Chem. Listy 93, 120 - 127 (1999)

PEPTIDOVE MAPY

HANA VAŇKOVA

Ustav patologické fyziologie, 1. lékařská fakulta, Univerzi-ta Karlova, U nemocnice 5, 128 53 Praha 2e-mail: hvank@ lfl.cuni.cz

Došlo dne 11.XII. 1997

Obsah

1.7

3.

4.

ÚvodŠtěpení bílkovin2.1. Štěpení pomocí enzymů

2.1.1. Trypsin (EC 3.4.21.4)2.1.2. Staphylococcal proteinasa - strain V8

(EC 3.4.21.19)2.1.3. a-Chymotrypsin (EC 3.4.21.1)2.1.4. Thermolysin (EC 3.4.23.4)2.1.5. Lysin specifická proteinasa

z Lycobacter enzymogenes (EC 3.4.?.?.)2.1.6. Subtilisin (EC 3.4.21.14)2.1.7. Papain (EC 3.4.22.2)2.1.8. Pepsin(EC 3.4.23.1)

2.2. Štěpení specifickými chemickými metodamiSeparace peptidů po hydrolýze3.1. Elektromigrační metody

3.1.1. Zónová elektroforéza3.1.2. Zónová elektroforéza v polyakrylamidovém

gelu v přítomnosti dodecylsulfátu(SDS-PAGE)

3.1.3. Kapilární zónová elektroforéza (CZE)3.2. Chromatografické metody

3.2.1. Chromatografie na měničích iontů3.2.2. Vysoce účinná kapalinová chromatografie

na reverzní fázi (RP-HPLC)3.3. Dvojrozměrné metodyDetekce peptidů4.1. Absorbční spektrometrie v ultrafialové oblasti4.2. Hmotnostní spektrometrie4.3. Fluorescenční emisní spektrometrie4.4. Autoradiografie a kapalinová scintilační

spektrometrie4.5. Detekční chemická činidla

1. Uvod

Peptidové mapování představuje velmi účinnou metodupro analýzu struktury bílkovin. Technika peptidového ma-pování se skládá z několika kroků. Nejprve je určitá bílko-vina specificky štěpena na řadu peptidových fragmentů.Poté jsou tyto fragmenty vhodnou metodou separoványa následuje jejich detekce. Tak vznikne peptidová mapa,která je pro danou bílkovinu charakteristická (tzv. finger-print). První peptidové mapy stanovil Ingram1, již v roce1956. Jednalo se o tryptické štěpy hemoglobinu separovanéchromatografií na tenké vrstvě. V současné době si pepti-dové mapování získává stále větší oblibu a to hlavně díkynově vyvinutým separačním i detekčním technikám, jenžmají nejen vysoký stupeň rozlišení, ale mohou být snadnoautomatizovány.

Peptidové mapování je velmi citlivá metoda, s jejížpomocí je možné určit i tak nepatrné změny jako je substi-tuce jediné aminokyseliny v molekule bílkoviny a proto sepoužívá ke studiu struktury bílkovin. Je nutné, aby srovná-vané bílkoviny vykazovaly vysokou homologii, tzn. abyobsahovaly určité identické sekvence. Je-li homologiev aminokyselinové sekvenci menší než 80 %, peptidovémapy vykazují velmi malou podobnost a nelze studovatrozdíly v bílkovinné struktuře.

Srovnáním map bílkovin, pocházejících z různých živo-čišných či rostlinných druhů, můžeme určit rozdíly v jejichaminokyselinové sekvenci a struktuře. Získanými údajimůžeme pak vysvětlit nejen rozdíly v biologické funkcitěchto bílkovin, ale i danou bílkovinu taxonomicky (evo-lučně) zařadit.

Peptidové mapy slouží i k identifikaci izoenzymů, tj.enzymů, které mají stejnou biologickou funkci, ale různouaktivitu a složení. Izoenzymy se většinou liší stupněmpostranslační modifikace (glykosylace, fosforylace, sulfa-tace apod.), která se při peptidovém mapování projeví.

Postranslační fosforylace bílkovin slouží často jako re-gulační prvek různých biologických pochodů. Její narušenímůže vést k onemocnění (například nádorová onemocněnívykazují větší množství fosforylovaných bílkovin). Pepti-dové mapy fosforylované a defosforylované formy bílko-

120

viny se vzájemně liší a mohou být tedy využity k diagnos-tice některých onemocnění.

Další oblastí, kde lze s výhodou použít peptidové ma-pování je syntéza bílkovin. Peptidové mapy slouží k moni-torování kvality a čistoty syntetizovaných bílkovin. Jednáse o velmi citlivý indikátor, neboť i nepatrná změna v ami-nokyselinovém složení nebo struktuře vede k odlišné pep-tidové mapě.

2. Štěpení bílkovin

Prvním krokem při stanovení peptidové mapy určitébílkoviny je její rozštěpení na menší fragmenty. To lzeprovést buď enzymaticky nebo chemicky2. S rostoucí dél-kou peptidových fragmentů roste pravděpodobnost jejichpřekrytí a zvyšuje se obtížnost jejich identifikace. Proto jevhodné štěpit velké molekuly v malém množství bodů, tytovětší fragmenty izolovat a poté provést jejich další štěpenía identifikaci.

U bílkovin se známou primární strukturou lze vybrat,na základě četnosti jednotlivých aminokyselin, nejvhodněj-ší metodu štěpení. Například vysoký obsah argininu nebolysinu je typickým ukazatelem pro použití trypsinu, zatím-co nepřítomnost methioninu ukazuje, že použití kyano-bromidu je zbytečné.

