksisk biprodukt ved aerob respirasjon og ved andre aerobe reaksjoner som involverer flavoenzymer. De fleste bakterier som kan gro aerobt, produserer derfor enzymet katalase som spalter hydrogenperoksyd: 2H2O2 katalase 2H2O + O2 Melkesyrebakterier kan gro aerobt, men er såkalt oksygen indifferente. Dvs. at de ikke kan utnytte oksygen til respirasjon, og de vokser derfor fermentativt under både aerobe og anaerobe betingelser. De er et unntak fra regelen om at bakterier som kan vokse aerobt, produserer katalase. Negativ katalasereaksjon er derfor et viktig taksonomisk kriterium for alle typer melkesyrebakterier. Testen på katalase utføres ved å overføre en dråpe 30% hydrogenperoksyd til et objektglass og slemme opp materiale fra en bakteriekoloni i denne dråpen. Bruk vernebriller! Positiv katalasereaksjon vil vises ved at suspensjonen bruser; dvs. at det dannes O2. Ved lav katalase-aktivitet kan det være nødvendig å inspisere dråpen i mikroskop ved lav forstørrelse (10X). Utførelse Melkesyrebakterier, 1. dag (Kursdag 8). Naturlig surnet melk lages ved å fylle opp et anaerobrør med upasteurisert melk og inkubere ved 30oC. Melkesyrebakterier, 2. dag (Kursdag 9). Inspiser kulturen med naturlig surnet melk for eventuell gassdannelse. En type melkesyrebakterie, Streptococcus er homofermentativ og produserer ikke CO

2, så gå videre selv om det ikke er gass. Pga. fett og protein i melken

er det nesten umulig å mikroskopere bakteriene uten bruk av spesielle fargeteknikker. Vi skal i stedet isolere bakteriene ved å stryke melken med en podenål på plater med KPGA5L-CaCO

3- medium. Som i tidligere

eksperimenter er CaCO3 tilsatt for å hindre at pH blir for lav under fermentering av sukker. Platene inkuberes

ved 30oC. Melkesyrebakterier, 3. dag (Kursdag 10). Inspiser platene med melkesyrebakterier. Melkesyrebakterier danner lite energi (ATP) både ved aerob og anaerob vekst og har store krav til vekstfaktorer. De danner derfor små saktevoksende kolonier. Se på bakteriene i mikroskop, og foreta katalasetest (som beskrevet over) og Gram-test etter KOH-metoden (som beskrevet i øvelse 5). Ta også med Pseudomonas fra øvelse 7 og Bacillus fra øvelse 11 i disse testene. Husk å føre resultatene inn i labjournalen.

- 25 -

Fig 13.1. Testing av antibiotikaproduksjon hos streptomyceter. (A) To renkulturer av streptomyceter strykes ut som parallelle striper på en agarskål. Skålene inkuberes. (B) Etter at streptomycetene har grodd fram på skålen, strykes 3-4 forskjellige bakterier mellom og på tvers av sterptomycetene. Disse utstrykningene skal gå helt inntil streptomycetene, men ikke berøre dem. Skålene innkuberes på nytt.

* * * ØVELSE 13. Virkning av antibiotika vist på agarskål. Enkelte bakteriestammer kan ha forskjellig resistens mot forskjellige antibiotika. I denne øvelsen skal vi vise hvordan resistensmønsteret enkelt kan påvises på en agarskål. Utførelse 1.dag (Kursdag 10) Det er utlevert to bakteriesuspensjoner, en gram positiv og en gram negativ. Med steril pipette settes 100 μl av bakteriekultur midt på agarskålen. Steriliser glasstaven ved å dyppe den i 70% etanol, brenn av etanolen og stryk ut bakteriekulturen. Gjenta dette med den andre kulturen. Antibiotika leveres i standard ”piller”, vi har fire forskjellige. Merk fire felt på undersiden av skålen, og legg en ”pille” oppå agaren midt i hvert felt. Skålen inkuberes, denne gang med agaroverflaten opp. 2.dag (Kursdag 11) Obs: Ta med en linjal. Der hvor virksom antibiotika ikke har diffundert ut i skålen, vil bakterien vokse som et teppe. Rundt antibioika pillene vil det være en klar sone, med mindre bakterien er resistent mot den typen antibiotikum. Mål diameter på klaringssonen, og før dette resultatet inn i journalen.

