PCR A TIEMPO REAL
Mara Maiques R4-Bioqumica Clnica 25-Abril-07
VEAMOSHerramientas para detectar mutaciones Molculas
fluorescentes y tecnologa FRET PCR a tiempo real: equipos y mtodos
de deteccin Interpretacin de resultados Utilidades de PCR a tiempo
real Ventajas y aplicaciones Conclusiones
en RGre SYB
SecuenciacinHib rida ci n
SONDAS ESPECFICAS
COMPONENTES DE LA REACCIN
SONDAS SYBRGreen ESPECFICAS
FLUORESCENCIA
*FLUORESCENCIAEEstado de Mxima Excitacin Estados
IntermediosCALOR
Estado Fundamental
Tiempo
E = h/
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)FRET es un proceso
por el cual un fluorforo (DONADOR) en estado excitado, transfiere
su energa a una molcula prxima (ACEPTOR)
E1= h/1
E3= h/3 E1 > E2 > E3 1 < 2 < 3 E2= h/2
FRET se produce slo si las dos molculas (DONADOR Y ACEPTOR) estn
suficientemente juntas, disminuyendo su eficacia al aumentar la
distancia entre ellas
MTODOS DETECCIN: sybr-greenSYBR Green I
ELONGACIN Unin inespecfica al DNAds Requiere empleo curvas de
melting Emite seal intensa que aumenta proporcionalmente al
producto acumulado
ANLISIS DE RESULTADOS
Umbral de deteccin
Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto
amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o
RNA de partida
en RGre SYB
SecuenciacinHib rida ci n
SONDAS ESPECFICAS
COMPONENTES DE LA REACCIN
Sondas especficas
MTODOS DETECCIN: sondas FRETFluorescein LC Red
ANNEALING Hibridacin de sondas especficas, marcadas con 2
fluorocromos (donador y aceptor) Su aproximacin disminuye la
fluorescencia emitida x el donador (FRET)
MTODOS DETECCIN:
sondas de hidrlisis (TAQMAN)
Sondas especficas con un fluorocromo en cada extremo (Reporter y
Quencher) Apantallamiento cuando la sonda est intacta
ELONGACIN
INSTRUMENTACIN
ANLISIS DE RESULTADOS
Umbral de deteccin
Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto
amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o
RNA de partida
en RGre SYB
SecuenciacinHib rida ci n
SONDAS ESPECFICAS
DISCRIMINACIN ALLICA
Alelo normal o wild-type
Alelo mutante
DISCRIMINACIN ALLICA
WILD-TYPE HETEROCIGOTO
HOMOCIGOTO
UTILIDADES DE LA PCRtrDeteccin de mutaciones, discriminacin
allica Cuantificacin - absoluta (patrn de diluciones estndar) -
relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de
PCR
UTILIDADES DE LA PCRtrDeteccin de mutaciones, discriminacin
allica CuantificacinGENES DE REFERENCIA
- absoluta (patrn de diluciones estndar) - relativa (respecto a
un control) Caracterizacin de productos de PCR
UTILIDADES DE LA PCRtrGene -actin -actin GAPDH 5.8S,18S, 28S RNA
2-microglobulin G6PDH PBGD aldolase HPRT U3, U8, ... ornithin
decarboxylase ... Genomic structure / pseudogenes multigene family;
> 20 genes; 1 active locus 20 pseudogenes multigene family;
pseudogenes multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse mostly
pseudogenes pseudogenes no pseudogenes no pseudogenes Regulation
e.g. : hormones of tyroid gland : stomach tumor : lung, pancreatic,
colon cancer : insulin, EGF
Deteccin de mutaciones, discriminacin allica no pseudogenes
SHpseudogenes pseudogenes Pseudogenes
O
SE U
EE K
NG PI
: Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors : kidney,
stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors
G
NE E
: tumors
Cuantificacin absoluta
UTILIDADES DE LA PCRtrDeteccin de mutaciones, discriminacin
allica Cuantificacin - absoluta (patrn de diluciones estndar) -
relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de
PCR
Cuantificacin relativaGe n Re fe re ncia 8 6 4 2 0 0 10 20 30
Log ng RNA y = -1,0365x + 28,82 R = 0,99362
Gen Diana8 6 4 2 0 0 Log ng RNA 20 40 y = -0,7147x + 27,213 2 R
= 0,9852
MUESTRAS Cerebro
C t
Ct GD 28.36
Ct GR 15.22
ng GD 0.84
ng GR 589
GD/GR 1.43* 10-3
C t
Ratio 1
Msculo Hgado Rin
32.33 20.71 24.58
15.74 15.12 15.15
0.13 33.11 5.13
302 661 646
4.17*10-4 5.01*10-2 7.94 * 10-3
0.29 35.08 5.56
UTILIDADES DE LA PCRtrDeteccin de mutaciones, discriminacin
allica Cuantificacin - absoluta (patrn de diluciones estndar) -
relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de
PCR
Caracterizacin de productos de PCRCada producto de PCR se
caracteriza por su Tm (T a la que el 50% del DNA est en forma de
cadena sencilla) Diferentes DNA tienen distintas Tm y productos no
especficos Amplificacin como dmeros DNA-primers tambin. Deteccin
con SYBRGREENLa Tm vara con:
GCLa Tm depende de:
41 C 10 C
GC 10,000 pb
50 pb
Identificacin del producto sales, MgCl , Sybr-green Concentracin
de 2 Grado de homologa entre la sonda y el DNA
VENTAJAS DE LA PCRrtAmplificacin especfica Automatizacin y
disminucin del tiempo de anlisis Reaccin monitorizada a tiempo real
No procesamiento post-PCR: no contaminacin Ciclos de amplificacin
rpidos (