Pro úplné a reprodukovatelné štěpení je nutné, abyanalyzovaná bílkovina byla nejprve denaturována (např. jenutné přerušit S-S vazby). Denaturace bývá nejčastěji pro-vedena rozpuštěním bílkoviny v denaturujícím roztoku(např. 6 M-HC1, 8 M močovina), popřípadě jejím zahřátímči precipitací. Některé vysoce stabilní bílkoviny je nutnopřed denaturací vhodně modifikovat (např. karboxymethy-lací či redukcí). Je potřeba si však uvědomit, že neúplnámodifikace bílkoviny vede naopak k ještě větším problé-mům a to hlavně s rozpustností, neboť reoxidací mohouvznikat nahodilé disulfidické můstky mezi různými částmiřetězce a vytvoří se polymerní struktura.

2 . 1 . Š t ě p e n í p o m o c í e n z y m ů

Bylo popsáno mnoho metod štěpení bílkovin enzymy.Enzymy štěpí polypeptidy a bílkoviny na specifickýchmístech, což zaručuje reprodukovatelnost, a proto je enzy-mové štěpení rozšířenější než štěpení chemickými činidly.Velikost fragmentů závisí na četnosti specifické aminoky-selinové sekvence.

Užití proteolytických enzymů pro peptidové mapování

je velmi časté, nicméně optimální podmínky štěpení jsouobvykle stanoveny empiricky. Některé bílkoviny jsou re-zistentní k proteolýze a je proto velmi obtížné získat dobroupeptidovou mapu. Toto lze většinou odstranit zvýšenímpoměru proteinasa-substrát. Avšak zvyšující se množstvíproteinasy vede ke komplikacím (nespecifické štěpení, vý-měnné interakce mezi disulfidickými můstky, autolýza).Autolýza proteinas je příčinou toho, že výsledná směsobsahuje peptidové fragmenty nejen z analyzované bílko-viny, ale i z použitého enzymu. To vede ke složitějšímpeptidovým mapám a k jejich zhoršené interpretaci. Tytoproblémy lze odstranit nahrazením rozpustných enzymůenzymy imobilizovanýmř . Imobilizované enzymy musímít dobře přístupné aktivní místo a vykazovat vysokouspecifickou aktivitu, neboť je nutné zajistit, aby došlo k úpl-né hydrolýze analyzované látky.

Nejčastěji používaným enzymem je trypsin. Jako druhýenzym pro štěpení velkých fragmentů, vzniklých předcho-zím chemickým či tryptickým štěpením, se nejčastěji po-užívá proteinasa ze Staphylococcus aureus (V8) nebo chy-motrypsin.

2.1.1. Trypsin (EC 3.4.21.4)3-43

Trypsin katalyzuje hydrolýzu peptidových vazeb zalysinem a argininem. Je-li následující zbytek prolin, štěpeníneprobíhá (toto omezení nemá obecnou platnost, někdy lzepozorovat velmi pomalé štěpení této vazby). Obecně platí,že vazba obsahující lysin je štěpena rychleji než vazbaobsahující arginin. Následuje-li kyselý aminokyselinovýzbytek dochází k výraznému snížení rychlosti hydrolýzy,zatímco v případě bazických aminokyselinových zbytků serychlost naopak zvyšuje. Štěpení určité bílkoviny trypsi-nem nejčastěji probíhá při teplotě 37 °C pH 8-8,5 a po dobuněkolika hodin. Příliš dlouhá doba štěpení určité bílkovinyvede k vysoké autolýze trypsinu, kterou lze zpomalit přidá-ním milimolární koncentrace Ca . Tento enzym si zacho-vává aktivitu i v roztoku 2 M močoviny.

2.1.2. Staphylococcal proteinasa — strain V8(EC 3.4.21.19)31'44-52

Extracelulární proteinasa ze Staphylococcus aureus (strainV8) štěpí vysoce specificky glutamylové peptidové vazbya za určitých podmínek též aspartylové peptidové vazby.Jestliže se glutamylový zbytek nachází v N-koncovém neboC-koncovém tripeptidu, rychlost štěpení je velmi nízká.Vazba mezi kyselinou glutamovou a prolinem není štěpena

121

vůbec. Tento enzym je používán v širokém měřítku, neboťje komplementární k trypsinu.

a-Chymotrypsin štěpí peptidy a bílkoviny nakarboxylovéstraně tryptofanu, tyrosinu, fenylalaninu, leucinu a methioni-nu. Jestliže je následující zbytek prolin, štěpení nenastává.Je-li v blízkosti přítomen kyselý zbytek, rychlost štěpenívýznamně klesá, zatímco v případě bazických aminokyse-linových zbytků je hydrolýza rychlejší. Účinek chymotryp-sinu lze jen těžko předpovědět, neboť štěpení je závislé naokolí štěpené vazby. Podmínky štěpení jsou obdobné jakou trypsinu. V případě krátkého štěpení dochází k hydrolýzepouze několika určitých vazeb a tím vznikne směs poměrnědlouhých fragmentů, zatímco štěpení delší než 24 hodinvede ke směsi dostatečně malých peptidů.