* * *

- 26 -

ØVELSE 14. Kimtall i næringsmiddel. Med kimtall forstås det antall bakterier som kan danne kolonier på et agarmedium. På engelsk brukes begrepene “viable count” eller mer vanlig; “colony forming units” (cfu). Kimtallsbestemmelse har visse begrensninger og vil alltid gi et lavere tall enn det virkelige antallet bakterier. Bare de bakteriene i prøven som kan vokse på det valgte agarmediet, blir registrert. Dessuten vil bakterier som er for nære hverandre, f. eks. ved at de henger sammen i kjeder eller er samlet på partikler, bare gi opphav til en koloni og derved bli registrert som ett kim. På tross av disse svakhetene er kimtallbestemmelse den mest brukte metoden til å bestemme antall bakterier i matvarer. Vanligvis lages et homogenisat av varen og det spres så ut 0,1ml fortynnet prøve utover en agarplate. Antall kolonier som vokser opp på plata, bør være mellom 30 og 300. Når det er mindre enn 30 kolonier, blir bestemmelsen unøyaktig av statistiske årsaker. Dersom antallet er over 300, greier vi ikke å skille de enkelte koloniene fra hverandre. Siden en ikke vet på forhånd hvor mange bakterier som prøven inneholder, lages det vanligvis en fortynningserie i sterilt medium eller en annen egnet fortynningsløsning, og det plates ut fra flere fortynninger på hver sin plate. Når en har telt kolonier etter inkubering, kan en velge ut hvilken fortynning som er best egnet som grunnlag for utregning av kimtall i den opprinnelige kulturen. Kimtall angis vanligvis som antall pr. ml (husk at vi bare plater ut 0,1 ml på hver plate). Utførelse Dag 1 (Kursdag 11) I dette forsøket skal vi bestemme kimtallet i et næringsmiddel. Vi bruker fersk kjøttdeig som eksempel. Pålegget blir homogenisert med aseptisk teknikk av kursassistentene. Til dette brukes en såkalt ”stomacher”. Vi bruker et kjent volum av sterilt 0.9% NaCl-løsning til å få bakteriene ut i suspensjon. Studentene henter så prøver fra dette homogenisatet. Lag først ferdig fortynningsrørene ved å overføre 9,0 ml LA-medium med en pipette til hver av de seks rørene. Fra homogenisatet overføres 1 ml til rør nr. 1 (10 x fortynning) og blandes godt. Fra rør nr. 1 overføres 1,0 ml til neste rør med 9,0 ml osv. Fra hvert rør overføres 0,1 ml med steril pipette til LA-medium, og prøven spres utover med glasstav på vanlig måte. NB: Ved utplating fra fortynningsrekka - HUSK å skifte pipettespiss mellom hver fortynning (hvis du ikke starter med røret som er mest fortynnet). Skålene inkuberes til neste kursdag (30°C). Kimtall, 2. dag (Avsluttes; Kursdag 12) Skålene inspiseres og antall kolonier på skåler med passe antall kolonier telles. Beregn kimtallet i det opprinnelige homogenisatet. Beregn deretter kimtall per gram matvare. Før resultatet inn i labjournalen.

- 27 -

Fig 15.1. Bruk av Bürker-tellekammer. Øverst til venstre. Tellekammeret sett ovenfra. Legg merke til plasseringen av tellerutene som er risset inn i glasset. Øverst til høyre. Forstørring av tellerutene. Nederst til venstre. Celler som ligger på streken, kan være et problem. Den beste løsningen er å telle de celler som ligger på to av strekene og ignorere de som ligger på de to andre. Nederst til høyre. Tellekammeret sett fra siden. A er renner som skal lede bort overflødig prøve, B er selve ”tellebrønnen” , C viser tellekammen dekket med dekkglass, og D er posisjonen hvor en kan se Newton-ringer når dekkglasset ligger riktig. ØVELSE 15A. Totaltall. Med totaltall forstår vi det antall bakterier som kan observeres (telles) i en prøve ved mikroskopering. Til denne kvantitative bestemmelsen skal vi benytte et Bürker tellekammer. Kammeret har inngravert et rutenett i bunnen som kan observeres i mikroskop (som vist på Fig. 15.1). De små rutene merket A på denne figuren har en sidekant på 50 μm (dvs. 0,005 cm) og de store rutene merket B har en sidekant på 200 μm. Ved bruk dekkes kammeret med et dekkglass slik at dybden på ”brønnene” i tellekammeret er 100 μm. Metoden er vanskelig å bruke dersom prøven inneholder partikler som kan forveksles med bakterier, men det finnes fargemetoder som kan brukes for å skille mellom bakterier og andre partikler. I dette forsøket skal vi benytte en renkultur av Vibrio natriegens, dette er den samme bakterien som vi skal benytte i vekstforsøket i Øvelse 16.

