PENGARUH EKSTRAK ETHANOL PROPOLIS TERHADAP …...protein antiapoptosis. P21 merupakan suatu tumor suppresor protein memiliki fungsi utama dalam regulasi terhadap progresi siklus sel

commit to user

library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

PENGARUH EKSTRAK ETHANOL PROPOLIS TERHADAP

EKSPRESI p21,Bcl2, Bax DALAM MENEKAN

PROLIFERASI DAN MENGINDUKSI

APOPTOSIS PADA KULTUR SEL

KANKER HEPATOMA (Hep G2)

TESIS

Disusun Untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Magister

Program Studi Magister Kedokteran Keluarga

Minat Utama Ilmu Biomedik

Oleh:

Kun Salimah

S501208023

PASCASARJANA

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2017

commit to user


PENGARUH EKSTRAK ETHANOL PROPOLIS TERHADAP

EKSPRESI p21,Bcl2, Bax DALAM MENGINDUKSI

APOPTOSIS DAN MENEKAN PROLIFERASI

PADA KULTUR SEL KANKER

HEPATOMA(Hep G2)

TESIS

Kun Salimah

S501208023

Pembimbing

dr. Paulus Kusnanto SpPD-KGEH.FINASIM

Prof. Dr. dr. H. M. Bambang Purwanto, Sp.PD-KGH, FINASIM

Drs. Sumardi, MSi

PASCASARJANA

UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA

SURAKARTA

2017

commit to user


commit to user


ix

Kun Salimah S501208023 Pengaruh Ekstrak Ethanol Propolis Terhadap

Ekspresi Protein Bcl2, P21 dalam Menekan Proliferasi dan Menginduksi

Apoptosis Pada Kultur Sel Hepatoma (Hep G2). TESIS. Pembimbing I : dr.

Paulus Kusnanto SpPD-KGEH.FINASIM, Pembimbing II : Prof. Dr. dr.

Bambang Purwanto, SpPD-KGH .FINASIM. Program PPDS I Ilmu Penyakit

Dalam. Universitas Sebelas Maret Surakarta.

ABSTRAK

Latar Belakang : Karsinoma Hepatoseluler (KHS) merupakan keganasan yang

paling sering ke 6 di seluruh dunia, dan merupakan penyebab kematian yang

semakin meningkat . Tumor primer di hati sebesar 90 % adalah karsinoma

hepatoseluler. Sorafenib telah banyak digunakan sebagai pengobatan kanker

hepatoseluler, bekerja dengan menghambat dua jenis kinase yakni profilerasi sel

dan angiogenesis (pembentukan pembuluh darah) di mana keduanya berperan

besar dalam proses pertumbuhan.Propolis diketahui memiliki aktivitas anti

kanker, melalui induksi apoptosis dan melalui penghambatan proliferasi dalam

siklus sel. Bax dan Bcl2 termasuk kelompok famili protein B-cell lymphoma

2 yang berperan sebagai apoptosis jalur intrinsic dimana BCl2 merupakan

protein antiapoptosis. P21 merupakan suatu tumor suppresor protein memiliki

fungsi utama dalam regulasi terhadap progresi siklus sel.

Tujuan Penelitian : Mengetahui efek anti kanker ekstrak ethanol propolis

(EEP) yang berasal dari Kerjo, Karanganyar pada kultur sel kanker

hepatoseluler (Hep G2) melalui potensinya sebagai antikanker dalam

meningkatkan ekspresi protein ekspresi P21, menurunkan ekspresi protein bcl2

dalam menekan apoptosis dan menurunkan proliferasi sel.

Metode Penelitian : Merupakan penelitian experimental laboratories, post

test with control group design. Dilakukan pada sel Hep G2 dengan

perlakuan pemberian konsentrasi EEP (½IC50, IC50, 2IC50), Sorafenib IC50,

kombinasi EEP IC50 + Sorafenib IC50, dan kontrol. Pengamatan ekspresi

protein Bax, Bcl2, P21 dengan metode imunositokimia ,pengamatan proliferasi

sel dengan doubling time, pengamatan apoptosis dengan flowcitometry.. Uji

statistik menggunakan ANOVA, dilanjutkan dengan uji post hoc Tuckey.