2.1.4. Thermolysin (EC 3.4.23.4)14-26'40'45

Termostabilní endopeptidasa z Bacillus themoproteoly-ticus (thermolysin) štěpí na N-konci hydrofobních amino-kyselin (leucinu, isoleucinu, methioninu, fenylalaninu,tryptofanu a valinu). O mnoho pomaleji hydrolyzuje alanin,tryptofan a threonin. Je-li následující zbytek prolin, štěpeníneprobíhá. Thermolysin nelze doporučit pro počáteční ště-pení bílkovin, neboť typická bílkovina obsahuje příliš po-tencionálních míst štěpení a vznikla by příliš složitá směsvelmi malých fragmentů. Thermolysin si zachovává aktivi-tu i při vyšších teplotách (okolo 60 °C), což je velmi výhod-né, neboť při této teplotě dochází současně k denaturacisubstrátu. Tento enzym vyžaduje pro svou aktivitu přítom-nost Zn2 + a pro svou termostabilitu přítomnost Ca .

Lysin specifická proteinasa z Lysobacter enzymogenesje endoproteinasa štěpící specificky vazbu na karboxylovéstraně lysinu. Hydrolýza probíhá za alkalických podmínek.Enzym je aktivní v 5 M močovině a 1 % SDS. Podmínkyštěpení jsou obdobné jako u trypsinu.

2.7.6. Subtilisin (EC3.4.21.14)53

Subtilisin je nespecifická proteinasa katalyzující hydro-lýzu celé řady peptidových vazeb. Její použití může být

užitečné v případě, že jiné proteinasy neposkytují vhodnéfragmenty pro doplnění aminokyselinové sekvence. Pod-mínky štěpení jsou podobné jako u trypsinu.

2.1.7. Papain (EC 3A.22.2)34-44

Papain je také nespecifická proteinasa, ale sekvencev místě štěpení má značně velký vliv na rychlost hydrolýzy.Papain je sulfohydrylová proteinasa, která pro svou aktivituvyžaduje přítomnost redukujících činidel. Papain je někdypoužíván k získání vhodných peptidů společně s některoudalší proteinasou, avšak je nutné použít krátkou dobu ště-pení a velmi nízkou koncentraci papainu.

2.1.8. Pepsin(EC 3.4.23.1)

Pepsin nejlépe štěpí malé substráty obsahující sekvencihydrofobních zbytků (nejlépe fenylalaninu). Tento enzymovšem též hydrolyzuje peptidové vazby za aromatickýmiaminokyselinovými zbytky a leucinem. Následuje-li prolinnení vazba štěpena. Použití pepsinu má dvě zřejmé výhody:enzym je aktivní při nízkém pH. Štěpená bílkovina jezároveň denaturována a výměnné interakce mezi disulfidic-kými můstky jsou ojedinělé. Jako u chymotrypsinu rychlosta pravděpodobnost hydrolýzy závisí na okolí štěpené vaz-by.

2 . 2 . Š t ě p e n í s p e c i f i c k ý m ic h e m i c k ý m i m e t o d a m i 3 6 ' 4 5 ' 6 0

Pro některé účely je vhodné, aby byla štěpena pouzejedna nebo dvě peptidové vazby. Této podmínky lze dosáh-nout použijeme-li ke štěpení specifických chemických či-nidel. Nejčastěji používaným chemickým činidlem pro tytoúčely je kyanobromid. Ten štěpí v kyselém prostředí me-thionylové vazby na povrchu molekuly. Methionylovézbytky jsou přeměny na směs C-koncových homoserinůa homoserinových laktonů, přičemž jedna forma může pře-cházet ve druhou.

3. Separace peptidů po hydrolýze

Druhým krokem při stanovení peptidové mapy je sepa-race fragmentů, enzymaticky nebo chemicky naštěpenébílkoviny. Mají-li být od sebe jednotlivé peptidy odděleny,musí se lišit alespoň v jedné fyzikální či chemické vlast-nosti. Metody používané pro stanovení peptidových map

122

2.1.5. Lysin specifická proteinasaz Lysobacter enzymogenes (EC 3.4. ?. ?.)36-57-59

2.1.3. a-Chymotrypsin(EC 3 4 21 if'10-12,14'18'36-44-46-53-56

lze rozdělit do dvou skupin. První tvoří elektromigračnímetody, druhou pak metody chromatografické.

3 . 1 . E l e k t r o m i g r a č n í m e t o d y

Elektromigrační metody jsou založeny na elektrofo-retickém pohybu ionizovaných částic ve stejnosměrnémelektrickém poli. Pohyblivost iontů závisí na velikosti ná-boje, velikosti a tvaru molekuly, na povaze nosiče, elektro-lytu aj. U amfoterních iontů jako jsou bílkoviny a peptidyvelikost náboje závisí na pH, vzhledem k tomu, že bílko-viny a peptidy mohou existovat minimálně ve třech nábo-jových formách.

3.1.1. Zónová elektroforéza

Termín zónová elektroforéza označuje všechny elektro-migrační metody, kde se zóny pohybují v nosném elektro-lytu různou rychlostí a v závěrečné fázi jsou nosným elek-trolytem vzájemně zcela odděleny. Pro účely peptidovéhomapování se používá zónová elektroforéza na nosičích,nejčastěji na tenké vrstvě silikagelu nebo celulosy .Hlavní nevýhodou všech těchto metod je vysoká pravděpo-dobnost překrytí zón jednotlivých peptidových fragmentů,proto je v současnosti tato metoda stále častěji nahrazovánadvojrozměrnými technikami.