- 28 -

Utførelse. (Kursdag 12). Tellekammeret sett fra siden er vist på Fig. 15.1. Ved bruk festes først dekkglasset over brønnene (rutenettet) ved hjelp av litt fuktighet mellom kammeret og dekkglasset (pust på dekkglasset før du legger det på). Der hvor dekkglasset slutter tett til mot tellekammeret (se Fig. 15.1), kan man observere Newton-ringer (regnbuefargede ringer). Det er viktig at dekkglasset ligger riktig på plass for at dybden skal bli korrekt. (Det skal ikke være væske i brønnene på dette tidspunktet). Prøven settes på med en pasteurpipette langs kanten av dekkglasset midt på tellekammeret (avmerket på figuren), slik at prøven trekkes inn i brønnen av kapillærkrefter. Dersom bakteriene er bevegelige er det mest hensiktsmessig å drepe dem med formalin. Man bruker et par dråper formalin pr. 10 ml kultur. Det er lettest å fokusere ved 40x fortørrelse pga av tykkelsen på kammeret. Ved telling velges en fortynning av prøven og en rutestørrelse som gir mellom 5 og 10 celler pr. rute. For bestemmelse av antall bakterier teller man gjerne bakterietallet i flere ruter slik at telletallet er over 200. Tell alle bakteriene inne i rutene samt alle som berører to av sidene. Bakterier som berører de to andre sidene telles ikke (se Fig. 15.1). Beregn volumet som en rute definerer, og beregn bakterietall pr. ml kultur. (Ta hensyn til eventuell fortynning av prøven). ((1 cm3= 1 ml)). Før resultatet inn i labjournalen. ØVELSE 15 B. Spektrofotometrisk måling av bakterietetthet. Innen visse grenser er det en lineær sammenheng mellom lysabsorbsjon (optisk tetthet) av en kultur og antall bakterier (bakterietetthet). For å oppnå linearitet må absorbansen må være lavere enn 0,4, men helst større enn 0,1. Kulturer som har en høyere tetthet, må derfor først fortynnes med vekstmediet eller en annen fortynningsløsning før måling. Bølgelengder som benyttes ved målingene er i området 420 til 660 nm. Metoden kan ikke brukes dersom prøven inneholder andre partikler enn de bakteriene som skal måles. I denne øvelsen skal vi benytte den samme renkultur av Vibrio natriegens som i Øvelse 16A. Utførelse (Kursdag 12). Prøven fra kulturen fylles i en kuvette, og absorbans måles i spektrofotometer ved 550 nm. Spektrofotometeret nullstilles med en "blank"-prøve med rent medium. Dersom den observerte absorbans er for høy, foretas en fortynning av kulturen med medium. Noter resultat i labjournal. * * * ØVELSE 16. Vekstkurve. En typisk vekstkurve for en bakteriekultur har inntil fire faser som fremkommer når logaritmen av en vekstparameter (kimtall, totaltall, optisk tetthet) plottes mot veksttiden. Disse fasene er lagfase (nølefase), eksponensiell fase (log-fase), stasjonærfase og dødsfase (Fig. 17.1). Vi skal bestemme vekstkurve for bakterien Vibrio natriegens. Dette er en bakterie som lever i slam i brakkvannsmiljø (såkalt estuarier). Bakterien er kjent for sin raske vekst. Under gunstige forhold (rikt medium, optimal temperatur, etc.) har bakterien en generasjonstid på under ti min. De vekstparametrene som vi skal måle gjennom hele vekstperioden, er totaltall og optisk tetthet. Dessuten skal vi bestemme kimtallet ved noen utvalgte tidspunkter. Disse målingene foregår i prinsippet på samme måte som vist i Øvelse 14 og 15. Utførelse. Vekstkurve, 1. dag. (Kursdag 13) FORSØKET TAR TO TIMER. En renkultur av V. natriegens er blitt dyrket over natten ved 37oC i flytende BHI-medium (Brain Heart Infusion) og overført til samme medium om morgenen, slik at bakteriene er i eksponensiell vekst (eller tidlig stasjonær fase) når forsøket starter.

- 29 -

En EM-kolbe med BHI-medium settes på vannbad (37oC) i to-tre minutter for å oppnå riktig temperatur. Forsøket startes ved at 10 ml av V. natriegens kultur overføres til BHI-mediet, hvoretter kulturen settes til rysting. Så snart som mulig etter start, og senere med jevne mellomrom, tas det ut prøver for bestemmelse av vekst. Optisk tetthet måles ved 550 nm som utført i Øvelse 15B. Når det er nødvendig, fortynnes prøven med rent medium slik at OD er under 0,4. Noter tid for prøvetaking, fortynning og avlest absorbans. Totaltall bestemmes som utført i Øvelse 15A. Det kan være hensiktsmessig å benytte samme fortynning av kultur for telling som for spektrofotometrisk måling (eller bruk de erfaringene som dere høstet under Øvelse 15). Stopp bakterienes bevegelse med formalin. Kimtall bestemmes i prinsippet som utført under Øvelse 14. Lag fortynningserie, men siden her er mer bakterier enn i matvaren, må vi bruke høyere fortynning. Lag til seks rør med fortynningsmedium, med 9,9 ml i det første og 9 ml i resten. Til rør 1 taes 0.1 ml av kulturen, bland godt, ta deretter 1 ml til den neste. Dette gir 10-2-fortynning i det første røret, 10-3 i det andre osv. Merk skåler med fortynningsgrad, det er utlevert fire skåler, og det skal plates ut fra de fire høyeste fortynningene. Skriv ned resultater fra alle gruppene i labjournalen. Neste kursdag telles koloniene i de skålene dette lar seg gjøre, dvs i skåler der det er mellom 30 og 300 kolonier. Etterarbeid. (Fullføres hjemme og gjennomgås Kursdag 14). 1) Fullfør tegning av vekstkurven. (Plott totaltall, kim og OD). 2) Beregn ved hjelp av kurvene (fortrinnsvis OD kurven) og oppgitte formler den spesifikke veksthastigheten og generasjonstiden.

Fig 17.1. Typisk vekstkurve for bakterier. Figuren viser antall bakterier og OD som en funksjon av inkuberingstiden. De fire vekstfasene er angitt; lag- (eller nøle-), eksponensiell-, stasjonær- og dødsfasen.

