BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak dengan cara

mengoksidasi zat-zat hara yang ada di lingkungan untuk menghasilkan energi dan

senyawa awal untuk sintesis komponen-komponen sel. Penggunaan zat hara

dipengaruhi oleh aktivitas metabolisme mikroorganisme dalam memecah molekul

kompleks, seperti karbohidrat, protein, lemak, dan asam nukleat menjadi

komponen yang lebih sederhana sehingga dapat diangkut sel ke sitoplasma

sebagai sumber energi dan senyawa awal.

Proses pemecahan karbohidrat dan asam amino secara anaerobik disebut

dengan fermentasi sedangkan proses penguraian makromolekul menjadi molekul

yang lebih sederhana dengan penambahan air disebut juga dengan hidrolisis.

Mikroorganisme dapat menghasilkan enzim yang dapat mengkatalis reaksi

hidrolisis.

Mikroorganisme amilolitik dapat memproduksi enzim amilase untuk

memecah pati menjadi gula yang lebih sederhana yang dapat dipecah lagi menjadi

asam, gas, alkohol, dan energi. Mikroorganisme proteolitik dapat menghidrolisis

protein dan menghasilkan peptida serta asam amino. Mikroorganisme lipolitik

dapat memecah lemak menjadi asam lemak dan gliserol, sedangkan

mikroorganisme pektolitik dapat memecah pektin dan menyebabkan hilangnya

kemampuan membentuk gel. Mikroorganisme di lingkungan aerob juga dapat

menghasilkan enzim katalase untuk menguraikan hidrogen peroksida (H2O2)

menjadi air dan O2. H2O2 bersifat toksik terhadap sel karena dapat menginaktivasi

enzim yang ada di dalam sel.

Pewarnaan Gram dapat digunakan untuk membedakan antara bakteri Gram

positif dan bakteri Gram negatif. Adanya perbedaan pada tahap pewarnaan Gram

disebabkan oleh perbedaan struktur dinding sel yang dimiliki bakteri Gram positif

dan bakteri Gram negatif. Komponen utama bakteri Gram positif adalah

1

peptidoglikan sedangkan sebagian besar dinding sel bakteri Gram negatif tersusun

dari lipid.

1.2 Tujuan

Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari sifat-sifat pemecahan komponen

kimia di dalam makanan oleh mikroorganisme, seperti bakteri, kapang, dan

khamir, menguji dan membedakan reaksi pemecahan karbohidrat, protein, dan

lemak oleh kultur jasad renik murni dan mikroorganisme yang ada di makanan,

mengetahui adanya enzim katalase pada mikroorganisme melalui uji katalase, dan

dapat mengamati bentuk dan ciri-ciri dari bakteri melalui pewarnaan Gram.

2

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Menurut Lay (1994), mikroorganisme dapat tumbuh, berkembang biak, dan

membentuk sel baru dengan menggunakan zat hara yang ada di lingkungannya,

yaitu molekul sederhana, seperti H2S dan NH4+ atau molekul organik kompleks,

seperti polisakarida dan protein. Zat-zat hara ini akan dioksidasikan oleh

mikroorganisme untuk mendapatkan energi dan senyawa awal agar dapat

melakukan sintesis dinding sel, membran sel, dan flagela.

Penggunaan zat hara ditentukan dari aktivitas metabolisme mikroorganisme.

Metabolisme dapat memberikan hasil sampingan yang dapat dipakai untuk

mengidentifikasi mikroorganisme. Salah satu jalur metabolisme adalah fermentasi

yang pemindahan elektronnya berlangsung di antara senyawa-senyawa organik

(Volk dan Wheeler, 1993).

2.1 Fermentasi

Menurut Fardiaz (1992), fermentasi adalah proses pemecahan komponen

karbohidrat dan asam amino oleh enzim mikroorganisme secara anaerobik untuk

menghasilkan energi. Proses ini tidak memerlukan adanya oksigen dan pada saat

fermentasi berlangsung, senyawa organik berperan sebagai penerima elektron

terakhir sehingga hasil fermentasinya lebih stabil. Pada proses fermentasi, hanya

sebagian bahan baku energi yang dipecah sehingga hanya dihasilkan sejumlah

kecil energi, CO2, air, dan beberapa produk akhir, seperti asam laktat, asam asetat,

etanol, serta asam organik volatil lainnya (Buckle et al., 1987). Karbohidrat

merupakan senyawa utama yang dipecah dalam proses fermentasi sedangkan

asam amino hanya dapat dipecah oleh beberapa jenis bakteri tertentu (Fardiaz,

1992).

2.1.1 Fermentasi Karbohidrat

Karbohidrat merupakan komponen utama yang dipecah di dalam proses

fermentasi. Pertama, polisakarida akan dipecah menjadi gula-gula sederhana

3

sebelum dilakukan fermentasi, contohnya pati dipecah menjadi glukosa-glukosa.

Selanjutnya, glukosa dipecah lagi menjadi senyawa-senyawa lain yang lebih

sederhana tergantung pada jenis fermentasinya (Fardiaz, 1992).

Selain itu, hasil akhir produk fermentasi juga dipengaruhi dari sifat

mikroorganisme, media biakan yang dipakai, dan faktor-faktor lingkungan, seperti

pH dan suhu. Media yang digunakan harus mengandung senyawa-senyawa yang

dapat dengan mudah difermentasikan dan dioksidasikan oleh mikroorganisme.

Glukosa sendiri merupakan senyawa karbohidrat yang paling banyak dipakai oleh

mikroorganisme dalam proses fermentasi.

Kemampuan mikroorganisme untuk memfermentasikan berbagai macam

karbohidrat dan produk yang dihasilkan dari fermentasi merupakan ciri-ciri yang

dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme. Identifikasi ini

berkaitan erat dengan aktivitas metabolisme mikroorganisme dalam menggunakan

dan menguraikan senyawa kompleks, seperti pati, lemak, protein, dan asam

nukleat (Lay, 1994).

Minimal ada tujuh proses fermentasi glukosa yang berbeda-beda pada bakteri.

Masing-masing proses fermentasi sendiri akan membentuk produk akhir yang

berbeda dan spesifik untuk kelompok bakteri tertentu. Ada dua tahap fermentasi

glukosa, yaitu:

1. Rantai karbon dipecah dari glukosa dan dilepaskan dua pasang atom

hidrogen untuk memperoleh senyawa karbon yang akan lebih mudah

teroksidasi daripada glukosa.

2. Senyawa yang teroksidasi dapat direduksi kembali dengan menggunakan

atom hidrogen dari tahap pertama untuk membentuk produk fermentasi.

Reaksi oksidasi harus seimbang dengan reaksi reduksi yang berlangsung.

Asam piruvat akan selalu dihasilkan pada tahap pertama fermentasi glukosa

(Fardiaz, 1992). Ada empat jalur pemecahan glukosa menjadi asam piruvat, yaitu:

1. Jalur Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) atau glikolisis

Jalur EMP merupakan mekanisme yang paling umum digunakan

bakteri, fungi, hewan, dan manusia untuk mengubah glukosa menjadi

asam piruvat (Volk dan Wheeler, 1993). Tahap pertama adalah tahap

pembentukan fruktosa difosfat. Tahap selanjutnya, fruktosa difosfat

4

dipecah menjadi dua molekul gliseraldehida fosfat yang dikatalis oleh

enzim aldolase, lalu diteruskan dengan reaksi dehidrogenasi gliseraldehida

fosfat yang juga termasuk reaksi oksidasi yang memproduksi ATP dan

dikatalis oleh enzim gliseraldehida fosfat dehidrogenase.

NAD (Nikotinamida Adenin Dinukleotida) akan menangkap atom

hidrogen yang dilepas untuk membentuk NADH2. Jika NADH2 dioksidasi

kembali pada tahap kedua fermentasi sehingga atom hidrogen dapat

dilepas kembali, maka proses fermentasi dapat berlangsung terus. Pada

proses fermentasi, NAD berperan sebagai pembawa hidrogen.

Energi yang dihasilkan pada tahap oksidasi gliseraldehida fosfat akan

membentuk dua ATP. Satu molekul glukosa dapat membentuk dua

molekul gliseraldehida fosfat sehingga seluruhnya dihasilkan empat ATP.

Namun, karena dua ATP digunakan untuk mengubah glukosa menjadi

fruktosa difosfat sehingga hanya tinggal dua ATP yang dipakai untuk

pertumbuhan tiap molekul glukosa (Fardiaz, 1992). Reaksinya:

Glukosa + 2(ADP + 2NAD+ → 2 piruvat + 2 ATP +

+ Pi) 2 (NADH + H+)

2. Jalur Entner Doudoroff (ED)

Pada jalur ED, akan dihasilkan senyawa antara unik, yaitu 2-keto-3-

deoksi-6-fosfoglukonat (KDFG). Senyawa ini kemudian dipecah menjadi

dua triosa, yaitu piruvat dan gliseraldehida-3-fosfat oleh enzim aldolase.

Selanjutnya, kedua triosa ini memasuki jalur EMP untuk menghasilkan

molekul piruvat kedua dengan cara melepas dua mol ATP, satu mol

NADH, dan H+ (Fardiaz, 1992). Reaksinya:

Glukosa + NADP+ + NAD+ + → 2 piruvat + NADP + H+ +

(ADP+Pi) NADH + H+ + ATP

3. Jalur Heksosamonofosfat (HMF)

Jalur yang dapat ditemui pada berbagai macam organisme ini berperan

penting di dalam metabolisme mikroorganisme agar dapat membentuk

pentosa yang dibutuhkan untuk melakukan sintesis asam nukleat, asam

amino aromatik, vitamin, dan sumber NADP+H+ untuk reaksi biosintesis.

Jalur HMF disebut juga dengan siklus pentosa karena energi tidak

5

diperoleh secara langsung, tetapi NADP + H+ yang dihasilkan ketika

dimasukkan ke dalam sistem transpor elektron akan menjadi sumber

energi potensial. Enzim yang digunakan di dalam jalur ini adalah

transaldolase dan transketolase (Fardiaz, 1992). Reaksinya:

Glukosa + 12 NADP+ + ATP → 6 CO2 + 12 (NADPH + H+) + ADP + Pi

4. Jalur Fosfoketolase (FK)

Jalur ini hanya dapat ditemui pada kelompok bakteri laktobasili

heterofermentatif. Jalur FK merupakan cabang dari jalur HMF karena

bakteri jenis ini tidak memiliki enzim aldolase yang digunakan untuk

memecah fruktosa 1,6-difosfat menjadi dua triosa-fosfat dan juga tidak

memiliki enzim transaldolase dan transketolase yang berperan penting di

dalam jalur HMF. Ketika asetil-fosfat diubah menjadi asetat, maka akan

dihasilkan 2 ATP yang memiliki ikatan energi tinggi. Reaksinya:

Glukosa + NAD+ + 2 NADP+ + → piruvat + asetat + CO2 + NADH

2 ADP + P + H + + 2 NADPH + H+ + 2 ATP

Namun jika asetil-fosfat diubah menjadi etanol, maka ikatan energinya

akan hilang sehingga hanya dihasilkan satu mol ATP per mol glukosa

(Fardiaz, 1992). Reaksinya:

Glukosa + NAD+ + ADP + Pi → piruvat + asetat + CO2 +

NADH + H + + ATP

Pada tahap kedua fermentasi, asam piruvat dipecah menjadi hasil produk akhir

yang spesifik untuk digunakan dalam berbagai proses fermentasi dengan memakai

atom hidrogen yang dihasilkan dari tahap pertama fermentasi. Produk akhir ini

dihasilkan dari reaksi yang dikatalis oleh enzim-enzim tertentu. Contohnya,

glukosa yang difermentasi oleh khamir melalui jalur EMP sehingga menghasilkan

alkohol dan CO2.