Separované peptidy jsou nejčastěji detegovány speci-fickým barvením (např. ninhydrinem, Commassie Blue).Pro zvýšení citlivosti lze použít fluorescenční či radioak-tivní značení.

3.1.2. Zónová elektroforéza v polyakrylamidovém geluv přítomností dodecylsulfátu (SDS-PAGE)

Velmi jednoduchá a široce užívaná metoda pro sta-novení peptidových map bílkovin7 '3 3 '3 4 '3 6 '4 5 '5 0 '5 2 '5 9. Zá-kladem je elektroforéza komplexů denaturovaných peptidůs anionickým detergentem dodecyl sulfátem sodným (SDS).Nábojové rozdíly mezi různými peptidy se navázáním SDStéměř úplně potlačí, komplexy protein-SDS jsou v neutrál-ním a alkalickém prostředí silně negativně nabité a putujík anodě. Procházejí-li polyakryamidovým gelem o vhodnéporozitě, je jejich pohyblivost dána velikostí molekuly.Separované fragmenty jsou nejčastěji detegovány specific-kým barvením, fluorescenčním nebo radioaktivním zna-čením.

Cleveland popsal modifikovanou verzi této metody .Bílkoviny jsou nejprve odděleny od kontaminujících látek

SDS polyakrylamidovou elektroforézou a detegovány spe-cifickým barvením. Vyříznuté plátky gelu, obsahující bíl-koviny, jsou umístěny do drážek druhého diskontinuálníhopolyakrylamidového gelu. Studované bílkoviny jsou elek-troeluovány z plátků do zaostřujícího gelu, jenž obsahujeproteinasy s vysokou specifickou aktivitou. Zde probíháštěpení. Peptidové fragmenty jsou pak elektroforeticky se-parovány v polyakrylovém gelu v přítomnosti SDS. Na-štěpené a separované produkty jsou detegovány jako v pří-padě klasické SDS-PAGE. Tato metoda může sloužit jakocitlivý indikátor stupně homologie bílkovin18'31'47.

3.1.3. Kapilární zónová elektroforéza (CZE)

Třebaže jsou různé formy elektroforézy v gelech snadnéa lehce dostupné, obvykle probíhají několik hodin a je ne-snadné je automatizovat a také kvantitativně vyhodnocovatvýsledky. Z těchto důvodů je vhodné použít pro separacikapilární elektroforézu, při které dělení probíhá ve velmitenkých (průměr 1 až 10 um) kapilárách, které rychle od-vádějí teplo, takže mohou být použita elektrická pole s vy-sokým napětím (100-300 V.cm ). Tím se sníží čas potřeb-ný pro rozdělení vzorku na několik minut. Objem vzorkupotřebného pro jeho analýzu se pohybuje maximálně v de-sítkách nanolitrů. Tato metoda má nejen vysoký stupeňrozlišení, ale může být snadno automatizována. Peptidyjsou zpravidla detegovány UV absorbčním detektorem.

Příkladem úspěšného použití CZE pro peptidové ma-pování je separace peptidových fragmentů vzniklých poštěpení lidského růstového hormonu trypsinem . Velmivhodná je tato metoda i pro rozlišení fosforylované a defos-forylované formy určité bílkoviny. Například Cobb a No-votný takto analyzovali tryptické peptidové fragmenty (3--kaseinu . Hynek a spol. pak různé formy pepsinogenů,které byly štěpeny a-chymotrypsinem55'56. Pro speciálníaplikace peptidového mapování se používá vysoce účinnáafinitní kapilární elektroforéza. Rush a spol. charakterizo-vali touto metodou rekombinantní lidský erytropoetin35.

3 . 2 . C h r o m a t o g r a f i c k é m e t o d y

Základním principem všech chromatografických metodje opakované ustalování rovnováhy rozpuštěné látky mezidvěma fázemi, z nichž jedna je pohyblivá (mobilní) a druházakotvená (stacionární). Pro peptidové mapování se po-užívá kapalinová chromatografie. Tato metoda zahrnujevšechny druhy, kde mobilní fáze je kapalná a stacionárnífáze tuhá látka.

123

3.2.1. Chromatografie na měničích iontů

Chromatografii na měničích iontů můžeme definovatjako vratnou výměnu iontů mezi mobilní a stacionární fází.Ionty, které jsou elektrostaticky vázané ke stacionární fázi sereverzibilně vyměňují s ionty v roztoku. Dělení látek je způ-sobeno rozdílem ve velikosti náboje. Ionty se stejným nábo-jem se hromadí na stejném místě a jsou eluovány současně.

Peptidové fragmenty jsou detegovány UV detektoremči fluorescenčním detektorem. Dnes je tato metoda stálevíce nahrazována vysoce účinnou kapalinovou chromato-grafii na reverzní fázi.

Peptidové mapy stanovil touto metodou prvně Benson .Jednalo se o peptidové mapy tryptických štěpů ribonukle-asy, lysozymu a hemoglobinu. Později byly takto studo-vány i další bílkoviny, např. hovězí albumin , a-inter-feron a bílkoviny obsahující cukerné složky .