Dinyatakan bermakna bila p<0,05.

Hasil Penelitian : Konsentrasi penghambatan 50 % sel Hep G2 oleh EEP 65,2

μg/mL, dan Sorafenib ( 6,08 μg/mL ) . EEP konsentrasi 2IC50 ( p= 0,001 ) ,

Sorafenib 1 IC50 ( p=0,001 ), 1IC50 EEP + 1IC50 Sorafenib ( p =0,001) mampu

meningkatkan ekspresi protein p21.

commit to user


x

Konsentrasi 2 EEP ( p=0,040),mampu menurunkan ekpresi protein Bcl2.Hasil uji

ANOVA menghasilkan p=0,001, menunjukkan masing-masing kelompok

berbeda secara menyakinkan. Kekuatan EEP 2IC50 menghasilkan dampak

lebih besar dibanding kelompok lain (p<0,05). Kekuatan EEP 1IC50 setara

dengan Sorafenib IC50 dalam menekan proliferasi 24jam (p>0,05). Kekuatan

EEP 0,5IC50 setara dengan Sorafenib IC50 dalam menekan proliferasi

48jam (p>0,05). Kekuatan EEP 1IC50 lebih baik dari Sorafenib IC50 dalam

menekan proliferasi 72jam (p>0,05).

Kesimpulan : Semua konsentrasi EEP meningkatkan ekspresi protein p21,

dengan kelompok EEP 2IC50 memberikan efek paling kuat. Semua

konsentrasi EEP mampu menurunkan proliferasi sel, dengan kelompok EEP

2IC50, memberikan efek paling kuat. Konsentrasi 2IC50 EEP berpengaruh

terhadap penurunan ekspresi protein bcl2 dan apoptosis sel hepatoma.

Kata kunci : Ekstrak ethanol propolis, bax,Bcl2, P21, apoptosis, proliferasi,

sel Hep G2

commit to user


xi

Kun Salimah. S501208023 .2017. Effect of ethanol extract of propolis on

Bcl2 protein expression, P21 induce apoptosis and decrease cell proliferation

in liver cell cancer culture ( Hep G2). TESIS. Pembimbing I : . Paulus Kusnanto

SpPD-KGEH.FINASIM Pembimbing II : Prof. Dr. dr. Bambang Purwanto,

SpPD-KGH FINASIM. Programe PPDS I Ilmu Penyakit Dalam. Universitas

Sebelas Maret Surakarta.

ABSTRACT

Background

Hepatocellular carcinoma (KHS) is the 6th most frequent malignancy worldwide,

and is a growing cause of death. The primary liver tumor of 90% is hepatocellular

carcinoma. Sorafenib has been widely used as a treatment for hepatocellular

cancer, acting by inhibiting two types of kinase ie cell profileration and

angiogenesis (blood vessel formation) in which both play a major role in the

growth process.Propolis is known to have anti-cancer activity, through apoptosis

induction and by inhibition of proliferation in cycles cell. Bax and Bcl2 belong to

the family group of B-cell lymphoma 2 protein that acts as an intrinsic path

apoptosis wherein BCl2 is an antiapoptosis protein. P21 is a protein suppressor

tumor has a major function in regulation of cell cycle progression.Propolis is

known to have anti-cancer activity by inducing apoptosis and inhibition

proliferation of the cell cycle.

Objectives

This study aims to determine the anti-cancer effects of ethanol extract of propolis

(EEP) derived from Kerjo, Karanganyar in cultured liver cancer cells (Hep G2)

through its potential as an anticancer in increasing protein expression

P21,decreasing protein expression bcl2 and decreasing cell proliferation and

induce cell apoptosis .