- 30 -

Fig 17.1. Typisk eksempel på ettrinns vekstkurve for en typisk bakteriofag. Figuren viser antall frie fag som funksjon av innkuberingstiden, A = latenstid, B = ”rise”-periode, og C = økning i antall fag, brukes til å bestemme ”burst size”. ØVELSE 17. Bakteriofag. Bakteriofager er virus som angriper bakterier. De består vanligvis av protein og DNA. (Noen har RNA som arvestoff). Virus kan aldri formere seg utenfor en vertscelle. En viktig gruppe av fager er lytiske. Dvs. at de dreper cellen og løser opp denne (lyserer cellen) etter at de har formert seg i cellens cytoplasma. I denne oppgaven skal vi studere T2-fag som er en lytisk DNA-fag som angriper E. coli. Den lytiske syklus hos en DNA-fag består av følgende faser: A) Absorsjon/infeksjon: Fagen fester seg til spesifikke reseptorer (proteiner) på bakterieoverflaten og injiserer sitt DNA inn i bakteriens cytoplasma. B) Latensperioden: Fagens gener overtar kontrollen over bakteriens metabolisme og starter en massiv produksjon av fag-DNA og -proteiner. I latensperioden skjer det ingen økning av ferdige fag i kulturens supernatant. C) ”Rise”-perioden: Fagen settes sammen i cytoplasma fra sine DNA- og protein-komponenter og får så cellen til å lysere. Dette kan registreres som en nedgang i kulturens turbiditet, samtidig som det skjer en økning av antall fag i kulturen. Antallet fag som frigjøres pr. celle kalles på engelsk ”burst size”. Kurven for en ettrinns vekstkurve vil i prinsippet se ut som vist på Fig. 18.1. I denne øvelsen skal vi først gjennomgå metoden for telling av fag, og deretter skal vi måle ”burst size” ved å bestemme to punkter på vekstkurven. Metode for telling av fag: For telling av antall fag i en løsning blandes fagen sammen med et stort overskudd av en vertsbakterie. Blandingen av fag og bakterier tilsettes et smeltet agarmedium (45 oC) med lavt agarinnhold (f. eks. 0.7% agar; kalt toppagar eller sloppy-agar) og det hele helles over et rikt agarmedium med vanlig innhold av agar (f. eks. 1.5%). Etter at toppagaren har stivnet inkuberes platene med toppagaren opp. Vertsbakterien vil begynne å gro i toppagaren og etter hvert danne en turbid vekst i denne. Der hvor det finnes en fag i toppagaren, vil denne infisere en nærliggende bakterie, reprodusere seg selv og lysere bakterien. Frigjorte fag vil på nytt infisere nærliggende bakterier, og etter flere runder med infeksjon og lysis dannes det en klar sone i det turbide bakterieteppet. Disse klare sonene kalles ”plaque”. Antall ”plaque” på en plate indikerer antall infeksiøse fag som er sådd ut, og oppgis på engelsk som antall ”plaque forming units” (og forkortes pfu). Utførelse Bakteriofager 1. dag. Telling av ”plaque forming units” (pfu). (Kursdag 14) I dette forsøket skal vi telle antall T2-fag ved å benytte E. coli B som vertsorganisme. Utlevert suspensjon av T2-fag fortynnes med fortynningsløsning i en tier-serie (nødvendig fortynning oppgis på kurset). Til rørene med 3.5 ml smeltet toppagar tilsettes 2 dråper av utlevert kultur av E. coli og 0,1 ml

- 31 -

fagfortynning. Mix på Whirlmixer. Det hele fordeles utover en plate med Herseys-agar og platene inkuberes ved 37oC. Pass på at toppagaren ikke stivner før den blir helt utover platen. Lag tre parallelle utsåinger fra de tre høyeste fortynningene (De andre fortynningene kastes). Bakteriofager 2. dag. Pfu og ”burst size” (Kursdag 15) Pfu: Platene fra telling av ”pfu” inspiseres og kastes etter at resultatene er notert. Forberedelse: Vertsbakterien E. coli er blitt dyrket over natten og overført til friskt medium om morgenen slik at cellene er i eksponensiell vekst når forsøket starter (gjøres av kursassistenter). Gangen i forsøket er angitt i vedlagt ”Tidsskjema”. Studer dette nøye på forhånd. Forsøk: Legg merke til at ved tid -10 min blandes bakterier og T2-fag sammen i en løsning som inneholder KCN. Dette er en respirasjonsgift som hindrer bakteriens energiproduksjon. Tettheten av fag og bakterier er stor slik at disse skal finne hverandre og starte infeksjonen, men fagene kan ikke begynne å formere seg pga. av mangel på energi (ATP). Ved tid -2 min og tid 0 min fortynnes fag-bakterie-kulturen hver gang 1:100 med friskt medium. Etter den siste fortynningen er KCN-konsentrasjonen blitt så lav at bakterien kan starte sin energiproduksjon, og formeringen av fag kan starte. Hensikten med KCN er med andre ord å synkronisere starten på fagsyntesen ved tiden 0 min. Legg videre merke til at ved hver utplating som er angitt i ”Tidsskjemaet”, skal det blandes sammen 0,1 ml prøve, pluss 2 dråper indikatorbakterie (vertsbakterien E. coli B) og 3,5 ml toppagar på same måte som utført under den tidligere utførte telling av pfu, husk å mikse løsningen så den er godt blandet før du plater ut. Tidsskjema for måling av ”burst size”. Tid: Handling Ca. –12 min. 0,1 ml 0,02M KCN overføres til reagensrør som oppvarmes til 37°C. Ca. –10 min. Tilsett 1ml logfase E. coli B til reagensrøret, tilsett så 0,1ml T2-suspensjon som er forvarmet til