3.2.2. Vysoce účinná kapalinová chromatografiena reverzní fázi (RP-HPLC)

Vysoce účinná kapalinová chromatografie na reverznífázi (RP-HPLC) se stává v současné době nejrozšířenějšímetodou používanou k peptidovému mapování. Dělí látkyna základě různě silných hydrofobních interakcí s chromato-grafickým nosičem obsahujícím hydrofobní skupiny. Chro-matografie na reverzní fázi používá jako stacionární fázinepolární kolonu plněnou mikročásticemi modifikovanéhosilikagelu, ke kterému je vázán alkyl o 8 či 18 uhlících. Jakomobilní fáze se pak používá polární kapalina. Nejčastěji tobývá voda s přídavkem kyseliny triflourooctové. Eluce jepak prováděna například gradientem acetonitrilu. Existujecelá řada faktorů ovlivňujících citlivost a účinnost. Citli-vost metody je nejvíce ovlivněna čistotou použité mobilnífáze, nečistoty mohou způsobovat vysoké pozadí absorban-ce. V porovnání s běžnými chromatografickými metodamije účinnost mnohem vyšší díky použití kolon s vysokýmirozlišovacími vlastnostmi (nmol množství analyzované lát-ky) a díky zkrácení času potřebného pro rozdělení (použitívysokého tlaku). Touto metodou lze dosáhnout velmi dobréreprodukovatelnosti ' . Separované peptidy jsou detego-vány UV absorbancí, indexem lomu či fluorescencí. Někdyje nutné pro zlepšení detekce provést derivatizaci separo-vaných peptidů ' 2 4 . V poslední době se stále častěji po-užívá spojení RP-HPLC s hmotnostní spektrometrií.

Pro bílkoviny o molekulové váze vyšší než 30 000 jevelmi obtížné získat jednoznačně interpretovatelné pepti-dové mapy. Tento problém je často řešen dvoustupňovou

separací. Jako počáteční krok může být použita permeačnígelová chromatografie či chromatografie na měničích ion-tů. V druhém případě je vhodné použít tandemového uspo-řádání HPLC, kdy peptidy jsou postupně eluovány z mě-niče iontů přímo na reverzní fázi19'20. Takto uspořádanýmexperimentem lze dosáhnout velmi vysoké citlivosti.

3 . 3 . D v o j r o z m ěr n é m e t o d y

Dvojrozměrné peptidové mapování je velmi účinnáa citlivá metoda, jenž je vhodná i pro složité směsi peptidů(okolo 50). Principem je kombinace dvou na sobě nezá-vislých metod separace (jak elektromigračních tak chroma-tografických). Ačkoli lze navrhnout celou řadu experimen-tálního uspořádání nejznámější je kombinace elektroforézyna tenké vrstvě následované chromatografii v kolmém smě-m7,8,i0,4l,45,61 T a k t Q b y l y n a p ř í k l a d stanoveny peptidové

mapy aktinů z různých tkání14. Další často používanouaplikací je dvojrozměrná elektroforéza v experimentálnímuspořádání zahrnujícím izoelektrickou fokusaci (IEF) zadenaturujících podmínek (močovina, redukující činidla)a následnou polyakrylamidovou elektroforézu v přítom-nosti dodecylsulfátu sodného (SDS)62. Výsledkem rozdě-lení peptidů je rovina o souřadnicích pI-Mr (izoelektrickýbod-relativní molekulová hmotnost). Lze samozřejmě po-užít i dvojrozměrnou chromatografii, například na tenkévrstvě polyamidů1'.

Dvojrozměrné techniky mají přiměřeně vysokou citli-vost. Množství potřebného vzorku je okolo 5 nmol odkaždého peptidů. Separované peptidy jsou nejčastěji dete-govány specifickým barvením (např. ninhydrinem, Com-massie Blue). Pro zvýšení citlivosti lze použít fluorescenčníči radioaktivní značení.

4. Detekce peptidů

Posledním krokem při stanovení peptidových map jedetekce separovaných peptidů. Detekce může být provede-na pomocí přímého či nepřímého stanovení peptidů. Přímástanovení jsou založena na měření určité fyzikální vlast-nosti analyzovaného peptidů - např. absorbční spektrome-trie, hmotnostní spektrometrie, emisní fluorescenční spek-troskopie. Při nepřímých metodách jsou měřeny komplexypeptidů s činidly, která jsou přidávána k analyzovanémupeptidů pro zvýšení citlivosti. Výběr vhodné detekční me-tody závisí na použité separační metodě.

Pro kapalinovou chromatografii či kapilární elektro-

124

forézu se nejčastěji používá přímé měření absorpce v ultra-fialové oblasti. Separační metody v plošném uspořádání(zónová elektroforéza, dvojrozměrné metody) častěji vy-užívají k detekci reakcí s chemickými detekčními činidly,fluorescenční nebo radioaktivní značení.

4 . 1 . A b s o r b č n í s p e k t r o m e t r i ev u l t r a f i a l o v é o b l a s t i

Rychlou a poměrně citlivou metodu představuje příméspektrofotometrické stanovení peptidů v oblasti absorpcepeptidových vazeb (210-220 nm) nebo aromatických ky-selin (280 nm). Velkou výhodou této metody je, že jenedestruktivní. Hlavním omezením této detekční metody jevysoká ultrafialová absorbance většiny roztoků používa-ných pro separaci peptidů, jenž ruší stanovení zejménav oblasti 210-220 nm. Absorbance při 280 nm závisí vý-razně na složení proteinu.