Methods

An experimental research laboratories post-test with control group of non cross-

over design. Performed on HepG2 cells treated with concentrations of EEP

(½IC50, IC50, 2IC50), Sorafenib IC50, combination IC50 EEP and

Sorafenib, and control. Observations p21, Bcl2, bax protein expression by

immunocytochemistry and observation method with a doubling time of cell

proliferation. Statistical test using ANOVA, followed by post hoc Tukey test.

Declared significant if p <0.05.

Results

commit to user


xii

This study shows inhibitory concentration 50% (IC50) of Hep G2 cells by EEP =

65,2 μg / mL, and by Sorafenib = 6,08 μg / mL. EEP concentration 2IC50 (p =

0.001), were able to increase the expression of p21 protein. ANOVA test results is

p = 0.001, respectively showed distinct groups convincingly. EEP

concentration 2IC50 can reduce the expression of Bcl2 and generate greater

impact than other groups (p <0.05). EEP concentration IC50 equivalent to

Sorafenib IC50 in reducing proliferation 24 hours (p> 0.05). EEP concentration

1/2IC50 equivalent to Sorafenib IC50 in suppressing the proliferation of 48

hours (p> 0.05). EEP concentration IC50 give better effect than Sorafenib IC50

suppressing the proliferation 72 hours (p> 0.05). Conclusions :All concentrations

of EEP, Sorafenib, and EEP + Sorafenib increase the expression of p21, with

EEP concentration 2IC50 group provide the strongest effect. All concentrations

of EEP, inhibit cell proliferation, with EEP concentration 2IC50 group provide

the strongest effect. Concentration 2 IC50 EEP generate impact on decreasing

expression of bcl2 and increasing apoptosis.

Keywords: Ethanol extract of propolis, bax, bcl2, apoptosis, proliferation,

HepG2 cells

commit to user


DAFTAR ISI

Halaman

Pernyataan Keaslian dan Persyaratan Publikasi ........................................................v

Kata Pengantar ......................................................................................................vi

Abstrak .................................................................................................................ix

Abstract ................................................................................................................xi

Daftar Isi .............................................................................................................xiii

Daftar Gambar .....................................................................................................xviii

Daftar Tabel .......................................................................................................xix

Daftar Lampiran ..................................................................................................xx

Daftar Singkatan..................................................................................................xxi

BAB I. PENDAHULUAN ..................................................................................1

A. Latar Belakang ...........................................................................................1

B. Rumusan Masalah ......................................................................................4

C. Tujuan Penelitian .......................................................................................5

D. Manfaat Penelitian .....................................................................................5

1. Manfaat teoritis .....................................................................................5

2. Manfaat praktis .....................................................................................5

BAB II. LANDASAN TEORI ............................................................................6

A. Tinjauan Pustaka .....................................................................................7

1. Kanker………………………………………………………………..7

2. Kanker Hati…………………………………………………………..9

commit to user


xiv

a. Epidemiologi ...........................................................................9

b. Etiologi………………………………………………………..10

c. Diagnosis dan Staging .............................................................12

3. Sel kultur Hep G2. .............................................................................14

4. Siklus Sel ............................................................................................14

5. Apoptosis ............................................................................................17

6. Protein p21 ..........................................................................................22

7. Protein bcl2 /Bax ................................................................................22

8. Propolis ...............................................................................................25

a. Definisi ........................................................................................25

b. Kandungan Kimia Propolis……………………………………..27

c. Aktivitas biologis Propolis .............................................................31

1. Aktivitas antikanker ........................................................32

2. Aktivitas antiinflamasi………………………………….32

3. Antioksidan .....................................................................34

4. Imunomodulator………………………………………..34

d. Ekstrak dan ekstraksi propolis ........................................................35