37°C. -2 min. Overfør 0,1ml av blandingen til 9,9ml forvarmet Hershey’s broth, rist forsiktig på røret og inkubér ved 37°C. 0 min. Overfør 0,1ml av blandingen fra ”–2 min” til 9,9ml forvarmet Hershey’s broth i et rør som er

godt merket med lagnummer, rist forsiktig og inkuber ved 37°C. Dette er vekstrøret. 5. min. Ta ut 1ml fra vekstrøret til fortynningserie 10-1, 10-2 og 10-3, husk å riste rørene før hver fortynning. Direkte fra vekstrøret og fra hver fortynning plates 0,1 ml ut til pfu, slik som forrige kursdag. Dvs: 0,1ml prøve+ 2 dråper indikatorbakterie blandes i flytende toppagar som helles på agarskål etter mixing. Skålene merkes med tid, fortynning og lagnummer. 10 min. Overfør 1 ml fra vekstrøret til sterilt sentrifugerør. Suspensjonen sentrifugeres ved 10 000x g i

5 minutter. Mål pfu i 0,1ml av supernatanten for å bestemme frie fag i suspensjonen. Merk platen ”frie fag” og lagnummer.

15 min. Gjenta fortynningserie og utplating som ved 5 minutter. 30 min. Gjenta fortynningserie og utplating som ved 5 minutter. 45 min. Gjenta fortynningserie og utplating som ved 5 minutter. 60 min. Gjenta fortynningserie og utplating som ved 5 minutter. Bakteriofag 3. dag. ”Burst size” (Kursdag 16; avsluttes). Platene med plaque inspiseres og telles. Noter resultatene i labjournalen og utfør beregningene. * * *

- 32 -

ØVELSE 18. Mikrobiologisk vannanalyse. De fleste patogene (sykdomsfremkallende) mikroorganismene som spres med drikkevann kommer fra mage-tarmkanal hos mennesker og andre varmblodige dyr. Som indikator på fekal forurensning benyttes som oftest bakterien E. coli. Den forekommer alltid i tarminnhold hos mennesker og varmblodige dyr. I frie omgivelser formerer E. coli seg bare under spesielle betingelser. Påvisning av E. coli i vann er derfor en sikker indikasjon på nylig fekal forurensning. E. coli er vanligvis ikke patogen, men hvis E. coli kan påvises i vannet, er det fare for at vannet også inneholder patogene tarmbakterier eller virus. Analysen som vi skal benytte, er i hovedsak basert på Norsk Standard 4714 (mai 1990) for påvisning av koliforme bakterier, termotolerante koliforme bakterier og presumptiv E.coli. Presumptivt koliforme er bakterier som spalter laktose under syre og gassproduksjon innen 48 timer ved 37oC. NS 4714 bruker i tillegg følgende definisjoner: Koliforme bakterier er bakterier som spalter laktose under syre- og gassdannelse i selektivt medium ved 37oC innen 48 timer. Termotolerante koliforme er bakterier som spalter laktose under syre- og gassdannelse i selektivt medium ved 44oC innen 48 timer. Presumptive E. coli er termotolerante koliforme som spalter tryptofan til indol ved den samme temperatur (44oC). Bestemmelsene av koliforme, termotolerante koliforme og presumptive E. coli skjer i tre trinn: 1) presumptiv prøve, 2) konfirmativ prøve og 3) komplett prøve. Vi skal benytte en rør-metode med et sett av i alt 15 rør, og antall bakterier i de ulike grupper skal beregnes ut fra en tabell for ”most probable number” (MPN; McCrady’s tabell, s. 34). PPrreessuummppttiivv pprrøøvvee: Vannet som skal undersøkes blandes/inokuleres i et ikke-selektivt medium inneholdende laktose og pepton samt indikatoren bromcresolpurpur. Mediet er på forhånd fordelt i reagensrør som inneholder et mindre rør for gassoppsamling (durhamrør), som er satt inn med bunnen opp. Under autoklaveringen fylles durhamrøret med medium og synker til bunns. Ved vekst av bakterier som produserer syre og gass fra laktose, slår fargeindikatoren om til gult og durhamrøret fylles med gass og stiger opp. Prøven avleses etter 24 timer (og etter 48 timer; se nedenfor). En reaksjon er positiv hvis det er både gass- og syreproduksjon. Bakterier som gir positiv reaksjon kalles ”presumptivt koliforme”, men testen er ikke et sikkert bevis på forekomst av koliforme bakterier. De ”presumptivt koliforme” bakteriene må derfor testes videre for å finne ut om bakteriene virkelig er koliforme. Det gjøres ved at alle positive prøver podes videre til tre forskjellige medier: 1) Selektivt laktose-pepton medium som inneholder inhibitorene briljantgrønt og oksegalle (konfirmativ prøve) Positiv reaksjon: Både vekst og gassproduksjon (koliforme bakterier) 2) Selektivt laktose-tryptose medium med gallesalter ( EC-medium, komplett prøve) Positiv reaksjon: Gassproduksjon fra laktose ved 44oC (termotolerante koliforme bakterier) 3) Trypton-medium (komplett prøve) Positiv reaksjon: Vekst og dannelse av indol ved 44oC (presumptiv E.coli) NS 4714 bruker følgende begreper: Konfirmativ prøve. Presumptive prøver med positiv reaksjon benyttes som inokulum i et selektivt laktose-pepton medium som inneholder inhibitorene briljantgrønt og oksegalle. Erfaring har vist at E. coli kan gro i dette selektive mediet ved 37oC, mens vekst av mange frittlevende fermentative bakterier hindres. Etter inokulering inkuberes rørene i inntil 48 timer (37 oC). På samme måte som for den presumptive testen, benyttes reagensrør med durhamrør. Positiv reaksjon på koliforme er både vekst og gassproduksjon. Komplett prøve. Presumptive prøver med positiv reaksjon benyttes også som inokulum i et selektivt laktose-tryptose medium med gallesalter (EC-medium) og et trypton-medium (for indol analyse) som begge inkuberes ved 44 oC. Disse testene foretas med andre ord samtidig med de konfirmative prøvene. Gassproduksjon fra laktose og indol-produksjon fra tryptofan avleses etter 48 timer. Ved hjelp av antall positive rør, bestemmes