4 . 2 . H m o t n o s t n í s p e k t r o m e t r i e

Hmotností spektrometrie se ukazuje být praktickou tech-nikou pro stanovení peptidových fragmentů, separovanýchpomocí RP-HPLC, obsahujících méně než 25 aminokyseli-nových zbytků. Touto metodou můžeme zjistit nejen mole-kulovou hmotnost ale i totožnost odpovídajících aminoky-selinových zbytků. Hmotnostní spektrometrie je založenana interakci iontů molekul s magnetickým polem. Moleku-ly separované látky jsou nejprve ionizovány a poté se nabitéčástice rozdělí podle své hybnosti a energie. Tato metodadetekce dosahuje citlivosti v oblasti pikomolů. Použití me-tody v analýze vysokomolekulárních biomolekul je ome-zeno průtokovou rychlostí typické analytické HPLC.

Pro peptidové mapování jsou vhodné tyto ionizačnítechniky - termosprej3'49 (zahřátím solventu se vytvořívelmi jemný sprej jehož chemická ionizace vede ke vznikuiontů), elektrosprej38'57'63 (aplikací vysokého napětí je zevzorku oddělena kapka, která se po odpaření mobilní fázerozpadá na menší nabité kapénky) a bombardování rych-lými atomy53 (peptid je rozpuštěn v málo těkavém rozpou-štědle a ozářen v ionizační komůrce svazkem atomů argo-nu nebo xenonu). Je možno použít i ionizační technikuMALDI (peptid je zabudován do matrice, při odpařenímatrice dochází k desorpci a ionizaci studované látky).

4 . 3 . F l u o r e s c e n č n í e m i s n í s p e k t r o m e t r i e

Nezbytnou podmínkou pro měření fluorescence je pří-

tomnost fluorescenčního chromoforu - fluoroforu. Peptidyobsahují přirozené vnitřní fluorofory - aromatické zbytkyaminokyselin tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu, které ob-sahují systém delokalizovaných elektronů n. Absorpčnípás těchto aminokyselin leží v rozmezí 240-300 nm. Budí--Ii se tyto aminokyseliny světlem v této spektrální oblastimůžeme pozorovat fluorescenci. Ta je dána u tryptofanuindolovým kruhem (maximum při 350 nm), u tyrosinufenolovým kruhem (maximum při 303 nm) a u fenylala-ninu benzenovým kruhem (maximum při 282 nm). Tutopřímou detekční techniku lze použít i pro peptidové ma-pování .

Daleko hojněji se však používá vnějších fluoroforus dobře definovanými chemickými a fluorescenčními vlast-nostmi, které se přidávají k analyzovanému peptidů. Nej-běžněji používaným fluorescenčním činidlem pro stano-vení peptidových map je fluoreskamin ' . Fluoreskamin(4-fenylspiro-[furan-2(3//)]-l'-ftalan-3,3'-dion) velmi ry-chle reaguje s primární aminoskupinou peptidů či bílkovina vzniká fluorescenční produkt '. Modifikovaný vzorekje nejprve excitován zářením o vlnové délce 390 nm a potéje měřena fluorescence při 475 nm. Fluorescenční vlast-nosti jsou stabilní v rozmezí pH 4—10. Tato metoda detegujeng množství aminokyselin. Dalším fluorescenčním čini-dlem je o-ftalaldehyd, který reaguje s primární aminoskupi-nou. Vzniklý komplex je excitován zářením o vlnové délce340 nm a fluorescence je měřena66 při 455 nm. Bensonpoužil toto fluorescenční činidlo pro stanovení tryptickýchštěpů hovězího albuminu13.

4 . 4 . A u t o r a d i o g r af i e a k a p a l i n o v ás c i n t i l a č n í s p e k t r o m e t r i e

Obě tyto metody vyžadují peptidy značené radioaktiv-ními izotopy a vedou k výraznému zvýšení citlivosti. Nej-častěji se používají izotopy [14C] [125I] [3H] [32P] [35S].Značení bílkoviny dvěmi různými radioaktivními izotopyvede k jednoznačnější interpretaci stanovených peptido-vých map.

Bílkovinu lze radioaktivně označit dvěma způsoby -biosyntézou s radioaktivně značenými aminokyselinaminebo modifikací radioaktivním činidlem. V biosyntetickémradioaktivním značení bílkovin se často používá izotop[3H]. Biosyntéza v přítomnosti [3H]lysinu a [3H]argininuje zvláště vhodná pro detekci peptidových map tryptickýchpeptidových štěpů. Všechny polypeptidové fragmenty(kromě C-koncových peptidů) jsou pak detegovány se stej-nou citlivostí. Takto byly studovány různé druhy aktinů67

125

a myších antigenů9. Dalšími izotopy používanými pro bio-syntetické značení je [32P] (cit.7*3 6 '4 1 '4 5). K modifikacipeptidů se používají nejčastěji reakce s methyl[14C]acet-imidem10 a reduktivní metylace [ C]formaldehydem .Obě modifikační činidla interagují s primární aminoskupi-nou. Některé zbytky lze modifikovat selektivně, napříkladlysin [14C]sukcinyl anhydridem8, methionin jodo[14C]ace-tátem8, tyrosin a histidin jodací [125I] ( ci t.

7 '1 2 '3 1-4 5-5 2 '5 9).Radioaktivní jodace sice podstatně zvyšuje citlivost, avšaktato metoda má řadu nevýhod, např. vznik dvou derivátůtyrosinu a nerozpustnost některých peptidů obsahujícíchjodované tyrosinové zbytky.

Autoradiografii využívají plošné separační meto-dy7,8,10,12,15,3U6,41,45,52,59,62 p e p t i d y J S Q U n e j p r y e c h e .

micky modifikovány radioaktivním činidlem a po té jeelektroforéza (či chromatogram) separovaných radioaktiv-ně značených peptidových fragmentů umístěna do kazety,kde probíhá ozáření filmu.