1. Definisi……………………………………………………….35

2. Cairan Penyari………………………………………………..35

BAB III. KERANGKA KONSEPTUAL,KERANGKA PIKIR DAN HIPOTESIS

PENELITIAN .....................................................................................................37

commit to user


xv

A. Kerangka Konseptual Penelitian .........................................................37

B. Kerangka pikir .....................................................................................38

C. Hipotesis Penelitian .............................................................................40

BAB IV. METODE PENELITIAN ....................................................................42

A. Jenis penelitian…………………………………………………… ..42

B. Tempat Penelitian..............................................................................42

C. Waktu Penelitian ...............................................................................42

D. Besar Sampel .....................................................................................43

E. Variabel penelitian ............................................................................44

F. Definisi Operasional..........................................................................45

G. Bahan dan Alat Penelitian .................................................................48

H. Jalannya Penelitian .............................................................................51

I. Alur Penelitian ...................................................................................63

J. Analisis Hasil………………………………………………………..64

BAB V. ANALISIS HASIL PENELITIAN .....................................................66

A. Data Penelitian ......................................................................................66

1. Uji sitotoksisitas dengan MTT assay untuk menetapkan

nilai IC50 ekstrak etanol propolis dan Sorafenib ..............................66

a. Pengamatan ekspresi protein p21 ........................................70

b. Pengamatan ekspresi protein bcl2 ......................................73

c. Pengamatan ekspresi protein bax ........................................75

2. Uji induksi apoptosis EEP pada sel Hepatoma (Hep G2) dengan

commit to user


xvi

flowcytometry………………………………………………………...76

B. Proses Analisis Penelitian……………………………………………...80

1. Deskripsi variabel penelitian……………………………………….82

a. Variabel p21…………………………………………………...83

b. Variabel bcl2………………………………………………......85

c. Variabel bax…………………………………………………...87

d. Variabel proliferasi…………………………………………....89

e. Variabel apoptosis………………………………………….....95

2. Analisis Pengaruh Pemberian EEP terhadap Ekspresi Protein p21,

bcl2, bax, dan Apoptosis serta Proliferasi……………………….....97

a. Variabel ekspresi p21………………………………………....97

b. Variabel ekspresi bcl2………………………………………..104

c. Variabel Ekspresi bax………………………………………..111

d. Variabel proliferasi…………………………………………..116

e. Variabel apoptosis…………………………………………...140

BAB VI. PEMBAHASAN ................................................................................149

A. Berdasarkan pendekatan prinsip ontologi .........................................149

commit to user


xvii

B. Berdasarkan Pendekatan Prinsip Epistomologi .........................................150

C. Berdasarkan Prinsip Aksiologi ..................................................................153

D. Nilai Kebaruan penelitian ..........................................................................154

E. Keterbatasan Penelitian .............................................................................154

BAB VII. PENUTUP .........................................................................................155

A. Kesimpulan ....................................................................................................156

B. Saran ..........................................................................................................157

DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................158

commit to user


xviii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Skema dasar molekuler kanker (Kumar,2005)……….................7

Gambar 2.2. 10 Besar Kanker Tersering di RSKD (Kasus Baru) Tahun 2010...10

Gambar 2.3. Algoritma BCLC staging………………………...................................13

Gambar 2.4. Siklus Sel………………………………………………………..16

Gambar 2.5. Apoptosis jalur ekstrinsik dan instrinsik ......................................19

Gambar 2.6. Struktur molekul flavones (flavonoid)…………………………..29

Gambar 2.7. Struktur molekul asam fenolat…....................................................32

Gambar 2.8. Struktur Molekul CAPE……………………………………………….........33

Gambar 3.1. Kerangka Konseptual Penelitian ..................................................37

Gambar 3.2. Kerangka Pikir ............................................................................ 38

Gambar 4.1. Skema pengisian plat mikrokultur uji sitotoksisitas ................... 53

Gambar 4.2. Skema pengisian plat mikrokultur untuk pengamatan

ekspresi protein p21,bcl2,bax ...................................................... 54

