PCR в реално време - в търсене на вируси, мечки, генно

модифицирани храни и гени

Олга Белчева и Гюлназ Джебир

12.06.2012

Център по молекулна медицина

За какво ще говорим днес

Целта на заниманията ни днес е да разберем:

що е то PCR в реално време;

какви са предимствата му пред „традиционния” PCR;

какви методи се използват за провеждането му;

за какво може да ни послужи.

PCR

Въз основа на данните получени от различните проекти за секвениране на човешкия геном е пресметнато, че всяка наша клетка съдържа около 3 млрд. б.д. ДНК или 10-25 000 белтък кодиращи гена. В повечето случаи ние се интересуваме от конкретни полиморфни варианти, екзони, регулаторни участъци или гени, а не от целия геном – работата ни е да открием игла в купа сено.

Полимеразната верижна реакция, PCR, ни позволява да намножим точно този участък, който ни интересува. Целта на PCR и PCR в реално време е една и съща – да получим смес от ДНК молекули, в която концентрацията на интересуващата ни нуклеотидна последователност е многократно по-голяма от тази на всички останали секвенции.

PCR – ход на реакцията

1

2

3

Какво става с нашата секвенция?

цикъл ДНК молекули

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

... ...

33 8 589 934 592

34 17 179 869 184

35 34 359 738 368

Какво става с нашата секвенция?

Теоретично, броят на новите копия нараства в геометрична прогресия.

цикъл ДНК молекули прогресия

1 2 =1*21

2 4 =1*22

3 8 =1*23

4 16 =1*24

5 32 =1*25

6 64 =1*26

... ... …

33 8 589 934 592 =1*233

34 17 179 869 184 =1*234

35 34 359 738 368 =1*235

На практика след определен етап нарастването се забавя, поради изчерпване на реактивите, паралелно разграждане на вече синтезирани фрагменти, „изтощаване” на ензима, и т.н.

цикъл ДНК молекули прогресия

1 2 =1*21

2 4 =1*22

3 8 =1*23

4 16 =1*24

5 32 =1*25

6 64 =1*26

... ... …

33 1 109 934 592 =1*232,36

34 1 189 934 592 =1*232,48

35 1 209 934 592 =1*232,60

Какво става с нашата секвенция?

0

200000000

400000000

600000000

800000000

1000000000

1200000000

1400000000

1 6 11 16 21 26 31 36

бр. цикли

ДН

К к

оп

ия

Така, ако искаме да преценим с колко копия сме започнали е най-

добре да засечем продукта преди реакцията да се е забавила, т.е.

преди графиката на зависимостта на броя копия от броя цикли да е

достигнала плато. В този случай се интересуваме от т.нар.

експоненциална част на графиката.

Ако започнем с повече?

цикъл

ДНК молекули

започваме с една

започваме с две

1 2 4

2 4 8

3 8 16

4 16 32

5 32 64

6 64 128

7 128 256

8 256 512

... ... ...

Ако започнем с повече?

0

200000000

400000000

600000000

800000000

1000000000

1200000000

1400000000

1 6 11 16 21 26 31 36

бр. цикли

ДН

К к

оп

ия

Малко математика

бр. цикли бр. ДНК молекули

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

... ...

33 1 109 934 592

34 1 189 934 592

35 1 209 934 592 22=4

log24=2

Разликата в броя ДНК молекули в началото на реакцията и към края й е огромно, което прави част от графиката „невидима”. За това, вместо да отчитаме какъв е броят на копията в края на всеки цикъл, можем да пресметнем степента на нарастването като използваме логаритмична функция.

Малко математика

бр. цикли бр. ДНК молекулиLog2 бр.

ДНК молекули

1 2 1,00

2 4 2,00

3 8 3,00

4 16 4,00

5 32 5,00

... ... …

33 1 109 934 592 30,05

34 1 189 934 592 30,15

35 1 209 934 592 30,17

Малко математика

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

1 6 11 16 21 26 31 36

бр. цикли

log

2 Д

НК

коп

ия

За различен брой копия от матрицата...

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

1 6 11 16 21 26 31 36

бр. цикли

log

2 Д

НК

коп

ия

Малко математика

бр. цикли бр. ДНК молекулиLog10 бр.ДНК молекули

1 2 0,30

2 4 0,60

3 8 0,90

4 16 1,20

5 32 1,51

... ... …

33 1 109 934 592 9,05

34 1 189 934 592 9,07

35 1 209 934 592 9,08

102=100

log10100=2

lg100=2

Малко математика

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

1 6 11 16 21 26 31 36

бр. циклиlo

g1

0 Д

НК

ко

пи

я

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

1 6 11 16 21 26 31 36

бр. цикли

log

2 Д

НК

ко

пи

яАко използваме десетичен логаритъм, скалата на ординатата

ще намалее още по-вече – графиката се “снижава”.

PCR срещу Real-time PCR

Разликата между PCR и PCR в реално време е в това какво получаваме накрая.

PCR ни дава това:

PCR в реално време това:

0

200000000

400000000

600000000

800000000

1000000000

1200000000

1400000000

1 6 11 16 21 26 31 36

бр. цикли

ДН

К к

оп

ия

0

200000000

400000000

600000000

800000000

1000000000

1200000000

1400000000

1 6 11 16 21 26 31 36

бр. цикли

ДН

К к

оп

ия

PCR срещу Real-time PCR

Двата метода ни позволяват да отчетем резултатите в различен етап от амплификацията.

PCR ни дава възможност да видим продукта на последния цикъл – момента когато реакцията е достигнала плато.