Glukosa dapat difermentasi menjadi alkohol maupun asam laktat. Pada

fermentasi alkohol, terjadi regenerasi NAD+ sehingga enzim mengubah piruvat

menjadi asetaldehida yang berperan sebagai penerima hidrogen dan CO2. NADH

kemudian membawa elektron dan ion H+ ke dua molekul asetaldehida sehingga

dihasilkan produk akhir berupa alkohol (Fardiaz, 1992). Reaksinya:

6

Glukosa → 2 Etanol + 2 CO2

Sedangkan pada fermentasi asam laktat, terjadi regenerasi NAD+. Dua NADH

membawa elektron dan ion H+ ke 2 molekul piruvat yang berperan sebagai

penerima hidrogen sehingga dihasilkan asam laktat sebagai produk akhirnya.

Reaksinya:

Glukosa → 2 Asam laktat

Fermentasi di atas disebut juga dengan fermentasi homolaktat karena hanya

dihasilkan asam laktat sebagai satu-satunya hasil fermentasi. Bakteri yang

melakukan fermentasi ini disebut bakteri asam laktat homofermentatif, contohnya

Streptococcus, Pediococcus. Ada juga bakteri asam laktat heterofermentatif yang

tidak hanya membentuk asam laktat, tapi juga senyawa-senyawa lainnya, seperti

etanol, asam asetat, dan CO2. Contoh bakteri ini adalah Leuconostoc,

Lactobacillus (Fardiaz, 1992). Reaksinya:

Glukosa → Asam laktat + etanol/asam asetat + CO2

Untuk menguji adanya proses fermentasi, dapat dilihat dari pembentukan

asam dan gas. Adanya gas dapat dilihat dengan menggunakan tabung durham atau

tabung smith. Tabung smith dipakai jika harus menentukan jumlah dan jenis gas

sedangkan tabung durham dipakai jika jenis dan jumlah gas tidak perlu diketahui.

Bila ada gas, maka gas tersebut akan masuk ke dalam tabung dan tampak sebagai

gelembung udara yang terperangkap di dalam tabung sehingga mendorong cairan

yang ada di tabung durham.

Media yang digunakan mengandung karbohidrat berupa glukosa, manitol,

laktosa, sukrosa, atau maltosa serta ekstrak sapi dan pepton sebagai sumber

nitrogen, mineral, dan vitamin. Asam yang terbentuk dapat diketahui dengan

menambahkan indikator ke dalam media yang digunakan. Jika pada proses

fermentasi bakteri ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa, maka

akan terbentuk asam sebagai produk fermentasi yang ditandai dengan perubahan

warna menjadi kuning yang dapat dilihat pada gambar 2.1. Asam ini akan

menurunkan pH media. Indikator yang umumnya dipakai adalah merah fenol

yang berwarna merah atau BCP(Brom Crescol Purple) yang berwarna ungu pada

pH>7 (Lay, 1994).

7

Gambar 2.1 Hasil fermentasi karbohidratSumber : Johnson (1998)

2.1.2 Fermentasi Asam Amino

Asam amino hanya dapat difermentasi oleh beberapa bakteri tertentu,

terutama Clostridia. Protein awalnya akan dipecah menjadi asam amino,

selanjutnya asam amino difermentasi menjadi senyawa lain berupa asam. Asam

amino yang dihasilkan dapat sepasang ataupun satu asam amino saja. Pada

fermentasi sepasang asam amino, satu asam amino akan menjadi oksidan

sedangkan satunya lagi akan menjadi reduktan (Fardiaz, 1992). Jalur fermentasi

sendiri dapat dilihat pada gambar 2.2. Reaksi fermentasi asam amino:

3 Alanin + 2 H2O → 2 asam propionat + asam asetat + CO2 + 3 NH3

Gambar 2.2 Jalur fermentasiSumber : Madigan (1997)

8

Bakteri-bakteri yang biasanya berperan dalam proses fermentasi adalah

bakteri asam laktat, contohnya Streptococcus thermophilus yang berguna dalam

industri susu, Pediococcus cerevisiae berperan dalam fermentasi sayuran dan

daging, Leuconostoc mesentroides dipakai dalam fermentasi sayuran, dan

Lactobacillus lactis penting dalam industri susu dan sayuran; bakteri asam asetat,

contohnya Acetobacter aceti yang dipakai dalam industri cuka; khamir, contohnya

Saccharomyces cerevisiae dalam industri bir, anggur, roti; kapang, contohnya

Aspergillus oryzae untuk membuat minuman beralkohol dan Aspergillus wentii

digunakan dalam fermentasi kecap, tauco, sake (Buckle et al., 1987).

2.2 Jenis Bakteri Berdasarkan Sifat Pertumbuhannya pada Makanan

2.2.1 Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat bergram positif, berbentuk batang atau bulat, dan dapat

memfermentasikan gula menjadi asam laktat yang sering digunakan dalam proses

fermentasi sayur-sayuran (pikel, sauerkraut), fermentasi susu (yogurt, keju, susu

asam), dan fermentasi ikan. Bakteri asam laktat menghasilkan asam secara cepat

sehingga dapat menurunkan pH lingkungan dan mencegah pertumbuhan

mikroorganisme lain yang tidak diinginkan. Contoh bakteri asam laktat adalah

beberapa Lactobacillus, Streptococcus, dan Pediococcus yang bersifat

homofermentatif serta Leuconostoc dan beberapa Lactobacillus yang bersifat

heterofermentatif (Fardiaz, 1992).

2.2.2 Bakteri Asam Asetat

Bakteri asam asetat berbentuk batang, bergram negatif, contohnya

Gluconobacter dan Acetobacter yang dapat mengoksidasi alkohol menjadi asam

asetat. Asam asetat dapat dioksidasi lebih lanjut menjadi CO2 oleh bakteri

Acetobacter. Spesies yang sering dipakai dalam industri cuka adalah A. Aceti dan

G. Suboxydans (Fardiaz, 1992).

2.2.3 Bakteri Proteolitik

Bakteri ini akan menghasilkan enzim proteinase ekstraseluler yang merupakan

enzim pemecah protein yang dibentuk di dalam sel dan dikeluarkan dari sel

setelah enzim selesai bekerja. Enzim proteinase terdapat pada semua bakteri,

9

tetapi tidak semua bakteri memiliki enzim proteinase ekstraseluler. Ada tiga

macam bakteri proteolitik, yaitu:

a. Bakteri aerobik atau anaerobik fakultatif yang tidak membentuk spora,

contohnya Proteus dan Pseudomonas.

b. Bakteri aerobik dan anerobik fakultatif pembentuk spora, contohnya

Bacillus.

c. Bakteri anaerobik pembentuk spora, contohnya beberapa Clostridium.

Ada bakteri yang bersifat proteolitik asam yang dapat menghidrolisis protein

dan memfermentasi asam, contohnya Streptococcus faecalis dan ada juga bakteri

yang bersifat putrefaktif yang memecah protein secara anaerobik dan

menghasilkan senyawa berbau busuk, contohnya Pseudomonas (Fardiaz, 1992).

2.2.4 Bakteri Lipolitik

Bakteri ini menghasilkan enzim lipase yang berfungsi sebagai katalis reaksi

hidrolisis lemak menjadi asam-asam lemak dan gliserol. Produk akhir dari

hidrolisis lemak dapat dioksidasi lagi menjadi energi di dalam kondisi aerob.

Kebanyakan bakteri aerobik dan proteolitik aktif juga merupakan bakteri lipolitik.

Contoh bakteri lipolitik adalah Pseudomonas, Alcaligenes, Serratia, dan

Micrococcus (Fardiaz, 1992).

2.2.5 Bakteri Sakarolitik

Bakteri ini memecah disakarida dan polisakarida menjadi gula-gula

sederhana. Hanya sedikit bakteri amilolitik yang dapat menghasilkan enzim

amilase dan menghidrolisis pati di luar sel, contohnya Bacillus subtilis dan

Clostridium butyricum. Ada juga bakteri yang dapat memecah selulosa (Fardiaz,

1992).

2.2.6 Bakteri Pektolitik

Pektin merupakan karbohidrat kompleks yang dapat ditemui pada buah dan

sayuran. Pektinase (campuran enzim pektolitik) dapat digunakan untuk memecah

pektin dan mengakibatkan busuk lunak atau busuk air pada buah dan sayur serta

hilangnya kemampuan memproduksi gel pada sari buah. Contoh bakteri pektolitik

adalah Erwinia, Bacillus, dan Clostridium (Fardiaz, 1992).

2.2.7 Bakteri Osmofilik

10

Bakteri osmofilik atau sakarofilik dapat ditemui pada media yang memiliki

kandungan gula tinggi, namun sebenarnya bakteri osmofilik hanya bersifat

osmotoleran sehingga masih dapat tumbuh dengan atau tanpa kandungan gula

yang tinggi, contohnya Leuconostoc (Fardiaz, 1992).

2.3 Produk-Produk Pangan Hasil Fermentasi

Produk pangan adalah media yang baik bagi pertumbuhan mikroorganisme.

Fermentasi sendiri merupakan perubahan kimiawi yang terjadi pada bahan pangan

yang disebabkan oleh enzim. Sifat produk pangan hasil fermentasi sangat

dipengaruhi oleh mutu dan sifat asli produk pangan itu sendiri. Fermentasi dari

mikroorganisme yang diinginkan akan memberikan bentuk, rasa, dan tekstur yang

bagus.

2.3.1 Sayuran

Bakteri asam laktat dapat memfermentasi hampir semua jenis sayuran dan

buah-buahan yang menyerupai sayuran, seperti tomat, mentimum, dan olive.

Sayuran dan buah mengandung gula yang tinggi dan bergizi untuk pertumbuhan

bakteri asam laktat. Faktor-faktor lingkungan yang akan mempengaruhi proses

fermentasi sayuran adalah:

a. Kondiri anaerobik.

b. Kadar garam yang dapat digunakan untuk menyerap cairan dan zat-zat gizi

dari produk.

c. Suhu yang sesuai untuk proses fermentasi.

d. Tersedianya bakteri asam laktat yang diperlukan.

Pada fermentasi sayuran akan terjadi perubahan-perubahan kompleks yang

ditimbulkan dari pertumbuhan serangkaian bakteri asam laktat, contohnya

fermentasi ini akan dimulai oleh Leuconostoc mesenteroides dan dilanjutkan oleh

Lactobacillus (Buckle et al., 1987).

2.3.2 Sauerkraut (Sayur Asin)

Sauerkraut merupakan kobis asam. Kobis dibersihkan, dicuci, dan diiris kecil-

kecil selebar 1 m, lalu irisan kubis dimasukkan ke dalam tangki dan ditambahkan

garam untuk menyerap cairan dari irisan kobis, kemudian diaduk serata mungkin.

Selanjutnya, tangki ditutup dengan plastik dan air dimasukkan ke dalam plastik

11

sebagai pemberat dan penutup sehingga irisan kobis akan terendam. Tidak

tercelupnya kobis di dalam larutan garam akan menyebabkan pertumbuhan

khamir dan kapang sehingga mengakibatkan rasa yang tidak dikehendaki.

Garam menarik air dan zat gizi dari jaringan sayuran sehingga zat gizi tersebut

akan melengkapi substrat yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri asam laktat.

Garam dan asam yang diproduksi dari fermentasi dapat mencegah pertumbuhan

mikroorganisme yang tidak dikehendaki dan memperlambat pelunakan jaringan

kobis. Kandungan garamnya harus cukup agar dapat menumbuhkan bakteri asam

laktat dan dapat menghasilkan kraut yang seimbang dengan garamnya.

Fermentasi dimulai oleh bakteri Leuconostoc mesenteroides dan dilanjutkan

oleh Lactobacillus sp. yang lebih tahan terhadap asam. Suhu berpengaruh besar

terhadap kecepatan fermentasi, mutu produk pangan, dan perkembangan jenis

mikroorganisme. Suhu antara 25-300C adalah suhu optimal untuk fermentasi dan

mutu produk pangan yang sempurna dan dapat terjadi dalam waktu 2-3 minggu.