Gambar 4.3. Alur Penelitian ............................................................................ 59

Gambar 4.4 Uji sitotoksiksitas IC50 dengan metode MTT ............................ 60

Gambar 4.5. Uji Apoptosis dengan Flowcytometry ........................................ 61

commit to user


xix

Gambar 4.6. Uji proliferasi dengan doubling time .......................................... 62

Gambar 4.7 Uji ekspresi protein Cp21,bcl2,bax dengan metode

imunositokimia ........................................................................... 63

Gambar 5.1. Morfologi Sel Hep G2 ................................................................. 66

Gambar 5.2. Pembentukan Kristal formazan setelah pemberian reagen

yellow MTT.. .............................................................................. 68

Gambar 5.3. Hasil pengecatan imunositokimia perbesaran 400 kali untuk

ekspresi p21 pada sel HepG2 setelah perlakuan dan

inkubasi selama 24 jam pada kelompok dengan EEP

konsentrasi ½ IC50 (a), IC50 (b), 2IC50 (c), kelompok

dengan Sorafenib (d) kelompok IC50 EEP + Sorafenib (e)

dan kelompok kontrol (f) ............................................................ 72

Gambar 5.4. Hasil pengecatan imunositokimia perbesaran 400 kali untuk

ekspresi bcl2 pada sel HepG2 setelah perlakuan dan




dan kelompok kontrol (f) ............................................................ 74

Gambar 5.5 Hasil pengecatan imunositokimia perbesaran 400 kali untuk

ekspresi bax pada sel HepG2 setelah perlakuan dan




commit to user


xx

dan kelompok kontrol (f) .......................................................... 75

Gambar 5.6 Gambar sel HepG2 dengan perbesaran 400 kali, untuk uji

apoptosis setelah inkubasi 24 jam pada EEP konsentrasi ½

IC50 (a), IC50 (b), 2IC50 (c), kelompok dengan Sorafenib

(d), kelompok IC50 EEP + Sorafenib (e) dan kelompok

kontrol (f) .................................................................................. 77

Gambar 5.7. Hasil flowcytometry sel HepG2 setelah perlakuan dan

inkubasi selama 24 jam pada kelompok kontrol (a),

kelompok dengan pemberian EEP konsentrasi ½ IC50(b),

IC50(c) dan 2 IC50(d) serta kelompok dengan pemberian

Sorafenib konsentrasi IC50 (e) dan pemberian IC50 EEP +

Sorafenib (f) ..............................................................................79

Gambar 5.8. Perbandingan Nilai Rata-rata Ekspresi Protein p21 antar

Kelompok Sampel .....................................................................84

Gambar 5.9 Perbandingan Nilai Rata-rata Ekspresi Protein bcl21 antar

Kelompok Sampel ....................................................................87

Gambar 5.10 Perbandingan Nilai Rata-rata Ekspresi Protein bax antar

Kelompok Sampel .....................................................................88

Gambar 5.11 Perbandingan nilai rata – rata proliferasi 24 jam

antarkelompok sampel ........................................................... 91

Gambar 5.12 Perbandingan nilai rata –rata proliferasi 48 jam antarkelompok

sampel .................................................................................... 93

Gambar 5.13 Perbandingan nilai rata –rata proliferasi 72 jam antarkelompok

commit to user


xxi

sampel .......................................................................................94

Gambar 5.14 Perbandingan nilai rata-rata Apoptosis antar Kelompok

Sampel .......................................................................................96

commit to user


xxii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1. Senyawa utama propolis...................................................................30

Tabel 4.1 Jadwal Penelitian ..............................................................................43

Tabel 5.1. Nilai rata-rata persentase viabilitas sel HepG2 dan nilai IC50

bahan uji dengan metode MTT assay...............................................69

Tabel 5.2 Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel Ekspresi Protein p21…….83