PCR в реално време ни позволява да видим как се увеличава броя на копията на нашия продукт през цялото време на реакцията. По този начин можем да отчетем реалните разлики в началните количества на матрицата в различните проби.

PCR

Real-time PCR

TaqMan проби за Real-time PCR

Визуализацията на продуктите от първия цикъл на реакцията, когато те са малко на брой, може да се постигне чрез флуоресцентно белязване. Една възможност е използването на TaqMan проби.

Това са олигонуклеотиди, комплементарни на участък между двата праймера. В 5’ края му е разположен флуорофор, а в 3’ края т. нар. затихвател (quencher). Когато върху пробата попадне лазерен лъч, високо енергийния флуорофор поема фотона, но ниско енергийния затихвател подтиска светенето му. В хода на амплификацията полимеразата започва да добавя нуклеотиди към 3’ края на праймера, а когато наближи пробата я разгражда (5’>3’ екзонуклеазна активност). Разпадането на пробата раздалечава флуорофора от затихвателя, в резултат на което той започва да свети.

TaqMan проби за Real-time PCR

В реакцията присъстват:

ДНК матрица;

праймери за интересуващата ни секвенция;

флуоресцентно белязана проба;

Taq полимераза.

Приложение на TaqMan пробите

Съществуват две основни приложения на флуоресцентно белязаните TaqMan проби за PCR в реално време:

количествен анализ – определяне на брой копия от дадена секвенция;

алелна дискриминация – разграничаване на два (или повече) варианта на една и съща секвенция.

За нуждите на количественият анализ използваме факта, че TaqMan пробите ни позволяват да отчетем броя на ново синтезираните фрагменти през експоненциалната фаза на амплификацията.

Когато трябва да различим алели, използваме проби, които са комплементарни на съответните варианти и са белязани с различни фолуорофора.

Количествен анализ с TaqMan

Техниката PCR в реално време най-често се използва за определяне на количеството (брой копия) на дадена секвенция. Нарастването на флуоресценцията с всеки изминал цикъл от експоненциалната фаза е право пропорционално на увеличението на броя копия на продукта.

Съществуват два варианта на количествен анализ:

абсолютен – измерва се точния брой копия от дадена нуклеотидна последователност;

относителен – определя се колко пъти повече/по-малко е дадена последователност в сравнение с референтна такава.

Абсолютен количествен анализ

Точното определяне на количеството на интересуваща ни секвенция става с помощта на стандартна крива, за построяването на която се използват серийни разредки на проба, съдържаща предварително известни количества от същата последователност.

В хода на PCR реакцията се отчита флуоресценцията на всяка от разредките и се построява графика на зависимостта на светенето от концентрацията им. Така построената графика се използва за да се определи на каква концентрация съответства измерената в неизвестната проба флуоресценция.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

1/1000 1/100 1/10 1 10

концентрация

фл

уор

есц

ен

ци

я

Построяване на стандартна крива

флуоресценция нанеизвестна проба

Относителен количествен анализ

Друг начин за извършване на количествен анализ е чрез

нормализиране на пробите с помощта на вътрешна контрола.

Такъв тип експериментална постановка се използва например

за сравняване на нивата на транскрипция на един ген в

различни типове клетки. Вътрешната контрола най-често е -

актин или глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, за които се

знае, че се експресират еднакво във всички клетки.

За всяка проба се използват два различно белязани TaqMan

олигонуклеотида, съответно за изследвания ген и за

контролата. Стойностите на флуоресценцията получени за

контролата се използват за да се нормализират резултатите

получени за интересуващия ни ген. В крайна сметка се

получава сравнителна стойност, напр. колко пъти експресията

на гена в клетки тип А надвишава тази в клетки тип Б.

Относителен количествен анализ

Алелна дискриминация с TaqMan

С помощта на PCR в реално време, използвайки TaqMan проби, можем да докажем присъствието на полиморфни варианти в дадена секвенция. Пример за това е SNP генотипирането, което има за цел да определи дали в дадена проба присъстват две копия на алел 1, две копия на алел 2 или по едно копие от двата.

След края на тези безкрайно дълги обяснения ще имате възможност да изпробвате това на практика!

Алелна дискриминация с TaqMan

Резултатът е представен графично като може да видим едновременно генотипите на всички анализирани проби:

или за всяка проба по отделно:

хомозигот хетерозигот

SYBR Green или TaqMan

TaqMan пробите не са единственият начин за проследяване хода на PCR реакции. Различни фирми са разработили различни техники за визуализация на резултатите от PCR в реално време (напр. Scorpions, Molecular beacon). Една много често използвана алтернатива е багрилото SYBR Green.

Молекулите на багрилото интеркалират с ДНК – когато се закачат за малката бразда на двойно верижните спирали те започват да флуоресцират.

SYBR Green или TaqMan

Какви са предимствата и недостатъците на SYBR Green?

Предимства:

универсален маркер - не изисква специфични проби;

по-евтино – един и същи реактив може да се използва за различни PCR реакции;

по-висока чувствителност - много флуорофорни молекули се закачват към продукта.

Недостатъци:

провеждането на алелна дискриминация изисква допълнителна оптимизация;

риск от фалшиво-положителен резултат (може да бележи и неспецифични продукти).

Приложение

За какво бихме могли да използваме PCR в реално време? Най-често срещани са следните приложения на този метод:

идентификация на индивиди;

еволюционни проучвания;

количествен анализ;

търсене на патогенни мутации;

търсене на нови гени или генетични елементи свързани със заболявания при човека;

...

Идентификация на индивиди

Еволюционни проучвания

Количествен анализ

Търсене на патогенни мутации

Търсене на патогенни мутации

Търсене на нови гени

Търсене на нови гени

Въпроси?