Suhu di atas 300C akan memungkinkan pertumbuhan bakteri homofermentatif dan

menghasilkan produk yang terlalu asam serta flavornya kurang sedangkan suhu di

bawah 250C akan meningkatkan keseluruhan waktu yang diperlukan untuk

fermentasi dan dapat mencapai waktu satu tahun (Buckle et al., 1987).

2.3.3 Miso (Air Tajin)

Miso merupakan hasil fermentasi beras atau kedelai. Bahan ini digunakan

untuk membuat sup dan memberi tambahan rasa pada produk pangan. Tahap

pertama fermentasi aeobik dilakukan oleh Aspergillus oryzae dan tahap fermentasi

kedua oleh Saccharomyces rouxii secara anaerobik.

Untuk membuat miso, pertama beras dicuci, direndam, dan direbus, kemudian

diinokulasi dengan Aspergillus oryzae sehingga terjadi proses fermentasi pada

suhu 400C. Beras harus dalam kondisi basah untuk pertumbuhan kapang, namun

harus cukup kering untuk menghambat pertumbuhan bakteri lainnya.

Pertumbuhan miselia kapang harus dihentikan sebelum terjadi pembentukan

spora. Beras yang telah berkapang disebut juga dengan koji yang merupakan

kultur stater untuk fermentasi.

Selanjutnya, kedelai dicuci, direndam, dan direbus, kemudian didinginkan.

Bahan ini dihancurkan bersama garam dengan perbandingan 4 bagian koji, 10

12

bagian kedelai, 2 bagian garam, dan 1 bagian miso lama serta air. Campuran ini

difermentasi pada suhu 280C selama seminggu secara aerobik, lalu dimasukkan ke

dalam tong untuk memulai fermentasi kedua pada kondisi anaerobik. Fermentasi

kedua akan menggunakan khamir pada suhu 350C selama 2 bulan. Setelah itu,

campuran dimatangkan pada suhu kamar untuk beberapa minggu. Produk akhir

kemudian dihaluskan menjadi adonan atau tepung basah untuk dipakai pada

campuran bahan pangan lainnya. Pada fermentasi ini, akan ikut berperan bakteri-

bakteri asam laktat (Buckle et al., 1987).

2.3.4 Air Rendaman Tahu

Dalam fermentasi tahu, pertama kacang kedelai direndam di dalam air dan

didedak hingga menjadi suatu campuran. Campuran ini kemudian disaring dan

diambil filtratnya, yaitu susu kedelai. Selanjutnya, susu kedelai diberi garam,

seperti magnesium klorida atau kalsium sulfat agar dapat menggumpal. Setelah

cukup lunak, gumpalan ini di-press menjadi potongan tahu. Bakteri yang

umumnya berperan dalam fermentasi tahu adalah Bacillus cereus (Ewald, 1997).

2.4 Pemecahan Makanan oleh Mikroorganisme

Mikroorganisme menggunakan zat-zat hara untuk dapat melakukan sintesis

sel dan memperoleh energi (Fardiaz, 1992). Zat-zat hara ini biasanya berupa

molekul besar, seperti karbohidrat, protein, lemak, dan asam nukleat (Lay, 1994).

Karbohidrat dan protein merupakan sumber energi untuk dapat menghasilkan

ATP sedangkan asam amino dari protein, purin dan pirimidian dari asam nukleat,

vitamin, serta mineral sebagai faktor-faktor pertumbuhan. Zat-zat lainnya yang

diperlukan mikroorganisme adalah unsur-unsur makro, seperti C, O, N, H, P, dan

S serta unsur-unsur mikro, yaitu Ca, K, Mg, Fe, Mn, Cl, Cu (Fardiaz, 1992).

Agar dapat digunakan oleh sel, maka makromolekul harus dihidrolisis terlebih

dahulu. Hidrolisis sendiri merupakan proses penguraian molekul dengan

menambahkan air. Mikroorganisme dapat menghasilkan enzim (eksoenzim) yang

dapat mengkatalis pemecahan makanan menjadi molekul-molekul sederhana.

Molekul kecil ini akan dibawa ke sitoplasma untuk dipakai sebagai sumber energi

dan senyawa awal dalam sintesis sel (Lay, 1994).

13

Umumnya makanan mengandung karbohidrat mulai dari monosakarida

sampai polisakarida, tetapi tidak semua mikroorganisme dapat menghidrolisis

karbohidrat, terutama pati. Hanya mikroorganisme yang bersifat amilolitik saja

yang dapat memecah pati sedangkan monosakarida dan disakarida dapat dengan

mudah dipecah oleh mikroorganisme.

Pada buah-buahan yang banyak mengandung monosakarida, sering terjadi

fermentasi spontan yang menghasilkan asam dan gas sedangkan pada susu yang

banyak mengandung disakarida (laktosa), sering terjadi fermentasi asam laktat.

Asam yang dihasilkan mikroorganisme sering ditemui pada makanan yang banyak

mengandung karbohidrat, namun kapang dan khamir biasanya tidak menghasilkan

asam.

Perubahan biokimia juga terjadi pada makanan yang banyak mengandung

protein, namun karena molekul protein lebih kompleks daripada karbohidrat

sehingga hanya mikroorganisme yang memiliki sistem enzim yang kompleks saja

yang dapat memecah protein, yaitu mikroorganisme proteolitik. Protein akan

dipecah menjadi asam amino yang dapat dipakai sebagai sumber energi sel. Selain

asam amino, pemecahan protein juga akan menghasilkan gas, asam, dan produk-

produk akhir lainnya yang tidak diinginkan, seperti bau busuk.

Makanan juga banyak mengandung lemak yang bermacam-macam

komposisinya. Komponen penyusun lemak adalah asam-asam lemak dan gliserol.

Asam-asam lemak berantai pendek lebih mudah dipecah dibandingkan asam-asam

lemak berantai panjang. Asam lemak berantai pendek dapat ditemui pada lemak

hewani sedangkan asam lemak berantai panjang banyak terdapat pada minyak

nabati. Lemak lebih sulit dipecah daripada karbohidrat dan protein. Pemecahan

lemak kadang-kadang merugikan karena menyebabkan bau tengik dan tidak

dikehendaki pada pematangan keju (Fardiaz, 1992).

2.4.1 Pemecahan Karbohidrat

Karbohidrat terdiri dari atom-atom C, H, dan O. Karbohidrat dapat dibagi

menjadi lima macam, yaitu monosakarida (glukosa, fruktosa, galaktosa) yang

tersusun dari aldehid dan keton dari alkohol polihidrat, disakarida yang tersusun

dari dua monosakarida (laktosa, maltosa, sukrosa, selobiase), trisakarida

14

(rafinose), oligosakarida (dekstrin, tetrasakarida), dan polisakarida (pati, glikogen,

selulosa).

Karena karbohidrat lebih mudah dipecah, maka makanan yang banyak

mengandung karbohidrat lebih mudah diserang oleh mikroorganisme. Karbohidrat

akan dipecah menjadi asam, gas, dan produk-produk lainnya. Pemecahan gula

bersifat spesifik untuk mikroorganisme tertentu, contohnya glukosa, laktosa, dan

sukrosa akan dipecah menjadi asam dan gas oleh bakteri Enterobacter aerogenes,

Staphylococcuc aureus akan memecah gula-gula tersebut menjadi asam,

sedangkan bakteri Alcaligenes faecalis tidak akan menghasilkan asam dan gas.

Pati dapat digunakan oleh bakteri tertentu untuk menghasilkan energi dan

komponen gum agar dapat melindungi sel dari pembentukan asam berlebih yang

dapat mengakibatkan pembusukkan makanan, contohnya kerusakan roti yang

disebut juga roti berlendir karena ketika pati dan protein pada roti dipecah,

terbentuk bau dan tekstur yang berbeda dari roti yang masih berkualitas bagus.

Asam laktat adalah asam yang paling banyak dihasilkan dalam proses

fermentasi makanan, contohnya fermentasi sayur asin dan susu. Konsentrasi asam

yang dihasilkan sangat tinggi sehingga dapat mencegah pertumbuhan

mikroorganisme yang memproduksinya maupun bakteri yang tahan asam.

Pertumbuhan bakteri akan terhambat apabila asam yang dihasilkan mencapai pH

3-4,3. Jenis mikroorganisme, kandungan gula, dan jenis makanan akan

mempengaruhi produksi asam yang dihasilkan.

Produk-produk yang dihasilkan dari pemecahan gula akan dipengaruhi oleh

jenis organisme. Enzim-enzim yang ada di sel mikroorganisme akan memecah

komponen karbohidrat kompleks menjadi lebih sederhana, yaitu:

Sukrosa −─invertase

→ glukosa + fruktosa

Maltosa −─maltase

→ glukosa + glukosa

Laktosa −─β-galaktosidase

→ glukosa + galaktosa

Karena pati merupakan karbohidrat kompleks yang sulit untuk dipecah, maka

pembentukan asam dari pati lebih lama dibandingkan pembentukan asam dari

karohidrat lainnya karena pati harus dipecah terlebih dahulu menjadi glukosa oleh

enzim amilase yang hanya dihasilkan mikroorganisme amilolitik (Fardiaz, 1992).

Enzim amilase terdiri dari β–amilase dan α–amilase yang memiliki kemampuan

15

menghidrolisis lebih kuat daripada β-amilase (Winarno, 1995). Aktivitas enzim

amilase akan mempengaruhi jumlah asam dan gula yang dihasilkan dari pati

(Fardiaz, 1992).

Yodium akan bereaksi secara kimiawi dengan pati dan masuk ke dalam

bagian pati yang kosong dan berbentuk spiral sehingga terbentuk warna biru-

kehitaman. Proses yodinisasi ini akan membentuk molekul yang dapat menyerap

semua cahaya, kecuali warna biru. Jika pati telah dipecah menjadi maltosa atau

glukosa, maka warna birunya akan hilang karena bentuk spiralnya sudah tidak

ada. Tidak terbentuknya warna pada saat larutan yodium ditambahkan ke dalam

media menunjukkan terjadinya hidrolisis pati.

Pada media yang mengandung pati, maka pati di sekitar pertumbuhan bakteri

akan dihidrolisis oleh enzim amilase yang dihasilkan bakteri. Jika zat pati

dihidrolisis, maka pada media agar yang diteteskan larutan yodium akan timbul

daerah transparan di sekitar pertumbuhan bakteri yang ditunjukkan pada gambar

2.3. Sebaliknya, jika pati tidak dihidrolisis, maka akan timbul warna biru-

kehitaman di sekitar pertumbuhan (Lay, 1994).

Media yang biasa digunakan pada uji hidrolisis karbohidrat adalah media

Starch Agar (SA) yang mengandung tripton, ekstrak khamir, K2HPO4, pati

terlarut, agar, dan air. Ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B kompleks, tripton

dipakai untuk menyediakan nitrogen, karbohidrat, dan garam mineral, air untuk

menyalurkan nutrient yang dibutuhkan mikroba, sedangkan pati berfungsi sebagai

komponen karbohidrat yang akan dihidrolisis pada uji ini (Fardiaz, 1992).

Gambar 2.3 Daerah transparan pada uji hidrolisis patiSumber : Rossbach (2004)

2.4.2 Pemecahan Protein

Komponen utama protein adalah asam amino yang terdiri dari unsur C, O, N,

dan H. Ada tiga macam protein yaitu protein sederhana (albumin, globulin,

16

gultelin, prolamin, dan albuminioid), protein terkonjugasi (glikoprotein,

fosfoprotein, nukleoprotein), dan turunan protein (protein terkoagulasi,

metaprotein, pepton, peptide). Contoh-contoh makanan yang mengandung protein

adalah telur, daging, susu, serelia, dan kacang-kacangan.

Pemecahan protein lebih kompleks dibandingkan pemecahan karbohidrat.