Tabel 5.3. Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel Ekspresi

Protein bcl2 ......................................................................................85

Tabel 5.4 Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel Ekspresi

Protein bax .......................................................................................87

Tabel 5.5 Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel proliferasi ...........................89

Tabel 5.6 Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel apoptosis ............................95

Tabel 5.7 Hasil Pengujian ANOVA Variabel ekpresi protein p21 menurut

Kelompok Sampel...............................................................................98

Tabel 5.8 Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Ekspresi Protein p21 antar

Kelompok Sampel…………………………………………………..99

Tabel 5.9 Hasil Pengujian (ANOVA) Variabel Ekspresi Protein bcl2 menurut

Kelompok Sampel…….....................................................................104

Tabel 5.10 Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Ekspresi Protein Bcl2 antar

Kelompok

Sampel……………………………………………………………...106

Tabel 5.11Hasil Pengujian (ANOVA) Variabel Ekspresi Protein Bax menurut

Kelompok Sampel.............................................................................112

Tabel 5.12 Hasil Pengujian ANOVA Variabel Proliferasi-24 Menurut Kelompok

commit to user


xxiii

Sampel……………...........................................................................117

Tabel 5.13.Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Proliferasi-24 antar Kelompok

Sampel ……………………………………………………………..118

Tabel 5.14.Hasil Pengujian ANOVA Variabel Proliferasi-48 menurut Kelompok

Sampel……………………………………………………………...125

Tabel 5.15.Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Proliferasi-48 antar Kelompok

Sampel……………………………………………………………...128

Tabel 5.16. Hasil Pengujian ANOVA Variabel Proliferasi-72 menurut Kelompok

Sampel……………………………………………………………...133

Tabel 5.17. Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Proliferasi-72 antar Kelompok

Sampel……………………………………………………………...134

Tabel 5.18.Hasil Pengujian (ANOVA) Variabel Apoptosis menurut Kelompok

Sampel……………………………………………………………...141

Tabel 5.19.Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Apoptosis antar Kelompok

Sampel……………………………………………………………...142

commit to user


xxiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Ethical clearance ................................................................... 132

Lampiran 2. Sertifikat kursus kultur jaringan ........................................... 133

Lampiran 3. Absorbansi sel HepG2 setelah pemberian bahan uji ......... 134

Lampiran 4. Persentase viabilitas sel HepG2 setelah pemberian bahan uji .... 135

Lampiran 5. Analisis regresi linear untuk menentukan IC50 EEP .......... 135

Lampiran 6. Analisis statistik untuk memastikan kemaknaan

perbedaan ekspresi p21,bcl2, bax pada sel Hep G2

pada keenam kelompok ....................................................... 137

commit to user


25

commit to user


ix

DAFTAR SINGKATAN

WHO : World Health Organization

NFkB : Nuclear factor kappa B

Bcl :B-cell lymphoma

DNA : Deoksiribonukleat Acid

RB : Retinoblastoma

CDK : Cyclin dependent kinase

CIN : Cromosomal Instability

MIN : Microsatellite Instability

MMR : Missmatch repair

APC : Antigen Presenting Cell

VEGF : Vascular Endothel Growth Factor

EGFR : Endotheal Growth Factor Receptor

COX2 : Cyclooxygenase-2

pGP : P-glikoprotein

TNFR : Necrosis Factor Receptor

TRADD : TNF receptor-associated death domain

FADD : Fas-associated death domain

DISC : Death-inducing singnalling complex

PS : phosphatidyl serine

CAPE : Caffeic Acid Phenethyl Ester

EEP : Ekstrak etanol propolis

commit to user


x

NFAT : Nuclear factor of activated cells

AP-1 : Activator protein-1

Klp : Kelompok

Documents

PENGARUH EKSTRAK ETHANOL PROPOLIS TERHADAP …...protein antiapoptosis. P21 merupakan suatu tumor suppresor protein memiliki fungsi utama dalam regulasi terhadap progresi siklus sel