Autoradiografii nelze použít pro peptidy značené izoto-pem ["H], ten lze však detegovat kapalinovou scintilačníspektrometrií9'60. Scintilátor absorbuje energii radioaktiv-ního záření a vyzáří ji ve formě záblesku viditelného neboultrafialového světla.

4 . 5 . D e t e k č n í c h e m i c k á č i n i d l a

Specifická detekční chemická činidla reagují s peptido-vými fragmenty a vznikají barevné komplexy, které jsoudetegovány spektrofotometricky. Tyto detekční metodyjsou používány hlavně pro separační metody v plošnémexperimentálním uspořádání.

Pro účely peptidového mapování se dříve často použí-vaná reakce polypeptidů s ninhydrinem '. Toto činidloreaguje s primární aminoskupinou a vede ke vzniku mod-rých produktů (absorpce při 570 nm). Ninhydrinové bar-vení nelze použít pro detekci peptidů v roztocích obsahují-cích močovinu (neboť je hydrolyzována na čpavek běhemreakce) nebo primární či sekundární aminy. Popsaná meto-da deteguje |0.g množství aminokyselin.

Někdy je vhodné použít pro usnadnění detekce separo-vaných peptidů činidlo, které reaguje specificky pouzes určitým aminokyselinovým zbytkem. Činidlo ninhydrin-kadmium reaguje s volnou koncovou aminoskupinou a růz-né aminokyselinové zbytky dávají rozdílně zbarvené pro-dukty68. Většina aminokyselinových zbytků dává růžovékomplexy, glycin, threonin a prolin žluté a serin oranžové.Touto metodou byly detegovány tryptické štěpy ribozomál-ních proteinů61 a chymotryptické štěpy králičí svalové

aldolasy10. V současnosti není tato metoda příliš používánavzhledem k vysoké toxicitě kadmia.

Zvýšení citlivosti chromatografických metod lze do-sáhnout reakcí peptidů s detekčním chemickým činidlemještě před jejich separací. Chang použil takto detekčníčinidlo (4,4-dimetylaminoazobenzen-4-izothiokyanát), kteréreaguje s aminoskupinou peptidů. Modifikované peptidypak separoval RF-HPLC a detegoval při 436 nm (cit.17'69).

LITERATURA

1. Ingram V. M.: Nature 778, 792 (1956).2. Allen G.: Laboratory techniques: Sequencing ofPro-

teins andPeptides, str. 73. Elsevier, Amsterdam 1989.3. Kim H. Y., Pilosof D., Dyckes D. F., Vestal M. L.: J.

Am. Chem. Soc. 106, 7304 (1984),4. Cobb K. A., Novotný M.: Anal. Chem. 61,2226 (1989).5. Shirota O., Rice D., Novotný M: Anal. Biochem. 205,

189 (1992).6. Benson J. V. Jones R. T., Cormick J., Paterson J. A.:

Anal. Biochem. 16, 91 (1966).7. Bray D„ Brownlee S. M.: Anal. Biochem. 55,213 (1973).8. Waterson R. M. Konigsberg W. H.: Proč. Nat. Acad.

Sci USA 71, 376 (1973).9. Brown J. L., Kato K., Silver J., Natheson S. G.: Bio-

chemistry 75,3174(1974).10. Bates D. L., Perham R. N. Coggins J. R.: Anal. Bio-

chem. 68, 175(1975).11. Tichy H.: Anal. Biochem. 69, 552 (1975).12. Davison P. F.: Anal. Biochem. 75, 129 (1976).13. Benson J. R.: Anal. Biochem. 71, 459 (1976).14. Vandekerckhove J., Weber K.: Eur. J. Biochem. 90,

451 (1978).15. NellesL.P.,BambergJ.R.:Anal.Biochem.94,150(1979).16. Rubinstein M., Levý W. P., Moschera J. A., Lai C. Y.

Herschberg R. D., Bartlett R. T., Pestka S.: Arch.Biochem. Biophys. 270, 307 (1981).

17. Chang J. Y., Knecht R., Balí R., Alkan S. S., Braun D.G.: Eu. J. Biochem. 727, 625 (1982).

18. Walker A. I., Anderson C. W.: Anal. Biochem. 146,108(1985).

19. Takahashi N., Ishioka N., Takahashi Y., Putman F.W.: J. Chromatogr. 326, 407 (1985).

20. Takahashi N., Takahashi Y., Ishioka N., Blumberg B.S., Putman F. W.: J. Chromatogr. 359, 181 (1986).

21. StoneK.L.,WiliemsK.R.:J.Chromatogr.359,203(1986).22. Hartman P. A., Stodola J. D., Harbour G. C, Hooger-

heide J. G.: J. Chromatogr. 360, 385 (1986).

126

23. L'Italien J. I: J. Chromatogr. 359, 213 (1986).24. Lu H. S., Lai P. H.: J. Chromatogr. 368, 215 (1986).25. Huberman A., AguilarM. B.: J. Chromatogr. 443,337

(1988).26. Krishna K., Horvath C: J. Chromatogr. 443, 343

(1988).27. Garnik R., Solli N. J., Papá P. A.: Anal. Chem. 60,

2546(1988).28. NielsenR. G.,RickardE.C:J.Chromatogr.516,99(1990).29. Gollinelli-Pimpaneau B., Badet B.: Eur. J. Biochem.