Produk akhir yang dihasilkan juga lebih bervariasi karena protein memiliki

struktur yang lebih kompleks. Oleh karena itu, hanya mikroorganisme yang

memiliki sistem enzim yang kompleks saja yang dapat mendekomposisi protein

menjadi senyawa-senyawa sederhana, yaitu:

Protein → proteosa → pepton → polipeptida →

peptida → asam amino → NH3 dan N

Produk akhir dan senyawa antara yang terbentuk sangat bervariasi.

Pemecahan protein juga akan menghasilkan alkohol, beberapa gas, seperti CO2,

hidrogen, metana, amonia, dan komponen-komponen yang berbau busuk, seperti

indol, skatol, hidrogen sulfida, kadaverin.

Dekomposisi protein oleh mikroorganisme disebut juga dengan proses

putrefaksi (Fardiaz, 1992) yang menggunakan enzim protease untuk

menghidrolisis ikatan peptida di protein dan melepas asam amino (Volk dan

Wheeler, 1993). Selain terjadi pemecahan asam amino, pada proses ini juga akan

dihasilkan komponen-komponen sederhana yang berbau busuk, contohnya

Clostridium memecah protein menjadi senyawa-senyawa sulfur berbau busuk

secara anaerobik. Pemecahan protein secara anaerobik menghasilkan produk akhir

yang lebih stabil sehingga berbau busuk dan menyengat. Sebaliknya, pemecahan

protein yang terdiri dari asam-asam amino sulfur secara aerobik tidak akan

menyebabkan bau busuk karena produk akhirnya lebih stabil dan dioksidasi secara

sempurna.

Walaupun dekomposisi protein sering mengakibatkan bau busuk, namun

pemecahan protein tetap merupakan tahap yang penting dan dikehendaki dalam

beberapa proses pengolahan pangan, terutama pengembangan daging dan

pengolahan keju. Di dalam proses tersebut, akan terjadi hidrolisis atau denaturasi

protein agar dapat mengempukkan protein daging dan mengumpulkan protein

susu (Fardiaz, 1992).

17

Pada hidrolisis protein, jika susu yang mengandung kasein dicampur dengan

media, maka akan timbul warna keruh pada media akibat reaksi kasein dengan ion

Ca2+ sehingga membentuk Ca-kasein. Kompleks Ca-kasein tidak dapat larut di

dalam media sehingga kompleks ini akan membentuk larutan koloidal yang

menyebabkan media menjadi keruh.

Jika mikroorganisme memproduksi enzim kaseinase yang dapat

menghidrolisis kasein, maka daerah di sekitar koloni bakteri akan berwarna jernih

yang dapat dilihat pada gambar 2.4. Kejernihan ini akibat penguraian molekul

kasein menjadi asam amino yang larut di dalam media sehingga kekeruhan di

sekitar koloni bakteri menjadi hilang. Enzim yang digunakan untuk

menghidrolisis protein disebut juga enzim proteinase (Lay, 1994).

Media untuk uji hidrolisis protein adalah media SMA (Skim Milk Agar) yang

tersusun dari tripton, dekstrosa, ekstrak khamir, agar, air destilata, dan 20% susu

skim bubuk. Biasanya media ini dapat bekerja pada pH netral, yaitu pH 7. Tripton

sebagai sumber sumber N dan mineral, ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B

kompleks, dekstrosa sebagai sumber energi, sedangkan susu skim bubuk

mengandung kasein yang akan dipecah pada uji hidrolisis ini (Fardiaz, 1992).

Gambar 2.4 Areal bening pada uji hidrolisis proteinSumber : Tugmon (2003)

2.4.3 Pemecahan Lemak

Lemak yang terdiri dari asam-asam lemak dan gliserol merupakan komponen

pangan yang sering ditemui pada tanaman dan hewan. Jenis asam-asam lemaknya

akan mempengaruhi sifat lemak. Asam lemak yang terdiri dari ikatan rangkap dan

tidak memiliki jumlah atom H maksimum disebut asam lemak tidak jenuh yang

mudah dipecah oleh mikroorganisme dan banyak ditemukan pada minyak

tumbuhan sedangkan asam lemak yang mempunyai jumlah atom H maksimum

disebut asam lemak jenuh dan banyak ditemui pada minyak hewani.

18

Jika asam-asam lemak berantai pendek (asam butirat) dihidrolisis, maka akan

timbul bau yang menyengat. Sebaliknya, asam-asam lemak berantai panjang

(asam oleat dan palmitat) bila dihidrolisis tidak akan menyebabkan bau yang

menyengat karena asam lemak berantai panjang dan jenuh memiliki titik cair yang

lebih tinggi daripada asam lemak tidak jenuh berantai pendek.

Lemak lebih sulit dipecah oleh mikrooganisme daripada karbohidrat dan

protein sehingga hanya mikrooganisme lipolitik yang menghasilkan enzim lipase

saja yang dapat memecah lemak menjadi asam-asam lemak bebas dan gliserol

dengan bantuan air (Fardiaz, 1992), selanjutnya gliserol dimetabolisasi melalui

jalur EMP dan asam lemaknya diuraikan melalui asetat pada siklus asam sitrat

(Volk dan Wheeler, 1993). Reaksi hidrolisis ini akan dipercepat lagi dengan

adanya asam, basa, dan enzim-enzim (Winarno, 1995). Kapang dapat

menghasilkan enzim lipase dalam jumlah yang banyak sehingga sering menyerang

makanan yang kaya akan lemak dan menyebabkan bau tengik (Fardiaz, 1992).

Jika lemak di dalam media dihidrolisis oleh enzim lipase, maka daerah di

sekitar koloni bakteri menjadi asam akibat terbentuknya asam lemak. Indikator pH

yang ditambahkan ke dalam media akan membantu menunjukkan adanya proses

hidrolisis yang ditandai dengan perubahan warna yang dintujukkan pada gambar

2.5. Indikator pH yang dipakai akan mempengaruhi perubahan warna (Lay, 1994).

Media NA (Nutrient Agar) merupakan media yang dipakai untuk hidrolisis

lemak. Agar dapat digunakan untuk menguji adanya mikroba lipolitik, maka pada

media ini ditambahkan lemak 1%. Komponen-komponen media ini adalah ekstrak

sapi sebagai zat hara untuk menyediakan karbohidrat, nitrogen, vitamin, dan

garam mineral, pepton untuk mengontrol pH, agar, air untuk transportasi nutrient

yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroba, dan merah netral sebagai indikator

(Fardiaz, 1992).

Gambar 2.5 Warna merah yang terbentuk pada uji hidrolisis lemakSumber : Engsterhold (1991)

19

2.5 Uji Katalase

Menurut Lay (1994), katalase merupakan enzim yang digunakan untuk

mengkatalis reaksi penguraian H2O2 (hidrogen peroksida) menjadi H2O dan O2.

Hidrogen peroksida yang dihasilkan dari metabolisme aerob ini bersifat toksik

terhadap sel karena dapat menginaktivasi enzim yang ada di dalam sel. Oleh

karena itu, senyawa toksik ini harus diuraikan oleh mikroorganisme yang hidup di

lingkungan aerob dengan menggunakan enzim katalase. Enzim peroksidase juga

dapat digunakan untuk menguraikan H2O2, namun tidak akan terbentuk O2 pada

penguraian ini.

Uji katalase dapat digunakan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri

tertentu, contohnya uji katalase dipakai untuk membedakan Staphylococcus dan

Streptococcus pada kelompok bakteri kokus karena kelompok bakteri

Staphylococcus bersifat katalase positif sedangkan Streptococcus bersifat katalase

negatif.

Uji katalase dapat dilakukan dengan menggunakan larutan H2O2 3% pada

koloni yang terpisah. Jika bakteri bersifat katalase positif, maka akan timbul

gelembung udara di sekitar koloni. Reaksi yang dikatalisasi oleh enzim katalase

adalah sebagai berikut:

H2O2 → H2O + ½ O2

katalase gelembung udara

2.6 Pewarnaan Gram

Menurut Lay (1994), pewarnaan Gram biasanya digunakan untuk

membedakan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Biakan yang dipakai

hendaknya yang masih segar dan berumur 24-48 jam sehingga dapat memberikan

hasil yang baik dan tepat. Pada saat kultur bakteri diberi kristal violet sebagai

pewarna primer, maka baik bakteri Gram positif dan negatif akan sama-sama

berwarna ungu.

Tahap selanjutnya adalah pemberian larutan lugol sebagai mordan yang

berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga

pengikatannya menjadi lebih kuat. Kristal violet dan lugol akan membentuk

20

kompleks yang berwarna ungu. Setelah ditambahkan larutan mordan, zat warna

akan lebih jelas dan sulit untuk dilarutkan.

Ketika bakteri diberi larutan pemucat (aseton alkohol), maka bakteri Gram

negatif menjadi tidak berwarna karena lipidnya larut di dalam larutan pemucat

sehingga pori-pori dinding sel menjadi besar dan kompleks kristal violet-yodium

dapat lepas sedangkan bakteri Gram positif tetap berwarna ungu karena kompleks

kristal violet-yodium dapat dipertahankan dan tetap melekat pada dinding sel.

Penambahan safranin sebagai zat warna sekunder mengakibatkan bakteri

Gram negatif menjadi berwarna merah karena kompleks kristal violet-yodium

telah larut dan dinding selnya mengikat safranin sedangkan bakteri Gram postif

tetap berwarna ungu karena dinding selnya sudah mengikat kristal violet sehingga

tidak bisa mengikat safranin lagi. Fungsi safranin adalah sebagai zat warna

pembeda terhadap pewarna primer.

Adanya perbedaan pada tahap perwarnaan Gram disebabkan perbedaan

struktur dinding sel yang dimiliki bakteri Gram positif dan negatif. Sebagian besar

dinding sel bakteri Gram positif tersusun dari peptidoglikan sedangkan komponen

utama dinding sel bakteri Gram negatif adalah lipid yang dapat larut di dalam

alkohol dan aseton sehingga dinding selnya menjadi besar dan kompleks kristal

violet-yodium dapat keluar.

2.7 Bacillus cereus

Menurut Fardiaz (1992), Bacillus cereus termasuk bakteri pembentuk spora

yang berbentuk silinder dan tidak membengkak. Bakteri ini berkatalase positif,

bergram positif, aerob sampai anaerob fakultatif, dan sering menghasilkan asam

tanpa gas yang sering merusak makanan kaleng. Spesies ini juga bersifat

proteolitik yang dapat menghasilkan enzim proteinase yang digunakan untuk

memecah protein menjadi polipeptida dan asam amino. Enzim yang diproduksi ini

menyerupai rennin sehingga sering mengumpalkan susu. Bakteri ini juga

termasuk bakteri lipolitik yang dapat memecah lemak menjadi asam lemak dan

gliserol. Bakteri Bacillus cereus dapat dilihat pada gambar 2.6.

21

Gambar 2.6 Bacillus cereusSumber : Loi (2007)

2.8 Fusarium moniliforme

Kapang ini banyak ditemui pada makanan dan sulit untuk dikenali karena

penampakan pertumbuhannya yang bervariasi. Ciri utama dari Fusarium sp.

adalah adanya makrokonidia yang berbentuk pedang, multisel, dan berwarna.

Kadang-kadang juga terdapat mikrokonidia yang berbentuk oval. Biasanya

kapang ini menghasilkan enzim hidrolitik, seperti amilase, lipase, dan proteinase

yang dapat digunakan untuk memecah makromolekul menjadi komponen yang

lebih sederhana sehingga Fusarium sp. dapat dtumbuh pada media yang

mengandung pati, lipid, pektin, dan protein.

Kapang ini dapat memproduksi asam giberelat yang dapat digunakan untuk

memproduksi benih dan mengganti hormon pertumbuhan. Selain itu, Fusarium

sp. sering dipakai dalam fermenatsi makanan, namun kelemahan fermentasi

kapang adalah adanya miselium yang dapat menganggu penampakan makanan.