- 33 -

antall termotolerante koliforme og presumtive E. coli . Termotolerante koliforme gir gassproduksjon ved 44oC i det selektive EC-mediet, og såkalte presumptive E. coli gir i tillegg indol-produksjon i trypton-mediet. Utførelsen av analysen etter NS 4714 er illustrert i figur på s. 35. Legg merke til at vi av tidsmessige grunner har foretatt en forenkling. Dvs. at bare de presumptive prøvene som var positive etter 24 timer, blir benyttet som inokulum for konfirmativ og komplett prøve. Presumptive prøver som gir positive reaksjon først etter 48 timer blir ikke tatt med av oss, men det ville helserådet gjort. (Den måten vi avleser prøven følger den gamle standarden, NS 4751). Det foretas en orientering om oppgaven på kursdag 16. Utførelse Vannanalyse, 1. dag. (Kursdag 16) Det blir delt ut noen vannprøver. Studenter som vil teste egne vannprøver, kan på forhånd få utlevert sterile vannflasker for egen prøvetaking (må da ta med 60-70 ml vann) For presumptiv prøve utleveres det 5 rør med laktose-pepton-medium med tredobbel styrke (innhold 5 ml) og 10 rør med laktose-pepton-medium med enkel styrke (innhold 10 ml). Til hvert av de 5 første rørene (med innhold 5 ml) tilsettes aseptisk 10 ml vannprøve. Fem av rørene med innhold 10 ml tilsettes 1 ml vannprøve, og de fem resterende rørene tilsettes 0,1 ml vannprøve. Prøvene inkuberes ved 37oC til neste dag. Vannanalyse, 2. dag ONSDAG 18/3 (kursdag 17). Rørene fra presumptiv prøve avleses etter 24 timer. Positive rør med syre og gassproduksjon telles, merkes, og brukes som inokulum for de konfirmative og komplette prøvene. Disse prøvene inkuberes ved henholdsvis 37 og 44oC. Vannanalyse, 3. dag. (Kursdag 18; avsluttes). Produksjon av gass fra laktose i de konfirmative prøvene for koliforme (37 oC) og de komplette prøvene for termotolerante koliforme (44 oC) avleses. Indol-produksjon ved 44 oC undersøkes ved å tilsette kulturene med trypton-medium 0,2 til 0,3 ml Kovacs indolreagens. Mørk rød farge i toppsjiktet er indikasjon på at indol er dannet i kulturen, og er et positivt resultat. Oransje farge indikerer tilstedeværelse av skatol, og er et negativt resultat. Uforandret gul farge etter 10 min er et negativt resultat. (Alt i følge NS). Bare bakterier som gir både indol- og gassproduksjon ved 44oC regnes som presumptiv E. coli. Antall koliforme, termotolerante koliforme og presumptiv E. coli i vannprøven beregnes ut fra MPN i McCrady’s tabell. Resultatene føres inn i labjournal. * * *

- 34 -

Tabell for MPN basert på tre fortynninger med fem rør i hver fortynning. (Etter McCrady)

Antall rør med positive reaksjoner MPN Pr. 100 ml

95% konfidensintervall

5x10ml 5x1ml 5x0,1ml Nedre grense

Øvre grense

0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 3 0 0 1 1 1 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5

2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 17 13 17 17 21 26 22 26 27 33 34 23 31 43 33 46 63 49 70 94 79 109 141 175 130 172 221 278 345 240 348 542 918 1609 >1609

<0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 1 1 2 2 3 1 2 2 4 4 5 5 3 5 5 7 9 7 9 9 11 12 7 11 15 11 16 21 17 23 28 25 31 37 44 35 43 57 90 117 68 118 180 303 635 >635

7 7 11 7 11 11 15 15 13 17 17 21 21 28 19 25 25 34 34 46 46 31 46 46 63 78 67 78 80 93 96 70 89 114 93 120 154 126 168 219 187 253 343 503 302 486 698 849 999 754 1005 1405 3222 5805 >5805

Tabell: Skjematisk fremstilling av analysen. EC-buljong for konfirmering av termotolerante koliforme bakterier.