201, 175(1991).30. Yamaguchi H.: J. Biochem. 110, 785 (1991).31. Caldwell K. K., Lips D. L„ Bansal V. S., Majerus P.

W.: J. Biol. Chem. 266, 18378 (1991).32. Bloom J. W.: J. Chromatogr. 574, 219 (1992).33. Airey J. A., Grinsell M. M., Jones L. R., Sutko J. L.,

Witcher D.: Biochemistry 32, 5739 (1993).34. Maruta S., Ikebe M.: Biochem. J. 292, 439 (1993).35. Rush R. S., Derby P. L., Strickland T. W, Rohde M.

F.: Anal. Chem. 65, 1834 (1993).36. el Benna J., Faust L. P„ Babior B. M.: J. Biol. Chem.

269,23431 (1994).37. VossT., FalknerE., Ahorn H„ KrystekE., Maurer-Fo-

gy I., Bodo G., Hautmann R.: Biochem. J. 298,719 (1994).38. Klarskov K., Roecklin D., Bouchon B., Sabatie J., van

Dorsselear A., Bischoff R.: Anal. Biochem. 216, 127(1994).

39. Wang Y., Mackay E. A., Kurasaki M., Kagi J. H.: Eur.J. Biochem. 225, 449(1994).

40. Haniu M., Horan T„ Arakawa T., Katta V., Le J.,Rohde M. F.: Arch. Biochem. Bioph. 324, 344 (1995).

41. Yakel J. L. Vissavajjhala P., Derckach V. A., BrickeyD. A., Soderling T. R.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92,1376(1995).

42. Lipari F., Hercovics A.: J. Biol. Chem. 271,27615 (1996).43. Ono S. Yamakita Y., Yamashiro S., Matsudaira P. T.,

GnarraJ. R., ObinataT., MatsumuraF.: J. Biol. Chem.272,2527(1997).

44. Cleveland D. W., Fisher S. G., Kirschner M. W.,Laemmli U. K.: J. Biol. Chem. 252, 1102 (1977).

45. Judd R. C: Anal. Biochem. 160, 306 (1987).46. Jones A. T., Roberte N.B..-J. Chromatogr. 599,179(1992).47. Boivin D., Gingras D., Beliveau R.: J. Biol. Chem.

268,2610(1993).48. Jones A. T., Keen J. N., Roberts N. B.: J. Chromatogr.

646,207(1993).49. Legrand R., Falconnet J. B., Prevost D. P. Schoot B.,

Devaux P.: J. Chromatogr. 647, 3 (1993).

50. SavageT. J„ Hatch M. W., CroteeauR.: J. Biol. Chem.269,4012(1994).

51. Jones M. D. Mereweter L. A., Clogston C. L. Lu H.S.: Anal. Biochem. 276, 135 (1994).

52. Čepek K. L., Rimm D. L., Brenner M. B.: Proč. Nati.Acad. Sci. USA 93, 6567 (1996).

53. Caprioli R. M., Wiliam T. M., Da GlueB., Martin M:J. Chromatogr. 443, 355 (1982).

54. Kanaya S., UchidaT.: Biochem. J. 240, 163 (1986).55. Hynek R., Kačička V., Kučerová Z., Káš J.: J. Chro-

matogr. B 681, 37 (1996).56. Hynek R., Kasička V., Kučerová Z., Káš J.: J. Chro-

matogr. B 688, 213 (1997).57. Drummond J. T., Loo R. R. Matthews R. G.: Bioche-

mistry 32, 9282 (1993).58. Katoh T., Tanahashi K., Hasegawa Y., MoritaF.: Eur.

J. Biochem. 227, 459(1995).59. Corsi D., Galluzzi L., Lecomte M. C, Magnani M.: J.

Biol. Chem. 272,2977(1997).60. Pohl G., Kallstrom M., Bergsdorff N., Wallen P.,

Jornvall H.: Biochemistry 23, 3701 (1984).61. Heiland I., Brauer D., Wittann-Liebold B.: Hoppe-

-Seyler's Z. Physiol. 357, 1751 (1976).62. 0'Farrel P. H.: J. Biolog. Chem. 250, 4007 (1974).63. Hara S. Rosenfeld R., Lu H. S.: Anal. Biochem. 243,

74(1996).64. Udenfriend S., Stein S.,BohlenP., Dairman W., Leim-

gruber W., Weigele M.: Science 178, 871 (1972).65. FelixA.M.,JimenezM.H.:J. Chromatogr. S9,361 (1974).66. Roth M: Anal. Chem. 43, 880 (1971).67. Gruenstein E., Rich A.: Biochem. Biophys. Res. Com-

mun. 64, 472 (1975).68. Heilmann J., Barollier J., Wetzke E.: Hoppe-Seyler's

Z. Physiol. Chem. 309, 219 (1957).69. Chang J. Y.: Biochem. J. 799, 537 (1981).

H. Vaňková (Institute ofPathofysiology, lst Faculty ofMedicíně, Charles University, Prague): Peptide Maps

Peptide mapping is common techique ušed for studyingproteins. Such methods can explain small changes in thestructure of the protein molecule. The article deals withvarious types of methods which are ušed for this purpose.The article describes first hydrolysis of different enzymesor degradation with cyanogen bromide, then separation ofpeptide fragments (by chromatography and electropho-resis). Finally, the separated peptides are detected. Theindividual steps of the technique are reviewed.

127