Kapang ini juga dapat menghasilkan antibiotik, enzim, dan asam. Enzim

amilase dan proteinase merupakan enzim utama dalam fermentasi makanan oleh

kapang. Hidrolisis pati digunakan dalam industri yang memakai tape, ragi, dan

koji sebagai starternya, hidrolisis proein dalam industri kecap dan tauco,

sedangkan hidrolisis lemak dalam industri susu (Fardiaz, 1992). Fusarium

miniliforme dapat dilihat pada gambar 2.7.

Gambar 2.7 Fusarium moniliforme Sumber : Rohmhaas (2006)

2.9 Candida tropicalis

Khamir ini bersifat oksidatif, tetapi bersifat fermentatif lemah atau negatif

juga dan sering ditemui pada makanan yang mengandung kadar garam dan asam

22

dalam jumlah yang tinggi. Spesies ini dapat membentuk film pada permukaan

bahan pangan dan sering merusak produk pangan berkadar garam dan asam

tinggi. C. tropicalis dapat memfermentasi monosakarida dan disakarida, seperti

galaktosa, glukosa, maltosa, sukrosa, laktosa, dan raffinosa, tetapi jarang yang

dapat memfermentasi pati karena jumlah enzim pemecah polisakaridanya sangat

rendah. Dari proses fermenatsi, khamir dapat menghasilkan alkohol, CO2, dan

produk-produk lain (Fardiaz, 1992). C. tropicalis dapat dilihat pada gambar 2.8.

Gambar 2.8 Candida tropicalisSumber : Doctorfungus (2007)

BAB III

23

METODE KERJA

3.1 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah gelas benda, gelas

penutup, jarum ose, lampu spiritus, mikroskop, penjepit, hair dryer, hand counter,

inkubator dengan suhu 30-320C, dan vortex.

Bahan-bahan yang dipakai adalah cat Gram A yang berupa larutan cat

Hucker’s crystal violet, larutan Gram B berupa larutan mordan lugol’s iodine,

larutan Gram C berupa larutan aseton-alkohol, cat Gram D berupa larutan cat

safranin, alkohol, tabung Glucose Broth (GB) + indikator Brom Cresol Purple

(BCP) + tabung durham, tabung Sucrose Broth (SB) + indikator BCP + tabung

durham, tabung Lactose Broth (LB) + indikator BCP + tabung durham, cawan

Starch Agar (SA), cawan Skim Milk Agar (SMA), cawan Nutrient Agar (NA) +

1% lemak + neutral red, tabung dan cawan kontrol untuk masing-masing media,

larutan lugol (yodium), larutan H2O2 3%, kultur murni Candida tropicalis,

Fusarium moniliforme, dan bakteri Bacillus cereus, serta sampel erlenmeyer air

sayur asin, air rendaman tahu, air asinan, dan air tajin.

3.2 Prosedur Kerja

3.2.1 Uji Fermentasi

1. Empat tabung berisi GB + indikator BCP + tabung durham, empat tabung

berisi SB + indikator BCP + tabung durham, dan empat tabung berisi LB

+ indikator BCP + tabung durham disiapkan.

2. Satu tabung dari masing-masing media diinokulasi dengan satu ose kultur

murni dari khamir Candida tropicalis, satu tabung diinokulasi dengan satu

ose kultur murni Fusarium moniliforme, satu tabung lagi diinokulasi

dengan satu ose kultur murni bakteri Bacillus cereus, dan satu tabung

lainnya dengan satu ose sampel air tajin.

3. Tabung-tabung yang telah diinokulasi tersebut diinkubasi pada suhu 30-

320C selama 2 hari.

24

4. Gas yang terbentuk pada tabung durham dan asam yang terbentuk pada

media yang ditandai dengan perubahan warna media dari ungu menjadi

kuning diamati dan dibandingkan dengan tabung kontrol.

3.2.2 Uji Hidrolisis Pati

1. Setengah bagian cawan SA digores langsung dengan ose yang telah

dipijarkan dari kultur murni Candida tropicalis sedangkan setengah bagian

lagi tidak diinokulasi, satu cawan digores dengan ose dari kultur murni

Fusarium moniliforme, satu cawan lagi digores dengan ose dari kultur

murni bakteri Bacillus cereus, dan satu cawan lainnya digores dengan ose

dari sampel air tajin.

2. Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.

3. Larutan yodium diteteskan pada semua cawan SA sehingga semua bagian

terendam.

4. Bagian transparan (kuning) yang mengelilingi koloni yang menunjukkan

adanya hidrolisis pati diamati dan dibandingkan dengan cawan kontrol.

3.2.3 Uji Hidrolisis Protein

1. Setengah bagian cawan SMA digores langsung dengan ose yang telah

dipijarkan dari kultur murni Candida tropicalis sedangkan setengah bagian

lagi tidak diinokulasi, satu cawan digores dengan ose dari kultur murni

Fusarium moniliforme, satu cawan lagi digores dengan ose dari kultur

murni bakteri Bacillus cereus, dan satu cawan lainnya digores dengan ose

dari sampel air tajin.

2. Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.

3. Areal bening yang mengelilingi koloni mikroba proteolitik yang

menunjukkan adanya hidrolisis protein diamati dan dibandingkan dengan

cawan kontrol.

3.2.4 Uji Hidrolisis Lemak

1. Setengah bagian cawan NA yang mengandung 1% lemak dan neutral red

digores langsung dengan ose yang telah dipijarkan dari kultur murni

25

Candida tropicalis sedangkan setengah bagian lagi tidak diinokulasi, satu

cawan digores dengan ose dari kultur murni Fusarium moniliforme, satu

cawan lagi digores dengan ose dari kultur murni bakteri Bacillus cereus,

dan satu cawan lainnya digores dengan ose dari sampel air tajin.

2. Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.

3. Warna merah yang terbentuk di bagian bawah koloni yang menunjukkan

adanya hidrolisis lemak diamati dan dibandingkan dengan cawan kontrol.

3.2.5 Uji Katalase

1. Air steril diteteskan di atas gelas objek, kemudian dua ose pertumbuhan

kultur Candida tropicalis diambil dan diletakkan di atas air steril pada

gelas objek.

2. Dua tetes larutan 3% H2O2 diteteskan di atas gelas objek tersebut.

3. Langkah di atas diulangi untuk kultur Fusarium moniliforme, Bacillus

cereus, dan sampel air tajin.

4. Gelembung-gelembung kecil oksigen yang terbentuk yang menandakan

adanya enzim katalase diamati.

3.2.6 Pewarnaan Gram

1. Pewarnaan Gram dilakukan pada sampel air tajin yang digunakan.

2. Hasil pewarnaan tersebut diamati.

3. Jumlah bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dinyatakan kira-kira

dalam persen.

26

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Bakteri Bacillus cereus

Tabel 4.1 Hasil uji yang dilakukan terhadap bakteri Bacillus cereus Pertumbuhan Bakteri

Uji Fermentasi GB gasasam

-+

LB gasasam

-+

SB gasasam

-+

Uji Hidrolisis Pati -Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA -

NA + lemak +

Fermentasi merupakan proses pemecahan molekul-molekul, seperti

karbohidrat dan asam amino tanpa membutuhkan oksigen agar dapat

memproduksi energi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroba. Proses

fermentasi sering terjadi pada komponen karbohidrat, yaitu sukrosa, laktosa,

glukosa, maltosa, dan sebagainya.

Pada uji fermentasi, media yang digunakan harus mengandung karbohidrat

agar dapat difermentasi oleh mikroba yang ada. Dalam percobaan ini, media yang

dipakai adalah Glucose Broth, Sucrose Broth, dan Lactose Broth. Media-media ini

mengandung ekstrak sapi, pepton, air destilata, dan yang paling utama adalah

glukosa, sukrosa, dan laktosa untuk masing-masing media. Pepton dan ekstrak

sapi berperan sebagai sumber nitrogen, vitamin, dan mineral untuk pertumbuhan

mikroba (Fardiaz, 1992).

Indikator BCP yang ditambahkan ke dalam media berfungsi untuk mengetahui

terbentuknya asam yang ditandai dengan perubahan warna media dari ungu

menjadi kuning karena indikator BCP akan berwarna ungu pada pH>7 dan

berwarna kuning pada pH asam sedangkan tabung durham digunakan untuk

menangkap gas yang terbentuk pada proses fermentasi. Tabung durham biasanya

dipakai bila jenis dan jumlah gas tidak perlu diketahui. Gas yang masuk ke dalam

27

tabung ini akan tampak sebagai gelembung-gelembung udara yang terperangkap

dan mendorong cairan yang ada di dalam tabung (Lay, 1994).

Bacillus cereus banyak terdapat pada makanan. Bakteri ini berkatalase

positif, aerobik sampai anaerobik fakultatif, bergram positif, dan dapat

membentuk spora. B. cereus dapat memproduksi asam tanpa gas jika

ditumbuhkan pada makanan dan memiliki sifat proteolitik kuat yang

menghasilkan enzim proteolitik yang bersifat menyerupai rennin sehingga mampu

menggumpalkan susu. Spesies ini juga termasuk bakteri lipolitik yang mampu

memecah lemak (Fardiaz, 1992).

Dari hasil percobaan uji fermentasi, diketahui bahwa B. cereus dapat

memecah glukosa menjadi asam yang ditunjukkan dengan perubahan warna

media GB dari coklat menjadi kuning, namun tidak terbentuk gas pada fermentasi

ini. Asam yang dihasilkan ini akan menurunkan pH media sehingga mengubah

warna indikatornya karena BCP akan berwarna kuning pada pH asam.

Ada dua tahap pada proses fermentasi glukosa, yaitu proses pemecahan rantai

karbon glukosa dan pelepasan atom hidrogen untuk memproduksi asam piruvat

serta pereduksian asam piruvat oleh atom hidrogen untuk menghasilkan senyawa-

senyawa, seperti asam dan gas sebagai produk fermentasi. Reaksi ini merupakan

reaksi redoks yang harus seimbang (Fardiaz, 1992).

B. cereus memecah glukosa menjadi asam piruvat melalui jalur EMP

(Embden Meyerhoff Parnas). Bakteri ini akan menghasilkan enzim aldolase untuk

memecah fruktosa difosfat menjadi dua molekul gliseraldehida fosfat dan enzim

gliseraldehida fosfat dehidrogenase untuk mengkatalis reaksi fosfogliseraldehida

yang akan memproduksi ATP.

Asam piruvat yang dihasilkan pada jalur glikolisis (EMP) akan direduksi oleh

NADH2 untuk memproduksi asam laktat. Karena B. cereus hanya memproduksi

asam laktat saja sebagai satu-satunya hasil akhir fermentasi, maka bakteri ini

dapat digolongkan sebagai bakteri asam laktat homofermentatif yang dapat

menghasilkan asam laktat dalam jumlah yang tinggi. Reaksi yang terjadi adalah:

Glukosa → 2 Asam laktat

B. cereus juga dapat memproduksi enzim yang dapat memecah sukrosa dan

laktosa menjadi monosakarida. Enzim yang dihasilkan adalah β-galaktosidase

28

yang akan memecah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa serta enzim invertase

yang memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Uji fermentasi yang

dilakukan menujukkan bahwa terbentuk asam laktat sebagai produk fermentasi

pada media SB yang berubah warna dari merah menjadi kuning dan LB yang

berubah warna dari biru keunguan menjadi kuning akibat penurunan pH media.

Zat-zat nutrient di alam biasanya masih berupa makromolekul, seperti

karbohidrat, protein, lipid, dan asam nukleat. Agar dapat dipakai oleh sel untuk

mensintesis komponen-komponennya, maka makromolekul tersebut harus

dihidrolisis terlebih dahulu. Proses hidrolisis sendiri merupakan pemutusan ikatan

molekul dengan menambahkan air (Lay, 1994). Protein lebih sulit dihidrolisis

dibandingkan dengan karbohidrat karena strukturnya yang kompleks sedangkan

lemak merupakan komponen yang paling sulit dihidrolisis.