- 35 -

- 36 -

ØVELSE 19. Winogradsky-søyle (Demonstrasjonsøvelse). Marint slam inneholder mange typer mikroorganismer som hovedsakelig er spesialisert til nedbryting av organisk materiale. Overflaten av slammet er vanligvis aerob, men lenger ned i slammet er forholdene anaerobe. Marint slam er derfor velegnet som inokulum for isolering av mange typer mikroorganismer, både aerobe og anaerobe arter En Winogradsky-søyle er et biologisk anrikningssystem for fototrofe (fotosyntetiske) svovelbakterier. Den består av en glassylinder med et lag av marint slam blandet med cellulose og CaSO4 og med sjøvann over dette. Sjøvannet kan gjerne være tilsatt litt gjærekstrakt som kilde for vitaminer og andre vekstfaktorer. Når sylinderen inkuberes i lys (f. eks. i et ikke solvendt vindu), vil fototrofe bakterier vokse ut mot glassveggen i og over slamlaget. Høymolekylære forbindelser som polysakkarider (cellulose) kan anaerobt brytes ned og forgjæres (fermenteres) til organiske syrer og alkoholer pluss CO2 og H2-gass. Forgjæringen skjer i flere trinn og mange typer bakterier deltar i denne prosessen. Sulfatreduserende bakterier kan bruke SO4

2- som ekstern elektronakseptor i anaerob respirasjon, og de oksiderer organiske syrer og alkoholer (elektrondonorer) til acetat eller helt til CO2 (oksidasjons-mønstret avhenger av art). Når SO4

2- er elektronakseptor, dannes det S2-, enten som H2S eller metallsulfider (gir svart utfelling). Anaerobe fototrofe bakterier kan fiksere CO2, men de bruker ikke H2O som elektrondonor (reduksjonsmiddel) i fotosyntesen og produserer derfor ikke oksygen, slik som planter, alger og cyanobakterier gjør. I stedet benytter disse bakteriene H2S som elektrondonor. Det skjer en anaerob oksidasjon av H2S til svovel (og videre til sulfat) og syntese av organisk materiale etter den forenklede ligningen: H2S + CO2 [CH2O] + 2S + H2O En skiller vanligvis mellom fire grupper anaerobe fototrofe bakterier: Purpur-svovelbakterier; disse er ofte store bakterier som lagrer svovelet i cellene og kan oksidere det videre til sulfat. Purpur-ikke-svovelbakterier; navnet er noe misvisende da disse bakteriene også kan bruke H2S som elektrondonor, men de har lavere toleranse for H2S. Disse bakteriene bruker hovedsakelig reduserte organiske forbindelser (f.eks. alkoholer) som elektrondonor og karbonkilde. Disse bakteriene gror med andre ord fortrinnsvis fotoheterotroft. Grønne svovelbakterier; avleirer alltid svovel utenfor cellen. Grønne ikke-svovelbaktereier (også kalt Chloroflexus-gruppen); den vanligste typen er Chloroflexus, er termofile filamentformige bakterier som fortrinnsvis gror fotoheterotroft. Hos alle disse bakteriene skjer fotosyntesen kun anaerobt. Utførelse Øvelsens 1. dag. (Kursdag 9) 50 ml anaerobt marint slam blandes med 1 spiseskje cellulosepulver og tilsettes ca 200 ml sjøvann som er blandet med 1 spiseskje CaSO4 og en teskje gjærekstrakt. Rør om og slå blandingen over i en 250 ml glassylinder. Tilsett sjøvann til 2-3 cm fra toppen. Dekk toppen med Al-folie og inkuber i lys ved romtemperatur Øvelsens avslutning. (Kursdag 16) Etter 1 til 3 uker vil det ha vokst fram røde og grønne flekker langs glassveggen nede i sylinderen. Ta ut prøver av disse flekkene ved hjelp pasteurpipetter og undersøk dem ved mikroskopiering. Se etter purpur (røde) og grønne svovelbakterier.

