O bien:

Reacción en cadena de la Polimerasa

Reyes García Marco Antonio

Kary Mullis (1944 - ) Premio nóbel de química 1993

Describe en 1986 la técnica de PCR, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

“Es una técnica que consigue encontrar la aguja en un pajar al tiempo que produce un pajar de agujas por amplificación selectiva”

La ADN polimerasa es una enzima que cataliza la síntesis de ADN a partir de desoxirribonucléicos y de una molecula de ADN plantilla o molde (DIANA) que es la que será "copiada".

La muestra de ADN no necesariamente debe estar pura, puede encontrarse como parte de mezclas complejas.

Debido a que el proceso requiere de altas temperaturas, se utilizan Polymerasas de organismos generalmente arqueas, que no se desnaturalicen por esta variante como: Thermofilus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus Furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus Termophilus (Tth).

¡Para realizar una PCR necesitas!:

• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)• Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno,

complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22. Delimitan la zona de ADN a amplificar.

• Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente.

• Iones monovalentes, como el potasio. • Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el

funcionamiento de la ADN polimerasa. Buffer• ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con

temperatura óptima alrededor de 70ºC (la más común es la Taq polimerasa).

• ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar. • Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura

necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo

Termociclador

• Es el aparato que ciclifica las temperaturas necesarias para que se lleve a cabo la replicación del ADN requerido, por lo tanto, es programable.

Ejemplo: PCR del gen blaIMP gen responsable de la resistencia a IMIPENEM en pseudomonas aeruginosa

1 ciclo 94° C - 3min 30 ciclos 94° C - 1min. 55° C - 1min

72° C -1.5min 1 ciclo 72° C- 7min

PCR

Iniciación

• Consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96ºC generalmente, que se mantiene durante 1-9 minutos

Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

Desnaturalización• Se separan las dos hebras de las cuales está constituido el ADN al

romper los puentes de Hidrógeno. Esto ocurre regularmente a la temperatura de iniciación, pero también depende por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma.

• Otra manera de llevar a cabo este proceso es añadiendo sales o agentes químicos.

• El cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-70ºC durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Sólo se establecen puentes de hidrógeno cuando la cadena concuerda con el complemento. ESTE MÉTODO ES MUY ESPECÍFICO

Alineamiento/Unión del cebador

. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN

Extensión/Elongación de la cadena

• La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP's complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad está en 75-80°C (comúnmente 72°C).

• En su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto!!!

Factor exponencial en la replicación

Elongación Final

• 70-74°C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado

LecturaElectroforesis

Lectura del corrimiento de un gel de agarosa al 0.7% cargado con DNA amplificado por PCR habiendo utilizado iniciadores específicos para ß-Lactamasas. El gel fue teñido con Bromuro de Etidio y leido en un trasiluminador, el cual arrojó la presente imagen. La información de cada ´pozo se encuentra arriba.

Bibliografía