Karbohidrat akan dihidrolisis menjadi komponen yang lebih sederhana,

seperti disakarida atau monosakarida, asam, gas, dan produk-produk akhir

lainnya. Asam laktat merupakan asam utama yang dihasilkan pada proses

pemecahan ini. Protein akan dipecah menjadi asam amino, alkohol, beberapa gas,

contohnya CO2, hidrogen, amonia, dan senyawa berbau busuk, seperti indol dan

skatol sedangkan lemak akan dihidrolisis menjadi asam lemak dan gliserol

(Fardiaz, 1992).

Dari uji hidrolisis pati, lemak, dan protein, dapat diketahui bahwa B. cereus

merupakan bakteri proteolitik dan lipolitik tetapi tidak termasuk bakteri amilolitik.

Hasil ini tidak cocok dengan teori yang ada. Menurut Kim (2004), B. cereus

merupakan bakteri amilolitik yang dapat memecah pati. Hal ini dapat dilihat

karena tidak terbentuknya daerah transparan pada media SA setelah ditetesi lugol

yang menunjukkan adanya hidrolisis pati. Kesalahan ini dapat terjadi karena

koloni yang tumbuh terlalu sedikit atau lugol yang ditambahkan kurang banyak.

B. cereus termasuk bakteri proteolitik kuat dan juga bakteri lipolitik yang

dapat memecah lemak (Fardiaz, 1992). Bakteri ini termasuk bakteri proteolitik

ditunjukkan dengan terbentuknya daerah bening yang mengelilingi koloni pada

media SMA. Daerah yang jernih ini dapat terbentuk karena kasein di dalam susu

pada media telah dihidrolisis oleh enzim kaseinase yang diproduksi bakteri B.

29

cereus menjadi asam-asam amino yang mudah larut di dalam media sehingga

kekeruhan yang disebabkan kompleks Ca-kasein menjadi hilang (Lay, 1994).

B. cereus juga termasuk bakteri lipolitik yang ditandai dengan terbentuknya

area yang berwarna merah di bagian bawah koloni. Indikator neutral red yang

ditambahkan ke dalam media akan membantu untuk menunjukkan adanya proses

hidrolisis lemak melalui perubahan warna menjadi merah. B. cereus akan

memproduksi enzim lipase untuk menghidrolisis lemak menjadi asam lemak dan

gliserol. Asam lemak yang dihasilkan dari proses hidrolisis ini akan menurunkan

pH media (Lay, 1994).

Media yang digunakan untuk hidrolisis karbohidrat adalah media SA (Starch

Agar) yang terdiri dari tripton, ekstrak khamir, K2HPO4, pati terlarut, agar, dan

air. Tripton berfungsi sebagai sumber karbohidrat, N, dan mineral, ekstrak khamir

untuk sumber vitamin B, air untuk transport zat-zat nutrient, sedangkan pati

sebagai komponen yang akan dipecah pada hidrolisis karbohidrat.

Media untuk hidrolisis protein adalah media SMA (Skim Milk Agar) yang

mengandung tripton, ekstrak khamir, dekstrosa, agar, air destilata, dan 20% susu

skim bubuk. Ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B kompleks, tripton dipakai

untuk menyediakan nitrogen dan mineral, sedangkan kasein yang ada di dalam

susu akan menyebabkan media menjadi berwarna keruh.

Media untuk hidrolisis lemak adalah media NA (Nutrient Agar) yang terdiri

dari ekstrak sapi, pepton, 1% margarin, agar, air destilata, dan ditambah dengan

indikator neutral red. Ekstrak sapi sebagai sumber nitrogen, karbohidrat, vitamin,

dan mineral, pepton untuk mengatur pH, air untuk menyalurkan nutrient, neutral

red sebagi indikator (Fardiaz, 1992).

Pada saat uji hidrolisis karbohidrat pada media SA dan uji hidrolisis lemak

pada media NA+lemak, bakteri B. cereus bersifat katalase positif sedangkan pada

uji hidrolisis protein pada media SMA, bakteri ini bersifat katalase negatif.

Katalase sendiri merupakan enzim yang dapat digunakan untuk mengkatalis reaksi

penguraian H2O2 menjadi O2 dan air. H2O2 sendiri bersifat toksik karena dapat

menginaktivasi enzim. Adanya enzim katalase dapat ditunjukkan dengan

terbentuknya gelembung-gelembung kecil O2 di sekitar koloni setelah ditetesi

H2O2. B. cereus termasuk bakteri berkatalase positif (Fardiaz, 1992). Namun

30

bakteri ini berkatalase negatif pada saat uji hidrolisis protein padahal seharusnya

berkatalase positif. Hal ini dapat terjadi karena kurangnya larutan H2O2 yang

ditambahkan atau koloni B. cereus yang diambil kurang banyak.

4.2 Kapang Fusarium moniliforme

Tabel 4.2 Hasil uji yang dilakukan terhadap kapang Fusarium moniliforme Pertumbuhan Kapang

Uji Fermentasi GB gasasam

--

LB gasasam

-+

SB gasasam

-+

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein 0Uji Hidrolisis Lemak 0

Uji Katalase SA +SMA 0

NA + lemak 0

Kapang banyak digunakan di dalam fermentasi makanan tradisional dan

pembuatan keju, namun fermentasi oleh kapang memiliki kelemahan, yaitu pada

permukaan makanan yang difermentasi dapat tumbuh miselium yang

mempengaruhi penampakan dari makanan. Pada proses fermentasi, kapang akan

menghasilkan asam, enzim, dan antibiotik. Enzim utama yang berperan dalam

fermentasi makanan oleh kapang adalah enzim amilase dan proteinase.

Pemecahan pati oleh enzim amilase banyak digunakan dalam industri pembuatan

produk yang memakai ragi, tape, dan koji sebagai starternya, pemecahan protein

oleh enzim proteinase digunakan dalam industri pembuatan kecap dan tauco,

sedangkan pemecahan lemak dipakai untuk industri keju.

Fusarium sp. termasuk kapang bersekat dan tidak memiliki spora seksual.

Kapang ini sering ditemukan pada makanan dan sulit diidentifikasi karena

penampakan pertumbuhannya bervariasi. Ciri utama yang membedakan Fusarium

sp. dari kapang lainnya adalah adanya makrokonidia yang tampak sebagai pedang

dan tersusun dari beberapa sel serta berwarna. Fusarium sp. biasanya dipakai

untuk mengganti hormon pertumbuhan dan memproduksi benih (Fardiaz, 1992).

Dari hasil uji fermentasi, didapat bahwa Fusarium sp. hanya dapat memecah

laktosa dan sukrosa menjadi asam yang ditandai dengan perubahan warna media

31

dari ungu menjadi kuning, namun tidak terbentuk gas pada tabung durham.

Fusarium sp. akan memproduksi enzim β-galaktosidase yang digunakan untuk

memecah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa serta enzim invertase yang

memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Monosakarida-monosakarida ini

kemudian dipecah lagi untuk menghasilkan produk akhir lainnya, seperti ragi

tape, koji. Proses fermentasi oleh kapang banyak digunakan untuk pembuatan

produk-produk yang memakai ragi, tape, dan koji sebagai starternya.

Pada uji hidrolisis karbohidrat, dapat dilihat bahwa Fusarium sp. termasuk

mikroba amilolitik yang dapat memecah karbohidrat menjadi komponen yang

lebih sederhana dengan menggunakan enzim amilase yang diproduksi kapang ini

dan ditandai dengan terbentuknya daerah transparan yang mengelilingi koloni

setelah diteteskan dengan yodium. Yodium akan bereaksi dengan pati dan masuk

ke bagian pati yang kosong dan berbentuk spiral sehingga membentuk warna biru

kehitaman. Jika pati telah dihidrolisis menjadi disakarida maupun monosakarida,

maka warna biru ini akan hilang karena bentuk spiralnya sudah tidak ada. Hal ini

cocok dengan teori yang ada. Menurut Mader (2007), Fusarium sp. dapat

menghasilkan enzim amilase pada pati.

Pada uji hidrolisis protein dan lipid, kapang Fusarium sp. tidak dapat tumbuh

pada media SMA dan NA+lemak. Hal ini disebabkan karena penggoresan yang

tidak menyentuh permukaan agar sehingga tidak ada kapang Fusarium sp. yang

tumbuh pada media tersebut. Umumnya, kapang dapat tumbuh pada makanan

yang mengandung pati, protein, dan lipid karena kapang dapat menghasilkan

enzim hidrolitik, yaitu enzim amilase, proteinase, dan lipase untuk memecah

komponen makanan kompleks menjadi sederhana (Fardiaz, 1992). Sebenarnya

mungkin ada sedikit Fusarium sp. yang tumbuh, namun karena penampakan

pertumbuhan kapang ini bervariasi sehingga sulit untuk diidentifikasi. Menurut

Rodier (1996), Fusarium sp. termasuk mikroorganisme proteolitik dan lipolitik

yang dapat memecah protein dan lemak.

Pada uji katalase, Fusarium sp. dapat menghasilkan enzim katalase untuk

memecah senyawa beracun H2O2 pada media SA menjadi air dan oksigen yang

ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen di sekitar koloni

setelah ditetesi H2O2, tetapi karena pada media SMA dan NA+lemak tidak ada

32

kapang yang tumbuh sehingga tidak dapat dilakukan uji katalase. Namun

sebenarnya Fusarium sp. termasuk mikroba berkatalase positif dan juga mikroba

aerob karena H2O2 biasanya terbentuk pada metabolisme aerob.

4.3 Khamir Candida tropicalis

Tabel 4.3 Hasil uji yang dilakukan terhadap khamir Candida tropicalis Pertumbuhan Khamir

Uji Fermentasi GB gasasam

++

LB gasasam

--

SB gasasam

++

Uji Hidrolisis Pati -Uji Hidrolisis Protein -Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

NA + lemak +

Berdasarkan sifat metabolismenya, ada dua kelompok khamir yaitu khamir

fermentatif yang dapat memecah glukosa menjadi alkohol dan CO2 melalui jalur

glikolisis EMP dan khamir oksidatif yang membutuhkan oksigen untuk

pertumbuhannya. Beberapa spesies Candida sp. bersifat oksidatif tetapi dapat

melakukan fermentasi secara lemah atau negatif juga.

Pada proses fermentasi oleh khamir, khamir yang ditumbuhkan pada media

glukosa umumnya mengandung jumlah enzim penghidrolisis disakarida dan

polisakarida yang sangat rendah. Banyak khamir yang dapat melakukan

fermentasi terhadap disakarida dan trisakarida, namun hanya beberapa spesies

khamir yang dapat memfermentasi polisakarida. Gula yang biasanya difermentasi

oleh khamir adalah galaktosa, glukosa, maltosa, sukrosa, dan laktosa.

C. tropicalis umumnya membentuk film pada permukaan makanan dan sering

merusak makanan yang berkadar garam dan asam tinggi. Khamir ini biasanya

digunakan untuk memecah gula dan memproduksi massa sel dari molase tebu

(Fardiaz, 1992).

Pada uji fermentasi, dapat diketahui bahwa C. tropicalis dapat memfermentasi

glukosa dan sukrosa serta menghasilkan asam dan gas yang ditandai dengan

perubahan warna media GB dari coklat menjadi kuning dan perubahan warna

media SB dari merah menjadi kuning serta terbentuknya gelembung gas di tabung

33

durham pada kedua media. Glukosa akan dipecah menjadi asam piruvat yang

dipecah lagi menjadi asam laktat, asam asetat, etanol, CO2, dan metabolit-

metabolit lain sedangkan sukrosa dipecah menajdi fruktosa dan glukosa oleh

enzim invertase yang diproduksi C. tropicalis. Laktosa sendiri tidak bisa

difermentasi oleh C. tropicalis karena tidak ada perubahan warna pada media LB

yang telah diberi indikator dan tidak ada gelembung gas yang terbentuk pada

tabung durham.