- 37 -

MEDIER Alle mengder er oppgitt i g pr. liter medium. pH justeres til angitt verdi med NaOH eller HCl. Mediene autoklaveres 20 min ved 121oC. ØVELSE 2 (E. coli). LA (”generelt “ medium) 5 g gjærekstrakt 10 g pepton 5 g NaCl 20 g agar pH 7,0 -7,2 Minimalmedium, Davis 7 g K2HPO4 2g KH2PO4 1 g (NH4)2SO4 1 g glukose 0,5 g NaCitrate 0,1 g MgSO4 . 7H2O pH 7,0 Løs i 1 liter vann, fordel porsjoner i EM-kolber med vattpropp og Al-folie, og autoklaver ØVELSE 3 og 4. LA (”generelt “ medium) ØVELSE 6 (Halofile). YES-agar 10 g gjærekstrakt 200 g havsalt 20 g agar pH 7,0. ØVELSE 7. Succinat-medium. 5 g succinat 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4 . 7H2O 1 g NH4Cl 15 g NaCl pH 7,0 Succinat-agar. Succinat-medium med 20 g agar. Succinat-nitrat-medium. Succinat-medium tilsatt 2 g KNO3 OF-medium. Hugh og Leifson; stikkagar for fermenteringstest 2 g pepton

- 38 -

10 g glukose 5 g NaCl 0.3 g K2HPO4 0.03 g bromtymolblått 5 g agar pH 7,6 Steril parafin 1 spiseskje parafinperler til et begerglass, dekk med Al-folie og autoklavér (5 min. er nok). ØVELSE 9 (Azotobacter) Mannitol-”N-fritt”-medium. 10 g mannitol 1 g KH2PO4 0,5 g MgSO4 . 7H2O 1 g CaCO3 (precipitatum) 0,01 g FeCl3 1,0 ml spormetall-løsning ØVELSE 10 (Streptomyceter) Kusteragar: Løsning 1: 10 g stivelse 0,3 g casein 2 g KNO

3 20 g agar 1000 g dest. vann pH 8,2 (pH justeres før agar tilsettes) Løsning 2: 10,9 g KH2PO4 250 g dest. vann Løsning 3: 5 mg FeSO4 x 7H2O 10 mg H2SO4 100 g dest.vann Etter autoklavering avkjøles løsningene til 50°C og løsning 1 tilsettes 3 ml av løsning 2 og 0,5 ml av løsning 3. Samtidig tilsettes også 2,5 ml cycloheximide-løsning (20 mg/ml, filtersterilisert). ØVELSE 11 GA5Urea (for Bacillus) 5 g gjærekstrakt 50 g urea 20 g agar fenolrødt (10 ml av 0,004% vandig løsning) pH 6,8

- 39 -

ØVELSE 12 (Melkesyrebakterier) KPGA5L-CaCO3-agar 8 g kjøttekstrakt 10 g pepton 5 g gjærekstrakt 50 g laktose 20 g CaCO3 20 g agar Laktosen sammen med agaren autoklaveres separat. Helles ut på skåler ved så lav temp. som mulig for å hindre at CaCO3 synker til bunns. ØVELSE 13 og 14. LA (”generelt “ medium) (Medium for plater tilsettes 20 g agar). Fortynningsløsning; 2% NaCl ØVELSE 17. (E. coli T2-fag) Hershey´s broth (og agar) 13 g Bacto trypton 8,5 g NaCl 1,5 g glukose (Medium for plater tilsettes 15 g agar). Hershey´s “sloppy” agar (toppagar) 10 g Bacto trypton 8,5 g NaCl 3,0 g glukose 7,5 g agar ØVELSE 18. (Vannanalyse etter Norsk Standard 4714) Lactose-pepton; enkel styrke. (Presumptiv prøve) 3,0 g kjøttekstrakt 5 g pepton 5 g laktose 1 ml bromcresolpurpur løsning (1,0% i 96% etanol) Laktose-briljantgrønt-galle [Konfirmativ (og evt. komplett) prøve]. 10 g pepton 10 laktose 13 ml briljantgrønt (0,1% i vann) 20 g oksegalle pH justeres til 7,4-7,5 før tilsats av briljantgrønt. Laktosen autoklaveres separat. EC-medium (NS4714, komplett prøve) 20 g tryptose (el. typticase) 5.0 g laktose 1,5 g gallesalt blanding (el. nr. 3) 5,0 g NaCl 4,5 g K2HPO4

- 40 -

1,5 g KH2PO4 pH 6,9 Autoklaver laktosen separat Trypton-medium (NS4714; for indol analyse) 10 g trypton

- 41 -

REAGENSER. Krystallfiolett (Løsning 1). 0,5 g krystallfiolett (gentianafiolett) 100 ml dest. vann Grams jodløsning (Løsning 2). 2,0 g KI 1,0 g jod 300 ml vann Jod tilsettes ett at KI er løst. Safranin (Løsning 3). 10 ml safranin (2,5% i 96% etanol) 100 ml dest. vann Kovacs’ oksydasereagens (for påvisning av cytokrom c). 1 g N-tetrametyl-p-fenylendiamin 100 g dest. vann Kovacs’ indolreagens (NS 4714) (Må vere ferskt, og rystes før bruk) 5,0 g p-dimetylaminobezaldehyd 75 ml amylalkohol (n- eller iso-) 25 ml kons. HCl Helseskadelig. Tilberedes i avtrekksskap. Løs reagensen i amylalkohol og tilsett så HCl. Metylenblått (red.oks.-indikator). 30 ml metylenblått (1% i 96% etanol) 100 ml dest. vann .