Pada uji hidrolisis, diketahui bahwa C. tropicalis termasuk mikroba lipolitik,

amilolitik, dan proteolitik. C. tropicalis termasuk mikroba lipolitik karena dapat

memproduksi asam secara lemah yang ditandai dengan terbentuknya sedikit

warna merah di sekitar koloni. Hal ini menunjukkan bahwa khamir ini dapat

menghasilkan enzim lipase yang memecah lemak menjadi asam lemak dan

gliserol. Asam yang terbentuk akan menurunkan pH media.

C. tropicalis juga termasuk mikroba amilolitik yang dapat menghasilkan

enzim α-amilase untuk memecah pati menjadi komponen yang lebih sederhana,

yaitu disakarida maupun monosakarida. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya

daerah transparan yang mengelilingi koloni setelah ditetesi dengan yodium karena

sudah tidak adanya kompleks pati-yodium yang berbentuk biru kehitaman. Hal ini

sesuai dengan teori. Menurut Azoulay (1980), C. tropicalis mengeluarkan enzim

yang dapat digunakan untuk menghidrolisis pati, yaitu α-amylase menjadi

komponen-komponen yang lebih sederhana, terutama gula.

C. tropicalis juga menunjukkan hasil yang positif pada uji hidrolisis protein

yang ditunjukkan dengan terbentuknya areal bening yang mengelilingi koloni C.

tropicalis karena asam amino hasil hidrolisis protein dapat larut di dalam media

SMA. Hal ini cocok dengan teori yang ada. Menurut Okumura (2006), C.

tropicalis termasuk mikroba proteolitik yang dapat memecah protein menjadi

peptida dan asam amino.

Pada uji katalase, C. tropicalis bersifat katalase positif untuk semua media

yang ada. Hal ini menunjukkan bahwa khamir ini memiliki enzim katalase yang

dapat digunakan untuk menguraikan hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen

yang ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung gas di sekitar koloni

setelah diteteskan H2O2.

34

4.4 Air Tajin

Tabel 4.4 Hasil uji yang dilakukan terhadap air tajin Pertumbuhan Mikroba

Uji Fermentasi GB gasasam

++

LB gasasam

++

SB gasasam

++

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

NA + lemak +

Beras yang difermentasi akan menghasilkan miso yang biasanya digunakan

untuk membuat sup dan memberi tambahan rasa makanan. Pertama-tama, air

beras diinokulasi dengan Aspergillus oryzae sehingga terjadi proses fermentasi

pada suhu 400C secara aerobik. Agar dapat ditumbuhi kapang, beras ini harus

daalm keadaan basah. Beras berkapang disebut koji yang merupakan stater untuk

fermentasi.

Campuran bahan dengan garam, koji, kedelai, miso, dan air difermentasi pada

suhu 280C selama seminggu secara aerobik, lalu campuran ini dimasukkan ke

dalam tong untuk memulai fermentasi kedua dengan menggunakan khamir

Saccharomyces rouxii pada suhu 350C selama 2 bulan secara anaerobik. Pada

fermentasi ini, bakteri-bakteri asam laktat akan ikut berperan (Buckle et al.,

1987).

Dari hasil percobaan, diketahui bahwa mikroba-mikroba yang tumbuh di air

tajin dapat memecah glukosa, sukrosa, laktosa menjadi asam dan gas yang

ditandai dengan perubahan warna media dari ungu menjadi kuning dan

terbentuknya gas pada tabung durham. Hasil pemecahan komponen karbohidrat di

air tajin akan menghasilkan produk akhir, berupa miso yang dapat dipakai untuk

membuat sup dan memberi tambahan rasa pada makanan. Selain itu, juga

dihasilkan asam laktat, alkohol, enzim, CO2, dan produk-produk lainnya.

Mikroba-mikroba yang ada di dalam air tajin adalah bakteri-bakteri asam laktat,

kapang Aspergillus oryzae, dan khamir Saccharomyces rouxii.

35

Bakteri asam laktat akan memecah gula dan menghasilkan asam laktat sebagai

produk akhir serta menurunkan pH lingkungan pertumbuhannya akibat

terbentuknya asam. Aspergillus oryzae dapat menghasilkan enzim protease untuk

membuat minuman beralkohol dari nasi sedangkan S. rouxii bersifat osmofilik

dan tahan dengan kandungan gula yang tinggi (Fardiaz, 1992).

Mikroba-mikroba di air tajin juga menunjukkan hasil yang positif pada uji

hidrolisis karbohidrat, protein, dan lemak. Mikroba-mikroba ini termasuk mikroba

amilolitik, proteolitik, dan lipolitik. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya

daerah transparan yang mengelilingi koloni pada media SA, koloni yang

dikelilingi areal bening pada media SMA, dan terbentuknya daerah yang berwarna

merah di bagian bawah koloni pada media NA.

Pada uji katalase, mikroba-mikroba ini juga termasuk katalase positif yang

ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung kecil O2 pada koloni. Hal ini

berarti mikroba-mikroba ini memiliki enzim katalase yang dapat memecah

hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen.

4.5 Air Rendaman Tahu

Tabel 4.5 Hasil uji yang dilakukan terhadap air rendaman tahu Pertumbuhan Mikroba

Uji Fermentasi GB gasasam

++

LB gasasam

++

SB gasasam

++

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

NA + lemak +

Tahu dibuat dari kacang kedelai yang direndam dan didedak hingga menjadi

suatu campuran antara air dengan kacang kedelai. Campuran ini disaring sehingga

hanya susu kedelai yang dapat lewat. Susu kedelai kemudian diberi garam, seperti

magnesium klorida atau kalsium sulfat agar menggumpal. Selanjutnya, gumpalan

ini di-press menjadi potongan tahu. Menurut Ewald (1997), bakteri yang biasa

berperan di dalam fermentasi tahu adalah Bacillus cereus.

36

Pada percobaan uji fermentasi, diketahui bahwa mikroba di air tahu dapat

melakukan fermentasi terhadap semua komponen karbohidrat yang ada, baik

glukosa, sukrosa, maupun laktosa. Fermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa

ditandai dengan terbentuknya asam pada media yang dilihat dari perubahan

indikator pada media menjadi kuning dan gas yang terdapat pada tabung durham.

Glukosa akan dipecah menajdi asam piruvat yang dipecah lagi menjadi asam

laktat dan CO2 atau etanol sedangkan enzim invertase memecah sukrosa menjadi

fruktosa dan glukosa. Laktosa dipecah oleh enzim β-galaktosidase menjadi

galaktosa dan glukosa.

Pada uji hidrolisis, mikroba yang ada di air tahu termasuk mikroba amilolitik,

proteolitik, dan lipolitik yang ditandai dengan terbentuknya daerah transparan

yang mengelilingi koloni pada media SA, areal bening di sekitar koloni pada

media SMA, dan terbentuknya warna merah di bawah koloni pada media

NA+lemak. Hal ini sesuai dengan teori yang ada. B. cereus termasuk bakteri

lipolitik dan proteolitik (Fardiaz, 1992) dan juga bakteri amilolitik (Kim, 2004).

Dari uji katalase, diketahui bahwa mikroba di air tahu termasuk mikroba aerob

yang dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen. Mikroba ini

dapat menghasilkan enzim katalase untuk semua media yang ada. Hal ini cocok

dengan teori yang ada. B. cereus berkatalase positif (Fardiaz, 1992).

4.6 Air Sayur Asin

Tabel 4.6 Hasil uji yang dilakukan terhadap air sayur asin Pertumbuhan Mikroba

Uji Fermentasi GB gasasam

-+

LB gasasam

-+

SB gasasam

-+

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

NA + lemak +

Sayur asin terbuat dari kobis yang diasamkan. Kobis yang telah diiris-iris

dimasukkan ke dalam tangki yang berisi air garam. Air dan nutrisi di jaringan

37

sayuran akan ditarik oleh garam sebagai substrat untuk pertumbuhan bakteri asam

laktat. Garam dan asam yang dihasilkan dari proses fermentasi dapat menghambat

pertumbuhan mikroba lain. Fermentasi diawali oleh bakteri Leuconostoc

mesenteroides dan diteruskan oleh Lactobacillus delbrückii yang lebih tahan

terhadap asam. Fermentasi dilakukan pada suhu antara 25-300C dalam waktu 2-3

minggu (Buckle et al., 1987). Pada sayur asin, juga dapat tumbuh khamir

(Fardiaz, 1992).

Dari hasil percobaan uji fermentasi, dapat diketahui bahwa mikroba-mikroba

yang ada di air sayur asin dapat memecah glukosa, laktosa, dan sukrosa menjadi

asam. Asam ini dapat berupa asam laktat yang merupakan asam utama pada

proses fermentasi ini. Terbentuknya asam ditandai dengan perubahan warna

media LB dari biru keunguan menjadi kuning, media SB yang berubah warna dari

merah menjadi kuning, dan media GB yang berubah warna dari coklat menjadi

kuning. Seharusnya, pada percobaan fermentasi ini dihasilkan gas pada tabung

durham karena bakteri Leuconostoc sp. dapat memfermentasi gula menjadi asam

laktat dan CO2 atau asam asetat (Fardiaz, 1992). Hal ini dapat terjadi karena gas

yang terbentuk kurang banyak sehingga sulit untuk diamati.

Leuconostoc sp. bersifat heterofermentatif yang dapat memfermentasikan gula

menjadi asam laktat dan CO2 atau etanol. Bakteri ini juga bersifat halofilik

sehingga dapat tahan dengan kadar garam yang tinggi dan berperan penting dalam

fermentasi awal bahan pangan yang mengandung kadar garam tinggi, seperi pikel

dan sauerkraut. Selain itu, bakteri ini dapat melakukan fermentasi secara cepat

sehingga dapat mencegah pertumbuhan bakteri lain. Pada fermentasi sukrosa,

akan dihasilkan juga lendir berlebih.

Lactobacillus delbrückii bersifat homofermentatif dan sering ditemui pada

fermentasi pikel. Bakteri ini akan memecah gula menjadi asam laktat sebagai

produk akhirnya (Fardiaz, 1992).

Pada uji hidrolisis pati, mikroba-mikroba yang ada di sayur asin menunjukkan

hasil yang positif yang ditandai dengan terbentuknya daerah transparan di sekitar

koloni. Mikroba-mikroba ini dapat menghasilkan enzim amilase yang dapat

digunakan untuk memecah pati menjadi komponen yang lebih sederhana.

Mikroba-mikroba ini juga termasuk mikroba lipolitik dan proteolitik yang

38

masing-masing dapat digunakan untuk memecah lemak dan protein. Hal ini

ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah di bawah koloni pada media

NA+lemak dan areal bening di sekitar koloni pada media SMA.

Mikroba ini juga termasuk mikroba yang dapat menghasilkan enzim katalase

untuk memecah hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen yang

ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung-gelembung gas O2 di sekitar koloni

setelah diteteskan dengan H2O2. Walaupun sebagian besar mikroba yang ada di air

sayur asin merupakan bakteri berkatalase negatif, tetapi mungkin ada mikroba lain

seperti khamir yang dapat menghasilkan enzim katalase.

4.7 Air Asinan

Tabel 4.7 Hasil uji yang dilakukan terhadap air asinanPertumbuhan Mikroba

Uji Fermentasi GB gasasam

++

LB gasasam

++

SB gasasam

++

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

NA + lemak +

Asinan biasanya terbuat dari sayur-sayuran atau buah-buahan. Sayuran dan

buah-buahan biasanya berkadar gula tinggi dan dibutuhkan untuk pertumbuhan

bakteri asam laktat. Ada empat faktor yang mempengaruhi fermentasi sayuran,

yaitu kondisi anaerobik, kadar garam yang cukup untuk menyerap nutrient, suhu

yang sesuai, dan adanya bakteri asam laktat yang dibutuhkan. Bakteri asam laktat

yang sering dipakai dalam fermentasi syuran adalah Leuconostoc mesenteroides

dan Lactobacillus (Buckle et al., 1987).

Pada uji fermentasi, bakteri-bakteri asam laktat pada air asinan dapat

memfermentasikan komponen-komponen karbohidrat, seperti sukrosa, laktosa,

dan glukosa menjadi asam dan gas. Asam yang dihasilkan akan menurunkan pH

media sehingga media yang mengandung indikator BCP akan mengalami

perubahan warna menjadi kuning bila terbentuk asam. Hal ini ditandai dengan

39

perubahan warna media LB dari biru keunguan menjadi kuning, media GB yang

berubah warna dari cokelat menjadi kuning, dan media SB yang berubah warna

dari merah menjadi kuning. Asam yang dihasilkan dapat berupa asam laktat atau

asam asetat. Pada percobaan ini, juga dihasilkan gas yang ditangkap oleh tabung

durham dan tampak sebagai gelembung udara. Gas tersebut merupakan CO2

sebagai produk samping hasil fermentasi.

Bakteri Leuconostoc sp. bersifat heterofermentatif yang akan memecah gula

menjadi asam laktat dan CO2 atau etanol/asam asetat. Bakteri ini juga termasuk

bakteri halofilik yang tahan kadar garam tinggi dan dapat melakukan fermentasi

secara cepat dan dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain sedangkan

Lactobacillus sp. bersifat homofermentatif dan memecah gula menjadi asam laktat

(Fardiaz, 1992).

Pada uji hidrolisis pati, bakteri-bakteri di air asinan akan membentuk daerah

transparan yang mengeliling koloni setelah diteteskan dengan lugol. Hal ini

menunjukkan bahwa baketri-bakteri di air asinan memiliki enzim amilase yang

dapat memecah pati menjadi komponen karbohidrat yang lebih sederhana,

terutama glukosa.

Pad uji hidrolisis protein, terbentuk areal bening yang mengelilingi koloni

pada media SMA. Hal ini berarti bakteri-bakteri di air sayuran termasuk bakteri

proteolitik yang memiliki enzim proteinase yang dapat digunakan untuk memecah

protein menjadi peptida dan asam amino. Bakteri-bakteri ini juga termasuk bakteri

lipolitik yang ditandai dengan terbentuknya warna merah di bagian bawah koloni

pada media NA+lemak sehingga dapat diketahui bahwa bakteri ini memiliki

enzim lipase yang dapat memecah lemak menjadi gliserol dan asam lemak yang

akan menurunkan pH medium.

Bakteri-bakteri ini juga menunjukkan hasil yang positif pada uji katalase.

Namun sebenarnya, bakteri-bakteri yang ada di sayuran berkatalase negatif,

seperti Leuconostoc sp. dan Lactobacillus sp. Hal ini mungkin disebabkan

kontaminasi dari mikroorganisme lain yang berkatalase positif atau hidrogen

peroksida (H2O2) yang ditambahkan terlalu banyak sehingga reaksinya menjadi

berlebihan.

40

4.8 Pewarnaan Gram

Tabel 4.8 Hasil pewarnaan Gram pada sampelKelompok Sampel Gram + (%) Bentuk Gram – (%) Bentuk

12

Air tajin 79,4164,84

kokuskokus

20,5935,16

kokuskokus

34

Air rendaman tahu 81,35100

kokuskokus

18,65-

kokus-

56

Air sayur asin 100100

kokuskokus

--

--

78

Air asinan 86,145,18

kokusbasil

13,955,82

kokuskokus

Pada pewarnaan Gram air tajin, dapat dilihat bahwa kebanyakan bakteri-

bakteri yang ada di air tajin merupakan bakteri asam laktat, seperti Lactobacillus,

Leuconostoc, Streptococcus, dan Pediococcus yang bergram positif dengan

persentase antara 65-80% dan sisanya yaitu antara 20-35% merupakan bakteri

Gram negatif. Hal ini menunjukkan bakteri di air tajin memiliki dinding sel yang

sebagian besar tersusun dari peptidoglikan, kebutuhan akan nutrient relatif

kompleks, dan lebih tahan terhadap perlakuan fisik.

Kebanyakan bakterinya berbentuk kokus, yaitu Streptococcus dan

Pediococcus yang homofermentatif serta Leuconostoc yang bersifat

heterofermentatif, namun ada satu bakteri bergram positif yang berbentuk

diplobasil, yaitu Lactobacillus yang bisa bersifat homofermentatif atau

heterofermentatif.

Dari pewarnaan Gram air rendaman tahu, bahwa bakteri utama di air tahu

adalah bakteri Gram positif dengan persentase 80-100%, yaitu bakteri Bacillus

cereus dan sisanya merupakan bakteri Gram negatif dengan persentase 0-18,65%.

Semua bakterinya berbentuk kokus pada saat pengamatan, padahal Bacillus

cereus sendiri berbentuk batang. Hal ini dapat terjadi karena adanya kesalahan

pengamatan mikroskopik.

Pada percobaan pewarnaan Gram air sayur asin, diketahui bahwa bakteri-

bakteri di sayur asin 100% merupakan bakteri Gram positif yang ditunjukkan

dengan koloni yang semua berwarna ungu pada saat pengamatan mikroskopik.

Hal ini cocok dengan teori yang ada karena Leuconostoc sp. dan Lactobacillus sp.

bergram positif (Fardiaz, 1992). Dari pengamatan, diketahui bahwa semua bakteri

di sayur asin berbentuk kokus, yaitu Leuconostoc sp., tetapi pada air sayur asin

masih ada bakteri Lactobacillus sp. yang berbentuk batang. Hal ini dapat terjadi

41

karena areal pandang yang diambil terlalu sedikit sehingga bakteri yang berbentuk

batang tidak kelihatan.

Pada pewarnaan Gram air asinan, diketahui bahwa bakteri-bakteri di sayuran

45-86% merupakan bakteri Gram positif sedangkan 14-56% merupakan bakteri

gram negatif. Hal ini tidak sesuai dengan teori yang ada karena Leuconostoc sp.

dan Lactobacillus sp. bergram positif (Fardiaz, 1992). Kesalahan ini mungkin

disebabkan kontaminan bakteri lain yang bergram negatif atau kesalahan

pengamatan mikroskopik. Bentuk bakterinya kebanyakan kokus, yaitu

Leuconostoc sp. dan ada juga yang berbentuk basil, yaitu Lactobacillus sp.

42

BAB V

KESIMPULAN

Fermentasi adalah proses pemecahan molekul, seperti karbohidrat dan asam

amino tanpa membutuhkan oksigen sedangkan hidrolisis adalah proses pemutusan

ikatan molekul dengan penambahan air. Berdasarkan sifat pemecahan komponen

makanan, ada mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik, pektinolitik, dan osmofilik.

Mikroba aerob juga dapat memecah H2O2 menjadi air dan O2.

Bacillus cereus dapat melakukan fermentasi terhadap komponen karbohidrat

dan menghasilkan asam, termasuk bakteri amilolitik, proteolitik, lipolitik,

berkatalase positif, dan bergram positif. Fusarium moniliforme hanya dapat

memfermentasi laktosa dan sukrosa menjadi asam, merupakan mikroba amilolitik,

proteolitik, lipolitik, dan berkatalase positif. Candida tropicalis hanya dapat

memfermentasi glukosa dan sukrosa serta termasuk mikroba amilolitik,

proteolitik, lipolitik dan berkatalase positif.

Air tajin mengandung bakteri asam laktat, Aspergillus oryzae, dan

Saccharomyces rouxii yang dapat memfermentasi sukrosa, laktosa, dan glukosa,

termasuk mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase positif, kebanyakan

bergram positif, dan berbentuk kokus. Pada air rendaman tahu, terdapat bakteri

Bacillus cereus yang dapat memfermentasi sukrosa, laktosa, dan glukosa,

termasuk mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase positif, dan

kebanyakan bergram positif.

Air sayur asin dan air sayuran mengandung Leuconostoc mesenteroides dan

Lactobacillus delbrückii yang dapat memfermentasi sukrosa, laktosa, dan glukosa,

termasuk mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase negatif, kebanyakan

bergram positif dan berbentuk kokus, tetapi ada juga yang berbentuk basil.

43

LAMPIRAN

Areal Pandang Jumlah bakteri Gram + Jumlah bakteri Gram -1 7 -2 12 43 34 144 26 75 57 12

Rata-rata 27 7

% Bakteri Gram + = 27 × 100 % = 79,41%

27+7

% Bakteri Gram - = 7 × 100 % = 20,59%

27+7

44

DAFTAR PUSTAKA

Azoulay, Edgard. “Fermentation Methods for Protein Enrichment of Cassava and Corn with Candida tropicalis,” AEM Online. Home pageon-line. Available from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=291281; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Buckle, K. A., dkk. Ilmu Pangan. Jakarta: UI Press, 1987.

Doctorfungus. “Candida sp.,” Doctorfungus Online. Home pageon-line. Available from http://www.doctorfungus.org/thefungi/candida_spp.htm; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Engsterhold, Robert. “Untersucht Bacteria Gruppe: E. coli,” UL Online. Home page on-line. Available from http://wwwstud.uni-leipzig.de/~mai03kbz/bioinfprak/mainFrame.htm ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Ewald, Heather T. “Micro-organisms for Education,” TCWM Online. Home pageon-line. Available from http://www.science-projects.com/safemicrobes.htm; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Fardiaz, Srikandi. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT Raja Garfindo Persada, 1992.

Fardiaz, Srikandi. Mikrobiologi Pangan 1. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama, 1992.

Fardiaz, Srikandi. Mikrobiologi Pengolahan Pangan Lanjut. Bogor: IPB Press, 1992.

Johnson. “Carbohydrate Fermentation,” MicroVision Online. Home page on-line. Available from http://www.mc.maricopa.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/cho.html ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Kim, H, J., dkk. “Characterization of Bacillus cereus Isolates from Raw Soybean Sprouts,” Sproutnet Online. Home page on-line. Available from http://www.sproutnet.com/Research/characterization_of_bacillus_cer.html ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Lay, Bibiana W. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada, 1994.

45

Loi, Enrico. “Batteri,” ECplanet Online. Home page on-line. Available from http://www.ecplanet.com/canale/scienza-1/batteri-66/0/0/6855/it/ecplanet.rxdf ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Mader, Algacyr M. “Culture Medium for Amylase Production by Toxigenic Fungi,” Scielo Online. Home page on-line. Available from http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-8913200 0000 500003; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Madigan, Michael T., John M. Martinko, and Jack Parker. Brock Biology of Microrganisms. USA: Prentice Hall International, 1997.

Okumura, Yoshiyuki, dkk. “Isolation & Characterization of aNovel Acid Proteinase, Tropiase from Candida Tropicalis IFO 0589,” JSMM Online. Home page on-line. Available from http://www.jsmm.org/common/jjmm48-1_019.pdf; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Rodier, M. H, dkk. “Purification of an intracellular metallopeptidase of Mr 45000 in Fusarium moniliforme,” Cambridge Online. Home page on-line. Available from http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract?fromPage=online&aid=41943; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Rohmhaas. “Fusarium,” Rohmhaas Online. Home page on-line. Available from http://www.rohmhaas.com/rhcis/markets_and_products/images/microorganisms/Gallery/fusarium_mycelium.jpg&imgrefurl ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Rossbach. “Starch Hydrolysis Medium,” Bios Online. Home page on-line. Available from http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Starch%20Hydrolysis%20Medium.html ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Tugmon, Cathy R. “Skim Milk Agar,” Biol Online. Home page on-line. Available from http://www.aug.edu/biology/skimmilkpage2.htm; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Volk, Wesley A. dan Margaret F. Wheeler. Mikrobiologi Dasar. Jilid 1. Edisi kelima. Jakarta: Erlangga, 1993.

Winarno, F. G. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama, 1995.

46